抗菌和抗炎作用尤金尼亚brejoensis精油对小鼠伤口感染金黄色葡萄球菌
- 1Laboratorio de Patogenicidade Microbiana Ceuma大学,圣路易斯,妈,巴西
- 2项目Pos-graduacao em Biologia Microbiana Ceuma大学,圣路易斯,妈,巴西
- 3项目Pos-graduacao em Odontologia Ceuma大学,圣路易斯,妈,巴西
- 4Laboratorio de Bioquimica de Proteinas Centro de Biociencias Departamento de Bioquimica大学联邦德伯南布哥,累西腓,巴西
尤金尼亚brejoensisMazine(桃金娘科)是精油的来源(EbEO)与抗感染药活动金黄色葡萄球菌。本研究评估EbEO的抗菌和抗炎潜力金黄色葡萄球菌来华的皮肤伤口。切除病变(64毫米2(6)诱导在瑞士老鼠回8-week-old)被分配到3组(n = 12):1)未受感染的伤口(CON);2)伤口感染金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538 (Sa);3)金黄色葡萄球菌来华的伤口,处理EbEO (Sa) + EbEO)。感染组收到大约104CFU /伤口。动物们对待EbEO(10µg /伤/天)或车辆从天感染后直到第十dpi (dpi)。临床参数(伤口面积,渗出物,水肿强度,等等)是每日分析。炎症介质的水平(细胞因子、一氧化氮、VEGF)和细菌负荷测量在皮肤组织4日dpi dpi和第十。局部应用EbEO加速伤口收缩收缩平均为83.48±11.27%的病变区域,直到第六dpi。在此期间,病灶萎缩的利率是54.28±5.57%和34.5±2.67%反对和Sa组,分别。的积极作用EbEO伤口收缩与显著相关(p< 0.05)减少细菌负荷和炎症介质的释放(il - 6, IL-17A, TNF-α,没有和VEGF)。综上所述,这些数据证实EbEO抗菌素的潜力,并提供洞察其抗炎作用,让这精油一个有趣的新治疗方法的开发候选人感染皮肤的伤口。
介绍
金黄色葡萄球菌通常见于皮肤微生物群,使其皮肤损伤的常见污染物(Parlet et al ., 2019;张et al ., 2021)。的存在金黄色葡萄球菌在伤口可能损害的愈合过程由于延长炎症阶段,表现为白细胞的招聘和释放细胞因子(TNF-αIFN-γ和IL-1β)、一氧化氮(NO)和其他效应分子(卡瓦略et al ., 2018;Carneiro et al ., 2021;Hatlen和米勒,2021年)。
在植物的产品,精油(OE)突出是由于它们的化学多样性和一些药理属性包括抗氧化剂,抗炎,antinociceptive、抗菌和愈合作用)(Bezerra球场et al ., 2020;Bunse et al ., 2022;科斯塔et al ., 2020 a;科斯塔et al ., 2020 b;Ćavar Zeljkovićet al ., 2022;Nascimento et al ., 2022)。这些特性使得EO有趣的替代药物治疗感染伤口(Nascimento et al ., 2022;Omarizadeh et al ., 2021)。
尤金尼亚brejoensisMazine(桃金娘科)是一种EO-bearing工厂在巴西东北部发现了在Caatinga域。获得的精油从它的叶子(命名为EbEO)已经在先前的研究特征主要由δ-cadinene,β-caryophyllene,α-muurolol,α-cadinol bicyclogermacrene,尽管这些植物成份的丰度提出了一些相应的差异研究条件可能由于季节性气候变化和土壤组成和设备用于化学表征(席尔瓦et al ., 2015;Souza et al ., 2017;门德斯et al ., 2018)。EbEO有广谱抗菌作用和反Trypanossoma cruzi效果,除了对海拉细胞毒性致癌细胞(Bezerra球场et al ., 2020;门德斯et al ., 2018;席尔瓦et al ., 2015;桑塔纳et al ., 2020)。特别是,EbEO显示在活的有机体内抗菌活性对金黄色葡萄球菌使用的幼虫广场mellonella和秀丽隐杆线虫模型(Bezerra球场et al ., 2020)。
尽管这些无脊椎动物模型提供的这些见解,EbEO尚未报道的抗菌作用在哺乳动物模型。因此,本研究旨在评估的精油的抗菌活性EbEO造成皮肤感染的小鼠模型金黄色葡萄球菌。
材料和方法
获得的精油大肠brejoensis
获得的植物材料在帕克(不做Catimbau (Buique、巴西)、加工和存放标本的西班牙Agronomico德伯南布哥(代金券号码:音标84.033)。EbEO得到的干叶子hydrodistillation 4 h Clevenger-type装置。提取后,得到EbEO在无水硫酸钠干燥和保存在惰性玻璃管保护。EbEO用于本研究的样本的特征门德斯et al。(2018)和β- (E)石竹烯(31.0%)、δ-cadinene(20.0%),和bicyclogermacrene(12.0%)作为主要的化合物(门德斯et al ., 2018)。
动物
的在活的有机体内研究动物设施的进行大学CEUMA(圣路易斯,巴西),批准后由其机构动物伦理委员会(协议号00013/18)。瑞士健康老鼠(n = 36;6 - 8周的年龄)保存在一个通风的房间平均温度21°C, 12 h明暗周期和收到了水和食物随意。聚丙烯的笼子里分配的实验进行通风架与独立的吹气和排气系统被用来减少感染的风险。
切除伤口感染金黄色葡萄球菌
老鼠肌肉麻醉(1毫克/公斤甲苯噻嗪盐酸和50毫克/公斤氯化氯胺酮)。之后,背地区trichotomized清洁和无菌150毫米氯化钠和70%的酒精。皮肤是划分使用消毒胶粘纸模(64毫米2)和皮肤被blunt-tipped剪刀和解剖钳。金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538(约4.0×106CFU /伤口)被添加到每个切除病变,除了诈骗集团获得80μL盐溶液(Carneiro et al ., 2021)。
实验小组和局部治疗
开始1 day-post感染的局部治疗(dpi)。动物分布在三组:
•欺诈(n = 12):动物与未感染伤口和日常处理无菌2% DMSO(二甲亚砜)。
•Sa (n = 12):动物被感染的伤口和日常处理无菌2% DMSO(二甲亚砜)的解决方案。
•Sa + EbEO (n = 12):动物被感染的伤口和日常处理50µL 200μg /毫升EbEO解决方案(10μg /伤口)。精油的解决方案(200μg /毫升)溶解在无菌2% DMSO溶液的解决方案。
治疗期间进行10天内层流,以避免外部污染。宏观检验后,封面是添加到每个病变。小鼠体重和温度也每日检查。动物被麻醉过量安乐死在第三或第十dpi(6动物每天/组)。收集组织标本进行组织学分析,量化的细菌负荷和炎症介质的测量。
宏观损伤的评价
每日进行宏观评价计算的严重性指数(铁et al ., 2019)基于以下参数:伤口面积(鹿),大量的渗出物(0 - 3)类型的渗出物(0 - 4),水肿强度(0 - 3),颜色周围皮肤组织(0 - 4)类型的清创术组织(0 - 3)。一切创伤的拍摄及其面积的计算是通过方程:伤口区域(毫米2)=π。r r, r是最大的半径和“r”是最小的半径。收缩的程度被表示为一个百分比(%)和定义的公式:100×(Wo- w我)/ Wo。在那里,Wo最初的伤口面积和W我是伤口区域各自的一天。
量化的细菌在组织受伤
伤口被背的一面和放置在一个管1毫升的PBS。90年代组织被浸渍在5000 rpm(5周期),其次是离心在2500 rpm(5分钟)。组织溶解产物在PBS稀释10倍和5µL镀在咸甘露醇琼脂。板块在37°C和孵化细菌负荷确定后24 h。结果表示为CFU / g的组织。
剂量的炎症介质和生长因子
组织中的细胞因子水平量化溶解产物样品使用BD仪珠阵列(CBA)鼠标Th1 / Th2 Th17细胞因子工具包(BD生物科学,圣保罗,巴西)- 2的检测il - 4、il - 6、il - 10, IL-17A, IFN-γTNF-α。试验进行的BD Accuri C6流式细胞分析仪,按照制造商的指令进行操作。CBA FCAP数组中的数据分析软件(BD生物科学,圣保罗,巴西)。结果表示为pg / g的组织。
伤口组织的蛋白质浓度是决定使用牛血清白蛋白标准曲线(31.25μg /毫升到500μg /毫升)。一氧化氮(NO)的含量是决定使用格里斯试剂和吸光度值获得使用分光光度计(板读者mb - 580;希尔、深圳、中国)。结果表示为亚硝酸盐(μM) /毫克的蛋白质。血管内皮生长因子(VEGF)水平在伤口组织衡量鼠标VEGF酶联免疫试剂盒(Sigma-Aldrich;巴西圣保罗,SP),按照制造商的指令进行操作。结果表示为pg /毫克的蛋白质。
统计分析
Graphpad棱镜的统计分析进行了5.0 (Graphpad软件公司,圣地亚哥、钙、美国)。数据被表示为平均值±标准误差和分析通过单向方差分析(方差分析),其次是Boferroni测试。意义是在0.05的水平。曲线下面积(AUC)也使用Graphpad棱镜8.4.3计算。提供统计分析中使用的数据补充表S1。
结果
大肠brejoensis精油促进了收缩金黄色葡萄球菌,感染伤口
之前的在活的有机体内应用程序,EbEO被确认的抗菌作用金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538年和256年的最低抑制浓度(MIC)μg /毫升得到先前的报道(Bezerra球场et al ., 2020)。实验模型应用于这项工作构成局部感染的皮肤伤口。这是观察到的动物麻醉后恢复得很好,皮肤切除和诱导金黄色葡萄球菌感染。每只小鼠的体重和温度在整个实验进行了分析。所有实验群体有一个轻微的重量减轻由于损伤的创伤和皮肤感染的发展。在另一天他们设法恢复和稳定他们的平均体重(数据没有显示)。
金黄色葡萄球菌感染伤口伤口收缩率最低,相比其他实验组(图1 a, B)。具体地说,金黄色葡萄球菌显著延迟愈合过程直到6日dpi (p< 0.05),与未感染组。在此期间,病灶萎缩的利率是54.28±5.57%和34.5±2.67%反对和Sa组,分别。EbEO显示治疗组更快的收缩金黄色葡萄球菌来华的伤口收缩平均为83.48±11.27%的病变区域直到6日dpi (p< 0.05)。EbEO治疗加速愈合过程甚至与那些没有感染的动物(p< 0.05)。这一事实的分析,证实了AUC从伤口收缩数据,在EbEO显示治疗组最高的AUC值(图1 c)。
图1。局部治疗的影响尤金尼亚brejoensis精油在皮肤损伤污染金黄色葡萄球菌。(一)代表图像的伤口收缩演化;(B)获得相对伤口收缩值在10天的分析;(C)曲线下面积(AUC)获得的数据从伤口收缩;(D)分析临床参数的实验组临床评估期间。(E)分析曲线下的面积(AUC)的临床参数的老鼠。(@)接受pbs感染伤口面积的统计差异(Sa组)和其他实验群体(CON和Sa + Cramoll组)(p< 0.001);(#)接受pbs感染伤口面积的统计差异(Sa组)和Cramoll-treated感染伤口(Sa) + Cramoll集团)(p< 0.01)。*p< 0.05;* *p< 0.01;* * *p< 0.001;* * *p< 0.0001。
得分基于临床参数的分析表明存在金黄色葡萄球菌三角直到第五dpi(更严重的炎症条件图2)。相反,它被视为EbEO治疗组明显降低2之间的炎症过程nd和5thdpi (p< 0.05),与受感染组(相比图1 d)。这些数据也证实了使用AUC分析(图1 e)。
图2。组织学评价与EbEO局部治疗。(一)伤口组织的分析金黄色葡萄球菌接种(CON组);(B)分析伤口组织感染金黄色葡萄球菌如果不进行治疗(Sa组);(C)分析伤口组织感染金黄色葡萄球菌和治疗由EbEO (Sa) + EbEO集团)。强烈的促炎渗透突出显示箭头。40 X。
所有这些结果都证实了组织学评估(图2),接受pbs伤口感染金黄色葡萄球菌表现出强烈的促炎渗透甚至10天后(图2 b)。另一方面,EbEO治疗降低了免疫细胞的存在(图2 c与温和的多孔性)和组织显示的是另组织愈合(成纤维细胞)。此外,EbEO-treated伤口显示真皮血管化,胶原纤维均匀分布和缺乏皮肤附件。
局部治疗EbEO减少了细菌在伤口污染负荷金黄色葡萄球菌
的在活的有机体内抗菌作用EbEO证实了细菌的定量负荷后皮肤组织活检在3日dpi (图3一)和10日dpi (图3 b)。Sa组提出9.66±0.71日志CFU / g和8.51±0.26日志CFU / g第三dpi和10 dpi,分别。局部治疗与EbEO显著降低(p< 0.05)CFU / g的值在30%左右分析阶段(第三dpi: 7.0±0.21日志CFU /;10日dpi: 6.21±0.23日志CFU / g)。
图3。局部治疗的效果尤金尼亚brejoensis精油对细菌负荷的组织伤口污染金黄色葡萄球菌。(一)3天的治疗后细菌负荷;(B)细菌负荷后10天的治疗。* *p< 0.05;* * *p< 0.001;* * * *p< 0.0001。
EbEO显示,伤口污染有效的抗炎作用金黄色葡萄球菌
组织细胞因子的水平进行了分析,第三dpi和10日dpi;然而,重要的结果只是观察il - 6, IL-17A和TNF-α第三dpi (图4)。确凿的临床分析,Sa组提出的最高水平(p< 0.05)il - 6和TNF-α(il - 6: 7243.38±12.05 pg / g的组织;TNF-α:2804.67±540.13 pg / g)相比,诈骗集团(il - 6: 1170.91±42.53 pg / g;TNF-α:996.78±92.06 pg / g)。IL-17A水平类似于Sa (192.93±23.23 pg / g)和反面组(209.0±12.05 pg / g)。
图4。局部治疗的效果尤金尼亚brejoensis精油的炎症标记物出现在组织伤口污染金黄色葡萄球菌。(一)数量的il - 6在伤口组织;(B)在伤口组织IL-17A量;(C)在伤口组织TNF-α量;(D)的没有在伤口组织;(E)VEGF在伤口组织。*p< 0.05;* *p< 0.01;* * * *p< 0.0001。
EbEO治疗明显降低(90%左右;p< 0.05)生产的il - 6 (803.7±70.27 pg / g), IL-17A (28.13±3.24 pg / g)和TNF-α(266.28±65.52 pg / g)与Sa组。有趣的是,EbEO显著降低的水平IL-17A和TNF-α与CON组(分别为86.54%和73.29%;p< 0.05)。
测量没有在3日dpi和VEGF。伤口从SA组显示更高的生产的(57.86±6.79μM /毫克的蛋白质)和VEGF (2270±196.63 pg /毫克的蛋白质)比未感染的伤口(21.14±5.41μM /毫克的蛋白质和665.37±44.41 pg /毫克的蛋白质,分别)。另一方面,EbEO显著减少这些炎症介质的当地生产(1.50±0.8216μM /毫克的蛋白质和850.16±270 pg /毫克的蛋白质,分别;p< 0.05)。值得注意的是治疗伤口的EbEO设法离开没有值明显低于Sa和反面组(p< 0.05)。
讨论
皮肤感染过程被认为是其中一个因素引起菌血症的发展金黄色葡萄球菌,可侵入血流并传遍身体(Kwiecinski Horswill, 2020;马赛et al ., 2021)。在这项研究中,我们报告的抗菌和抗炎作用EbEO在皮肤伤口感染引起的典范金黄色葡萄球菌。一些来自自然的产品尤金尼亚工厂已报告作为皮肤伤口的愈合剂使用在体外或在活的有机体内模型(阿尔伯克基et al ., 2016;席尔瓦et al ., 2018),然而这些产品的评价在bacterial-infected伤口尚未报道。我们的结果表明,局部管理EbEO加速的收缩金黄色葡萄球菌,通过减少细菌感染伤口负载和炎症介质的水平。
EbEO的抗菌功效金黄色葡萄球菌以前演示了使用这两种吗在体外化验和无脊椎动物感染模型(秀丽隐杆线虫和g . mellonella)。EbEO能够抑制生产重要的毒力因子金黄色葡萄球菌如溶血素和staphyloxanthin (Bezerra球场et al ., 2020)。因此,获得的结果发现在小鼠模型中证实了那些在替代感染模型。
引起的皮肤感染金黄色葡萄球菌加剧了生产相关的促炎细胞因子肿瘤坏死factor-α(TNF-α)和il - 6 (Carneiro et al ., 2021;小林et al ., 2015)。虽然对于疗愈和宿主防御,炎症介质的过度可能导致组织损伤。我们发现EbEO-treated比未经处理的伤口表现严重程度评分降低感染的病变,这些影响是与EbEO抗菌作用及其抗炎的潜力。
一些EO获得尤金尼亚类似的化学成分的植物和EO EbEO显示消炎抗菌的效果(科斯塔et al ., 2020 a)。此外,β-caryophyllene所示是一个模型的治疗作用的皮肤伤口切除大鼠治疗这种化合物减少促炎细胞因子的水平(TNF-α、IFN-γIL-1β和il - 6) (Gushiken et al ., 2022)。在这种情况下,这些数据是按照有效的抗炎效果观察EbEO治疗导致减少的水平不,VEGF、il - 6, TNF-αIL-17A,缓解强烈的促炎症反应引起的金黄色葡萄球菌。
结论
总之,目前的研究表明,局部治疗大肠brejoensis精油加速愈合过程和减少的严重程度金黄色葡萄球菌,诱导创伤减少细菌负荷和炎症介质(IL-17A TNF-α,il - 6, VEGF和NO)。这些数据证实了抗感染的潜在EbEO并提供洞察其抗炎和治疗功效,使这对药物开发石油的一个有趣的替代。的细胞和分子机制参与EbEO治疗应该更好的阐明。
数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
道德声明
动物研究回顾和依法批准的研究伦理委员会的使用Animals-CEUA(协议编号00013/18)。
作者的贡献
概念化,女士,MC, AZ, LCNS;调查:RD, TF, JM、LS、WS,阿宝,EA, CF, AZ, JS;原创作品草稿准备、采访、TF、JM LS, JS;writing-review和编辑,AZ LCNS;融资收购,MS, MC, LCNS。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。
资金
这项工作是由Fundacao德帕罗尽管e Desenvolvimento Cientifico做马拉尼昂(过程数据:UNIVERSAL-01008/18 BEPP-02241/18)和慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(过程数量:426950/2018-6)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.999131/full补充材料
引用
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关键词:caatinga植物挥发性化合物,传染性疾病,皮肤愈合,host-pathogen交互,炎症介质
引用:Diniz RM,费尔南德斯TGF Mendonca JSP,席尔瓦摩门教Saminez世界粮食日,奥利维拉PVd,莫林EADF Figueiredo css, Bezerra球场厘米,科雷亚mtd,席尔瓦MVd Sa苏萨JCd, Zagmignan Nascimento da Silva LC(2022)抗菌和抗炎作用尤金尼亚brejoensis精油对小鼠伤口感染金黄色葡萄球菌。前面。杂志。13:999131。doi: 10.3389 / fphar.2022.999131
收到:2022年7月20日;接受:2022年9月30日;
发表:2022年10月14日。
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米兰Mladenovic塞尔维亚Kragujevac大学版权想一想©2022迪尼斯那样不知满足、、费尔南德斯、资助者,席尔瓦,Saminez,奥利维拉,阿莫林,Figueiredo, Bezerra球场,科雷亚是席尔瓦Sa苏萨,Zagmignan Nascimento达席尔瓦。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
*通信:路易斯·克劳迪奥·达席尔瓦Nascimento,luiscn.silva@ceuma.br,luisclaudionsilva@yahoo.com.br
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