抗冻糖蛋白的作用(AFGP)和聚乙烯醇/聚甘油(X / z - 1000)在大鼠肝脏的部分冻结冰调节器

介绍

肝脏器官短缺使得移植开发领域的大胆的新策略来保护移植器官。目前,保护移植肝的临床标准是静态的冷藏(SCS)在4°C,使肝脏最多12 h (1]。延长保存时间在很多方面可以改善器官的分配。例如,它将减少器官丢弃由于不能接受的长冷缺血时间、降低手术室成本通过肝脏移植(LT)操作选修课,加强捐助者与接受者的选择与人类白细胞抗原(HLA)匹配和全局匹配的项目,并使宽容感应协议更可行的(2- - - - - -4]。

最低温保存的努力集中在较低的制冷温度范围(< -80°C) (3]。然而,最近的研究调查扩大用于移植的器官的存储在高低温温度范围从4°C到-20°C (2,5- - - - - -11]。这些温度使代谢抑郁症比低温SCS同时避免vitrification-related冷冻保护剂毒性和热应力。潜在的高低温保存的一些例子包括存储热力学冰点以下冰的没有使用过冷或等体积的过冷(∼4°C到6°C对于较大的系统,如器官)(5,7,11]。虽然这些无冰的方法显示6°C以上的巨大希望,还是偶然的冰形成的风险增加减少温度的函数(12]。替代方法是利用关键的生存策略freeze-tolerant动物在自然界中(2,13)冻结整个器官到-15°C使用一个方法称为局部冻结(9]。核心部分冻结成功启动冰接近冰成核温度使用冰核粒子由于这是远比意外伤害小冰的形成。然而,需要进一步进展描述和解决ice-mediated损伤模式,包括由于再结晶。

一个潜在的解决方案来解决ice-mediated伤害冰调节器。Ishine等人表明,冰调节器等抗冻糖蛋白(AFGP)可以在肝脏保护作用冻结冰通过抑制再结晶,防止离子通过细胞膜在低温下泄漏,尽管作者报告损伤内皮细胞层(14]。AFGP已表现出抑制再结晶冰和冰增长低于T_米(热力学冰点)。这些糖肤,丙氨酸和苏氨酸的所有组成骨干,抑制冰增长在活的有机体内和在体外不可逆转地绑定到多个面孔的冰晶(15- - - - - -18]。AFGPs也被证明能提高冰同质成核温度(T_H)通过组织水变成一个更像冰一样的状态19]。然而,由于我们部分的温度范围冻结协议远高于T_H(20.),手头的问题涉及的角色AFGP冰塑造和冰再结晶的抑制。尽管AFGP可以冰塑造成破坏性的针状体(21),这种效果可能会超过我们的存储条件下冰AFGP增长和再结晶的抑制的影响。另外,x - 1000是一个2 kilodalton (kDa)水溶性合成聚乙烯醇(22),其中包含20%的醋酸乙烯酯,使x - 1000的溶解度和ice-inhibiting效果可能通过防止self-association x - 1000之间链。聚乙烯醇是广泛应用于许多生物医学应用程序作为一个冰调制器和抑制冰再结晶和生长,即使浓度很小(23,24]。z - 1000是一种合成聚甘油,抑制异构冰成核(25]。通常,冰结晶在称为成核剂的微小杂质。z - 1000具体结合这些成核剂,抑制冰形成的网站。一起X / z - 1000保护老鼠的心脏已被证明在过冷(26- - - - - -28)和功能从0°C温度低于-120°C (29日]。

在目前的研究中,整个大鼠肝脏部分冻结长达5天在高低温(-10°C到-15°C)通过结合冰成核剂(ina)和机器灌注(联合国)加载和评估。进一步,两个冰调节器,抗冻糖蛋白(AFGP)和聚乙烯醇/聚甘油组合(X / z - 1000)进行测试的能力克服ice-mediated受伤的啮齿动物肝脏。相比之前的努力Tessier et al . 20229),目前的研究主要使用甘油作为渗透CPA。甘油被选自结果不如乙二醇和丙二醇,使冰的评估调节器救glycerol-preserved肝脏损伤的能力。综上所述,肝脏冻的包容AFGP或X / z - 1000相比,对照组(以甘油为主要CPA)主要的成果是subnormothermic机器灌注(SNMP)指标,ATP,电费(EC),体重增加和组织学。

材料和方法

实验设计

图1概述了鼠肝部分冻结协议在八个连续步骤:1)肝脏采购,2)预处理在SNMP, 3)会计师预压期间低温机器灌注(HMP), 4)加载最后存储解决方案和冰调节器在高分子聚合物,5)大鼠肝脏的部分冻结,解冻6)大鼠的肝、7)卸载注册会计师协会在高分子聚合物,和8)功能恢复的冷冻大鼠肝脏在SNMP。

在这个协议,我们首先比较部分冷冻肝脏在-10°C (n= 4肝脏)和-15°C (n= 9肝脏)与12%甘油作为主要渗透CPA。在寻找最小的两组之间的差异对perfusion-based指标,我们联合控制,相比他们的肝脏部分冻结0.5毫克/毫升0.05% (w / v) AFGP (n= 4肝脏X-1000/0.2% z - 1000)或0.1% (w / v, 0.3%;n= 4肝脏)冰调制药剂添加到保护解决方案。冻结后,肝脏对SNMP可行性相比对照组12%甘油和冰调制两组(AFGP和X / z - 1000)。AFGP蛋白是来自一家名为/ F蛋白Inc .(请参阅补充表S2)。抗冻糖蛋白从本公司是净化冷海水硬骨鱼鱼的纯度> 98%。提供所有蛋白质在干燥形式和存储−20°C。在这种情况下,该公司已确认4年的保质期。本研究中使用的所有AGFP是适当的存储和使用后几个月的到来。

部分冻结协议

大鼠肝脏灌注系统涉及通过插管灌注门静脉(PV)的监管压力,流量,温度。详细设置之前所描述的灌注系统(30.]。总鼠肝切除术协议是机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)的马萨诸塞州总医院(美国波士顿)。老鼠肝脏从男性获得刘易斯(250 - 300克,年龄10 - 12周。查尔斯河实验室,美国马威尔明顿)(图1步骤1)。胆管被隔离和插管,和老鼠肝素化30 U肝素钠。PV脾和胃分支,以及肝动脉结扎管子之前。16-gauge的PV随后空心导管和立即刷新40毫升肝素化盐在室温下(1000 U /毫升)。肝脏被释放从腹膜附件,刷新肝素化盐水的额外的20毫升。采购后,肝脏重和机器灌注立即启动。

预处理在SNMP发起21°C和5毫升/分钟的流量(图1步骤2),流量逐渐增加(1毫升/分钟),直到最大光伏压力5毫米汞柱,或25毫升/分钟的流量,达到(哪个是达到第一)。鼠肝脏灌注了1 h和500毫升的预处理方案组成的威廉姆斯E, 200 U / l的胰岛素,2% w / v挂钩,BSA 50 g / l, 100毫米3-O-methylglucose (3-OMG), 10000 U / l的肝素,24 mg / l(地塞米松,25毫克/毫升的氢化可的松,40000 ug / l青霉素,链霉素40000 U / l和碳酸氢钠来维持生理pH值(见补充表S1组成的解决方案)。

在SNMP 1 h的预处理后,温度下降到4°C∼1°C /分钟的速度。流速逐渐调整是必要的,以确保最大灌注压力的3 - 5毫米汞柱在高分子聚合物。SNMP预处理的解决方案是将500毫升CPA预加载解决方案在4°C(由威廉姆斯E, 200 U / L的胰岛素,2%挂钩,BSA 50 g / L, 100毫米3-OMG, 30毫米棉子糖,3%羟乙基淀粉(HES), 6%的甘油,4000 U / L的肝素,24 mg / L(地塞米松,25毫克/毫升的氢化可的松,40000 ug / L的青霉素,链霉素40000 U / L,并根据需要碳酸氢钠保持生理pH值)(图1步骤3;补充表S1)。HMP持续了1 h,以确保完成整个肝实质平衡的解决方案。

CPA预压在高分子聚合物后,大鼠肝脏含有50毫升的最终存储解决方案(包括威斯康星大学(UW)的解决方案(生命桥有限公司,哥伦比亚、SC、美国),5%的挂钩,50 mM海藻糖,v / v(1.64米)甘油12%,1 g / L Snomax (Telemet,猎人,纽约,美国)促进成核,10 U / L的胰岛素,24 mg / L(地塞米松,碳酸氢钠来维持生理pH值,和0.5毫克/毫升AFGP或0.1% x-1000/0.2% z - 1000 (图1灌注过程中,步骤4)。最后存储解决方案的肝脏灌注在一个固定的流量为0.5毫升/分钟30分钟,导致灌注压力3毫米汞柱。

一旦最终存储解决方案在高分子聚合物通过肝脏灌注,肝脏被安置在一个存储袋50毫升的存储解决方案在pre-cooled冷却器(恩格尔、Schwertberg、奥地利;模型没有。ENG65-B)部分冻结(图1步骤5)。注意:棉子糖的浓度和他更高的存储解决方案的预加载解决方案,因为存储的解决方案是用UW含有棉子糖和他。在肝脏中与甘油冷冻,冷却温度pre-cooled -10°C或-15°C,和肝脏是存储在一个温度下1 - 5天。肝脏冷冻和冰调制两位候选人都储存在-15°C。

部分冻结后,肝脏被解冻(图1步骤6)放置在50毫升解冻的解决方案组成的威廉姆斯E, 10 U / L的胰岛素,2%挂钩,BSA 50 g / L, 100毫米3-OMG, 30毫米棉子糖,他3%,50 mM海藻糖、5毫米L-glutathione, 200µM环腺苷酸,1000 U / L的肝素,24 mg / L(地塞米松,25毫克/毫升的氢化可的松,40000 ug / L的青霉素、链霉素和40000 U / L,预热至37°C在恒温浴(热费希尔,沃尔瑟姆,妈,美国)。肝脏轻轻搅拌,直到完全解冻,大概需要4 - 5分钟基于肤浅的观察和热之间的平衡最终融化溶液温度和4°C的肝脏表面温度。

解冻后,注册会计师和在卸货期间HMP (图1步骤7),解冻肝脏灌注在4°C与解冻的解决方案60分钟的初始流量2毫升/分钟。流动,使最大压力增加3毫米汞柱。60分钟后,灌注温度增加到21°C,和灌注的解决方案是改为750毫升的SNMP恢复解决方案(包括威廉姆斯E, 20 U / L的胰岛素,2%挂钩,50 g / L BSA, 5毫米L-glutathione, 200环腺苷酸,1000 U / L的肝素,24 mg / L(地塞米松,25毫克/毫升的氢化可的松,40000 ug / L的青霉素、链霉素和40000 U / L;补充表S1),丢弃前50 - 100毫升,以确保完成会计师移除。在SNMP功能恢复的冷冻大鼠肝脏恢复解决方案持续了3小时(图1第八步)的最大肝内灌注压力5毫米汞柱,最高25毫升/分钟的流量。

可行性评估

灌流液测量每小时SNMP复苏期间完成的。时间为零(t= 0)被定义为在高熔点约5分钟,此时第一流出采集标本(流,2毫升/分钟)。PV和infrahepatic下腔静脉(IVC)氧气分压和乳酸水平测量Cg4 + i-STAT盒(目录没有。03 p85-50)和手持血液分析仪。同样,钾和其他电解质测定在印度河流域文明使用化学样品8 + i-STAT墨盒(目录号09年p31-26)相同的血液分析仪(目录号WD7POC012;美国雅培,芝加哥,IL)。

大鼠肝脏重量测量后直接采购、冻结,解冻后,经过可行性测试。体重计算比例增加的复苏相比,肝脏重量后采购。血管阻力计算灌注压力除以PV的流量每克肝使用采购后肝脏的重量作为参考标准体重。耗氧率计算(pO₂^在阿宝₂^出)* F / W,阿宝₂^在和阿宝₂^出是氧气含量每毫升的流入和流出的灌流液,分别和它们之间的差异乘以灌注率(F, ml / min)提供的总耗氧量每分钟。这个值被肝脏重量然后规范化(W)计算每分钟耗氧量,每克的肝脏。解冻和SNMP复苏后,大鼠肝组织要么是flash在液态氮冷冻或固定在10%福尔马林,嵌入在石蜡,切片,苏木精和伊红染色())。末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)也对鼠肝组织执行冻结后检测DNA断裂作为细胞凋亡的指标(7]。flash冻的肝组织是用来量化ATP和电费(EC)后来的儿童医院质谱核心(波士顿,MA,美国)。

棱镜8执行统计分析软件(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)显著性水平为0.05。方差分析(方差分析),其次是图基事后测试(方差分析/图基)是用于时间进程灌注的比较数据。ATP和EC -10°C和-15°C组中使用未配对比较,双尾t。

结果

比较部分冷冻大鼠肝脏在-10°C和-15°C和12%的甘油

汇集结果肝脏储存1和5天在-10°C (n= 4)或-15°C (n= 9)鸡尾酒含12%甘油比较1 h CPA卸货后和3 h与SNMP在复苏后21°C。两组之间没有统计上的显著差异对耗氧量(图2一个),乳酸PV (图2 b)和血管阻力(图2 c在双向方差分析/图基测试。同样,没有统计上显著的差异在-10°C和-15°C肝脏对体重增加(百分比图2 d)、ATP (图2 e)、电子商务(图2 f)和灌流液钾(补充图S1A)未配对,双尾学习任务。因此,老鼠的肝脏灌注指标部分冷冻12%甘油在-10°C和-15°C之间并没有统计上的不同,因此,被组合在一起形成一个更健壮的对照组(n= 13)对冰调制器组比较。然而,应该注意的是,-10°C和-15°C之间的差异被蒙蔽病理学家,在组织学如下进一步的描述。

比较的部分冻结控制老鼠的肝脏肝冻AFGP或X / z - 1000冰调节器

三组之间没有统计上的显著差异对耗氧量基于双向方差分析/图基测试(图3一)。控制glycerol-only肝脏意味着最低灌流液乳酸(1.17±0.61更易/ L)在时间为零。在SNMP的第一个小时,减少乳酸在所有三组。两组之间没有显著差异在任何时间点根据双向方差分析/图基测试(图3 b)。X / z - 1000冻肝脏意味着血管阻力明显高于{1.44±0.37 mmHg /((毫升/分钟)/ g)} (0 h相比12%甘油控制肝脏{0.528±0.39 mmHg /((毫升/分钟)/ g),p价值0.0315}和AFGP肝脏(0.413±0.27,p值0.0215)(通过方差分析/图基)。然而,这些差异都不再重要,剩下的时间点阻力位聚合随时间(图3 c)。此外,没有统计显著差异累积胆汁生产所有三个组(补充图S2)。

最后的意思是glycerol-only控制体重,+ AFGP + X / z - 1000组26.9±15.3%,分别为12.8±13.2%和39.5±5.69%。肝脏冷冻至少与AFGP水肿,相比大大减少X / z - 1000肝(p价值0.0294单向方差分析/图基;图3 d)。意味着ATP的甘油对照组、AFGP和X / z - 1000分别为0.187±0.075,0.624±0.20,0.680±0.32 ug /毫升。ATP浓度显著降低了肝脏与甘油与AFGP(存储p= 0.0057)和X / z - 1000 (p(方差分析/图基)= 0.0023)。ATP水平没有显著差异之间AFGP和X / z - 1000冷冻肝脏(p= 0.91)(图3 e)。最后,意味着EC甘油对照组,AFGP,和X / z - 1000为0.066±0.032,0.063±0.015,0.591±0.62 (ATP + 1/2ADP) / (ATP + ADP + AMP)。EC在肝脏更高存储X / z - 1000和甘油相比仅甘油(p= 0.0159)和甘油+ AFGP (p= 0.0428)(单向方差分析/图基)。之间没有显著差异在EC AFGP和甘油冷冻肝脏(p= 0.99)(图3 f)。最后,没有显著差异在灌流液钾1 h灌注(用作标记的细胞损伤)AFGP之间,X / z - 1000,甘油冷冻肝脏(补充图印地)。

)染色后的鼠肝实质1和5天部分冻结显示变量正弦,肝细胞和内皮细胞损伤组。X / z - 1000年冰冻肝脏、圆)显示,更好的保护的正弦明显由于肝细胞细胞肿胀比看到其他组经过1天的存储,这有点恶化后5天的存储。内皮之间也明显恶化天1和5,水肿的变化和积累的胞浆内空泡和焦内皮细胞破坏特别在中央小静脉(1天之后:图4一;5天之后,图4 e)。1天的存储后,糖原染色减少X / z - 1000肝,但不是在AFGP或glycerol-only组。AFGP冷冻肝细胞肿胀的正弦开放展出和遭受内皮细胞层压缩和破坏轻微后1天(图4 b5天(后),结果更加糟糕图4 f)的存储。肝脏冷冻只有甘油在-10°C正弦损伤,内皮细胞损失,中央静脉内皮细胞破坏图4 d)和大量的肝细胞肿胀(图4 h)。减少这些控制甘油肝脏的储存温度为-15°C恶化实质水肿所指出的)1(后病理图4 c)或5 (图4 g天冷冻储存。

TUNEL染色观察在门户静脉的内皮细胞衬里以及分散后的正弦内皮细胞(SEC) 1和5天的冷冻储存在X / z - 1000 (图5 a, E)。AFGP冷冻肝脏门静脉血管内皮染色与温和的交会染色后1天(图5 b),但在5天之后,TUNEL肝细胞的核染色指出与美国证券交易委员会(图5 f)。与其他组相比,AFGP冷冻肝脏在-15°C和5天的部分冻结最TUNEL染色。甘油只有肝脏储存在-10°C非常少TUNEL染色相比,X / z - 1000和AFGP肝脏仅有轻微的一些分散的正弦染色后1天(图5 d),5天(图5 h)的存储。的)结果,降低甘油的储存温度只有肝脏-15°C没有加剧TUNEL染色后1天(图5 c)或5天(图5克)的存储。

讨论

延长保存时间捐献器官移植领域将是一个巨大的资产。肝移植,延长SCS的同种异体移植物保护时间从目前的标准在4°C会减少器官丢弃和无计划的手术的高成本,减少器官排斥率通过改善捐助者与接受者的火柴或使免疫耐受诱导协议,甚至可能开放途径为全球匹配程序。此外,保存整个人体器官的研究将是一个宝贵的资源,包括药物发现和揭露疾病病因3,31日]。

低温器官保存之前的努力通常(虽然不是普遍32])遇到致命的(33,34)或不可接受的损害(29日,35- - - - - -37大量细胞外的冰,或引入的挑战的巨大浓度会计师需要排除这种损害(29日,38,39]。到目前为止,尚未充分克服这些困难的挑战,因此,应调查和其他方法更快可能会产生实际的结果。我们当前的方法利用高低温(−−4°C 20°C)但不深低温下延长器官保存时间。在这种能力,我们探索一种方法叫做部分冻结,我们结合保存在高低温(-10°C和-15°C)与机器灌注抑郁和代谢率的好处最大化体外器官恢复/评估[9]。虽然glycerol-treated,部分冷冻存储的肝脏5倍以上临床控制显示一些有利的结果,还需要进一步的研究来全面描述和地址ice-mediated损伤。冰调节器已被证明修改冰晶形状和抑制再结晶的冰,冰激细胞损伤可能减少。在大鼠肝脏的部分冻结,冰调节器可以提供一个额外的保护层从这些类型的ice-related细胞损伤。

这项研究第一次表明,大鼠肝脏冻结在-10°C与-15°C和甘油在统计学上类似的关于灌注指标(图2)。然而,减少储存温度从-10°C到-15°C可以在细胞水平上对器官生存能力。事实上,先前的努力,使用丙二醇的主要渗透CPA部分冷冻肝脏(9),显示存储温度可以在细胞水平上影响生存能力的结果。当水结冰,溶质被排除在冰晶,这就增加了同渗重摩和减少解冻水的冰点分数。因此,冻结温度较低导致更多的冰和更高层次的渗透转移(40]。在我们的案例中,12% v / v甘油(1.64米),相当于1.86质量摩尔浓度。根据近似凝固点降低,冰点降低约1.86°C每osmolal浓度的增加。添加甘油车辆的0.3 osmolal贡献解决方案,我们的存储介质的熔点应在4°C的附近。在-10°C,大约60%的解决方案将被转换成冰的水,在-15°C,大约73%的水将会被排斥,这是一个显著增加。虽然膜稳定糖类、海藻糖、棉子糖(41)了,他们不进入细胞,因此不名义上保护内膜传单或减少细胞收缩引起的水提取在寒冷。

本研究的主要目的是评估的影响两个冰调节器,AFGP和X / z - 1000,部分冷冻大鼠肝脏与甘油控件(图3)。相比之前的努力Tessier et al . 20229),本研究使用甘油作为主要渗透CPA和假定冰调节器可以从ice-mediated救援glycerol-preserved肝脏损伤。AFGP在冰塑造和冰抑制再结晶过程中发挥作用,而X / z - 1000抑制冰再结晶和影响冰核事件。AFGP冷冻肝脏有最少的水肿和高水平的ATP。然而,AFGP-mediated冰调制对内皮细胞不利影响,反映在他走时和TUNEL染色,尤其是在长期存储(图4,5)。冻结的时间从1增加到5天,AFGP TUNEL染色从主要内皮损伤扩大到更加突出肝细胞和正弦细胞损伤。AFGP有一个建立在动态冰塑造角色,冰再结晶抑制、滞后冰点降低(17,42,43]。由于内皮细胞会使冰直接接触,有可能AFGP可能导致不利于冰晶形状破坏肝脏的内皮细胞。在研究Rubinsky et al .,抗冻蛋白导致死亡的红细胞在寒冷尽管定向凝固方法的使用通常最小化冰伤害(21,44]。然而,AFGP可能提供保护肝细胞通过其行动的其他机制,抑制再结晶。应该注意的是,AFGP冰点降低通常局限于1 - 2°C,它是小于我们的解决方案的的区别_米年代和我们选择的存储温度,因此无法提供这些实验的保护作用。等温冻结固定(34)可能是有用的在未来的研究中在相关的细节冰分布和特征观察结果(45]。

X / z - 1000第二次冰调制器组合在这项研究评估。X / z - 1000冻肝脏ATP和迄今为止最高最高的EC但遭受最高SNMP阻力位t= 0,最后水肿恢复(图3)。染色,X / z - 1000冻肝脏TUNEL染色相比,减少了AFGP冷冻肝脏,但仍表现出正弦内皮染色的,看到只甘油组(图4,5)。X / z - 1000肝脏ATP和EC含量有很大的差异,这可能是由于行动的竞争机制的X - 1000 / z - 1000的冰成核剂,Snomax [25]。Snomax会减少冰晶的数量,因此,要提高他们的平均大小和颗粒大小的范围。这可能与更大的观察正弦曲线的大小和随机差异在当地的成核和冰晶大小影响肝细胞生存能力的一致性。而X / z - 1000是有吸引力的高ATP和EC,高水平的部分冻结后水肿有关,也可能与血管造成的损害更大的局部血管内或间质冰颗粒,这将符合先前的观察Rubinsky等人有关损伤冷冻肝脏血管扩张,血管内冰(46]。未来的方向与此相关的冰调制器应探讨使用x - 1000,这是一个再结晶抑制剂,不使用z - 1000,这是一个antinucleator。另一方面,总血管扩张应该是类似的组织,由glycerol-water解决方案的相图,然而更温和glycerol-only组水肿。在任何情况下,X / z - 1000似乎承诺使用孤立的隔离或保护肝细胞,维护高的ATP / EC是主要目标。

最后,glycerol-only控制肝脏乳酸水平最低t= 0和最小TUNEL染色(图3- - - - - -5)。然而,这些肝脏也有非常低的ATP和EC相比冰调制器组。一个潜在的生物原因的区别是甘油导致甘油激酶将甘油转化为glycerol-3-phosphate,这是一个ATP依赖的途径。因此,甘油的活动作为一个注册会计师可能抑制ATP的水平(47]。事实上,其他研究已经证实取代甘油与其他渗透注册会计师,如乙二醇或丙二醇可能会更有前途9]。然而,冰的和意想不到的非凡能力的调节器,以防止低ATP没有明确的解释,但似乎利用乳酸糖原生成ATP和更有效的在X / z - 1000组和AFGP集团在较小程度上,基于更强烈的糖原染色(建议减少糖原代谢)glycerol-only组。这将是有趣的,看看冰再结晶结构不相关的小分子抑制剂(IRIs) [48]会有类似效果,也更好的保护了血管系统。没有冰的影响调节器防止破坏性冰再结晶,glycerol-only肝脏也一贯温和的实质肿胀和内皮细胞损伤)染色,尽管添加Snomax和3-OMG拯救从部分冷冻损伤内皮细胞。因此,加入冰调制的概念的基本方法论高温冷冻似乎支持。最后,所有肝组织清除乳酸2 h灌注和(而引起肝细胞损害)可行)组织学灌注后,移植会议两个标准(49,50]。因此,未来实验移植这些部分冷冻后肝脏SNMP进行评估如果corelates灌注性能在活的有机体内肝的功能。

总的来说,理想的冰调制器组合提高部分冻结协议将保留高ATP和EC的积极作用在X / z - 1000的低水平与AFGP水肿,细胞损伤的内皮细胞和正弦与冰看到调制器组。因此,未来的发展方向,扩大保护肝脏移植的部分冻结方法取决于两个修改冻结协议以及冰调制器的组合。此外,提高注册会计师的浓度减少在较低温度下冰的形成和扩大在努力改善注册会计师的装卸机器灌注,像已经被追求9),可以改善肝脏可行性。除了甘油,乙二醇,丙二醇测试本和Tessier et al (9]。,there are other permeating CPAs that could be tested in the partial freezing protocol such as dimethyl sulfoxide, N-methylformamide, urea, or combinations thereof [38,51,52]。最后,改变基础的解决方案从华盛顿大学低钾携带解决方案可以降低跨膜渗透压力水解冻分数。

总之,本研究把冰调节器到大鼠肝脏局部冻结协议延长肝脏的保存时间。我们证明AFGP和X / z - 1000冰调节器可以产生有益的影响部分冷冻大鼠肝脏ATP和EC含量,分别。然而,进一步阐明工作最优冰鸡尾酒调制器是必要AFGP肝脏有高水平的内皮细胞DNA损伤和X / z - 1000肝脏遭受post-freeze水肿。修改注册会计师的组合,以及改进机器灌注CPA装卸,可以帮助改善这些部分的可行性冰冻的器官。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到相应的作者。

道德声明

所有研究符合伦理规定和实验协议机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)的马萨诸塞州总医院(美国波士顿)。

作者的贡献

圣、CP、SC、麻省理工学院、GF,满足,和KU构思和设计研究;圣、CP和SC进行实验;圣,哦,嗯,LW, HY, JM, GF,满足,和KU分析和解释数据;圣、CP和哦进行统计分析;圣哦写的手稿;所有作者参与重要的修订手稿的知识内容;所有作者的手稿的准备。

资金

这项研究是由美国国立卫生研究院(R01DK114506, R01DK096075、R01DK107875 R21GM143659)和NSF ATP-Bio ERC格兰特(NSF 1941543)。进一步,我们感激地承认资金SNT NIH (K99 / R00 HL1431149;R01HL157803),美国心脏协会(18 cda34110049),埃莉诺和英里海岸奖学金,哈佛医学院和Claflin于杰出学者奖代表MGH执行委员会在研究。我们感激地承认研究由美国肝脏基金会支持哦(2019汉斯·波普尔纪念博士后研究奖学金)和美国外科医生(批准号1123 - 39991奖学金捐赠基金)。

确认

我们感谢MGH细胞资源核心援助与灌注设备和质谱特别共享设施在后来儿童医院(波士顿)量化的组织腺苷酸水平。最后,我们感谢我们的合作对高低温器官保存Sylvatica生物技术有限公司

的利益冲突

作者麻省理工学院是受雇于公司Sylvatica生物技术公司和女朋友是受雇于该公司21世纪医学。MGH-affiliated作者申报利益冲突。太,KU、圣、LW SC, CP与本研究相关的专利申请。KU金融利益机关解决方案,公司专注于开发器官保存技术。太、KU和圣担任科学顾问委员会Sylvatica生物技术公司,公司致力于开发高低温器官保存技术。利益竞争MGH调查人员管理的MGH依照他们的利益冲突和合作伙伴的医疗政策。

其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fphy.2022.1033613/full补充材料

缩写

3-OMG 3-O-methyl -d葡萄糖;方差分析,方差分析;AFGP抗冻糖蛋白;BSA,牛血清白蛋白;注册会计师,冷冻剂;电子商务、能源费用;他走时,苏木精和伊红;他,羟乙基淀粉;人类白细胞抗原HLA,;低温机器灌注高熔点; INAs, ice nucleating agents; IRIs, ice recrystallization inhibitors; IVC, infrahepatic vena cava; IACUC, Institutional Animal Care and Use Committee; LT, liver transplant; M, molarity; PEG, polyethylene glycol; X/Z-1000, polyvinyl alcohol/polyglycerol; PV, Portal Vein; SCS, static cold storage; SEC, sinusoidal endothelial cells; SNMP, subnormothermic machine perfusion; TUNEL, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling; UW, University of Wisconsin; WE, Williams E.

引用