小说Egg-In-Cube系统能够长期文化和早期胚胎发育的动态成像
Mohit戴夫
约书亚·莱文1、2,
赛斯沃尔特鲁芬,
有差别的Kawahara- 1放射学与发育神经科学项目,系研究所儿童医院的洛杉矶,洛杉矶,加州,美国
- 2干细胞生物学和再生医学,Broad-CIRM中心,凯克医学院的南加州大学,洛杉矶,美国CA
- 3解剖学系和细胞生物学、医学科学研究生院,九州大学,日本福冈
- 4转化成像中心、南加州大学、洛杉矶、钙、美国
- 5生物科学、分子生物学和计算,南加州大学,洛杉矶,美国CA
- 6生物学系、达纳和Dornsife学院信件,艺术,科学,南加州大学,洛杉矶,美国CA
- 7放射学,凯克医学院的南加州大学,洛杉矶,美国CA
- 8生物功能工程系、九州技术研究所、日本北九州
鸟类的蛋是一个封闭的系统,保护胚胎发育的胚胎发展的外部因素,但防止直接观察。各种文化系统中存在文学研究的发展孵化的胚胎在短时间内(从12 h最多60 h的蛋孵化)。这些文化技术共同的缺陷是无法文化unincubated禽胚盘完整组织本土蛋黄的紧张局势。这项工作的目标是创建一个独特的小说egg-in-cube系统可用于长期鹌鹑胚胎培养开始从其unincubated胚盘阶段。egg-in-cube作为人工透明蛋壳系统,拥有越来越多的胚胎,使它适合显微镜。egg-in-cube系统,可以将鹌鹑胚胎成长的9天unincubated胚盘(孵化在空气中,20.9%啊2),它可以提高到15天切换到60%的氧环境O2。在egg-in-cube系统,使用转基因荧光鹌鹑胚胎细胞运动unincubated胚盘使用反向共焦显微镜动态成像,已具有挑战性的实现与其他文化系统。除了这些观察,其他几个成像系统的应用程序被描述在本工作使用转基因荧光鹌鹑胚胎和正直的共焦显微数字化。证明有用的egg-in-cube系统扰动试验,鹌鹑神经管electroporated与荧光mRNA“三次”,其次是electroporated胚胎的孵化和显微镜electroporated地区胚胎的立方体。egg-in-cube文化系统结合“三次”电穿孔和这里描述动态成像功能将使研究人员调查几个基本问题在早期胚胎发生的禽流感(鹌鹑)胚胎在其本地蛋黄。
介绍
的主要优势鸟类胚胎的发育研究中使用很容易可访问性和文化蛋壳内的胚胎的能力(蛋)或人工基质(如蛋)。这些胚胎培养技术使生物学家首先详细描述鸡胚胎的正常发育。
隔离技术和半固态基质培养的胚胎被沃丁顿开始(沃丁顿1932),进一步提高了索兰托(索兰托,1947)在一个开创性的研究脊椎动物的形式和功能。胚胎隔离和前女友蛋文化技术开发的新的(新,1955)提供了一个简单的技术文化、操作和观察早期鸟类胚胎发生从原条阶段到汉堡和汉密尔顿(HH)阶段12 - 13(汉堡包和汉密尔顿分期系统,汉堡&汉密尔顿,1951)。几组修改新的文化通过将玻璃/金属环之间的孤立的胚胎主要扩展的发展时期的原条阶段HH17 (那些时光,Gallera和Nicolet 1961;雅各(1971);贾菲,1974;Seidl 1977;斯特恩和爱尔兰,1981年)。“康沃尔郡的糕点”培养法(Connolly et al ., 1995)及其改性MC文化(Nagai et al ., 2011)也来自于新的文化适应一种新的“折叠和文化”的方法在液体媒体由蛋白和盐的混合物。这两种文化的方法也致力于实现更好的脉管系统发展阶段HH18。
早期的小鸡(EC)培养法(查普曼et al ., 2001)改进新的文化技术通过使它更快,更容易小鸡胚胎正常组织张力。欧盟文化系统允许将胚胎培养阶段HH3-15背或腹侧表面。然而,使用电子商务文化培养pre-primitive条纹胚胎仍然有限,由于在这些早期胚胎存活率低(查普曼et al ., 2001)。EC文化仍广泛用于隔离和文化之间的胚胎后期HH3 HH15,之后,一些神经和心脏形态发生缺陷通常被观察到查普曼et al ., 2001)。EC文化在新修改的文化的一个优点是易于适应文化系统高分辨率显微镜。使文化pre-gastrulating胚胎,新的文化的修改隔离和文化pre-primitive条纹胚胎早在EGK十二世(Voiculescu et al ., 2007)[EGK分期系统(Eyal-Giladi & Kochav, 1976)]。这项工作还描述了前几延时成像实验理解pre-gastrulation小鸡胚胎的发展阶段。这种改性技术使隔离pre-primitive条纹胚胎,但不幸的是没有克服艰苦的自然固有的文化技术新的文化系统。
几个whole-yolk文化系统开发(奥尔巴赫et al ., 1974;猛烈的风暴et al ., 2004;Borwompinyo et al ., 2005;Yalcin et al ., 2010)解决各种蛋文化交货方法的缺点。在这些文化系统中,胚胎仍在完整的蛋黄,和所有的鸡蛋蛋白的内容转移到另一个容器进行孵化。火鸡或鸡肉的容器不同代理蛋壳(Nirasawa et al ., 1992;Borwompinyo et al ., 2005),一个培养皿中(奥尔巴赫et al ., 1974),或者保鲜膜吊床(猛烈的风暴et al ., 2004;Yalcin et al ., 2010;Schomann et al ., 2013;Tahara Obara, 2014)文化。有些系统还包括顺序文化多个容器,包括一个塑料杯(0-24 h),鹌鹑蛋壳(24 - 76 h),然后在鸡蛋壳(直到孵化)供应的最佳生长鸡瘦蛋白(小野et al ., 1994)。在这些whole-yolk胚胎培养系统增加了可访问性和生长,直到孵化。大多数的这些技术是非常有用的学习后胚胎血管系统的发展是建立在研究早期形态发生和原肠胚形成仍难以实现。虽然一些文化系统启用访问鹌鹑胚胎的早期发展(小野et al ., 1994),他们不适合直接观察/显微镜由于文化,在一个不透明的蛋壳24 h后的胚胎生长。
越来越需要一个文化系统,可以使显微镜早期胚胎的原生蛋黄模仿自然条件和维护适当的组织成像胚胎发展的紧张情绪。第一个蛋成像研究涉及追踪后脑神经嵴细胞的迁移使用染料注射,使胚胎的鸡蛋蛋黄在本土环境(Kulesa et al ., 2000;Kulesa &弗雷泽,2000;Kulesa et al ., 2010)。这些研究使用聚四氟乙烯膜蛋壳窗口提供光学透明度和保持湿度在胚胎期间成像。并发症在蛋的方法是,胚胎可以慢慢散去的3 d扩张由于其自然关注蛋黄。这种横向运动不适合长期的成像方法。理想成像和文化系统应该解决问题前蛋和蛋上面描述系统。
我们最近建立了一个广义人工egg-in-cube系统的设计方法,重点优化氧渗透率通过立方体表面和文化条件小鸡胚胎从第三天开始(E3),直到第七天(E7)的发展(黄et al ., 2015)。我们展示正常胚胎发展的多维数据集与蛋壳的可访问性的胚胎的优势和它的脉管系统。我们标准化的厚度聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜(细胞膜形成立方体的边),使更高的氧扩散还提供了足够的灵活性来插入手术器械通过胚胎的多维数据集的访问。
在这里介绍的工作,我们定制egg-in-cube系统小鹌鹑蛋,用荧光耦合转基因鹌鹑行演示egg-in-cube体系使长期文化的力量和高分辨率成像的禽类胚胎产蛋阶段(EGK-X)。
材料和方法
立方体的制造和样品制备
立方蛋壳的制造工艺和聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜作为(黄et al ., 2015)和少量修改(补充图S1)。简而言之,PDMS膜(Sylgard 184硅酮弹性体基地和固化剂,陶氏,# 2646340)是捏造的,切成立方体的尺寸短(L * a * H: 24 * 24 * 18毫米)。这些膜附在立方体的五国框架使用液体PDMS胶水和治愈热板(20分钟80°C)的顶面保持打开。多维数据集进行泄漏检测,然后用蒸馏水和70%乙醇消毒。鹌鹑蛋受精的内容转移到多维数据集。多维数据集是密封的透明度高的氧渗透膜(高灵敏度拉伸膜,YSI /木质部Inc . # 098095)或一个矩形块无菌和干净的保鲜膜紧绷的身体在开放的表面和与一个弹性橡皮筋举行到位。(补充图S1)。
详细设计的舞台孵化器
我们设计了一个定制的盒子孵化器的立方体,可以连接到一个电源。这个盒子孵化器配备一个圆柱形座房子立方体封装两个加热器用碳纤维制成的。USB碳利用热收缩管的管状加热器线圈结构。一个线圈放置在中心的持有人在其外缘(纵向)。另一个是附在盒子的盖子,确保加热的胚胎。电阻值(热值)两个加热线圈的校准和调整通过改变加热线圈的长度来获得相同的温度输出线圈。组装后加热线圈在紧凑的孵化器,5 V直流电压被应用于加热线圈。通过使用热成像摄像机、加热线圈的输出调整升至°C通过改变直流电压。小塑料水库符合一个电风扇被用来保持最佳湿度孵化器系统。测试和校准的孵化环境条件,精确micro-TEMP / RH传感器(Sensirion SHT35灵活,SysCom corp .)是用来检查前的孵化条件实验。 A portable temperature and humidity sensor (EEEKit LCD digital thermometer/hygrometer, supplier: Amazon, #B07KBW4W12) was then used to monitor the real-time temperature and humidity fluctuations in the incubator environment if any. The output terminals for this sensor were extended with electrical wires to measure the local environment very close to the embryo in the cube. This customized incubator setup is highly useful for imaging on microscopes not equipped with on-stage incubators (补充图S2A)。
详细设计为一个自定义的孵化器长期胚胎成像
更大的定制孵化器是修改从一个特百惠容器碳光纤加热器提供一个恒定的热源温度维持在37-38°C。一个塑料格栅平台保持高度的方块小水库。一个小风扇用于维护统一的湿度环境中。除了一个精确的温度/湿度传感器反馈控制器连接到一台笔记本电脑,这个孵化器还配备了一个可移植的温度/湿度传感器,视觉检查条件。水被添加到容器每24小时使用一个小港口的孵化器而令人不安的数据集。
转基因鹌鹑
(Tg (hUbC: H2B-cerFP-2A-Dendra2)]鹌鹑线(来源:Lansford实验室,CHLA)无所不在地co-expresses组蛋白2 b-ceruleanfp (H2B-cerFP)和Dendra2 (鲨鱼肉& Lansford, 2017)。Dendra2 photoconvertible绿色荧光蛋白,转化成一种红色在暴露于近紫外线光(Gurskaya et al ., 2006)。(Tg (hUbC: Membrane-eGFP)]鹌鹑线(请提供的杰罗姆·格罗斯博士(巴斯德研究所、巴黎、法国)]标签所有细胞的质膜(Saadaoui et al ., 2020)。(Tg (PGK1: H2B-mCherry)]鹌鹑行无所不在地表达组蛋白2 b-mcherryfp (H2B-mCherryFP) (鲨鱼肉et al ., 2015 a)。所有动物程序批准后进行了指导方针从洛杉矶儿童医院和南加州大学的动物保健和使用委员会制度。
显微镜和图像分析
正直人共焦成像形态,延时图像获得蔡司780 LSM正直的共焦显微镜(ZLSM780u)使用1.0 W Plan-Apochromat 20 x / na DIC (UV)可见M27 75毫米的目标或与一个正直的奥林巴斯MVX10立体显微镜数字化MVPLAPO x1/0.25NA目标加上一个奥林巴斯XM10相机奥林巴斯CellSens尺寸控制的软件(奥林巴斯,RRID: SCR_016238)。成像在倒置的形态进行780年蔡司LSM反向共焦显微镜(ZLSM80i)×5/0.16NA,×10/0.45NA M27,或×20/0.8NA M27 Plan-Apochromat目标。延时图像也收购了摩托罗拉使用来自一个Android brightfield成像E5手机相机(原始规格:13 MP, f / 2.0, 1/3.1”、1.12µm针对PDAF, JPEG分辨率:4368×2912)。相机是使用编程的调试模式”与PC通信的手提电脑。这种编程修改相机分辨率获得JPEG图像960×720像素0.7像素。图片是定期获取和存储在笔记本电脑上。图像和延时文件处理使用蔡司禅(黑色)软件(蔡司,RRID: SCR_018163), NIH ImageJ (PMID 22743772, NIH RRID: SCR_003070),和伊万里瓷器9.5 (Bitplane RRID: SCR_007370)。
胚胎阶段
鹌鹑胚胎阶段基于先前建立的标准(汉堡&汉密尔顿,1951;Eyal-Giladi Kochav, 1976;安斯沃思et al ., 2010),原条的附加详细描述形态和分期(斯特雷特&斯特恩,2008年)。
延时分析胚胎发展的多维数据集
几种野生鹌鹑蛋受精的内容被转移到多维数据集和设置成一个定制的盒子孵化器(补充数据开通,C)作为控制成像以及完整的鸡蛋。LED光源垂直安装在一个合适的距离为一个常数的白色光源的立方体亮视场成像。Android摩托罗拉E5手机相机程序每隔5分钟自动捕获图像。收购了JPEG图像被存储在一个电脑连接到手机。成像是持续不间断的h(直到96年孵化。在96 h,多维数据集与正常胚胎形态下被重新定位相机,和其他数据集被丢弃。成像是继续这些选定的胚胎,直到他们恶化。后天jpeg转换为TIFF文件使用ImageJ 1.53。结果从这个方法被描述为3.1节的一部分。
测试的效果60%2在胚胎成长的立方体
几个野生鹌鹑蛋受精的内容被转移到多维数据集和孵化以及完整的鸡蛋作为强制空气控制孵化器37°C 3天。3天,一些数据集生活胚胎被转移到一个氧过多室保持恒定的环境(O 60%的氧气2)以及一套完整的鸡蛋作为控制。在立方体强制空气孵化器和孵化胚胎在60% O2被允许孵化和检查每一个18 - 24 h的可行性。不能存活胚胎从多维数据集以及相应的蛋控制和固定冷4%甲醛在4°C PBS 48 h。这些固定的胚胎被洗在PBS。举办这些固定的胚胎,第三个脚趾的长度和喙长度测量阶段他们根据汉堡包和哈密顿系统(汉堡&汉密尔顿,1951;安斯沃思et al ., 2010)。测量获得的图像是由第三脚趾和喙放置在一个塑料尺子奥林巴斯MVX10立体显微镜数字化的正直的人与一个MVPLAPO×1/0.25NA目标加上一个奥林巴斯XM10相机奥林巴斯CellSens尺寸控制的软件。
珠注入胚胎
空的孵化器(见定制的盒子S2A补充数据,一个“预平衡37°C)的方法是将这个盒子在处理前的蛋孵化鸡蛋1 h。野生鹌鹑胚胎在37°C湿润孵化器孵化72 h达到阶段E3 (HH18)。内容,这些受精卵轻轻转移到几个数据集和筛查正常形态和适当的胚胎进行分期。荧光微球(直径1μm,深红色的前女友/ Em: 625/645) (FluoSpheres ThermoFisher科学,# F8816)被稀释1:1000进无菌PBS和microinjected使用了玻璃针进入左外侧卵黄静脉血液流动的方向。这些注入了“三次”胚胎转移回37°C孵化器为30分钟恢复。最好的注射是第一筛选直立奥林巴斯MVX10立体显微镜数字化与MVPLAPO×1/0.25NA客观,然后转移到盒子孵化器在舞台上,用于动态成像。
电穿孔的鹌鹑胚胎“三次”
多个(Tg (PGK1.H2B.mCherry))胚胎转移到多维数据集和electroporated 1μL 0.5μg /μL mRNA,在体外从pCS2.membrane转录。eGFP质粒(pCS2.membrane。eGFP Le陈博士是一个礼物)针对midbrain-hindbrain和神经管的地区。多维数据集的electroporated胚胎孵化2 h在37°C的湿润孵化器。2 h后,electroporated胚胎筛选GFP表达下直立奥林巴斯MVX10立体显微镜数字化,然后转移到蔡司LSM反向共焦显微镜成像阶段。电穿孔条件:25 V 50 / 100为3 - 5个脉冲女士(女士中村Funahshi, 2001)。
结果
长期的文化鹌鹑胚胎的多维数据集
egg-in-cube系统开发在我们以前的工作是保持鸡蛋的内容(黄et al ., 2015)。适应的鹌鹑蛋,我们减少了聚碳酸酯(Takiron有限公司,猫# PCP1609A)立方体框架尺寸小一号(L×W×H: 24×24×18毫米)。我们的第一个目标是描述egg-in-cube系统和测试它的长期文化鹌鹑胚胎从unincubated EGK-X阶段。胚胎发展慢得多,其形态在立方体的不规则的胚胎在密切接触膜表面(补充图S3)。我们发现,长期的文化(几天)立方体从EGK-X,至关重要的气隙∼5毫米高透明膜的表面之间(的立方体)和胚胎。成像长远发展(几天)胚胎的高分辨率的正直与气隙共焦显微镜将被限制在低放大率长工作距离目标像×5×10的目标。虽然这气隙不妨碍在直立的荧光成像立体镜由于长途的工作目标。
测试修改后的培养条件的作用对长期生存的鹌鹑胚胎立方体系统,我们转移的内容几个EGK-X (unincubated)野生型鹌鹑蛋多维数据集,引入了一个气隙,并设置一个定制的盒子孵化器成像(见补充数据开通,C)。图1一个显示代表时间帧从一个胚胎的延时电影11.25天(11天、4 h)孵化从天0 (EGK-X unincubated鸡蛋)。早期胚胎经过扩张前2天,和脉管系统发展到第二天(见补充视频S1)。通过3 - 4天的孵化,胚盘边盖的顶部可见的蛋黄,胚胎生长大,曲线成c形结构,现在显然是brightfield图像和它的心跳。开始的第五天,尿囊明显扩张的血管开始信封胚胎。色素沉着的眼睛是可见的;规模增加随着分化的四肢(∼天6)。
图1。氧过多(60%啊2)提高胚胎生存egg-in-cube长期文化系统。(一)帧捕获实时成像的一个EGK-X野生鹌鹑胚胎。这里显示的图像使用Android收购摩托罗拉E5手机相机从胚胎的背方面的多维数据集每隔5分钟。从EGK-X获得的图像(E0)第四天的发展,照明和多维数据集被调整,成像一直持续到胚胎开始恶化了11.25天。从手机中直接获取的原始JPEG文件并使用ImageJ加工成TIFF文件。在大约24小时的间隔时间框架隔离这些口角在这里代表人物。原视频文件中可以看到补充视频S1。比例尺= 5毫米。(B)卡普兰Meier存活曲线绘制在胚胎孵化之间空气(20.9%啊2,蓝线,nO = 21胚胎)和60%2(红色线,n= 15胚胎)。胚胎存活百分比绘制在孵化的轴和时间轴上的多维数据集(天)。X表示胚胎的死亡和填充正方形表示胚胎是未知的生存端点/胚胎未通过审查的分析。Mantel-Haenszel生存率较,χ21 = 7.16,p< 0.0074。
头部和胸腔的胚胎大小增加蛋黄的形状变得不那么球面由于卵黄吸收和新陈代谢的卵黄囊(第七天)。绒毛膜尿囊的膜(CAM)脉管系统进一步发展成一个密集的墙上的毛细血管和血管网络的多维数据集。胚胎经过孵化的正常发展,直到11.25天;其蛋黄合约后,血管系统开始出现故障,停止和成像。一旦成像停止,胚胎被隔离的分段的多维数据集。我们观察到眼睑的形成,但胚胎没有棕色和黑色色素沉着。使用这些特性的存在,我们分配了胚胎的发育阶段HH35 (∼E8)。因此,胚胎在立方体的增长比预期略推迟年龄在11天的孵化。
胚胎培养egg-in-cube系统已经从EGK-X变量生存时候孵化。在几个试验胚胎孵化的立方体,大约23%的胚胎死于第三天的孵化和34%的胚胎存活,直到8天的孵化。死亡率在最初的3 - 4天的孵化之前已经观察到在文学(佩恩,1919;谜,1930)。胚胎死亡前4天可能发生由于内在因素如结构畸形和先天畸形总值(拜尔利1930),异常积累有限公司2在碳水化合物代谢和积累乳酸(玻尔和Hasselbalch, 1903;获利1921)。的一个重要外部因素可能是氧气供应不足的早期胚胎发育过程中(谜,1930)中所见到的血管床躺下来图1一个孵化(第四天)。为了验证这个假设,我们决定调查如果提供较高的氧气量的胚胎E3以后会增加胚胎发展的时间可以达到的多维数据集,提高早期存活率。
在这项研究中,几个胚胎在EGK-X首先转移到多维数据集和在一个强制空气孵化器孵化37°C 3天(n= 36胚胎)。一些数据集(n= 15胚胎)与生活胚胎被转移到一个氧过多室保持恒定的氧气供应的60%2(梅特卡夫股票和1984人)在37°C和匹配长期孵化蛋控制。绘制kaplan - meier生存曲线% %胚胎生存(轴)与时间的胚胎孵化立方体(天,轴)来分析如果胚胎存活更长时间由于添加氧气在其环境。生存曲线(图1 b)表明,胚胎孵化在立方体60% O2(n= 15胚胎)明显更好的生存的几率(Mantel-Haenszel生存率较,χ21 = 7.16,p< 0.0074)相比,那些在空中孵化(nO = 21个胚胎,20.9%2)。胚胎孵化的生存时间中位数在立方体60% O2(14天)也远高于那些在空中孵化(20.9%啊2,8天)。代表图像的胚胎孵化率为60%2与那些在空中孵化(20.9%啊2)所示S6A补充数据,B随着他们了。
因此,60%的氧环境(O2),我们改善了生存和增长的鹌鹑胚胎的中位生存时间8 - 9天到14天的孵化。文化的所有生物胚胎egg-in-cube被终止的最大孵化15天根据洛杉矶儿童医院(协议# 351 - 16)机构动物保健和使用委员会的协议。
成像组织运动发生在使用一个正直的荧光体视镜Pre-gastrulation胚胎
证明胚胎培养的能力和动态成像使用立方体系统在一个正直的荧光体视镜,我们使用了一个unincubated EGK-X (Tg (hUbCp.membrane.EGFP)) (Saadaoui et al ., 2020胚胎)安装在成像的多维数据集。我们捕获了胚胎的发展通过孵化前10 h (补充视频S2)。胚胎开始慢慢扩大通过孵化的第一个4 h polonaise-like运动(葡萄,1929)外胚层伴随着古典前内胚层运动(斯特恩,1990;劳森& Schoenwolf, 2003)。这两个动作帮助形成和伸长的原条前胚胎,从而增加胚胎沿着p轴的长度随着电影结束在9小时50分钟。图2这里包括代表图像的延时电影突出上述形态学变化。
图2。使用一个正直的荧光体视镜成像原肠胚形成。帧捕获实时成像的一个EGK-X Tg (hUbC.membrane.GFP)鹌鹑胚胎。这里显示的图像使用直立奥林巴斯收购立体显微镜从胚胎的背方面的多维数据集每隔10分钟。从EGK-X获得的图像(E0) HH3 + (9.8 h(孵化)。每隔1 - 2小时时间框架是孤立的从原始TIFF文件。原视频文件可以被视为补充视频S2(EGK-X HH3 +)。酒吧= 700µm规模。
血流动力学的HH15 (E2.5)野生型胚胎注射荧光微球
荧光微球注射剂已广泛应用于哺乳动物理解心肌梗死和区域血流量测量(Glenny et al ., 1993;Deveci & Egginton, 1999;Goyal et al ., 2013)。这种技术已经扩展到小鸡胚胎的测量心输出量在正常和缺氧条件(E10小鸡胚胎穆德et al ., 1997;穆德et al ., 1998)。这里,我们microinjected深红色荧光微球进入血液循环的E3野生鹌鹑胚胎和成像微球的运动在较小的胚外血管的毛细血管。
30分钟内注入,荧光珠的形式分布于整个胚胎和胚外循环。图3一(补充视频S3A)显示了珠子胚外循环的血管在左边的p轴胚胎。板在图3 b显示的放大视图区域的兴趣图3一用小毛细血管。作为研究区域血流量的概念证明使用多维数据集,一个集群的珠子(环绕在白色,图3 b)跟踪通过30帧延时(4代表帧50、450、900、和1500 ms所示图3 b,补充视频S3B)。图3 c展示了代表初始和最终位置的荧光珠跟踪图3 b。流通中的平均速度的珠子被发现0.55±0.14 mm / s(值均值±SEM,n= 6珠子跟踪)。
图3。使用荧光珠注射研究血流动力学在胚胎正直的荧光体视镜上使用多维数据集。(一)从实时成像帧捕获E3野生鹌鹑胚胎的立方体。胚胎是microinjected小丸的荧光微球/珠子在外侧离开卵黄静脉,立方体覆盖着高透明膜和装在定制孵化器成像。图片所示使用奥林巴斯正直的人获得立体显微镜从胚胎的背方面在立方体50毫秒间隔。面板(一)展示了代表感兴趣的区域(ROI)用于焊缝跟踪分析。(B)捕获的帧从ROI(白色广场)(一)。包围珠穿过小毛细管和通过它的路径跟踪船。代表图像从四个时间框架50 ms, 450毫秒,900毫秒,1500毫秒的延时显示珠穿过容器(标记为1 - 4帧序列的顺序)。(C)第一帧和最后一帧所示(B)和用于跟踪微球的位移通过循环在伊万里瓷器(测量工具)。原视频文件可以被视为补充视频S3A(原始延时地区面板3所示)补充视频S3B(放大延时地区面板所示3 b)。
荧光微已经被其他组织使用的鹌鹑胚胎研究血流动力学、血液流速值由这些群体之间存在着显著的差异在不同胚胎胚外血管区域成像HH13 (0.3 2 mm / s)根据血管直径和接近主要血管(Ghaffari et al ., 2015)。这些研究使用一个精心设计的设置保持胚胎生长在培养皿中卵黄蛋白覆盖。egg-in-cube系统将使它更容易microinject,跟踪和量化珠子在流通使用的速度可能所有可能类型的成像模式。
成像心脏神经嵴细胞迁移使用Photoconversion Dendra2蛋白质在多维数据集使用转基因胚胎
心脏神经嵴细胞多能干细胞(CNC)引起咽弓动脉和心脏流出道(Le Lievre &勒Douarin, 1975;Kirby et al ., 1983)。它们源自背神经管地区耳泡和第三之间的体节HH11和横向迁移对胚胎的腹侧表面,直到HH17当他们开始出现在precardiac墙,限定地区咽ectomesenchyme和红衣主教前静脉(Kirby et al ., 1985;Hutson &科比,2007)。共焦成像的神经嵴细胞移植在蛋就完成了(Kulesa et al ., 2000;Kulesa &弗雷泽,2000)。这个蛋成像技术使很长一段时间的观察,保持胚胎的优势与其正确的方向和组织张力完好无损。
演示使用egg-in-cube系统成像在胚胎心脏神经嵴迁移在蛋黄,我们photoconverted Dendra2表达细胞之间的神经管的耳板和第三体节HH10 (Tg (hUbC: H2B-Cerulean-2A-Dendra2)]鹌鹑胚胎使用波长405纳米的激光安装在多维数据集。780年lsm直立共焦显微镜用于photoconvert和图像心脏神经嵴细胞的迁移。图片被收购前后photoconversion确认的程度Dendra2 photoconversion在该地区的利益。代表图像(图4一)显示photoconverted感兴趣的地区。Photoconverted心脏神经嵴细胞开始迁移的神经管和横向定位接近体节7 h到延时(图4 b),补充视频S4)。正交切片的可视化视图艾滋病在神经嵴迁移和计算距离由photoconverted数控神经管细胞两侧(S4A补充数据,B)。当我们量化photoconverted细胞的数量在t = 0 t = 7 h, h和细胞的数量增加了2.5折(334神经管细胞在t = 0 h, 890个细胞总数的神经管在t = 7 h +加工中心,补充图自己)。数量的增加代表着忠诚的传播photoconverted Dendra2荧光蛋白通过连续的细胞之间的细胞分裂神经管标记迁移加工中心的一个子集。egg-in-cube系统使我们能够形象心脏神经嵴细胞的迁移,它可能可以用于在活的有机体内操作的信号通路针对这种迁徙行为进一步了解这些细胞在胚胎发展的作用。
图4。心脏神经嵴细胞迁移photoconversion成像的HH10 (Tg (hUbC: H2B-Cerulean-2A-Dendra2)]胚胎使用egg-in-cube系统。(一)共焦图像的绿色Dendra2(称为Dendra2绿色),photoconverted红Dendra2形式,天蓝色的渠道在一个HH10 (Tg (hUbC: H2B-Cerulean-2A-Dendra2)] photoconversion之前和之后的胚胎(PC)。神经管细胞耳板和第三之间的体节Dendra2表达绿色photoconverted使用405 nm紫外线激光诱导激活红Dendra2(称为Dendra2吗红色的这里)表达式。Dendra2绿色荧光强度随其photoconversion红色形式而天蓝色通道的荧光强度保持不变。(B)共焦图像photoconverted红Dendra和天蓝色的通道在不同时间点取样的延时数据在0 h、3 h, h和7获得使用共焦显微镜正直的人。横向Photoconverted心脏神经嵴细胞迁移的神经管体节。最初的延时文件中可以看到补充视频S5。
成像早期胚盘细胞运动
我们也好奇胚胎如何开发收益如果我们翻egg-in-cube这细胞运动可以在倒置显微镜成像。在倒置的共焦显微镜,胚胎和透明膜之间的距离在缩小的一层薄薄的蛋白(∼100μm)在胚胎和膜表面。当我们在反向测试胚胎的生长数据集(n= 3胚胎在立方体)和48 h,孵化胚胎发展略慢(3 - 4 h比预期的阶段),可能由于一个不自然的蛋黄重量对发育中的胚胎(数据未显示)。然而,这些胚胎形态正常发展时期。相比之下,胚胎蛋孵化控制发育正常。
考虑我们的观察从上面的胚胎生长的实验中,我们证明了共焦成像方法的禽类胚胎发展的第一个24小时使用一个EGK-X (Tg (hUbC.membrane.EGFP))鹌鹑胚胎egg-in-cube系统。多维数据集的胚胎是倒,把舞台孵化器的蔡司LSM780反向共焦显微镜动态成像。胚胎细胞外侧的后边缘EGK-X开始走向中线发起polonaise-like运动外胚层在30分钟(图5,补充视频S5A)。这些运动产生的原条小三角结构在9 h (HH2)和伸长长度一半最终由12 h的延时(∼HH3 +)。在这些早期的事件中,胚盘扩大不仅在x - y维也拉长了Z维度在其自然月牙形曲率蛋黄,也变得明显(图5 b,补充视频S5B)。我们使用了正交截面视图在伊万里瓷器量化胚盘的长度和曲率的变化在第一∼10 h的发展。胚盘的变化从一个平面盘状形状的叶绿体会EGK-X: 3.3毫米长度弯曲结构的弧长6.5毫米在HH2 + (补充图S5A)。可以看到随着原肠胚形成的继续,未来的中胚层细胞产生的形式中胚层的翅膀从两侧延伸的原条(12.5 h HH3可见)。20 h (HH4),中胚层的翅膀已达到双方的前半胚新月的连胜达到完整。由22 h原结变得明显,条纹开始回归头褶皱开始出现的24小时(HH6)。胚胎变亮与发展由于细胞膜EGFP的积累。使用egg-in-cube系统,我们报告的第一个24小时的成像从EGK-X禽类胚胎发展。
图5。egg-in-cube系统使早期胚胎发育的动态成像。帧捕获来自生活的共焦显微镜成像EGK-X Tg (hUbC.membrane.EGFP)鹌鹑胚胎。5 x照片,×0.6光学变焦,最大强度的预测11光学切片(100µm)在10分钟的间隔从胚胎的背方面倒共焦显微镜。(一)帧显示在不同的时间点强调早期鸟类的关键特性发展发展的第一个24小时。(B)帧显示在不同的时间点突出的扩张胚盘在3 d后自然曲率蛋黄。延时图像获得使用禅宗2011(黑)软件,收购被暂时调整焦点和恢复几次。获得的图像转换为最大强度投影和缝合在一起时间的发展作为一个连续的延时。图片所示(B)被从第一个9.1 h 4 d的发展和作为一个正交切片视图使用伊万里瓷器。视频文件中可以看到补充视频S5A(5)和补充视频S5B(面板5 b)。
成像的迁移内胚层使用Dendra2 Photoconversion
图像的前迁移内胚层,我们使用阶段HH2 (10 h(孵化)的胚胎(Tg (hUbC: H2B-Cerulean-2A-Dendra2)]鹌鹑线和多个胚胎转移到方块。最亮的Cerulean-Dendra2荧光胚胎筛选,然后将选择的胚胎转移到舞台上的反向共焦显微镜。我们photoconverted细胞(鲨鱼肉et al ., 2019)在一个感兴趣的弧形区域(ROI)的假定的迁移内胚层阵线(图6)。随着时间的推移photoconverted细胞层随后跟踪。延时的分析显示,一群细胞迁移像一张集体分开这个photoconverted ROI(白色虚线选择,图6 b1 h-3 h,补充视频S6)和迁移前胚新月的胚胎。一个原位立即与探针杂交染色对ApoA1 mRNA延时后,让我们来验证的身份追踪细胞从photoconverted内胚层细胞区域(白色箭头,图6 c上面板,左右)。使用egg-in-cube系统随着photoconvertible (Tg (hUbC: H2B-Cerulean-2A-Dendra2)]鹌鹑胚胎,我们能够跟踪前内胚层细胞的迁移。
图6。Egg-in-cube系统使成像内胚层迁移。(一)面板显示感兴趣的假定的内胚层地区的前胚新月HH2 (Tg (hUbC: H2B-Cerulean-2A-Dendra2)]鹌鹑胚胎photoconversion之前和之后。使用405 nm紫外线激光photoconvert感兴趣的地区使用“地区”和“漂白”功能在禅宗黑色。原子核是由天蓝色荧光蛋白标记(青色)。Dendra2 Photoconverted细胞标记红色的荧光蛋白(红色)。规模:100µm。(B)细胞的迁移(红细胞、地区有限的白色虚线)photoconverted地区的兴趣显示在不同的时间点(见补充视频S6)。帧捕获来自生活共焦显微镜成像的背侧HH2 (Tg (hUbC: H2B-Cerulean-2A-Dendra2)]鹌鹑胚胎。图像最大强度投影×20瓦的图片(24片6µm)×0.6光学变焦获得每10分钟。规模:100µm。(C)最后一帧的延时(Dendra2红色的左面板上3 h)是Dendra2相比红色的通道(左下方面板)来演示下胚层的位置层(白色虚线区域有界的所有面板)之前和之后ApoA1 HCR染色。图像最大强度投影×20共焦Z栈(20片8毫米)包埋原位杂交为内胚层特定ApoA1(绿色)内染色HH2 (Tg (hUbC: H2B-Cerulean-2A-Dendra2)]。DAPI染色细胞核中显示为蓝色。规模:150µm。
电穿孔的鹌鹑神经管“三次”
演示可访问性的增加发展中胚胎在多维数据集,我们electroporate信使rna编码membrane-GFP成HH10-11 (Tg (PGK1: H2B-mCherry)]胚胎单方面到背神经管/ midbrain-hindbrain地区和形象产生的电穿孔2 h后的孵化37°C。图片中给出两个胚胎图7,前面板显示左侧中脑区域之一H2B-mCherry胚胎(红核)electroporated膜eGFP mRNA(绿色)和底部面板显示了一个地区尾从第二electroporated胚胎中脑(靠近后脑和耳板)。
图7。egg-in-cube系统使电穿孔的神经管荧光mRNA。图片在前面板显示代表的中脑区域(Tg (PGK1-H2B-mCherry))胚胎(红核)electroporated membrane-eGFP mRNA(绿色)和底部面板显示了一个地区尾中脑(靠近后脑和耳板)。这些图像显示一小部分H2B-mCherry colocalizing与膜eGFP表达细胞电穿孔。规模:70µm。
优化使用多维数据集的不同的显微镜
我们观察到快速横向运动导致胚胎泼在三次和蛋。这不是意外因为蛋黄周围是厚和薄液体蛋白层。胚胎位移会引起严重的图像配准问题,如果动作发生在延时成像可能防止细胞准确事后跟踪和分析。例如,机动阶段期间经常使用延时成像实验覆盖并收集大感兴趣的区域(ROI)与高空间分辨率。事实上我们发现在事后分析阶段运动在一些显微镜诱导胚胎位移,我们没有注意到的眼睛在实验。
阶段的速度在780年我们的蔡司LSM反向共焦显微镜在实验室里被认为是低于780年蔡司LSM直立版本在一个不同的位置。这阶段速度放缓有助于防止蛋黄的晃动在x - y方向,会导致瓷砖之间无缝缝合后延时图像已经被收购了。绕开这个问题在其他显微镜,我们提出了热稳定蛋黄固定方法。使用热烙铁,我们可以变性蛋黄接触的PDMS膜将其绑定到四方的多维数据集,使其更耐晃动速度更快的阶段。
另一个重要考虑成像模式的选择对于任何egg-in-cube实验胚胎的发育阶段。多维数据集的胚胎是更加稳定和耐蛋黄旋转在第一个24小时的发展,因此一个倒置的或直立显微镜可用于成像在这些阶段。随着胚胎生长在3 d和变得更重,蛋黄旋转成为一个重要因素,和一个正直的成像显微镜更适合成像后24 h(孵化。
众所周知,鸡蛋成分可以改变体重显著不同品种等因素,群年龄、紧张,甚至在群内品种(Friese 1923;Scott &沃伦,1941;杜尔曼&姚明,1960;弗莱彻et al ., 1981;侯赛因et al ., 1993)。这种可变性在蛋组件重量,特别是蛋黄的大小引起的胚胎与一个较小的蛋黄体积与一个或多个表面失去联系的多维数据集,当越来越多的胚胎到成像的多维数据集,使它容易晃动如上所述。为了解决这个问题,我们增加了消毒玻璃珠到多维数据集添加鸡蛋之后内容提高蛋黄和维持胚胎接近的成像表面立方体。另一种方法,可以应用于提高胚胎的高度,是添加∼1毫升的熔融之前bacto琼脂添加蛋黄。这bacto琼脂床上凝固,基本上暂时减少了立方体的高度,可用于较小的鸡蛋蛋黄大小。bacto-agar方法的另一个优点是减少可用的立方体的灵活性高度由用户根据需要。消毒珠子和bacto琼脂床,从赤道略平蛋黄,增加接触立方体表面,允许热固定小蛋黄在反向共焦成像的情况下提供更好的稳定性。
观察从Egg-In-Cube系统至关重要
我们已经设计了egg-in-cube系统允许胚胎发生动态成像在本土国家在蛋黄。这里所示的实验中,我们使用了鹌鹑egg-in-cube系统探讨不同发育事件发生在鸟类胚胎使用不同的成像平台。egg-in-cube系统提供方便地访问发展中胚胎进行各种实验,包括组织移植,显微镜下注射,病毒感染的早期胚胎,电穿孔的DNA / RNA或吗啉代胚胎,和设置动态成像在一个短的时间间隔。
我们第一次成像鹌鹑胚胎的发展从EGK-X直到孵化使用egg-in-cube系统11.25天,这对应于一个发展阶段的HH35 (∼E8)胚胎。这是第一次报告的前女友蛋文化系统能够形象的前8天鹌鹑胚胎的发展。几项研究在文献中报告的影响氧过多禽流感胚胎在不同级别的O2供应以上常氧条件(从25 - 100%2)(梅特卡夫股票和1984人;梅特卡夫et al ., 1981;希望和扬,1995;Lourens et al ., 2007)。的实验股票和梅特卡夫。(1984)描述了一个加速与小鸡胚胎孵化胚胎增长60%啊2而在空中控制孵化(20.9%啊2)。我们推断,我们也许能够减少胚胎发展的滞后,提高胚胎存活率观察egg-in-cube系统使用60% O2条件。卡普兰Meier的生存曲线分析表明,60%的胚胎孵化O2有更高的机会存活时间的平均存活时间14天。这个系统,在其目前的形式来看,可以达到50%的胚胎存活率高达14天的孵化的立方体开始从EGK-X(8/15的胚胎,图1 b)在60%啊2以最小的干扰系统文化时期。滞后的胚胎蛋控制增长相比,也减少了从∼3天(空气孵化,20.9%啊2,图1一个)∼24 h (60% O2,补充图S6A)。额外的描述与氧孵化的胚胎培养条件环境需要进一步减少胚胎发展滞后,使胚胎的孵化使用egg-in-cube系统。这个系统被证明是一个强大的工具来理解鸟类胚胎通过长期的发展文化和纵向成像。
我们证明egg-in-cube系统与一个定制的孵化器可用于胚胎培养和动态成像的荧光鹌鹑胚胎从产蛋阶段(EGK-X)。尽管修改交货蛋新文化已成功用于图像小鸡胚胎的发展从EGK-XII (2 h(孵化)(Voiculescu et al ., 2007),立方体系统可以研究细胞运动刚禽胚盘。多维数据集时,用于一个正直的影像学特征,我们可以概括正确的组织张力和机械力量,发生在胚胎在其发展的鸡蛋。
在最初几个小时的潜伏期,主内胚层来自上外胚层层polyingression的过程(Vakaet 1962,1970年)。这主要内胚层是由前迁移内胚层和anterio-laterally传播,引起发展中胚外(卵黄囊)内胚层(Eyal-Giladi Kochav, 1976;桑德斯et al ., 1978)。前女友的缺点之一蛋文化系统成像的发展下胚层是难以维持较低的层(内胚层)细胞的完整而隔离比HH2早在胚胎阶段。使用荧光转基因[Tg (hUbC: H2B-Cerulean-2A-Dendra2)]鹌鹑egg-in-cube系统,我们photoconvert和跟踪的前迁移假定的内胚层层。延时是立即紧随其后原位杂交染色对一个特定的内胚层标记ApoA1确认跟踪细胞的身份内胚层。egg-in-cube系统连同photoconvertible荧光转基因鹌鹑胚胎打开内胚层的途径来更好地理解过程polyingression和迁移动态生活胚胎。
随着下胚层的形成,原生殖细胞外胚层中指定层并进行分层,以满足前迁移内胚层和到达胚外太空HH4 (迅速,1914;Eyal-Giladi et al ., 1981)。原始生殖细胞的规范,只有在发展研究使用静态快照。egg-in-cube系统的联合力量和荧光转基因鹌鹑,它会更容易使用多光子显微镜图像不同的发育事件,这将是完成前蛋文化技术挑战性。
小鸡胚胎的蛋中蛋电穿孔技术开发作为基本方法引入质粒/病毒载体的收益或损失函数研究开发(Muramatsu表示et al ., 1997;Funahashi et al ., 1999)。在这项工作中,我们证明了电穿孔的鹌鹑神经管在体外转录membrane-GFP mRNA,后跟一个短2小时转染胚胎的胚胎孵化和成像。egg-in-cube系统也可以用于动态成像的荧光蛋白成熟和易位到目标细胞器电穿孔在活的有机体内。在我们先前的研究(Tran et al ., 2019),我们已经表明,当我们electroporate蛋HH5鹌鹑胚胎培养,信使rna编码荧光蛋白(FPs)表达在22分钟的电穿孔效率为75%比DNA编码的FPs (∼3 - 6 h后电穿孔效率为25%)。这“三次”电穿孔技术使它容易使转染细胞信使rna编码荧光蛋白的禽类胚胎,显性负表达结构和引入廉价的试剂,紧随其后的是“三次”文化。egg-in-cube系统将启用动态/静态转染胚胎的显微镜观察表型由扰动引起的。
前3天的孵化,禽类胚胎可以很容易地操纵的“窗口”为观察蛋壳re-incubated,直到所需的基础。这个属性的禽类胚胎的发展导致了几个经典的手术操作技术,跟踪由DiI注射细胞迁移(Kulesa &弗雷泽,2000),组织移植/烧蚀研究(Le Douarin 1973;戈尔茨坦,2006;Lwigale &施耐德,2008)研究形态发生和细胞命运。egg-in-cube系统使胚胎可以访问所有这些操作技术,使它对胚胎的影响的直接观察静态/动态成像。我们已经表明,多维数据集很容易适合手术工具的插入和操纵小鸡的血管和组织系统。我们也使用多维数据集作为一个平台来研究血管生成,诱导血管的小鸡凸轮(黄et al ., 2017)。这个系统也将使它方便研究脂质吸收/代谢的功能的引入通过蛋黄脂质荧光示踪剂或化学抑制剂注入多维数据集。为数不多的缺点这个文化系统的动态成像是不能直接访问的腹侧一边禽类胚胎仍在蛋黄的头几天的发展。
在这项研究中,我们已经演示了使用egg-in-cube平台的使用简单的手机摄像头,一个正直的荧光体视镜和正直的人/反向共焦显微镜成像鹌鹑胚胎发展。多维数据集也可能被用于任何其他成像平台/倒置的形式像显微镜的光表,与小阶段的修改。我们已经适应egg-in-cube系统发达的小鸡胚胎黄et al。(2015)这里的鹌鹑胚胎。立方体的概念可以很容易地扩展到其他鸟类物种为研究这些模型系统,可能使其有价值的其他卵生的模型系统。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到相应的作者。
道德声明
动物研究是由南加州大学机构进行审核和批准的动物保健和使用委员会(协议# 11944 - cr001)和洛杉矶儿童医院机构动物保健和使用委员会(协议# 351 - 16)。
作者的贡献
RL、TK和MD的构思和设计研究。医学博士收集的数据,进行统计分析,起草了手稿。JL参与了数据收集。SR动态提供了重要的输入和知识共焦成像的胚胎。y和科幻小说提供了重要的投入在实验设计和执行的研究。TK和RL参与数据收集和修改了手稿。所有作者批准了最终版本的手稿。
资金
这部分工作是支持萨班研究所校内培训奖:医学博士,九州理工学院海外研究支持项目奖和jsp KAKENHI (18 h01395 21 h01277) TK。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
确认
我们感谢大卫鲨鱼肉对他有用的洞察这个工作。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2022.893736/full补充材料
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关键词:禽类胚胎培养,胚胎发展,egg-in-cube成像,长期的文化,鹌鹑(Coturnix粳稻)
引用:戴夫,莱文J,鲁芬西南,佐藤Y,弗雷泽年代,Lansford R和T(2022)小说Egg-In-Cube Kawahara系统能够长期文化和早期胚胎发育的动态成像。前面。杂志。13:893736。doi: 10.3389 / fphys.2022.893736
收到:2022年3月10日;接受:2022年4月25日;
发表:2022年5月12日。
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