褪黑激素整合多维Na的监管⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶ionocytes和促进压力和缓解低氧诱导反应吸气式的鱼:教训综合方法

1介绍

作为一个强有力的监管机构的生理和季节性节律,松果体的神经激素褪黑激素参与几个在脊椎动物包括鱼类生理活动(Velarde et al ., 2010;埃斯特万et al ., 2013;慕克吉et al ., 2014;慕克吉Maitra, 2015;妈妈̃oz-Perez et al ., 2016;Sanchez-Vazquez et al ., 2019)。这个多功能激素控制的规定ionosmotic在鱼类体内平衡(Kulczykowska 2002;Kulczykowska et al ., 2006;猎鹰et al ., 2007;Sangiao-Alvarellos et al ., 2007;Ngasainao Lukram, 2016)。例如,褪黑激素是影响水和矿物质平衡哺乳动物(津田et al ., 1995;画et al ., 2001;SajeebKhan和彼得,2015年)、鸟类(Ching et al ., 1999)和两栖动物(赖特et al ., 1997)。褪黑素受体的广泛分布在淡水与海水鱼类的渗透调节的组织表明,这些组织的网站可能是褪黑激素行动(Kulczykowska 2002;Kulczykowska et al ., 2006)。此外,有研究报道,盐度可以修改鱼类肠道的褪黑素含量和鳃以及其在等离子体的水平(Lopez-Olmeda et al ., 2009),指向extra-pineal来源褪黑激素的作用在鱼体内平衡。作为进化保守褪黑激素的产生过程中起着重要作用动物对环境的适应性行为,是调节斑马鱼的日常和年度生理节奏和增长(Lima-Cabello 2014)。尽管报告演示一个动作的褪黑激素鱼(Kulczykowska et al ., 2006;Sangiao-Alvarellos et al ., 2007;埃斯特万et al ., 2013;笨蛋et al ., 2021Na),一个综合作用的褪黑激素⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶(NKA)监管ionocytes特别是在低氧诱导应力还不知道尤其是吸气式的鱼。

离子运输活动的集成的ionocytes渗透调节的鳃上皮细胞,肾和肠道是至关重要的维持osmointegration和系统性离子稳态(埃文斯et al ., 2005;彼得,2011在硬骨鱼类)。鳃ionocytes,俗称氯细胞或细胞线粒体丰富,鳃上皮细胞的有效组成部分,作为水和离子交换的主要网站在硬骨鱼(埃文斯et al ., 2005)包括斑马鱼(Guh和黄,2017)和吸气式的鱼(Rejitha et al ., 2009;彼得et al ., 2011)。同样,肾ionocytes位于近端、远端和收集肾小管和肠ionocytes在肠道上皮细胞也同样参与系统性Na的规定⁺体内平衡(彼得et al ., 2022)。这些ionocytes渗透调节的上皮细胞具有跨膜离子转运体NKA驱动电化学Na⁺梯度和膜电位的细胞,导致细胞的渗透调节卷(Mobasheri et al ., 2000)和离子稳态(麦考密克2001;彼得和Gayathry, 2021年)。此外,许多辅助运输系统主要定位在顶端和基底膜的渗透调节的上皮细胞由NKA控制(Skou Esmann, 1992;Tipsmark et al ., 2011)。

从结构上看,NKA包含三个子单元α,β和γ(FXYD蛋白质)α和β是必要的二聚形成的离子注入和功能性NKA,而第三单元调节泵功能(卡普兰,2002;约根森et al ., 2003;Garty Karlish, 2006)。催化α-subunit是一个大型110 kDa的蛋白质,含有离子结合位点,ATP和乌本苷phosphoryation网站(Skou Esmann, 1992;Therien Blostein, 2000;劳尔森et al ., 2013),β-subunit与α-subunit交互,并参与调节ion-binding酶的亲和力复杂(布兰科,美世1998)。四个α-subunits(α1、α2α3和α4)和三个β-subunits(β1,β2和β3)已确定在脊椎动物不同组织分布(布兰科,美世1998;Lingrel 2010)。大量研究已经证明了在硬骨鱼这些亚型的存在;特别是催化α-subunit (Tipsmark et al ., 2011;Urbina et al ., 2013;Ching et al ., 2015;杨et al ., 2016)和α-subunit在渗透调节的重要性研究(Blondaeu-Bidet et al ., 2016)。在鱼类中,只有三个亚型(α1α2和α3)已确定,其中α1尤为重要的渗透调节由于其高表达在渗透调节的组织(Tipsmark et al ., 2011;Ip et al ., 2012;Urbina et al ., 2013;Armesto et al ., 2014;穆斯林et al ., 2015)。另外,Ip和同事(2012)报告的存在nkaα1子亚型viz. nkaα1a, nkaα1b和nkaα1c鳃的爬上攀鲈testudineus。几项研究已经证明,NKA的短期调节活动发生直接影响酶的动力学行为通过的磷酸化和去磷酸化过程催化单元(麦克唐纳和法利,1993年;Chibalin et al ., 1998;1999年)。

在鱼类中,感应压力的唤起一组应激反应,包括渗透和离子传输干扰(Wendelaar Bonga 1997;彼得,彼得,2011)。吸气式的鱼攀鲈testudineus继电器在许多离子转运蛋白维持离子和渗透压平衡(彼得,彼得,2011)。大量研究表明,当保持在水浸30分钟这条鱼进行了缺氧与修改后的监管动态NKA在转录组水平明显改变的mRNA的表达模式nkaα1子亚型等nkaα1a, nkaα1b和nkaα1c在渗透调节的组织(思米et al ., 2017;彼得和Gayathry, 2021年)。记录,对接触压力、鱼开发周期的适应性反应,产生压力和缓解响应(彼得,2013;彼得et al ., 2022)。与经典的生理机制,包括一个扰动干扰离子稳态,鱼类唤起应激反应和应激激素的释放,如肾上腺素和皮质醇(Wendelaar Bonga 1997)。另外,鱼类也开发机制,改善应激反应的大小通过唤起恢复或缓解响应为了恢复基底稳态状态借助神经内分泌/ cytogenic褪黑素和一氧化氮信号(彼得,2013;彼得和Gayathry, 2021年;彼得et al ., 2022)。同样,有益作用的褪黑激素降低应激反应的大小提出了在许多鱼(Sanchez-Vazquez et al ., 2019;杨et al ., 2021 a;Kruk et al ., 2021)。此外,抗应激和抗抑郁作用的褪黑激素已报告在高等脊椎动物(Konakchieva et al ., 1997;帕雷德斯et al ., 2007;Detanico et al ., 2009;SajeebKhan和彼得,2015年)和褪黑素显示anti-hypoxic能力在中华绒蝥蟹(杨et al ., 2021 b)。抗应激作用的褪黑激素皮质醇功能也被报道在鱼(埃雷罗et al ., 2007;Azpeleta et al ., 2010;Lopez-Patino et al ., 2013;2014年)包括斑马鱼(笨蛋et al ., 2021;Zhang et al ., 2021)。它的许多行之有效的生理效应介导的通过高亲和性细胞膜受体属于G-protein-coupled受体的总科。膜像MT1褪黑激素受体(MTNR1A),是(MTNR1B) heterotrimeric G-protein-coupled受体相互作用等下游使者腺苷酸环化酶,磷脂酶A2和磷脂酶C (大学运动员et al ., 2016)。MT1和是受体存在于几乎所有的外围组织,以及在中枢神经系统和他们可能与核受体类维生素a孤儿受体和Z类维生素a受体(大学运动员et al ., 2016)。

在离子对褪黑激素的作用在鱼类体内平衡,我们假设褪黑素可能调节NKA功能主要ionocytes鱼和集成功能主要ionocytes恢复干扰系统性Na⁺内稳态的缺氧的压力。为此,我们测试的监管和综合行为有褪黑激素在ionocytes NKA函数和hypoxia-stressed吸气式的鱼(攀鲈testudineus布洛赫)描绘在Na褪黑激素的综合作用⁺体内平衡和确定如何褪黑素调节压力和缓解响应在这条鱼。我们确定我们模型的工作通过测量等离子体中褪黑激素浓度和记录大量的mtnr1亚型。我们分析转录、翻译和翻译后规定NKA函数和评估的动态NKA-immunoreactivity褪黑激素治疗后ionocytes有和immersion-stressed鱼。进一步,我们提出了一个综合抛物线模型评估的优先行动ionocytes褪黑素,确定ionocyte的领导角色驱动的最大分子调控机制NKA函数导致复苏或缓解hypoxia-stressed响应对褪黑素可用性鱼类。

2材料和方法

2.1鱼控股条件

成人健康的两性爬上(攀鲈testudineus布洛赫),属于鲈形目和家庭攀鲈科,重约35 - 45 g收集从附近的水体和饲养大型水泥坦克。他们适应实验室条件下2个月用淡水水泥坦克保持在28±1°C下自然的光周期(12 l / 12 d)。鱼与商业鱼饲料喂食每天体重(1%),pre-spawning时期(3)。在实验之前,他们一直在50 L玻璃水族馆(60×30×30厘米)在静态条件3周和食物被撤回的采样前24小时,以确保最佳的实验条件。部门的规定动物伦理(DZ / 10442/14)而饲养和实验完成了鱼。

2.2实验设计

两组实验进行。的dose-responsive在活的有机体内褪黑素的作用是进行第一次实验。32 laboratory-acclimated鱼分成四个每组八鱼。第一条鱼组收到注入.65%生理盐水腹腔内担任虚假的控制。其余三组的鱼保持30分钟后管理的不同剂量的褪黑激素(12.5、25、50 g ng⁻¹)。

在第二组实验中,laboratory-acclimated鱼被分成4组12每关在玻璃坦克一式三份(n = 144)。我们选择50 g ng⁻¹褪黑素是最有效的在活的有机体内剂由于其能力引起离子转运体的变化ionocytes鱼的组织和甲状腺激素和皮质醇的水平在我们的实验中(数据没有提交)。第一和第二组鱼鱼有鱼批和第三和第四组immersion-stressed鱼。鱼在第一组注射生理盐水(后保持了30分钟。65%生理盐水),他们担任有虚假的控制鱼。褪黑激素(50 g ng⁻¹)为30分钟第二鱼组管理。第三和第四鱼团体举行下钢丝网一直在表面的水无法吞空气30分钟。盐水注射给这些强调第三组的鱼stressed-sham控制和保持30分钟。褪黑激素(50 g ng⁻¹鱼)是给第四集团也给浸压力。所有的鱼都以同样的方式处理规范化注入和抽样是并发执行的影响。没有观察到任何鱼死亡组在实验。

2.3抽样和组织准备

鱼在每组同时网状和麻醉物质二苯氧乙醇溶液(SRL、孟买)在这两个实验。从尾动脉血液样本收集使用肝素化注射器和收集血液在冰上举行,分析动脉血液离子。每个鱼然后牺牲了脊髓横断和组织抽样是很快完成的。我们切除第二鳃弓,代表一个典型的长一双hemibranch发达ionocytes,树干肾脏保存更多的渗透调节的功能和肠略低于前地区的十二指肠,肠上皮细胞渗透调节的功能(Abaurrea-Equisoain Ostos-Garrido, 1996)。NKA的分析活动,组织存储在SEI (Sucrose-EDTA-Imidazole)缓冲区(。05 M: pH值7.1)。组织样本从每组的六个鱼也保存在孵化缓冲区(50 mM咪唑、25%甘油.25%脱氧胆酸盐,10毫米β-mercaptoethanol和Na。1毫米₂EDTA) phosphorylation-dephosphorylation研究。组织样本来自另一个4个鱼放在里帕缓冲区(50毫米三。2 M氯化钠和物质Triton x - 100, pH值7.4)为西方墨点法和RNA后立即解决方案(Ambion英杰公司)qRT PCR和保持在-80°C到分析。免疫组织化学分析,两条鱼从每组与4%多聚甲醛灌注。1 M磷酸盐缓冲剂(pH值7.2)15分钟,然后第二鳃弓,树干肾脏和一夜之间,前肠被固定在同一媒体在4°C。固定组织然后冲洗。1 M磷酸盐缓冲剂和放置在25%蔗糖在一夜之间在4°C和后存储在组织tek(徕卡生物系统公司、英国)在-80°C。

2.3.1 NKA-specific活动的量化和血液离子

在吉尔的ouabain-sensitive NKA-specific活动、肾脏和肠道匀浆是量化采用的方法彼得et al。(2000)修改为微型板块试验(彼得et al ., 2011)。皂苷(。2毫克的蛋白质⁻¹)经常添加到优化基质的可访问性。样本重复包含(1.0µg蛋白质)被添加到一个包含100毫米96孔酶标氯化钠,30毫米咪唑(pH值7.4),MgCl EDTA。1毫米和5毫米₂13毫米氯化钾作为发起人和.14点毫米乌本苷作为抑制剂。涡流后,测定混合是在37°C的环境,持续15分钟。。3毫米的反应是由增加ATP和终止与添加8.6%柠檬酸。解放了磷酸无机磷酸盐是衡量标准在700 nm协同HT Biotek微型板块读者。吸收促进剂和抑制剂之间的变化分析和回归分析用于计算得出的活动速度NKA和表达µmolesπ解放人力资源⁻¹毫克的蛋白质⁻¹。我们也量化的总离子等(Na⁺][K⁺][Cl⁻]和[Ca^{2 +}从每个鱼)水平在动脉血液收集所有组使用气体离子分析仪(辐射计,ABL80 FLEX,德国)。

2.3.2等离子褪黑激素

褪黑激素浓度基于竞争immunoenzymatic血浆样本量化分析工具(Immunotag,美国)验证爬上。简而言之,褪黑激素抗体预涂井处理50µL生物素化的抗体分别包含标准和20µL样本。后加10µL anti-MT抗体样本井,50µL strepatavidin-HRP是补充道。微型板块被漩涡和孵化60分钟37°C。洗后,50µL衬底溶液A和B被添加和孵化37°C在黑暗中10分钟。吸光度是阅读在450海里后停止反应1 n盐酸。回归分析是对吸光度值和激素水平在L pg表示⁻¹。intra-assay的变异系数为6.2%,inter-assay变异系数为7.3%

2.3.3成绩单的表达mtnr1和nkaα1亚型的存在

总RNA分离鳃、肾和前肠组织和纯化使用纯链接RNA迷你包(Ambion,表达载体,生活技术)。RNA纯度验证了光密度(OD)吸收比率(OD 260/280 nm)使用光度适应计(埃普多夫,光度适应计+)和琼脂糖凝胶电泳的完整性检查。样品显示的比例在1.8和2.0之间是互补脱氧核糖核酸的合成。1µg总RNA的互补脱氧核糖核酸合成期实时qPCR系统使用高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司,生活技术)后,制造商的协议。热循环条件如下:25°C 1分钟,120分钟37°C, 85°C 5分钟和最后4°C阶段。互补脱氧核糖核酸序列NKAα-isoforms和褪黑素受体;nkaa1a(JN180940),nkaa1b(JN180941),nkaa1c(JN180942),mtnr1a(xm - 026360941.1),mtnr1b(XM_026357982.1),mtnr1bb(XM_026372231.1)和mtnr1bb (x1x2)(XM_026375344.1)取自Gen-Bank (表1)。引物对nkaα1使用底漆表达基因设计软件(2.0.0版本;应用生物系统公司)和褪黑激素受体的设计使用选择底漆NCBI的工具(表1)。

测定混合的nkaα1子单元包含定制的引物与家人贴上MGB探针(应用生物系统公司,生活技术)。执行中存在的重复使用实时StepOne qPCR系统(应用生物系统公司)使用Taqman化验(应用生物系统公司,生活技术)。2 x的反应包含5µL Taqman普遍掌握混合,5µL 20 x定制引物(表1ng)和互补(1)或标准(1µL)总量的10µL。循环条件保持50°C 2分钟和95°C 10分钟为一个周期后40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。开发真核18 s rRNA(产品目录号:4319413 e)与维克™/ MGB探针,底漆有限公司(加入X03,105.1数量,扩增子大小:187;扩增效率:99.66%)被用来作为内生控制(应用生物系统公司)。数据收集(阈值周期(Ct)值)在实时。

的测定混合mtnr1亚型包含5µL 2 x标准SYBR绿色主人混合,500海里的正向或反向引物(表1)、互补脱氧核糖核酸(1 ng)或标准(2µL)总量的10µL。循环条件50°C 2分钟和10分钟95°C(1周期),紧随其后的是40 95°C的周期为60年代15秒和60°C。数据收集(阈值周期(CT)值)在每一个伸长的一步。运行是紧随其后的是融化曲线分析95°C的15秒,60°C为60和95°C 1 s确认的存在只有一个产品。β-actin GAPDH和作为内生控制(欧陆坊科学,德国)。数据收集(阈值周期(Ct)值)在实时。Ct、边坡、PCR效率y拦截和相关系数(R²)计算使用的默认设置QuantStudio-3(应用生物系统公司)。的扩增效率nkaα1单元和mtnr 95% - -100%之间,信使rna转录丰度计算采用2^−ΔΔCt比较阈值周期(Ct)方法(ΔCt =ΔCt sample-ΔCt控制;Livak Schmittgen, 2001)。结果统计分析软件工具使用相对表达2009 (REST)和值是表示相对于控制。

2.3.4 NKAα蛋白质丰富的免疫印迹

NKAα蛋白质丰度在鳃、肾和肠道组织量化采用前所述协议为西方墨点法(麦考密克et al ., 2009)做了一些调整。短暂、组织均质五卷里帕缓冲区(50毫米三。2 M氯化钠和物质Triton x - 100;包含50 mMβ-glycerophosphate pH值7.4),. 05 mM氟化钠,钠orthovandate 1毫米,. 05毫米DL-dithiothreitol和.5%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ,美国)。组织匀浆都是离心机在5000 g×10分钟在4°C (5430 r,埃普多夫,德国)和鳃的上层清液再次离心机在20000 g×10分钟并存储在-80°C。蛋白质浓度测定用布拉德福德的方法。样本解冻,然后用螺栓混合摩门教的样品缓冲(4 x)和螺栓还原剂(10 x) (Novex,美国),和在70°C加热10分钟。NKA蛋白质丰度量化在鳃(80µg)、肾(40µg)和肠(40µg)匀浆使用10% SDS-polyacrylamide凝胶电泳(李et al ., 1998)。Pre-stained蛋白质标记(蓝色Plus2 Pre-stained蛋白质标准,Novex,美国)也加载车道作为一个参考。电泳(Bio-Rad,美国;分离胶80 v和90 v叠加凝胶),被转移到蛋白质硝化纤维膜使用iBlot两个印迹干燥系统(生活技术,美国)。确认印迹效率,我们玷污了硝化纤维膜与朱红色年代的解决方案(P3504 Sigma-Aldrich,美国)。硝化纤维膜被堵在磷酸缓冲盐,PBS pH值7.4(137毫米氯化钠,氯化钾3毫米,10毫米Na₂HPO₄KH和2毫米₂阿宝₄孟买)5% BSA (SRL)一夜之间在4°C。阻塞后,膜与PBST冲洗(包含价格下跌0渐变20 PBS,洗涤剂)然后孵化anti-NKAα亚基(1:50 0;NKAα(h - 300): sc - 28800,圣克鲁斯生物技术,美国加利福尼亚州)和anti-β-actin (1:1000;A1978 Sigma-Aldrich、美国)。所有主要抗体在PBS稀释和孵化1 h在室温下。在PBST冲洗后,屁股暴露在山羊anti-rabbit免疫球蛋白(1:5,000;山羊anti-rabbit IgG-HRP: sc - 2004,圣克鲁斯生物技术,美国加利福尼亚州)和山羊anti-mouse免疫球蛋白(1:20 00;猫。没有:1030 - 05年,Sourthern生物技术、伯明翰、美国)结合辣根过氧化物酶,在PBS稀释,孵化1 h在室温下在黑暗。在PBST冲洗后,墨迹孵化了1:1的混合增强化学发光底物A和B (Novex表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)和免疫反应性的乐队被发现使用Chemidoc (Gelstan,钦奈)。 The band staining intensity was measured using ImageJ (Fiji, NIH, United States) and the relative immunoreactivity to the β-actin protein expression was gratified. Data were obtained from four fish in each group.

2.3.5 NKA的磷酸化和去磷酸化状态

NKA-rich磷酸化/脱磷酸化状态的组织样本从鳃、肾和肠道爬鲈鱼的化验的方法Ramanan和层(2006)。冷冻组织样本均质(1:2 w / v)的均质化咪唑缓冲区包含25毫米,pH值8.0,10% v: v甘油,100毫米蔗糖,10毫米β-mercaptoethanol,价格下跌0 (w: v)钠脱氧胆酸盐(DOC), 2毫米EDTA, 2毫米EGTA, 25毫米氟化钠和氟化phenylmethylsulfonyl (PMSF)(添加在均化)。均质样品在10000×g在寒冷的离心机离心(5430 r,埃普多夫)10分钟4°C和收集上层清液脱盐去除内源性磷酸离子和自由使用交联葡聚糖G25列(PD Minitrap G-25,通用电气医疗集团,联合王国)。提取的蛋白质含量测定用布拉德福德反应和样本存储在-20°C到分析。

样本提取混合有两卷的孵化缓冲区(50 mM咪唑、25%甘油.25% (w / v)医生,10毫米β-mercaptoethanol和EDTA。1毫米)和内源性蛋白激酶活动刺激的10毫米Na₂MgCl ATP, 30毫米氟化钠,50毫米₂,1)1毫米营地刺激蛋白激酶A (PKA), 2) 1毫米cGMP刺激蛋白激酶G (PKG)或3)1.3毫米CaCl₂和7μg毫升⁻¹十四烷酸佛波醇酯刺激蛋白激酶C (PKC)。完整的去磷酸化的蛋白质,1 IU小牛肠碱性磷酸酶是孵化与样本提取包含50 mM MgCl孵化缓冲区₂和1.3毫米CaCl₂。控制孵化项目运行这些和只包含孵化缓冲检查系统的灵敏度。孵化后,NKA比活度测量在所有样本使用ouabain-sensitive方法(彼得et al ., 2000)如前所述。

2.3.6 NKA的免疫组织化学定位α丰富ionocytes

Cryosections 10µm由鳃,树干肾脏和前肠使用低温恒温器(徕卡厘米1850)设定在-21°C。伤口是主要的鳃丝的长轴平行,但在肾脏和肠道,部分是由横向。部分被从所有的鱼组,然后放在poly-L-lysine-coated幻灯片(Sigma-Aldrich,美国),干一夜之间在室温和放入密闭容器中储存在-80°C。部分被冲洗。1 M PBS (pH值7.2),然后添加了卫PBS (。特里同x - 100)的25%。内源性过氧化物酶活性被3%的H₂O₂在PBS和保存在室温下40分钟。孵化与10%的部分正常山羊血清(GeNei,班加罗尔)在PBS 1 h在潮湿的房间以减少非特异性免疫染色。部分被暴露于anti-NKAα亚基(NKAα(h - 300): sc - 28800,圣克鲁斯生物技术,加利福尼亚,美国)摘要稀释PBS和孵化一夜之间在4°C。三全音PBS的部分被冲洗三次,然后暴露于HRP-conjugated anti-rabbit二级抗体(山羊anti-rabbit IgG-HRP: sc - 2004,圣克鲁斯生物技术,加利福尼亚,美国)在1:1000稀释1 h在室温下。的特异性免疫反应性确认通过运行负控制以及每个部分的孵化与主要抗体是省略。孵化后,幻灯片和三全音PBS冲洗三次,样本沾.06% 3,3 ' Diaminobenzidine(轻拍;σ,美国在. 01)M Tris-HCl (pH值7.6)含3% H₂O₂为2分钟。所有的部分都与苏木精复染色,脱水和安装联苯乙烯增塑剂二甲苯(DPX)。邻近肾脏部分受到周期性acid-Schiff (PAS)染色和苏木精复染色鉴定的近端、远端和收集小管。相邻的鳃和肠也沾haematoxylin-eosin形态识别。安装部分被认为与数码相机连接到荧光显微镜(德国徕卡DM 100年)。显微照片被随机×100放大鳃、肾和×40放大了肠。代表显微照片拍摄从每一组至少有四个组织样本收集的鱼。

2.3.7 Immunofluorescence-based NKA的本地化α丰富ionocytes

低温恒温器部分存储在-80°C被带到室温和冲洗了。1 M PBS (pH值7.2),然后用1% SDS孵化(美国猫# 1610301,Bio-Rad)抗原检索4分钟(布朗et al ., 1996)。孵化后,部分被用PBS。1米洗净,然后用PBST (。25% Triton X-100) for 10 min. The sections were then incubated with 10% antibody dilution buffer (ADB) containing 10% normal goat serum (GeNei, Banglore), 3% bovine serum albumin (SRL, Mumbai) and .05% Triton X-100 for 30 min. Due to the discontinuation of SC-28800, we purchased mouse monoclonal NKAα1 subunit (a6F) from Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa city, United States diluted 1:10 in ADB and was applied to sections and kept at 4°C overnight in humid chamber. The sections were rinsed three times with PBST and then exposed to Alexa-Fluor 488 labeled goat polyclonal anti-mouse secondary antibody (1:200 dilution, Cat# Ab150113, Abcam, United States) for 2 h at room temperature. The sections were then rinsed with PBS three times for 15 min and incubated with 1 µM 4’, 6-diamidino -2- phenylindole, dihydrochloride (DAPI, Cat# D9542, Sigma-Aldrich, United States) for 1 min and later rinsed in PBS. Sections were mounted on Fluoromount Aqueous mounting medium (Cat# F4680, Sigma-Aldrich, United States). The specificity of the immunoreaction was confirmed by running a negative control along with each assay in which the incubation with primary antibody was omitted. Representative fluorescence images were captured (n = 4) using a Confocal Laser Scanning Microscope (Leica TCS SP8, Leica Microsystems, Germany) with a Leica Application Suite X (LAS X) software. The staining intensity (mean grayscale/pixel) of immunoreactive cells from each group was measured using ImageJ (National Institute of Health, United States). A single threshold level for each image was used to quantify immunoreactive regions. Background staining intensity value of negative control was subtracted from each staining intensity value and the difference between groups evaluated statistically and considered the control as 100%.

2.3.8综合抛物线模型评估微分复苏ionocytes hypoxia-stressed鱼褪黑激素的反应

开发一个综合抛物线模型代表综合的褪黑素和优惠措施NKA-driven复苏响应ionocytes测试在测试中存在的物种。这个模型使用测试变量的响应模式NKA监管在鳃、肾和肠道爬上有下,immersion-stressed immersion-stressed +褪黑激素治疗。首先,我们说明NKA-driven复苏外源性褪黑激素反应的示意图。典型的应力响应曲线第一次生成显示测试变量在鱼组织如何应对压力浸泡30分钟,相比有鱼。这些都是标注在X设在。外源性褪黑激素给immersion-stressed鱼时,一个典型的恢复曲线抛物线的形式获得,代表了一种典型的经济复苏的反应。随后,不同恢复模式响应曲线为每个测试参数,得到不同于典型的抛物线melatonin-induced复苏的反应。利用多2018年起源y轴图软件(起源实验室,美国),我们绘制变化产生的量化级NKA等功能NKA特定活动,同种型nkaα1a,nkaα1b和nkaα1c信使rna表达,NKAα蛋白质丰度和免疫荧光染色强度。综合的抛物线模型,生成后续测量抛物线因此复苏的评估提供了一种定性模型的反应渗透调节的上皮细胞在强调鱼褪黑激素。

2.4统计分析

数据收集从每组实验鱼包括NKA-specific化验分析和磷酸化/脱磷酸作用分析。正态分布和方差的同质性之前检查数据统计分析。单向方差分析(方差分析)其次是SNK比较测试被用于寻找治疗之间的意义。每个值被表示为±SEM。有意义之间的控制与melatonin-treated鱼或浸强调鱼(“*”),强调与强调+ melatonin-treated鱼(“#”)和有控制和强调melatonin-treated鱼(‘@’)的帮助下进行了分析Graphpad软件(Graphpad Instat-3,圣地亚哥)和水平的意义被接受(p< . 05)和图表绘制使用Sigmaplot 11.0。相对的mRNA表达亚型于2009年统计分析软件工具使用相对表达式(REST)和鱼之间的显著差异组记录描述意义后p< . 05。

3的结果

3.1有褪黑激素治疗对血浆中褪黑激素浓度的影响和hypoxia-stressed鱼

等离子体褪黑激素浓度显著增加(p<措施)在低和高剂量的褪黑激素治疗(图1一个)。同样,褪黑激素含量显著升高血浆浓度(p< . 01)褪黑激素治疗后发生在有和hypoxia-stressed鱼(图1 b)。有趣的是,等离子体褪黑激素浓度显著增加迫使浸30分钟后(图1 b在这些鱼)显示一个巨大的血氧不足早些时候报道(彼得和Gayathry, 2021)。

3.2 Dose-responsive在活的有机体内褪黑激素的作用在NKA活动ionocyte上皮细胞和血液离子有鱼

短期政府褪黑激素的剂量(12.5、25、50 g ng⁻¹)显著增加ouabain-sensitive NKA-specific活动相比,爬上控制鱼的鳃上皮细胞(图2一个)。相反,低剂量的褪黑激素治疗显著降低肾脏NKA活动(图2一个ng),而50 g⁻¹褪黑激素增加了肾脏NKA活动(图2一个)。然而,褪黑激素治疗没有产生任何修改在肠NKA活动(图2一个)。我们选择50 g ng⁻¹褪黑激素剂量为我们进一步的研究来测试其行动hypoxia-stressed鱼,剂量显示实质性响应的测试变量。总离子含量的分析影响褪黑素细胞和细胞龛之间血液显示剂量反应关系治疗有鱼(表2)。显著下降(K⁺]和[Cl⁻和增加细胞和细胞龛之间显著的剂量反应关系(nCa)内容^{2 +})内容被发现褪黑激素治疗后(表2)。

3.3褪黑激素行动NKA活动和血液离子hypoxia-stressed鱼

melatonin-treated鱼的鳃NKA活动显著增加在有鱼(图2 b)。但褪黑激素治疗有利于减少immersion-stressed鱼的鳃NKA活动显示活动拒绝NKA缺氧条件(图2 b)。同样,肾脏NKA-specific活动显示,有鱼褪黑激素治疗后显著上升,而褪黑激素青睐拒绝活动immersion-stressed鱼也显示拒绝NKA活动在缺氧状态下(图2 c)。相比之下,褪黑激素和缺氧产生任何修改在肠道NKA活动(图2 d)。此外,肠道NKA活动在immersion-stressed鱼(褪黑激素治疗后仍不受影响图2 d)。

褪黑激素治疗产生下降[K⁺]内容有鱼的血但不是[Na⁺)内容(表3)。显著降低(Na⁺]和[K⁺内容被发现在immersion-stressed鱼(表3)。有趣的是,褪黑激素治疗可以恢复的损失(Na⁺]和[K⁺)内容immersion-stressed鱼(表3)。然而,(nCa显著上升^{2 +}]褪黑激素治疗后发生水平强调鱼,而有控制鱼(表3)。

3.4褪黑激素行动mRNA的表达nkaα1亚型有和hypoxia-stressed鱼

微分和空间的监管nkaα1a, nkaα1b和nkaα1c同种型表达式被发现在吉尔褪黑素治疗后,肾脏和肠道上皮细胞有鱼。mRNA的表达nkaα1a同种型显示upregulation褪黑激素治疗后在有鱼的鳃、肾(图3 a, D)。在高对比度,同种型的表达下调后,这些组织melatonin-treatment强调鱼(图3 a, D)。的差别是对这些nkaα1b同种型褪黑激素治疗后被发现在鳃、肠而不是肾脏有鱼(图3 b、E、H)。相反,褪黑激素调节的治疗nkaα1b同种型表达式的所有组织强调鱼(图3 b、E、H)。有趣的是,nkaα1a, nkaα1b和nkaα1c亚型表达下调褪黑激素治疗后肠中有鱼,但它显示了upregulation褪黑激素治疗后在浸强调鱼(图3胃肠道)。mRNA的表达nkaα1c同种型肾的褪黑激素治疗后差别显示对这些有鱼(图3 f)。在高对比度,同种型的表达调节在这个组织在强调melatonin-treatment后鱼(图3 f)。的nkaα1c同种型调节在有褪黑激素治疗后鳃鱼,但它褪黑激素治疗后在浸强调差别显示对这些鱼(图3 c)。

3.5褪黑素mRNA表达行动有褪黑激素受体和hypoxia-stressed鱼

mRNA的表达mtnr1a和mtnr1bb在腮褪黑激素治疗后显著下调hypoxia-stressed鱼,但它显示了upregulation肠(图4)。mRNA的表达mtnr1a和mtnr1bb褪黑激素治疗后显著调节肾脏有和hypoxia-stressed鱼(图4)。褪黑激素治疗明显不受监管mtnr1b信使rna表达的肠有和hypoxia-stressed鱼(图4)。但是,褪黑激素治疗的mRNA表达显著下调mtnr1bb在有鱼的鳃变体,但显著调节其表达hypoxia-stressed鱼(图4)。mRNA的表达mtnr1bb变异显著dowregulated褪黑激素治疗后的肾脏hypoxia-stressed鱼(图4)。

3.6褪黑激素行动NKAα-subunit蛋白质丰度在有和hypoxia-stressed鱼

我们量化NKAα渗透调节的蛋白密度有栖息的上皮细胞和压力条件,发现平移NKAα调节亚基发生褪黑激素治疗后在这些鱼。分离蛋白的免疫印迹分析这些组织提供单一NKA-immunoreactive乐队∼110 kDa。在有鱼,NKA的相对丰度α蛋白在鳃上皮细胞显著增加褪黑激素治疗后(图5一个)。但感应immersion-stress显著降低免疫反应性相比,有控制(数据未显示)和褪黑激素治疗产生了显著升高NKAα-protein丰富的组织强调鱼(图5一个)。同样,NKAα蛋白密度大幅增加褪黑激素治疗后在melatonin-treated鱼(有肾上皮细胞图5 b)。NKAα蛋白密度显著上升褪黑激素治疗后肾组织中发现了immersion-stressed鱼(图5 b)。有虚假的鱼相比,表现出小影响褪黑激素治疗NKAα蛋白表达在肠道上皮细胞(图5 c)。在高对比度,褪黑激素治疗显著降低了蛋白质丰度immersion-stressed鱼(图5 c)。

3.7褪黑激素行动NKA磷酸化/脱磷酸化状态在渗透调节的上皮细胞有和hypoxia-stressed鱼

NKA的磷酸化蛋白激酶已被确认为短期NKA函数的调节器。我们测试了如何通过蛋白激酶磷酸化和去磷酸化调节NKA活动对有褪黑激素治疗反应和immersion-stressed条件。激活PKC-dependent磷酸化被发现在有和melatonin-treated鱼鳃上皮细胞(图6 a, D)。在高对比度,失活PKC-dependent磷酸化发生在肾和肠道上皮细胞有和melatonin-treated鱼(图6罪犯)。出乎意料,激活PKA和PKG-dependent磷酸化发生在强调,强调鱼的鳃,收到了褪黑激素(图6 a, D)。然而,这些反应都没有找到在肾和肠道上皮细胞(图6罪犯)。一个完整的去磷酸化NKA的碱性磷酸酶证明NKA的最大活动在所有这些测试组织(图6 a - c)。

3.8免疫组织化学和immunofluorescence-based NKAα-immunoreactivity在hypoxia-stressed ionocytes

鳃的分布模式ionocytes一直在前面描述的爬上的鳃上皮细胞(彼得et al ., 2011)。在这条鱼鳃ionocytes主要位于外围地在二级片晶圆或椭圆和圆核细胞。二级片晶减少这种鱼呼吸大气和拥有迷宫型辅助呼吸器官。免疫组织化学和免疫荧光鳃上皮细胞显示NKA的图像α免疫反应性是集中在这些ionocytes管基底,鳃ionocytes的典型指标(图7,10)。产生大量的NKA褪黑激素治疗α鳃ionocytes免疫反应性(图7,10),这是明显的鳃ionocytes的基底面。然而,Immersion-stress产生了降低NKA-immunoreactivity鳃ionocytes (图7,10)。然而,褪黑激素治疗产生更强烈的鳃ionocytes NKA-immunoreactivity强调鱼(图7,10)。

结构独特的NKAα疣状被发现在离散区域的肾小管爬上。具体NKAα免疫反应性获得的肾肾小管上皮细胞局部,而这种免疫反应性会缺席在肾小球(数据没有显示)。肾小管的不同部分是杰出的帮助下PAS染色(Teranishi金子,2010)。近端小管具有单层柱状上皮细胞,配有PAS-positive刷寄宿生顶端膜(图8)。远端肾小管部分有单层立方细胞中央位于核但缺乏顶端刷边界(图8 g)。相反,收集肾小管有单层柱状上皮细胞集中位于核和周围结缔组织(图8米)。具体NKAα免疫反应性和形态不同的ionocyte分布被发现在近端,远端和收集小管(图8 c, I, O;图11)作为肾ionocytes的亚型。的免疫反应性免疫组织化学和免疫荧光图像显示更强烈,强烈远端小管的局部在整个细胞,而免疫反应性仅限于在近端和收集小管基底外侧膜。免疫组织化学NKA的模式α免疫反应性即在这些肾ionocyte亚型;近端、远端和收集管ionocytes melatonin-treatment有爬上显示强烈的免疫反应性(图8 d, J, P)。免疫反应性的免疫荧光图像也显示出类似的模式(褪黑激素治疗图11)。NKA复苏的证据α褪黑激素治疗后免疫反应性被发现的近端和远端小管ionocytes immersion-stressed鱼(图8 f L;图11)。然而,NKA的分布格局α-免疫反应性较小的集合管ionocytes immersion-stressed鱼比免疫反应性的近端和远端小管(图8问)。同样,褪黑激素治疗几乎没有对这些ionocytes immersion-stressed鱼的免疫反应性的影响,接受了褪黑激素治疗(图8 r,11)。

免疫组织化学和免疫荧光分析的ionocytes前肠上皮细胞的NKA爬上显示突出α疣状基底外侧区域的柱状细胞在肠道绒毛和这些肠ionocytes扩展到上皮细胞的基础(图9,12)。相反,我们发现一个聚合NKA强度分布和突出α免疫反应性在顶端和巴塞尔地区的肠ionocytes immersion-stressed鱼(图9 e;图12)。然而,NKAα免疫反应性肠ionocytes较少的鱼有鱼和immersion-stressed褪黑激素治疗后(图7 d, F;图12)。

3.9综合抛物线模型melatonin-induced恢复反应hypoxia-stressed鱼

在一个假设的模型图13显示一个典型的压力反应在缺氧的鱼和褪黑激素如何引起恢复反应在这些鱼。随后,构造了一个综合抛物线模型生成模式有复苏的响应的测试变量,immersion-stressed immersion-stressed鱼,褪黑激素。NKA特定活动的分析数据,记录的表达nkaa1a, nkaa1b和nkaa1c,NKA一个蛋白质丰度和免疫荧光强度的测试变量进行,形成了特定的抛物线为每个变量测试在鳃等组织(图13 b)、肾(图13 c)和肠(图13 d)。定性分析的模式生成抛物线显示完整,消灭或弱类型,根据其对褪黑激素在恢复stress-disturbed NKA函数基础水平。比较评价的定性指标显示总分的4/6,分别为5/6和3/6的鳃、肾和肠道(表4)。肾上皮细胞获得最高分数测试变量,这使我们得出结论:肾脏的主要领导角色melatonin-driven复苏响应在这条鱼。

4讨论

在硬骨鱼,系统性ionosmotic集成和后续的离子平衡的维护主要是通过高效离子转运机制,整合鳃的离子运输活动,肾脏和肠道(埃文斯et al ., 2005;彼得,2011;彼得和Gayathry, 2021)。信息的缺乏褪黑激素的作用在Na的监管⁺在鱼体内平衡特别是在缺氧压力,促使我们调查其短期在活的有机体内行动NKA功能的ionocytes吸气式的鱼在水浸。在这里,我们找到了一个更高的生产褪黑激素在缺氧的鱼和多维的监管NKA ionocytes功能测试。这将有助于恢复缺氧的鱼或容忍系统性Na的失衡⁺体内平衡,表明褪黑素的作用压力和缓解响应在这条鱼。

松果腺melatoninergic系统已经显示出更高的应力敏感性在脊椎动物(菲et al ., 2022)。褪黑激素的大量崛起的等离子体缺氧的鱼显然表明褪黑素的潜在参与应激反应。多项研究表明,褪黑素可能发挥作用在硬骨鱼类的减轻压力的影响,在许多情况下,调制相关的神经内分泌反应HPI内轴(Sanchez-Vazquez et al ., 2019)。褪黑素可以调节对斑马鱼急性应激影响诱导睡眠状态,抑制皮质醇水平,减少运动活动,减少脂质过氧化反应和刺激抗氧化物酶活性(Hacışevki巴巴,2018;笨蛋et al ., 2021)。治疗与褪黑激素的剂量增加模拟夜间能够减少压力激素水平影响鱼(Gesto et al ., 2016)。Likewsie,外围褪黑激素可以抑制应激反应在金鱼(Carassius auratus)和显示额外的硬骨鱼类的镇静效应(Azpeleta et al ., 2010)。褪黑激素可以通过代理施加其影响通过质膜上的特定细胞受体,与其他激素相似,或通过receptor-independent机制涉及复杂的分子相声。的微分响应mtnr1a,mtnr1bb及其变体在测试渗透调节的上皮细胞hypoxia-stressed鱼及其应对外源性褪黑素进一步证实melatoninergic系统的积极参与在这条鱼缺氧和经济复苏响应。

当保持水浸,鱼失去了(Na⁺]和[K⁺)内容,这将占一个典型的压力反应与这些淡水鱼呼吸空气。有趣的是,我们发现,褪黑激素治疗诱导的恢复这些离子损失hypoxia-stressed鱼。恢复(Na⁺在缺氧的鱼)内容通过褪黑素可能是由于其综合行动NKA函数主ionocytes位于osmoregulatroy组织。这些证据以及褪黑素水平的上升中观察到缺氧的鱼的等离子体表明褪黑激素的作用在这两种压力反应和恢复这条鱼或减轻反应。的下降(K⁺)内容有缺氧的鱼鱼褪黑素治疗后,其复苏的褪黑素明显表明K的敏感性⁺离子对缺氧耐受性褪黑素及其保护行动的鱼。很显然,淡水鱼松离子在他们遇到压力(Wendelaar Bonga 1997;埃文斯et al ., 2005;彼得,2011)。褪黑激素也开低可用性的细胞外K⁺在我们的鱼但提高更多的自由或净Ca的可用性^{2 +}在有鱼,强调它在离子传输中的作用。但是免费Ca的更高需求^{2 +}保留在鱼收到褪黑激素和浸渍压力和指向褪黑激素的能力,以确保严格细胞Ca吗^{2 +}信号在强调和有条件。

褪黑激素在鳃ionocytes行动

NKA的活动模式已被广泛用作衡量hydromineral硬骨鱼的能力(党et al ., 2000;麦考密克2001;彼得et al ., 2011)。在鱼类,许多内分泌信号包括甲状腺激素和皮质醇已被证明为系统性hydromineral平衡调制NKA转运体功能在不良压力条件(党et al ., 2000;彼得,2011;彼得,彼得,2011)。最重要ionoregulatory器官鱼,鱼鳃作为敏感目标的压力在硬骨鱼(埃文斯et al ., 2005;彼得,彼得,2011)。NKA活动的增加有鱼的鳃褪黑激素治疗后指出,褪黑素的直接行动NKA函数在鳃和修改臂Na的能力⁺交通工具。快速调制的NKA活动响应各种环境挑战已经渗透调节的组织报告的鱼类(Mancera骄傲地指出,现在联邦区麦考密克,2000年),包括爬上(思米et al ., 2017)。

分析功能nkaα1亚基亚型等nkaα1a, nkaα1b和nkaα1c在鳃上皮细胞显示一个微分对褪黑激素的敏感性和缺氧的压力。upregulation mRNA的表达nkaα1a和nkaα1c和的差别,对这些nkaα1b鱼的鳃上皮细胞有褪黑激素治疗后指出,褪黑激素不同调节的能力nkaα1亚型。有趣的是,这些亚型显示immersion-stressed逆转对外源性褪黑素鱼,提供转录组证据表明褪黑激素的优惠措施nkaα1在强调鳃上皮细胞同种型开关。此外,这个微分同种型表达式进一步证实了褪黑素的直接基因组行动有选择地招聘α1亚型NKA函数恢复其改变对immersion-stress NKA回应。此外,NKA就越高α鳃上皮细胞蛋白质丰富的褪黑激素有和immersion-stressed鱼揭示转化NKA的监管。很可能迅速褪黑激素可以激活转录和转译效率更多的功能性NKA NKA的新兵α-蛋白质为重建Na⁺运输在鳃上皮细胞缺氧的鱼。

NKA磷酸化是翻译后调控主要实现的通过PKA, PKC或包裹(Vasilets et al ., 1990;Fotis et al ., 1999;Therien Blostein, 2000;保尔森et al ., 2012)。这些激酶依赖的类型α同种型泵和钙浓度抑制或刺激活动(程et al ., 1999;Lopina 2001)。的激活PKC-dependent NKA磷酸化的鳃上皮细胞有和melatonin-treated鱼点褪黑激素可以利用PKC开关调节NKA褪黑激素治疗后活动,展示了一个增强的活动。调制的NKA活动由于刺激蛋白激酶中也得到了证实鱼组织(克龙比式,1996;Tipsmark马德森,2001)。有趣的是,这种调制可以发现强调鳃中褪黑激素有利于PKA PKG-dependent磷酸化。褪黑激素似乎还可以利用这些kinase-switches降低NKA stressed-fish鳃的活动。尽管有报道的蛋白激酶对NKA活动(有相反的影响Therien Blostein, 2000对NKA磷酸化/脱磷酸化状态)或修改蛋白激酶和蛋白磷酸酶活动(艾瓦特Klip, 1995;Therien Blostein, 2000)(Helenius et al ., 2010)。

鳃ionocytes本地化在鱼鳃上皮细胞使用NKAα-subunit抗体(威尔逊和劳伦特,2002年;麦考密克et al ., 2009)。突出NKAα-immunoreactivity在鳃上皮细胞标记的存在鳃ionocytes免疫荧光和免疫组织化学分析表明,这些细胞位于二级吉尔薄片表面的攀登的证明(彼得et al ., 2011)。有增强的鳃NKAα-immunoreactivity褪黑素后和hypoxia-stressed鱼进一步表明褪黑素的目标行动在这些鱼鳃ionocyte函数。此外,很可能分散NKAα-immunoreactivity hypoxia-stressed鱼的鳃ionocytes似乎是由于增加了吉尔渗透率与儿茶酚胺分泌增加有关类似catecholamine-induced吉尔渗透率上升被发现在hypoxia-stressed虹鳟鱼(麦克尼尔和佩里,2006)。看来NKAα-immunoreactivity越高,表明这些细胞蛋白质丰度升高immersion-stressed鱼的褪黑素可能是由于褪黑素的保护作用在拯救ionocyte函数在浸渍压力。也表明褪黑激素可以帮助这些鳃ionocytes招募更多的NKAα蛋白在质膜,支持他们反对immersion-stress工作。这种观点赞同前面研究褪黑素的保护作用,因为它降低了鸟类的等离子catacholamines水平(Mahata和德,1991年),提供了对能保护行动应激损伤大鼠(楼陀罗et al ., 2014)。同样,褪黑激素管理似乎保护小鼠免受restraint-stress (SajeebKhan和彼得,2015年)。此外,外源性褪黑素已被证明为保护大鼠肾上腺(Pertsov 2006)和稳态控制是至关重要的一些脊椎动物组织的能量代谢包括鱼(Conde-Sieira et al ., 2012)。

褪黑激素行动肾上皮细胞

肾脏在鱼类保持离子调节中起着举足轻重的作用(Varsamos et al ., 2005;彼得,2011)。但是它的运输Na⁺不研究淡水鱼特别是在压力条件。它已经表明,缺氧诱导导致修改模式NKA功能肾脏的鱼(思米et al ., 2017)。看来,褪黑素对肾钠直接控制交通,因为它支持的下降immersion-stressed鱼的肾小管NKA活动虽然刺激肾上皮细胞的活动有鱼。这一观点进一步支持了这种观点,即褪黑激素可以支持hyperosmoregulatory这条鱼的能力明显提高动脉血液的能力(Na⁺)的水平。众所周知,鱼类调节水和矿物质平衡通过促进hyperosmoregulatory机制在淡水(埃文斯et al ., 2005)。信使rna的表达分析nkaa1a 1 b和1 c有鱼的基因在肾脏上皮细胞显示微分调节褪黑激素治疗后表明褪黑激素的优惠措施。此外,类似于腮,褪黑激素上升nkaa1a同种型表达式的肾脏有鱼,之后显示监管在缺氧的鱼。同样的,nkaa1b和nkaa1c显示在强调肾upregulation褪黑激素反应进一步证实了褪黑素调节NKA-driven Na的能力⁺在肾小管运输不同调节它nkaα1同种型的多样性。

NKA的上升α-蛋白表达以及一个加剧NKAα-immunoreactivity在近端和远端肾ionocytes,进一步支持直接作用的褪黑激素NKAα-protein肾脏上皮细胞在缺氧条件。这将使肾小管恢复干扰系统性Na⁺内稳态回到基础水平低氧诱导的鱼。这进一步揭示了一个直接平移控制NKAα-subunit褪黑素的功能,还指出,褪黑激素的能力促进钠的重吸收⁺在肾上皮细胞复苏的反应。这种观点是符合报告,褪黑激素能增加水和Na⁺滤过率威斯特老鼠(Pishak Kokoshchuk, 1995),尽管减少上皮Na⁺运输已经报道在狒狒褪黑激素治疗后(乐可利et al ., 1982)。

磷酸化的不同位置NKAα1亚基的NKA活动决定了抑制或激活肾上皮细胞(Pedemonte et al ., 1997;Ogimoto et al ., 2000)。看来,褪黑激素能调节NKA泵活动通过灭活PKC-dependent磷酸化有肾上皮细胞。NKA的活性降低,褪黑激素在这个强调鱼的组织在不改变其磷酸化效率还指出,多靶向作用的褪黑激素在肾上皮细胞。这将进一步指明了褪黑激素的方法修改上皮Na⁺和K⁺运输功能在缺氧条件下也可以要求较小的敏感kinases-activated磷酸化。研究表明,在Ser PKA-mediated磷酸化^938年调节NKA活动大鼠近端小管后快速激活血管紧张素ⅱ,兴奋剂的Na⁺在近端和远端小管重吸收梅西et al ., 2016)。同样,多巴胺和血管紧张素ⅱ参与刺激NKA函数已被证明在Ser PKC介导的¹⁸(Zhang et al ., 2010)。

NKA越高α褪黑激素治疗后免疫反应性肾近端和远端ionocytes表明褪黑激素增强NKAα肾小管蛋白丰度。免疫组织化学研究表明,NKAα是本地化主要在肾小管的上皮细胞在许多硬骨鱼(Ura所言et al ., 1996;林et al ., 2004)。的NKAα免疫反应性在不同的段肾元除了肾小球表明这些小管负责盐的重吸收。不同亚型的肾ionocytes即;近端、远端和收集管ionocytes中发现了这条鱼,显示其具体结构特点(彼得和Gayathry, 2021年)。多元化NKAα免疫反应性模式ionocytes在肾小管中有鱼后褪黑素可能对应于ionocytes的功能属性。

褪黑激素对肠上皮细胞

在淡水硬骨鱼,作为综合控制系统的一部分离子稳态,肠道上皮细胞可以弥补潜在损失的Na⁺离子在鳃和肾上皮细胞通过加速Na⁺离子吸收(彼得,2011)。看来,褪黑激素,尽管其丰富的可用性在肠道组织的一个重要extra-pineal褪黑素合成的来源(Bubenik 2002;慕克吉Maitra, 2015),没有行动的总NKA活动组织。但有趣的是,褪黑素可以诱导一个微分行动nkaα1亚型在肠道组织显示upregulation在缺氧的鱼,在有差别而表现出对这些鱼。此外,一个可能的转录组激活nkaα1亚型可以看到由于降低蛋白质丰度和PKC-mediated NKA磷酸化。的降低NKAα免疫反应性和免疫印迹在肠道上皮细胞对应NKA的影响α蛋白质丰度在缺氧肠道NKA函数反映了低参与这些鱼可能作为综合控制离子稳态受褪黑激素。然而,很可能褪黑激素可以参与缺氧耐受性的调制NKA功能的转录组和转录后修饰。褪黑激素似乎还可以更多地依赖于肾比鳃和肠道恢复干扰系统性Na⁺内稳态的浸没式压力。前面报告的存在褪黑素受体在鱼类肠道绒毛支持我们观察褪黑激素可以修改Na的跨膜运输⁺交通工具。此外,褪黑素被证实引起肠道肌肉的放松促进肠道蠕动在大鼠(Bubenik 2008)。同样,它与dopamine-sensitive Ca^{2 +}激活K⁺在肠频道(Reyes-Vazquez et al ., 1997)。同样保护作用的褪黑激素对胃应激损伤大鼠(曹et al ., 1989)和微循环恢复(Konturek et al ., 2011)。外源性褪黑素已被证明,以减少腹泻大鼠结肠炎(Cuzzocrea et al ., 2001),在调节Cl中发挥作用⁻在结肠分泌(陈et al ., 1998)。

褪黑激素ionocyte功能的集成和复苏的hypoxia-stressed鱼

看来,褪黑激素在鱼ionocytes整合多维NKA的监管功能,在转录、翻译和转录后水平。这个证据作用的褪黑激素系统的集成Na⁺体内平衡要求激活/失活NKA函数和随后的Na⁺/ K⁺运输在ionocytes建立最优全身ionosmotic地位在压力和缓解情况。

作为主要积分膜转运体,建立了细胞和系统性体内平衡,NKA驱动器Na⁺在渗透调节的信号ionocytes。褪黑激素的综合行动NKA-driven Na⁺体内平衡测试在鳃、肾和肠道上皮细胞通过quatifying ouabain-sensitive NKA活动,其转录表达,NKAα-密度和免疫反应性和蛋白质磷酸化状态。我们发现,褪黑激素产生一个综合行动主要ionocytes如鳃、肾和肠道ionocytes显示空间微分反应浸渍压力。褪黑素调节压力诱导的NKA活动的改变,nkaα1a 1 b和1 c亚型表达,NKAα-免疫反应性和NKAα蛋白表达在上皮细胞进行测试,表明褪黑激素的快速和直接控制NKA-transcriptional和转化规定。此外,褪黑激素产生差异和空间管制NKA通过唤起的磷酸化蛋白激酶有和stress-challenged鱼,表明组织翻译后的监管要求PKC NKA功能,PKA或PKG信号通路。这是激素可以创建报告符合急性NKA泵活性的变化通过通过调节亚细胞分布的NKA泵装置或施加催化亚基的可逆磷酸化(艾瓦特Klip, 1995)。

生成的综合抛物线模型表明,复苏的褪黑激素的反应发生在缺氧模式强调鱼。这个模型提供了定量的证据褪黑激素的作用,恢复NKA的应激障碍函数基于响应模式的测试变量hypoxia-stressed鱼收到褪黑激素。模式的分析复苏的反应发生在NKA监管导致不同类型的抛物线的测试变量组织模式。肾上皮细胞,最大分测试变量,让我们得出这样的结论:肾、鳃和肠紧随其后,在melatonin-driven复苏的反应中起着重要的领导角色在这个鱼。很明显,肾可能利用其主要NKA监管机制以应对melatonin-driven恢复行动强调鱼鳃、肠等相比,它的合作伙伴。总的来说,这项研究表明,褪黑激素1)目标和指导Na⁺内稳态的调节在ionocytes NKA函数和不同2)集成NKA-driven ionocyte鳃、肾和肠道的领导角色肾脏缺氧应激期间打扰NKA功能恢复。我们的数据从而支持早期的假说(彼得,2013),褪黑激素能促进缓解鱼在他们适应环境压力的反应,因此考虑恢复或缓解鱼类激素褪黑激素。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

综述了动物研究和动物学博士委员会批准的部门,大学喀拉拉邦。

作者的贡献

MCS彼得是参与制定概念、实验设计、写作、审查和编辑、监督基金收购。RG做实验,主要分析、写作。党卫军激素和qpcr分析。和彼得审查和编辑手稿。

确认

我们感激地承认iCEIB项目(喀拉拉邦的高等教育部门,政府)的慷慨的财政支持。我们应感谢UGC-SAP-DRS二世在美国大学的动物学喀拉拉邦。我们承认DST,新德里和印度生物技术部BioCare,新德里和喀拉拉邦大学的一些研究支持。垂直地震剖面KSCSTE承认退休科学家的支持方案和Sastrajeevan (SBE,特里凡得琅)。MCSP承认UGC的UGC-BSR教员奖学金奖,新德里。党卫军承认DST-SERB -格兰特,新德里。

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