Cyclovirobuxine D,从中医心血管药物,减轻炎症和神经性疼痛主要是通过抑制电压门控钙v3.2渠道
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阴年- 1重点实验室的动物模型和人类疾病机制/云南省重点实验室生物活性肽,离子通道研究和药物开发中心、中国科学院昆明动物研究所,中国科学院昆明,云南,中国
- 2植物化学国家重点实验室和植物资源在中国西部,昆明植物研究所、中国科学院昆明,云南,中国
- 3中国科学院大学,北京,中国
- 4生物科学学院,哥伦比亚大学,纽约,纽约,美国
Cyclovirobuxine D (CVB-D),中药的主要活性组分进行了microphylla,开发安全有效的心血管药物在中国。b . microphylla也被用于缓解各种疼痛症状。在这项研究中,我们审查发现强大和持久的镇痛效果cyclovirobuxine D对几个痛苦的小鼠模型,包括卡拉胶,CFA-induced炎性疼痛和paclitaxel-mediated神经性过敏。Cyclovirobuxine D显示了intraplantar或腹腔内管理类似的镇痛效果。Cyclovirobuxine D强有力地抑制电压门控钙v2.2和Cav3.2通道,但微不足道的影响不同组的疼痛的离子通道分布在初级传入神经元,包括Nav1.7,Nav1.8、TRPV1 TPRA1、TRPM8 ASIC3, P2X2和P2X4。此外,抑制Cav3.2,而不是Cav2.2,扮演着主导的角色在衰减孤立的背根神经节神经元的兴奋性和疼痛缓解的影响cyclovirobuxine d .我们的工作显示,目前正在使用的心血管药物主要有很强的镇痛效果通过Ca的封锁v3.2提供了一个令人信服的理由和依据进行临床研究,把cyclovirobuxine D在疼痛管理。
1介绍
疼痛是全球一个主要的健康和社会经济的负担,并有密集的努力开发新的疗法治疗疼痛和管理(Yekkirala et al ., 2017;科恩et al ., 2021)。常用的疼痛药物包括非甾体抗炎药(非甾体抗炎药),胺再摄取抑制剂、抗癫痫药和阿片类药物(Laev Salakhutdinov, 2021;欧本et al ., 2021)。尽管他们的有效性和广泛使用,这些药物有不同,有时效果不足。当使用过度,造成有害的副作用如消化道出血、焦虑、抑郁症和补充(Laev Salakhutdinov, 2021;欧本et al ., 2021)。因此,仍有需要发展的新颖的止痛剂。
许多目前使用疼痛药物要么是天然产物衍生品从水杨酸(阿司匹林)(Sinniah et al ., 2021)、吗啡(美沙酮)(Kreutzwiser Tawfic, 2020),ω-conotoxin (Ziconotide) (杨et al ., 2019)或再利用的药物开发的最初设计用于抑郁症和癫痫(加巴喷丁(Wiffen et al ., 2017)和阿米替林(摩尔et al ., 2015))。在这种背景下,进一步探索天然产品,特别是临床承认的,新颖的止痛剂发展的可能大大加快这一过程。
进行了microphyllavar。中央研究院(中国黄杨木)是一种传统中药(TCM)广泛应用于心血管疾病管理几个世纪以来(的贝利,2020张)。中国调查人员确定了三萜烯生物碱cyclovirobuxine D (CVB-D) (图1一个)的主要活性成分b . microphylla(王先生和王出版社,1979年;梁et al ., 1981)。随后,这个生物碱是发达Huangyangning活性组分的分散片,一个著名的中国食品和药物管理局批准的药物(CFDA) 2009年冠心病患者心绞痛,心律失常,甚至心脏衰竭(柯et al ., 2016;中国药典委员会,2020年)。CVB-D也被报道将有益的潜力在其他人类疾病,如肿瘤(曾庆红等人。,2021年)、缺血性中风(Ao et al ., 2019),登革热(王et al ., 2021)。传统上,b . microphylla也被用于各种疼痛症状,包括胃痛,牙痛,风湿关节痛(中药学委员会,1999年)。然而,有一个缺乏知识分子机制的镇痛效果。
图1。CVB-D对急性疼痛和炎症的影响过敏小鼠模型。(一)CVB-D的化学结构。(B)CVB-D对辣椒素的影响(Cap)全身剧烈的疼痛。盐水(黑)被用作控制帽(红色),和车辆(灰色)被用作控制CVB-D(蓝色)。AMG517(3毫克/公斤)治疗标记为紫色。老鼠的时间花在舔或取消注入hindpaws清点后5分钟内即pl.注射生理盐水的盐(黑)集团CVB-D车辆(灰色)集团和帽的团体。(C)CVB-D对AITC-induced急性疼痛的影响。盐水(黑)被用作控制AITC(红色),和车辆(灰色)被用作控制CVB-D(蓝色)。- 967079 (A96)治疗标记为绿色。动物行为记录在使用相同的方法图1 b。(D)CVB-D (i.pl的效果。注射)carrageenan-induced机械过敏症。佩恩表的编制者测量与冯·弗雷细丝在指定的时间后即pl.注入生理盐水或卡拉胶。Vehicle-saline(黑)被用作控制vehicle-carrageenan(红色)。CVB-D-saline(灰色)被用作控制CVB-D-carrageenan(蓝色)。统计分析两组之间CVB-D-carrageenan vehicle-carrageenan。(E)CVB-D (i.pl的效果。注射)carrageenan-induced热过敏。在分组一样图1 d。PWL测量使用热板试验在指定的时间后即pl.注入生理盐水或卡拉胶。统计分析两组之间CVB-D-carrageenan vehicle-carrageenan。(F)CVB-D (i.pl的剂量。注射)抑制carrageenan-induced热过敏。每一个散点图显示了PWL动物接受不同剂量的CVB-D注射角叉菜胶后30分钟。(G)CVB-D效果(ip注入)carrageenan-induced机械过敏症。同样的实验程序图1 d,除了CVB-D及其相应的车辆是腹腔内注射前30分钟即pl.注射角叉菜胶。统计分析两组之间CVB-D-carrageenan vehicle-carrageenan。(H)CVB-D (i.pl的效果。注射)CFA-induced机械过敏症。佩恩表的编制者测量与冯·弗雷细丝后两周内即pl.注入生理盐水或特许金融分析师。Vehicle-saline(黑)被用作控制vehicle-CFA(红色)。CVB -d盐水(灰色)被用作控制CVB-D-CFA(蓝色)。统计分析两组之间CVB-D-CFA CFA-vehicle。(我)CVB-D (i.pl的效果。注射)CFA-induced热过敏。分组一样一样的图1 h。PWL测量使用的热板试验表明天后即pl.管理盐水或特许金融分析师。统计分析两组之间CVB-D-CFA CFA-vehicle。数据信息:在每个图表示用于每个实验的老鼠数量。统计学意义是评估使用双尾t以及(双官能团的比较),*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001;ns表示没有意义。确切的t、F和p值显示在附录表S1。所有的数据都意味着±SEM。
因为CVB-D的主要化合物b . microphylla是一种临床使用的药物,我们研究其镇痛潜力和潜在的分子机制。我们对疼痛的CVB-D对几种小鼠模型的影响和一群不同的离子通道表达疼痛的初级传入神经元和参与痛觉。这些渠道包括low-voltage-activated (LVA)钙通道(Cav3.1,v3.2和Cav3.3),high-voltage-activated (HVA)钙通道(Cav2.2),电压门控钠通道(Nav1.7和Nav1.8),瞬时受体电位(TRP)通道(TRPV1 TPRA1和TRPM8),酸感性离子通道(ASIC3)和purinergic频道(P2X2和P2X4)(Zamponi et al ., 2015;Zamponi 2016;Yekkirala et al ., 2017)。我们的研究表明,intraplantar或腹腔内管理CVB-D显著减轻炎症和神经性疼痛小鼠主要通过抑制Cav3.2,一个重要的目标在现代镇痛药物开发(Zamponi et al ., 2015;Zamponi 2016;Yekkirala et al ., 2017)。
2材料和方法
2.1化学物质
Cyclovirobuxine D (CVB-D HY-N0107),辣椒素(hy - 10448)和紫杉醇(HY-B0015)从MedChem表达购买。异硫氰酸烯丙酯(AITC, 115342)是来自人工智能科达化工科技有限公司从Selleckchem AMG 517 (S7115)购买了。a - 967079 (B7702)和三磷酸腺苷二钠盐(B3304)从APExBIO获得。卡拉胶(S51730)从上海购买原液生物技术有限公司l半胱氨酸(A600132)从Sangon生物技术获得。Z944盐酸盐(SML2635) snx - 111 (C1182),(±)薄荷醇(63670 - 100 g - f)(简单地称为薄荷醇在这项研究),CsCH3所以3(C1426) Mg-ATP (A9187) CsOH(232041),和完全弗氏佐剂(CFA, F5881)从Sigma-Aldrich购买。其他化学物质用于电生理学买来Sangon生物技术,包括生理盐水(A501218),氯化钾(A501159) CaCl2(A501330) MgCl2(A100288),玫瑰(A100511)、葡萄糖(A501991) TEA-Cl (A500933) TEA-OH (A501767),氢氧化钠(A100583), KOH (A610441)、中海(A620054), EGTA (A600077) BaCl2(A602020) K-gluconate (A507810)。
2.2动物和道德
C57BL / 6 j小鼠体重在18到22岁的g和年龄在6 - 8周买来SKbex生物技术有限公司有限公司和维护在中国科学院昆明动物研究所的动物服务设施。老鼠的两性动物随机分为6到24个/组。我们一半的雄性和雌性老鼠的一半用于组甚至动物数量,和组包含一个奇怪的动物数量一个鼠标与不同的性别。老鼠维持在一个恒定的温度(22°C)和湿度(55%)与一个12 h光暗周期。畜牧业进行完全是由实验者对整个动物的时间呆在住房设施。实验室外套和手套军团之间的改变。住宅房间是专门用于这项研究和开放只有实验者。小鼠适应测试设备在实验开始之前至少1周。每个动物都住在一个笼子里,防止战争和自由消费食物和水。
所有程序和护理和处理动物的动物保健和使用委员会批准在中国科学院昆明动物研究所,中国科学院(iacuc - re - 2022 - 07 - 002),和实验动物保健原则(NIH出版86 - 23号修订1985年)随访。所有动物实验在室温下进行(约23°C)。
2.3急性疼痛模型
测量前辣椒素——或者AITC-induced剧烈的疼痛,小鼠适应一个树脂玻璃室至少30分钟。基于毒理学研究CVB-D (Yu et al ., 2008),饱和浓度CVB-D(10.07μg 10μL /爪)在5%的乙醇首次刚做好的盐溶液(车辆)和管理到老鼠hindpaws intraplantar (i.pl)注射用micro-syringe 30-gauge针。同样体积的车辆被i pl.注入管理控制。剂量依赖性关系CVB-D动物模型进一步进行和下一节中描述。三十分钟后CVB-D或车辆注入,刚做好的100μM辣椒素生理盐水(10μL /爪),1毫米AITC生理盐水(20μL /爪),或控制盐水管理到足底注射hindpaws表面。老鼠立即回到树脂玻璃室,使用数码摄像机记录疼痛行为。老鼠的时间花在舔或解除注入hindpaws是急性疼痛感应后5分钟内计算。在一些实验中,选择性TRPV1抑制剂- 967079(10毫克/公斤)或特定的TRPA1阻滞剂AMG517(3毫克/公斤)是由腹腔内管理(i.p)注射前1 h i pl.应用辣椒素或AITC。
Capsaicin-induced热过敏是如前所述进行(DuBreuil et al ., 2021)。老鼠首先获得一个i pl.注入车辆(10μL /爪,1% DMSO在盐水snx - 111和Z944;5%乙醇在盐水CVB-D) snx - 111(10μL /爪,53岁ng), CVB-D(10μL /爪,10.07μg)或Z944(10μL /爪,3.84μg)。30分钟后老鼠收到刚做好的100μM辣椒素生理盐水(10μL /爪)i pl.注入。热过敏小鼠热板试验评估了(北京Zhongshidichuang科技发展有限公司,ZS-CTE)。短暂,老鼠放在一个不锈钢板的温度设置52°C(60年代截止时间),和爪子撤军延迟(PWL)小鼠表现出痛苦的反应(舔hindpaw或跳从板)被记录。行为进行了评估0分钟,15分钟和30分钟后热敏感感应。
2.4炎性疼痛模型
周围炎症painmodels被i pl.注射角叉菜胶或生成CFA的hindpaws老鼠。我们使用卡拉胶3%盐水诱导sub-acute炎症如前所述(Helyes et al ., 2009;日圆et al ., 2009)。老鼠首先获得一个i pl.或i . p .注入车辆(10μL /爪,一样在2.3),snx - 111(10μL /爪,53岁ng), CVB-D(10μL /爪,10.07μg i pl.注射;i . p .管理5毫克/公斤),Z944(10μL /爪,3.84μg i pl.注射;i . p .政府3毫克/公斤),和一个组合(i . pl。) snx - 111和CVB-D或Z944。剂量依赖性关系研究CVB-D、老鼠收到一个i pl.注入CVB-D(10μL /爪)浓度从0.4到10.07μg。三十分钟后,老鼠被分为两组:那些收到另一个i pl.注入生理盐水(50μL /爪)和卡拉胶(50μL /爪),分别。行为评估(冯·弗雷测试或热板试验)在前30分钟,10分钟、30分钟、60分钟、1天,2天之后过敏归纳。
在CFA模型中,老鼠首先收到一个i pl.注入车辆(10μL /爪,一样在2.3),CVB-D(10μL /爪,10.07μg)或Z944(10μL /爪,3.84μg)。三十分钟后,20μL CFA(1:1的乳化盐)或生理盐水被我管理pl.注入。接受这种治疗的时间被设置为0。机械和热过敏CFA注射后两周内进行了研究。机械过敏症研究0天,第一天,第二天,第四天,7天,10天,14天,和热过敏评估0天,第一天,第二天,第四天,第七天,12天。
评估机械过敏症,老鼠被放置在一个塑料笼网底部和被允许适应直到笼勘探和主要梳理活动停止。50%机械爪撤军阈值(佩恩表的编制者)评估与冯·弗雷细丝(北海岸的医疗公司,NC12775)采用升降法(Chaplan et al ., 1994)。热过敏是评估使用热板试验如2.3节所述。
2.5l-cysteine-induced疼痛模型
为l-cysteine-induced超敏反应模型,小鼠l根据协议如前所述(半胱氨酸Todorovic et al ., 2001)。总之,老鼠首先收到一个i pl.注入车辆(10μL /爪,一样在2.3),CVB-D(10μL /爪,10.07μg)或Z944(10μL /爪,3.84μg)。三十分钟后,老鼠了l半胱氨酸(1μg /爪,20μL)或由i pl.注射生理盐水。行为评估(冯·弗雷测试或热板试验)在10分钟后过敏感应使用相同的方法在2.3节和2.4节所述。
2.6 Paclitaxel-induced神经性疼痛模型
小鼠接受紫杉醇基于先前描述的协议(Abed et al ., 2017;李et al ., 2017;Caillaud et al ., 2021)。总之,老鼠收到4毫克/公斤i . p .政府的紫杉醇每隔一天总共四个注射(天0、2、4、6),导致最后累积剂量16毫克/公斤。三十分钟前的第一个政府紫杉醇、老鼠收到一个i pl.注入车辆(10μL /爪,一样在2.3),CVB-D(10μL /爪,10.07μg)或Z944(10μL /爪,3.84μg)。控制动物只收到一封相同体积的生理盐水。热过敏研究使用相同的方法如2.3节所述。热敏感的基线评估前30分钟CVB-D或Z944应用程序(第0天)。检查站第0天,4天,7天,10天,14天。
致盲没有进行上述小鼠模型,测试人员也进行了建模和畜牧业。此外,这些模型的影响是很明显的在处理动物和执行测试。
2.7主要背根神经节神经元文化
吸入麻醉是首先应用于成年老鼠。然后背根神经节解剖,冲洗和汉克的缓冲区(Gibco, 13150016),和消化在同一个缓冲区含1.5毫克/毫升胶原酶P(罗氏诊断,11213865001)25-45分钟在37°C。部分消化组织在200×g离心3分钟,和球团resuspended 0.25% trypsin-EDTA (Gibco, 25200056)和消化额外增加5分钟37°C。消化神经节旋转下来,resuspended和磨碎用塑料吸管技巧释放神经元。这些细胞被过滤70 -μm细胞过滤器(Biologix, 15 - 1070),镀成24-well盘子,然后在保利-整除和培养d-lysine-treated 35毫米菜含DMEM / F-12 (Gibco, 11320033)补充GlutaMAX (Gibco, 35050061)和10%胎牛血清(Gibco, 10100)。电生理实验2 h后文化。
2.8 HEK 293 t细胞培养和转染
HEK 293 t细胞(美式文化集合(写明ATCC)生长在DMEM(生物产业,01 - 055 - 1 - a)加上10%胎牛血清(青霉素Gibco, 10100)和1% (100 U /毫升)/链霉素(0.1毫克/毫升;生物产业,03 - 031 - 1 - b)。暂时HEK 293 t细胞转染与pCDNA3.1-human TRPA1 (NM_007332.3),人类TRPV1 (AJ277028.1),人类TRPM8 (NM_024080.5),鼠P2X2(NM_053656.3),人类的P2X4(NM_002560.3),鼠ASIC3 (NM_173135.1),鼠Nav1.7 (NM_133289.1),人类Nav1.8 (NM_006514.3),人类的Cav3.1 (NM_198387.3),人类的Cav3.2 (NM_021098.3),人类的Cav3.3 (NM_021096.4)和人类的Cav2.2 (NM_000718.4)(鼠β3 (NM_012828.3)和兔α2δ(NM_001082276.1)子单元),连同pEGFPN1 (Addgene, 6085 - 1)使用LipoD293质粒在体外DNA转染试剂(SignaGen实验室、SL100668)和使用在48 h。
2.9电生理学
膜片钳放大器Axopatch 200 b(轴突,美国)和双异丙醇(萨特仪器、美国),这是一个集成的膜片钳放大器和数据采集系统,用于细胞电信号放大。一个数模转换器1440 Digidata(轴突,美国)是用于数字电信号转换Axopatch 200 b时使用。电流被低通滤波在2千赫采样10 kHz。记录包括分析只有在访问抗性开始低于25 MΩ并没有改变,在录音期间30%以上。pCLAMP 10软件(分子器件、美国)和SutterPatch2.1软件(萨特仪器)是用于数据采集和分析。所有实验在室温下进行(约23°C)。膜片箝记录,吸量管从硼硅玻璃制造(世界精密仪器,PG52151-4)使用微量吸液管拉出器(p - 1000、萨特仪器),fire-polished抗性的4 - 6 MΩ全细胞记录。所有的实验,比较不同条件下进行了进行了双盲。
衣架式钙通道(Cav3.1 - -3.3)电流测量,细胞外的解决方案包含(毫米)142年中海,1 MgCl22 CaCl2,10葡萄糖和玫瑰与CsOH (pH值7.4调整)。细胞内的解决方案包含(mM) 142年中海,2 MgCl211 EGTA 5 Na2atp, 10玫瑰与CsOH (pH值7.4调整)。Ca的峰值电流v3.1和Cav3.2被150 - ms去极化引起−40每隔4 s mV控股的潜在(HP)−100 mV。Ca的记录峰值电流v3.3,刺激时间被设置为400 ms。为研究Ca的依赖v3.2,惠普将−100 mV和−75 mV,分别。为研究use-dependent Cav3.2、刺激频率设置为0.1赫兹和1赫兹,分别。Ca的电流-电压曲线v3.1和Cav3.2被唤起150 - 80−去极化mV女士+ 60 mV 10-mV增量的4 s间隔从惠普−100 mV。Ca的记录电流-电压曲线v3.3,刺激时间被设置为400 ms。
压敏电阻器的激活钙v3.2被应用的一系列刺激150 -步骤去极化女士从80−+ 40 mV 5-mV增量的4 s间隔从惠普−100 mV。每个电压的峰值电流测量和相应的电导计算G)使用方程:G = I / V (V−牧师),V是测试电压和V牧师线性外推法计算的峰值电流和去极化电位从10到40 mV。规范化G当时策划针对电压、和激活曲线是通过玻耳兹曼配件:G / Gmax = 1 / {1 + exp (V1/2−V) / k)}, Gmax最大电导,V1/2half-maximal激活的潜力,k是斜率因子。
Ca的失活v3.2研究通过比较当前振幅(P1)引起的电压一步−40 mV (10 ms)在缺乏快速失活第二步(P2)后的一系列150 -钝化步骤女士从100−−30 mV 5-mV增量的4 s间隔从惠普−110 mV。P1随后−1 s复苏一步110 mV删除任何引起的失活P1。P2 / P1比率作为衡量分数可用的频道。归一化剩余电流是绘制的电压调节脉冲。失活曲线都配备了玻耳兹曼函数形式的I / Imax = 1 / {1 + exp (V1/2−V) / k)}。
n型钙通道(Cav2.2)电流测量,细胞外的解决方案包含(毫米)105年中海,BaCl 40 TEA-Cl, 221 MgCl2,10d葡萄糖和10个玫瑰与CsOH (pH值7.4调整)。细胞内的解决方案包含130 CsCH(毫米)3所以310 TEA-Cl 10 EGTA, 10玫瑰,5 MgCl25 Na2与CsOH atp (pH值7.4调整)。Ca的峰值电流v2.2引发了500 -女士去极化0 mV每隔4 s的惠普−80 mV。依赖政府的研究中,惠普将80−−60 mV,分别。Ca的电流-电压曲线v从−2.2唤起了500 -女士去极化60 mV + 70 mV与4 s 10-mV增量区间从惠普−80 mV。
TRP通道录音,细胞外的解决方案包含(150毫米)氯化钠,1 MgCl2和10个玫瑰与氢氧化钠(pH值7.4调整)。细胞内的解决方案包含(150毫米)氯化钠,1 MgCl21 EGTA, 10玫瑰与氢氧化钠(pH值7.4调整)。ASIC3, P2X2和P2X4录音,TPR的细胞外的解决方案是一样的通道。细胞内的解决方案包含140氯化钾(mM), 5 EGTA, 10玫瑰与氢氧化钠(pH值7.4调整)。TRPA1的全细胞电流,TRPM8和TRPV1引起500 -电压斜坡女士从100年−到+ 100 mV 0.5赫兹的频率与惠普(0)mV。ASIC3的全细胞电流,P2X2和P2X4被膨胀模式记录的惠普−60 mV。对Nav1.7和Nav1.8记录,内部解决方案包含135 K-gluconate(毫米),5氯化钾,5 Mg-ATP 0.5 Na2三磷酸鸟苷5玫瑰,2 MgCl20.5、5 EGTA和CaCl2调整与KOH pH值7.4,和浴缸的解决方案包含(140毫米)氯化钠,氯化钾,2 CaCl22 MgCl2,10玫瑰,和10葡萄糖,调整与氢氧化钠pH值7.4。Na的峰值电流v1.7和Nav1.8被10 ms诱发去极化−30 mV每隔5 s的惠普−110 mV。
全细胞记录的背根神经节(DRG)神经元,镀后2小时,灌注分离DRG神经元的细胞外的解决方案包含10 BaCl(毫米)210 152 TEA-Cl,消息灵通的调整与TEA-OH pH值7.4。记录电极充满了一个解决方案包含135 TEA-Cl(毫米),10 EGTA MgCl 40玫瑰,22调整与TEA-OH pH值7.2。LVA钙通道电流峰值被250 -诱发女士去极化−40 mV每隔4 s的惠普−100 mV。HVA钙通道电流峰值被250 -诱发女士去极化从惠普每隔4 s + 10 mV−80 mV。DRG神经元与等直径10 ~ 30μm选择录音。
背根神经节神经元的组织current-clamp记录,内部和浴Na的解决方案是一样的v频道录制。DRG神经元举行0 pA,动作电位的阈值电流是诱发使用一系列的500 -女士去极化电流注入10-pA步骤从0。只有神经元静息膜电位低于−40 mV,稳定的基线记录,显示诱发峰值超过0 mV被用于进一步的实验和分析。串联电阻是补偿75%以上记录DRG神经元。
电生理实验,细胞外的解决方案包含CVB-D, Z944, snx - 111, AITC,薄荷醇,辣椒素,或ATP立即在实验前就做好了准备。
2.10统计
我们使用样品/动物大小被认为适合统计和类似于其他的研究领域。动物被随机选择和分配给实验团体。Shapiro-Wilk常态评估的数据方法,差异平等的两个或两个以上的数据组是由野生或列文的测试。统计学意义是评估使用双尾t以及(对于所有群比较)或单向方差分析(方差分析)其次是图基的和LSD测试(多群比较)。数据给出平均值±标准平均误差(SEM),和一个p值< 0.05被认为是显著,*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。多组比较,星号,英镑迹象或&分别使用ns表示没有显著性差异。
3的结果
3.1 Cyclovirobuxine D减轻炎性疼痛
评估CVB-D的镇痛效果,我们首先检查其alleviationon辣椒素(Cap)引起的急性疼痛和AITC分别激活TRPV1和TRPA1。帽或AITC (i.pl。老鼠注射)引起的健壮的急性疼痛的反应,表现为舔或取消注入hindpaws (图1 b, C)。这些反应主要由前政府阻止TRPV1-specific拮抗剂AMG 517或选择性TRPA1-inhibitor - 967079 (A96)p价值的p< 0.001和p分别为= 0.007,但不是CVB-D (图1 b, Cp帽和CVB-D = 0.329;pAITC vs CVB-D = 0.697)。CVB-D (i.pl。注射)单独不引起过敏的反应(图1 b, C,补充图S1A。p= 0.529)。因此,CVB-D并不影响TRPA1或TRPV1-mediated急性疼痛。
我们下一个检查CVB-D的影响两个典型的鼠标引起的炎性疼痛模型i pl.注射角叉菜胶和CFA,分别。carrageenan-induced模型中,没有noticeble区别男性和女性之间的机械过敏性小鼠在控制和测试组(补充图印地。p每个测试点的值是0.221,0.551,0.451,0.389,0.495,和0.492,分别)。因此,结果从两性结合数据分析和统计。Carrageenan-induced机械和热敏感,表现为降低爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)或爪子撤军延迟(PWL),分别达到10 ~ 30分钟,逐步衰落超过2天(sub-acute阶段)。独自CVB-D(10.07μg)管理即pl.注入并不影响佩恩表的编制者或PWL控制动物(图1 d, E,补充数据就是S1C, D。在补充图就是S1C,p= 0.796为生理盐水和车辆,p生理盐水与CVB-D = 0.578,p= 0.780车辆与CVB-D。在补充图S1D,p= 0.932为生理盐水和车辆,p生理盐水与CVB-D = 0.390,p= 0.717车辆比CVB-D)。相比之下,它(i.pl。注射)减少急性(10、30和60分钟)和sub-acute阶段(第一天)机械过敏(图1 dp每个测试点的值是0.300、0.001 < 0.001,< 0.001、0.009和0.463,分别)。引人注目的是,在这个剂量CVB-D阻止热过敏(的发展图1 ep每个测试点的值是0.121、0.000 < 0.001,< 0.001,< 0.001和0.053,分别)。在剂量范围0.4 - -10.0μg pl.注入,CVB-D摄入量有关延长了PWL以30分钟卡拉胶注射后,欧共体502.03±0.53μg (图1 f和补充图S1E)。CVB-D管理局(5毫克/公斤)i . p .注射也产生机械obviousanalgesic影响过敏而不影响基线佩恩表的编制者(图1 g和补充图S1F。p价值在图1 g每个测试点是0.234,0.000,0.000,0.000,0.002,和0.051,分别。在补充图S1F,p= 0.596为生理盐水和车辆,p生理盐水与CVB-D = 0.623,p= 0.106车辆比CVB-D)。因此,intraplantar和腹腔内管理CVB-D产生明显的镇痛对carrageenan-induced炎症性超敏反应的影响。
CFA-induced过敏症是另一个研究慢性炎性疼痛模型,与高度敏感反应持续大约1 - 2周(伯杰et al ., 2014;林et al ., 2016)。一剂CVB-D(10.07μg) i pl.注入减毒机械过敏(图1 hp每个测试点的值< 0.001,< 0.001,< 0.001,< 0.001,< 0.001、0.185和0.048,分别),在很大程度上消除热过敏(图1我p每个测试点的值是0.383,0.003,0.001,<分别为0.001、0.002和0.007)在2周后注射的CFA。这些长期CVB-D暗示其行动的影响可能不仅涉及起始,也维护CFA-induced过敏症。
这些结果表明,除了心血管生物活性,CVB-D具有较强的镇痛作用炎性疼痛过敏。
3.2 cyclovirobuxine D对重组的影响疼痛的离子通道
调查潜在的分子目标由CVB-D镇痛,我们首先分析了其效果在几个离子通道参与外围伤害感受。CVB-D(30μM)并不影响基底全细胞电流的mock-transfected HEK 293 t细胞,并没有影响agonist-induced电流HEK 293 t细胞表达TRPM8和TRPV1,有害的温度和化学物质(图2 a - c,补充图S2A, B)(Yekkirala et al ., 2017)。CVB-D没有激活TRPA1,另一个有害的化学传感离子通道,但剂量依赖性抑制AITC-induced inward-currents, IC50值为16.03±0.11μM (图2 d和补充图S2C, D)。值得注意的是,CVB-D没有AITC-induced急性疼痛镇痛效果(图1 c),这表明TRPA1 CVB-D不是一个潜在的目标在这个实验中使用的剂量。CVB-D(30μM)也几乎没有影响其他离子通道参与炎症过敏,包括酸感性离子通道3 (ASIC3)和P2X频道,P2X2和P2X4(图2比和补充图S2E)(Yekkirala et al ., 2017),对Na疼痛反应的影响可以忽略不计v1.7和Nav1.8电压门控钠+通道(图2 h,我)(Hameed 2019;雪et al ., 2021)。
图2。CVB-D对重组的影响疼痛的离子通道。(g)代表全细胞电流在模拟转染HEK 293 t细胞(一)或细胞表达TRPM8(B),TRPV1(C),TRPA1(D),ASIC3(E)P2X2(F)和P2X4(G)为了应对500年μM methol(B)1μM辣椒素(C)100μM AITC(D),胞外溶液酸性pH值为5.0(E),100μM ATP(F, G)在没有或存在30μM CVB-D每个通道(n = 4)。(H I)代表全细胞电流HEK 293 t细胞表达Nav1.7和Nav1.8在没有或存在30μM CVB-D。
3.3 Cyclovirobuxine D抑制重组Cav3.2和Cav2.2渠道
LVA钙通道,即衣架钙通道(TTCCs),由Cav3.1 - -3.3。其中,Cav3.2是占主导地位的同种型中大量表达的TTCCs痛觉神经元和被认为是一个有前途的神经性的目标,炎症和内脏痛(Jevtovic-Todorovic Todorovic, 2006;Cai et al ., 2021;Hoppanova Lacinova, 2022)。因此,我们检查了CVB-D对Ca的影响v3通道。CVB-D 30μM强劲抑制全细胞电流HEK 293 t细胞表达Cav3.2 (图3一)。这种抑制是相对缓慢,可以部分逆转(图3 b)。剩余电流完全被Z944(10μM) (图3 b),高亲和力TTCCs抑制剂在临床试验(李,2014;哈丁et al ., 2021)。CVB-D抑制Ca的剂量反应关系v3.2峰值电流获得惠普−100 mV收益率IC502.28±0.35μM (图3 c, D)。CVB-D剂量依赖性抑制Cav3.1和Cav3.3表达HEK 293 t细胞,IC50值μMμM 2.11±0.09, 2.02±1.29,分别为(补充图S3A, B)。
图3。CVB-D-mediated抑制重组Cav3.2和Cav2.2渠道表达HEK 293 t细胞。(一)代表电流电压(电流-电压)的关系v3.2在没有或存在30μM CVB-D。(B)抑制作用的时间进程CVB-D(30μM)和随后的抑制Z944 Ca(10μM)v3.2峰值电流。(C)抑制钙v3.2不同浓度的峰值电流CVB-D。(D)CVB-D抑制Ca的剂量反应关系v3.2峰值电流。坚实的曲线代表适合希尔方程。数据意味着±SEM。每个浓度n = 8 - 12。(E)代表电流-电压关系的Cav2.2在没有或存在10μM CVB-D。(F)抑制作用的时间进程CVB-D(10μM)和随后的抑制snx - 111(0.5μM)的Cav2.2峰值电流。(G)抑制钙v2.2不同浓度的峰值电流CVB-D。(H)CVB-D抑制Ca的剂量反应关系v2.2峰值电流。坚实的曲线代表适合希尔方程。数据意味着±SEM。每个浓度n = 8。
在HVA钙通道,Cav2.2 (n型)是一种行之有效的目标antinociceptive药物开发(Hoppanova Lacinova, 2022)。CVB-D剂量依赖性抑制钙v2.2表达HEK 293 t细胞,一个集成电路50值为1.82±1.40μM (图3情况)。像Ca的抑制v3.2,CVB-D Ca的封锁v2.2只有部分可逆CVB-D冲刷后(图3 f),剩余电流可以完全抑制snx - 111(0.5μM),选择性Cav2.2杀杀杀,临床上用于吗啡麻木疼痛症状(图3 f)。
这些结果,加上上面这些,证明在不同组的外围疼痛的离子通道CVB-D主要抑制衣架和n型钙通道表达HEK 293 t细胞。
3.4规定的其他电生理学性质的重组v3.2和Cav2.2渠道cyclovirobuxine D
我们还研究了Ca的CVB-D对其他电生理特性的影响v3.2和Cav2.2表达HEK 293 t细胞。因为Cav3.2在CVB-D的镇痛效应中起着重要作用,将在以后的章节中,我们主要关注Cav3.2。CVB-D 1μM和3μM Ca的表现出更强的抑制v从惠普75−3.2 mV (Cav3.2部分钝化状态下)于100年从惠普−mV (Cav3.2在静息状态下)(图4一p每个浓度为0.266的值,<分别为0.001、0.002和0.055)。CVB-D有集成电路501.47±0.03μM (图4一)在惠普−75 mV,比2.28μM−的惠普100 mV。因此,CVB-D抑制Cav3.2是依赖政府,更强的灭活的封锁通道。然而,CVB-D抑制Cav2.2是几乎相同的惠普80−−60 mV (图4 bp= 0.755)。CVB-D(2.50μM)明显改变了half-inactivation潜力(V1/2inactCa的)v从3.2−60.53±0.47 mV−64.19±0.89 mV,以及有说服力地改变失活曲线的斜率系数从2.57±0.16 mV 3.54±0.11 mV (图4 cp= 0.001 V的比较1/2inact,p边坡因素比较p < 0.001)。CVB-D显示half-activation潜力(V的微不足道的影响1/2actCa的)v3.2 (−51.99±0.77 mV与−52.91±0.87 mV),但它明显增强激活曲线的斜率系数从3.48±0.21 mV 5.10±0.16 mV (图4 dp= 0.447 V的比较1/2act,p边坡因素比较p < 0.001)。结果,当前窗口,这是由重叠的激活和失活曲线下的面积,被CVB-D消极转移(图4 e)。对Ca CVB-D还显示可忽略的use-dependent影响v3.2与类似的抑制刺激频率的0.1和1赫兹,分别为(图4 f)。有趣的是,Z944显示一个明显的依赖政府抑制Cav3.2但不影响其失活(Tringham et al ., 2012),这表明这两个化合物可能与Cav3.2不同的时尚。
图4。重组Ca CVB-D对电生理特性的影响v3.2和Cav2.2渠道表达HEK 293 t细胞。(一)CVB-D抑制Ca的剂量反应关系v3.2峰值电流从惠普75−100 mV(黑色)或−mV(红色),分别。坚实的曲线代表适合希尔方程。(B)抑制了2.5μM CVB-D Cav2.2−的惠普80 mV或-60 mV,分别。(C)在Ca CVB-D效果(2.5μM)v3.2失活。左面板是Ca的失活曲线v3.2(红色)存在与否CVB-D(黑色)。坚实的曲线代表适合玻耳兹曼方程。正确的上面板half-inactivation潜在的比较(V1/2)在(红色)或缺乏CVB-D(黑色)。右面板比较低的坡度因素的存在(红色)与否CVB-D(黑色)。(D)在Ca CVB-D效果(2.5μM)v3.2激活。左面板是Ca的激活曲线v3.2(蓝色)存在与否CVB-D(黑色)。坚实的曲线代表适合玻耳兹曼方程。正确的上面板half-activation潜在的比较(V1/2)在(蓝色)或缺乏CVB-D(黑色)。右面板比较低的坡度因素的存在(蓝色)与否CVB-D(黑色)。(E)Ca的比较v电流在3.2窗口(红色为失活曲线,蓝色为激活曲线)或缺乏CVB-D(黑色)。(F)CVB-D对Ca的影响v3.2在0.1或1赫兹的频率刺激。数据信息:在每个图表示细胞的数量在每个实验中使用。统计学意义是评估使用双尾t以及(双官能团的比较),*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001;ns表示没有意义。确切的t、F和p值显示在附录表S1。所有的数据都意味着±SEM。
3.5 cyclovirobuxine D对DRG神经元的影响v3.2和Cav2.2电流和兴奋性
我们接下来检查CVB-D对本地的影响v3.2和Cav2.2通道,已被证明是占主导地位的疼痛的LVA和HVA钙通道在中小型DRG神经元(直径在10 ~ 30μm) (Talley et al ., 1999;玫瑰et al ., 2013;北野et al ., 2019;李et al ., 2019;哈桑et al ., 2021;Hoppanova Lacinova, 2022)。全细胞电流由内生Cav3.2和Cav2.2通道记录从新鲜分离小鼠DRG神经元使用不同的去极化电压(Bourinet et al ., 2005)。Z944-sensitive Cav3.2当前诱发−40 mV在很大程度上是被10μM CVB-D (图5一个)。与重组Cav3.2,这种抑制是相对缓慢,很难被逆转(图5 b)。平均而言,Cav3.2电流下降了58.9% 10μM CVB-D (图5 cp浴和CVB-D = 0.026,p浴和Z944 = 0.005,p= 0.022 CVB-D比Z944),几乎是被5μM Z944 (图5 c)。在这个浓度Z944没有影响当前诱发+ 10 mV (HVA补充图S4A)。
图5。CVB-D对DRG神经元钙通道电流的影响和兴奋性。(一)代表LVA (Cav3.2)Ca2 +通道的峰值电流诱发去极化女士到250 - -40 mV(从惠普-100 mV)治疗后的浴(黑),CVB-D(10μM,蓝色)或Z944(5μM,橙色)。(B)抑制作用的时间进程CVB-D(10μM,蓝色)和随后的抑制Z944(5μM,橙色)LVA (Cav3.2)Ca2 +通道峰值电流。(C)量化的LVA (Cav3.2)Ca2 +通道电流密度从神经元处理浴(黑),CVB-D(蓝色)或Z944(橙色)。(D)代表HVA (Cav2.2)Ca2 +由250 - ms去极化通道的峰值电流诱发+ 10 mV(从惠普-100 mV)治疗后的浴(黑),CVB-D(10μM,蓝色)或snx - 111(0.5μM、绿色)。(E)抑制作用的时间进程CVB-D(10μM,蓝色)和随后的抑制snx - 111(0.5μM,绿色)HVA (Cav2.2)Ca2 +通道峰值电流。(F)量化的HVA (Cav2.2)Ca2 +通道电流密度从神经元处理浴(黑),CVB-D(蓝色)或snx - 111(绿色)。(G-J)美联社代表记录由一个阈值神经元去极化电流所引起的发射的浴(G),30μM CVB-D(H)5μM Z944(我),或0.5μM snx - 111(J)。(K)CVB-D效果(蓝色),Z944(橙色)或snx - 111(绿色)的平均诱导美联社发射电流阈值神经元。(左)CVB-D效果(蓝色),Z944(橙色)或snx - 111(绿色)的平均数美联社解雇(峰值)诱发的神经元阈值去极化电流。数据信息:在每个图表示细胞的数量在每个实验中使用。统计学意义是评估使用双尾t以及(对于双官能团的比较)或单向方差分析(方差分析)其次是图基的测试和LSD测试(多群比较),*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001;ns表示没有意义。确切的t、F和p值显示在附录表S1。所有的数据都意味着±SEM。
CVB-D(10μM)也大大抑制snx - 111敏感,Cav2.2介导HVA当前在DRG神经元诱发+ 10 mV (图5 d)。这种抑制作用是缓慢而略可逆(图5 e)。平均10μM CVB-D减少Cav2.2目前的46.8%,相当于snx - 111 0.5μM(的影响图5 fp浴和CVB-D = 0.026,p浴和snx - 111 = 0.002,p= 0.056 CVB-D与snx - 111)。这snx - 111的浓度没有影响v3.2当前诱发−40 mV (补充图S4B)。
接下来,我们检查了CVB-D对DRG神经元的动作电位(AP)解雇。刚分离DRG神经元被随机分为四组:控制(溶液),CVB-D(30μM), Z944(5μM)和snx - 111(0.5μM)。控制神经元,一个阈值去极化电流诱发重复并持续(美联社射击图5克)。引人注目的是,一个阈值去极化电流只引起一个CVB-D-treated和Z944-treated神经元(图5 h,我),说明Ca的至关重要的作用v3.2在美联社解雇这些神经元。相比之下,snx - 111没有明显改变美联社解雇(图5 j)。相比控制神经元,更高的阈值需要去极化电流来产生一个美联社CVB-D-treated和Z944-treated神经元(图5 kp为Ctrl与CVB-D = 0.003,pCtrl与Z944) < 0.001,美联社峰值的数量大幅下降(图5 lp为Ctrl与CVB-D = 0.002,pCtrl与Z944 = 0.001)。没有这样的效果观察snx - 111治疗神经元(图5 k,L。p为Ctrl与snx - 111 = 0.911图5 k,p为Ctrl与snx - 111 = 0.721图5 l)。
这些结果表明,CVB-D强有力地抑制本地Cav3.2和Cav2.2通道和抑制v3.2,但不是Cav2.2,大大减少DRG神经元的兴奋性。
3.6钙v3.2过程中起着重要作用的镇痛效应cyclovirobuxine D
接下来我们研究了Ca的重要性v3.2 CVB-D的镇痛效果。l半胱氨酸促进皮肤的机械和热过敏通过快速通过Ca和具体方式v3.2通道(Todorovic et al ., 2001)。CVB-D管理局(10.07μg) i pl.注入极大的佩恩表的编制者和PWL中恢复过来l在老鼠-cysteine-induced过敏(图6 a, B。在图6,p= 0.001盐水VS。l-cystetine,p= 0.797 saline-CVB-D vs CVB-D -l半胱氨酸,p= 0.007l半胱氨酸对CVB-D -l半胱氨酸。在图6 b,p= 0.006盐水VS。l-cystetine,p= 0.130 saline-CVB-D vs CVB-D -l半胱氨酸,p< 0.001l半胱氨酸对CVB-D -l半胱氨酸)。Z944(3.84μg)适用于i pl.注入显示比较镇痛效果在触觉敏感CVB-D (图6 cp= 0.002l半胱氨酸和CVB-D,p< 0.001l半胱氨酸和Z944,pCVB-D vs Z944 = 0.849)而不影响基线佩恩表的编制者或PWL (S5A补充数据,B。在补充图S5A,p= 0.969为生理盐水和车辆,p生理盐水与Z944 = 0.464,p= 0.056车辆与Z944。在补充图S5B,p= 0.721为生理盐水和车辆,p生理盐水与Z944 = 0.682,p= 0.580车辆比Z944)。
图6。Ca的主要作用v3.2在小鼠模型CVB-D的镇痛效应。(一)CVB-D影响l-cysteine-induced机械过敏症。盐水(黑)是用来控制l半胱氨酸(红色)、汽车(灰色)被用作控制CVB-D(蓝色)。佩恩表的编制者测量与冯·弗雷丝在10分钟后即pl.注入生理盐水(黑色),CVB-D(灰色)l半胱氨酸(红色和蓝色)。(B)CVB-D影响l-cystetine-induced热过敏。与在相同的分组和实验过程,除了PWL热板试验的测定。(C)比较CVB-D和Z944的镇痛效果l-cystetine-induced机械过敏症。(D)Z944 (i.pl的效果。注射)carrageenan-induced机械过敏症。同样的实验程序图1 g,除了Z944(3.84μg /爪、橙)intraplantarly注射角叉菜胶注射前30分钟(红色)。Vehicle-saline(黑)被用作控制vehicle-carrageenan(红色)。Z944-saline(灰色)被用作控制Z944-carrageenan(橙色)。统计分析两组之间Z944-carrageenan Vehicle-carrageenan。(E)Z944 (i.pl的效果。注射)carrageenan-induced热过敏。同样的实验程序图6 d。团体之间的统计分析进行Z944-carrageenan(橙色)和Vehicle-carrageenan(红色)。(F)Z944效果(ip注入)carrageenan-induced机械过敏症。同样的实验程序图6 d,除了Z944(1毫克/公斤,橙色)及其相应的车辆(灰色)腹腔注射30分钟前注射角叉菜胶(红色)。统计分析两组之间Z944-carrageenan Vehicle-carrageenan。(G)比较CVB-D的镇痛效果和Z944 (i pl.注入)carrageenan-induced热过敏在卡拉胶治疗后30分钟。(H)比较CVB-D的镇痛效果和Z944 (i . p .注射)carrageenan-induced机械过敏症在卡拉胶治疗后30分钟。(我)比较CVB-D的镇痛效果和Z944 (i pl.注入)CFA-induced机械过敏症。团体之间的统计学意义CVB-D-CFA(蓝色)和Vehicle-CFA(红色)由星号标记,这组之间的Z944-CFA(橙色)和Vehicle-CFA(红色),英镑的迹象。在每个图表示数据信息:老鼠的数量在每个实验使用。统计学意义是评估使用双尾t以及(对于双官能团的比较)或单向方差分析(方差分析)其次是图基的和LSD测试(多群比较),*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001,#p< 0.05,# #p< 0.01,# # #p< 0.001;ns表示没有意义。确切的t、F和p值显示在附录表S1。所有的数据都意味着±SEM。
在carrageenan-induced小鼠模型,i . pl。(3.84μg)或i . p。(3毫克/公斤)注入Z944缓解急性和sub-acute阶段的热力和机械过敏(图6 d-fp价值在图6 d每个测试点是0.848,< 0.001,< 0.001,< 0.001,< 0.001和0.008,分别。p价值在图6 e每个测试点是0.055,< 0.001,< 0.001,< 0.001,< 0.001和0.001,分别。p价值在图6 f每个测试点是0.627 < 0.001,< 0.001,< 0.001、0.039和0.481,分别)。这些影响与CVB-D,以比较的效果在30分钟的测试时间(图6 g H。在图6克,p卡拉胶与CVB-D < 0.001,p卡拉胶与Z944 < 0.001,pCVB-D vs Z944 = 0.247。在图6 h,p卡拉胶与CVB-D < 0.001,p卡拉胶与Z944 < 0.001,pCVB-D = 0.247 (i.p)。比Z944)。值得注意的是,与CVB-D一样,单剂量的Z944 i pl.注入持续消除机械过敏症从第一天到第七天CFA-induced小鼠模型(图6我和补充图S5E。在图6我,p每个测试点的值vehicle-CFA和CVB-D-CFA < 0.001, < 0.001, < 0.001, < 0.001, < 0.001、0.185和0.048,分别。p每个测试点的值vehicle-CFA和Z944-CFA < 0.001, < 0.001, < 0.001, < 0.001, < 0.001、0.881和0.005,分别。p价值CVB-D-CFA和Z944-CFA每个测试点是0.109,0.081,0.102,<分别为0.001,0.618,0.097和0.268。在补充图S5E,p每个测试点的值vehicle-CFA和Z944-CFA < 0.001, < 0.001, < 0.001, < 0.001, < 0.001、0.881和0.969,分别)。Z944单独注射(ip)并不影响基线佩恩表的编制者(补充图S5C。p= 0.508为生理盐水和车辆,p生理盐水与Z944 = 0.633,p= 0.431车辆比Z944)。CVB-D车辆和Z944显示对基底的影响可以忽略不计机械感觉和carrageenan-induced触觉敏感(补充图S5D。p价值的车辆(5%乙醇)+生理盐水与车辆(1% DMSO) +生理盐水的每个测试点是0.963,0.123,0.630,0.031,0.235,和1.000,分别。p价值的车辆(5%乙醇)+卡拉胶与车辆(1% DMSO) +卡拉胶的每个测试点是0.604,0.517,0.470,0.811,0.155,和0.039,分别)。
这些结果表明,Cav3.2过程中起着重要作用的镇痛效应CVB-D Z944。
3.7钙v2.2扮演小角色的镇痛效应cyclovirobuxine D
Cav2.2起着至关重要的作用在背角AP-induced发射机释放(Jevtovic-Todorovic Todorovic, 2006;Yu et al ., 2008)。据报道,Cav2.2还参与TRPV1-mediated热敏感轴突外围正常皮肤(DuBreuil et al ., 2021)。符合本研究中,我们观察到,即pl.注入snx - 111 (53 ng)减毒TRPV1-mediated热过敏(图7p价值的帽子和帽+ snx - 111的每个测试点是0.634,0.003,和0.598,分别)。然而,CVB-D(10.07μg)或Z944(3.84μg)管理,即pl.注入了更为强大的镇痛效应比snx - 111 (图7 b, Cp价值的帽子和帽+ CVB-D f(每个测试点是0.383,<分别为0.001和0.001。p价值的帽子和帽+ Z944每个测试点是0.304,<分别为0.001和0.034)。事实上,PWL顶注气后15或30分钟甚至超过基线PWL(0分)图7 b, C)。这些结果表明,Cav3.2比Ca中发挥更大的作用v2.2在衰减TRPV1-mediated CVB-D热过敏。有趣的是,即pl.注入snx - 111或CVB-D孤独,但不是Z944,增加了基底PWL(在15或30分钟)(补充图S6A-C。p价值的盐水和盐水+ snx - 111的每个测试点是0.525,0.021,和0.007,分别。p价值的盐水和盐水+ CVB-D每个测试点是0.918,0.040,和0.011,分别。p价值的盐水和盐水+ Z944每个测试点是0.690,0.379,和0.771,分别),这表明Cav2.2还有助于CVB-D的镇痛效应对热敏感。
图7。Ca的次要角色v2.2在小鼠模型CVB-D的镇痛效果。(两者)影响snx - 111(绿色),CVB-D(蓝色),或Z944(橙色)Cap-induced热过敏。PWL测量的热板试验(0分)之前,和15和30分钟后即pl.注射帽。(红色)。(D)snx - 111对carrageenan-induced热超敏反应的影响。同样的实验程序图1 e,除了snx - 111是intraplantarly注射角叉菜胶注射前30分钟。团体之间的统计分析进行snx - 111 -卡拉胶(绿色)和Vehicle-carrageenan(红色)。(E, F)协同效应SNX111和CVB-D或Z944 carrageenan-induced热过敏。在D实验过程一样,除了snx - 111和CVB-D或Z944 intraplantarly一起注射角叉菜胶注射前30分钟。团体之间的统计学意义CVB-D-carrageenan(蓝色)或Z944-carrageenan(橙色)和Vehicle-carrageenan(红色)由星号标记,这组之间的cvb - d - snx - 111 -卡拉胶(绿色)或z944 snx - 111卡拉胶(绿色)和Vehicle-carrageenan(红色),英镑的迹象。(G)snx - 111对carrageenan-induced机械超敏反应的影响。同样的实验程序图1 e,除了snx - 111 intraplantarly注射角叉菜胶注射前30分钟。团体之间的统计学意义snx - 111 -卡拉胶(绿色)和Vehicle-carrageenan(红色)是由星号标记的。(H)协同效应SNX111和CVB-D carrageenan-induced机械过敏症。同样的实验程序图7 g,除了snx - 111和CVB-D intraplantarly一起注射角叉菜胶注射前30分钟。团体之间的统计学意义CVB-D-carrageenan(蓝色)和Vehicle-carrageenan(红色)由星号标记,这组之间的cvb - d - snx - 111 -卡拉胶(绿色)和Vehicle-carrageenan(红色),英镑的迹象,这组之间的cvb - d - snx - 111 -卡拉胶(绿色)和CVB-D-carrageenan(蓝色),&。(我)协同效应SNX111和Z944 carrageenan-induced机械过敏症。实验程序一样在h组之间的统计学意义Z944-carrageenan(橙色)和Vehicle-carrageenan(红色)由星号标记,这组之间的z944 snx - 111卡拉胶(绿色)和Vehicle-carrageenan(红色),英镑的迹象,这组之间的z944 snx - 111卡拉胶(绿色)和Z944-carrageenan(橙色)&。在每个图表示数据信息:老鼠的数量在每个实验使用。统计学意义是评估使用双尾t以及(对于双官能团的比较)或单向方差分析(方差分析)其次是图基的和LSD测试(多群比较),*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001,#p< 0.05,# #p< 0.01,# # #p< 0.001,p< 0.05,p< 0.01,p< 0.001。确切的t、F和p值显示在附录表S1。所有的数据都意味着±SEM。
接下来,我们检查是否特定的Cav2.2阻滞剂snx - 111可以减轻炎症过敏症CVB-D一样。snx - 111 (53 ng)管理,即pl.注入对热或机械超敏反应的影响可以忽略不计carrageenan-induced小鼠模型(图7 d, Gp价值的卡拉胶和卡拉胶+ snx - 111图7 d每个测试点是0.315,0.021,0.079,0.659,0.017,和0.537,分别。在图7 g,p= 0.611卡拉胶和卡拉胶+ snx - 111在第一天p= 0.008卡拉胶和卡拉胶+ snx - 111天2)。此外,结合snx - 111与CVB-D或Z944显示可忽略的协同镇痛效果(图7 e、F、H,我。在图7 e,p价值的卡拉胶和卡拉胶+ snx - 111和CVB-D每个测试点是0.990,0.005 < 0.001,< 0.001、0.042和0.997,分别。p价值的卡拉胶和卡拉胶+ CVB-D每个测试点是0.182,< 0.001,< 0.001,< 0.001,< 0.001和0.070,分别。p价值的卡拉胶+ CVB-D与卡拉胶+ snx - 111和CVB-D每个测试点是0.133,0.205,0.420,0.915,0.075,和0.073,分别。在图7 f,p价值的卡拉胶和卡拉胶+ snx - 111和Z944每个测试点是0.946,0.060 < 0.001,< 0.001、0.168和0.998,分别。p价值的卡拉胶和卡拉胶+ Z944 f(每个测试点是0.985,0.062 < 0.001,< 0.001、0.047和0.219,分别。p价值的卡拉胶+ Z944与卡拉胶+ snx - 111和Z944每个测试点是0.876,1.000,0.376,1.000,0.800,和0.226,分别。在图7 h,p价值的卡拉胶和卡拉胶+ snx - 111和CVB-D每个测试点是0.999,< 0.001,< 0.001,< 0.001、0.223和0.997,分别。p价值的卡拉胶和卡拉胶+ CVB-D每个测试点是0.468,< 0.001,< 0.001,< 0.001、0.009和0.675,分别。p价值的卡拉胶+ CVB-D与卡拉胶+ snx - 111和CVB-D每个测试点是0.456,0.565,0.007,0.005,0.007,和0.727,分别。在图7我,p价值的卡拉胶和卡拉胶+ snx - 111和Z944每个测试点是0.999,< 0.001,< 0.001,< 0.001、0.336和0.856,分别。p价值的卡拉胶和卡拉胶+ Z944每个测试点是0.917,< 0.001,< 0.001,< 0.001、0.062和1.000,分别。p价值的卡拉胶+ Z944与卡拉胶+ snx - 111和Z944每个测试点是0.900,< 0.001、0.004、0.065、0.638和0.872,分别)。
总的来说,这些结果表明,Cav3.2中起着重要作用,Cav2.2扮演配角的角色在小鼠模型CVB-D的镇痛效应。
3.8镇痛效应的cyclovirobuxine D paclitaxel-induced周围神经病变
紫杉醇(PTX)是一个著名的抗肿瘤药物在世界范围内(Ozols et al ., 2003)。然而,PTX诱发无法忍受周围神经病变,往往限制了其临床应用(Ozols et al ., 2003)。因为Cav3.2是高度参与PTX-induced鼠标神经病变(李et al ., 2017),我们测试了CVB-D这个疼痛的镇痛效果模型。PTX管理局(4毫克/公斤),i . p .注入每隔一天总共四个应用程序(天0、2、4、6)诱发严重的热敏感,持续通过实验的持续时间(14天)(图8)。一剂CVB-D(10.07μg) i pl.注入在第0天消除了热过敏(图8p每个测试点的值是0.767,0.226,0.346 < 0.001,< 0.001,< 0.001)。Z944产生了比较镇痛效果(图8 b, Cp价值在图8 b每个测试点是0.494,0.804,0.005 < 0.001,< 0.001和< 0.001,分别。在图8 c,pPTX vs CVB-D < 0.001,pPTX vs Z944 < 0.001,pCVB-D vs Z944 = 0.687)。鉴于CVB-D也被确认为一种潜在的抗肿瘤剂(的贝利,2020张),它可以同时提高PTX治疗效果和减少不必要的周围神经病变。
图8。CVB-D对PTX-induced周围神经病变。(一)CVB-D对PTX-induced热过敏。PWL热板试验测量了两周。Vehicle-saline(黑)被用作控制vehicle-PTX(红色),和CVB-D-saline(灰色)被用作控制CVB-D-PTX(蓝色)。团体之间的统计分析进行CVB-D-PTX(蓝色)和Vehicle-PTX(红色)。(B)Z944对PTX-induced热过敏。同样的实验程序,除了老鼠收到i pl.注入Z944 PTX治疗前30分钟。Vehicle-saline(黑)被用作控制vehicle-PTX(红色),和Z944-saline(灰色)被用作控制Z944-PTX(橙色)。团体之间的统计分析进行Z944-PTX(橙色)和Vehicle-PTX(红色)。(C)比较CVB-D的镇痛效果和Z944 PTX-induced热过敏14天。数据信息:统计显著性是评估使用双尾t以及(对于双官能团的比较)或单向方差分析(方差分析)其次是图基的和LSD测试(多群比较),*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001;ns表示没有意义。确切的t、F和p值显示在附录表S1。所有的数据都意味着±SEM。
4讨论
在目前的研究中,我们发现迄今为止未知的强大的镇痛效应对卡拉胶和CFA-induced CVB-D炎症过敏症和PTX-induced神经性疼痛小鼠模型。我们还发现CVB-D减轻capsaicin-induced热过敏和l-cysteine-mediated热力和机械老鼠过敏症。尽管CVB-D临床使用药物和被发现在人类和动物有不同的行为,其分子目标仍有待确定(柯et al ., 2016;Ao et al ., 2019;中国药典委员会,2020年;王et al ., 2021;曾庆红等人。,2021年)。我们的研究表明,CVB-D的镇痛效应主要是通过抑制实现的Cav3.2,一个重要的目标在现代镇痛药物开发(Jevtovic-Todorovic Todorovic, 2006;Cai et al ., 2021;雪et al ., 2021)。值得注意的是,CVB-D对一群不同的疼痛的伟大的选择性离子通道分布在初级感觉神经元,如Nav1.7,Nav1.8、TRPV1 TPRA1、TRPM8 ASIC3, P2X2和P2X4。
在DRG神经元,小膜去极化引起钙流入通过TTCCs产生低门槛钙飙升,进而随着voltage-activated钠离子通道引起的APs (畅和胫骨,2013)。Cav3.2,轴突中高度表达,soma中小疼痛的DRG神经元,是至关重要的启蒙和一代的美联社解雇(Talley et al ., 1999;Todorovic Jevtovic-Todorovic, 2013)。CVB-D抑制钙v3.2和Ca的失活曲线变化v3.2更超极化电位,使更多的频道灭活静止膜电位(图4 d)。结果降低了Cav3.2电流降低破裂DRG神经元的倾向(图5克、我L)。Cav2.2大量分布在痛觉神经元的薄层I和II的背角,是至关重要的(Hoppanova Lacinova, 2022)。符合这个概念,我们发现对美联社snx - 111有一个微不足道的影响中小DRG神经元(图5 j-l)。因此,我们的研究表明Cav3.2主要通道负责CVB-D美联社DRG神经元的调控。
CVB-D和Z944产生一个强大的镇痛效应比snx - 111 capsaicin-induced热过敏(图7 a - c)。CVB-D和Z944 i . p .或i pl.注入,也减轻热过敏症在卡拉胶-,CFA和PTX-induced小鼠模型(图1 e,我,图6 e,图8 a, B)。相比之下,snx - 111 (i.pl。注射)有一个微不足道的镇痛效应carrageenan-induced热过敏(图7 d)。此外,结合snx - 111与CVB-D或Z944并不产生协同或额外镇痛(图7 e, F)。这些结果表明,Cav3.2是主要的贡献者在热过敏CVB-D的镇痛效果。
值得注意的是,在卡拉胶、CFA和PTX-induced老鼠模型,单一剂量的CVB-D,以及Z944,申请前的敏化试剂就足以消除发展热过敏(图1 e,我,图6 e,图8 a, B)。这个持久效应的潜在的分子机制还有待阐明。一种可能性是,减少钙流入相关通过TTCCs。这种钙流入亚阈值分泌过程中发挥重要作用,自发释放的神经递质从背角的传入神经终端(Hoppanova Lacinova, 2022)。我们推测,钙流入通过Cav3.2可能是重要的热敏感的开发和维护。通过抑制钙v3.2,将失活曲线和Ca的当前窗口v3.2更负电位(图4 d, F),CVB-D可能阻碍上述生理过程,从而防止热敏感的起始和/或维护。
Cav3.2最近被确认为一种选择性标记的两个主要的低门槛的机械(LTMRs) AδC-LTMRs (弗朗索瓦et al ., 2015)。Ca的存在v3.2在LTMR-fiber轨迹符合其关键作用在低门槛机械信号的传输和机械过敏症的发展(弗朗索瓦et al ., 2015)。Ca的贡献v2.2机械过敏症仍不完全定义。例如,药理Ca的封锁v2.2不减弱机械过敏症CFA-induced老鼠(Pitake et al ., 2019)。Cav2.2 KO小鼠显示出类似的机械WT动物一样的感觉(Pitake et al ., 2019;DuBreuil et al ., 2021),但表现出明显减少机械脊神经结扎后过敏(Saegusa et al ., 2001)。我们的工作表明,虽然CVB-D和Z944很强的镇痛效应在卡拉胶对机械过敏症,CFA-induced小鼠模型(图1 d、G H,图6 d, F,我和补充图S5E),snx - 111不减轻机械过敏症carrageenan-induced老鼠(图7 gsnx - 111)和政府一起CVB-D Z944产生微不足道的协同或其他镇痛(图7 h,我)。因此,我们的研究结果表明,Cav3.2的主要参与者CVB-D机械过敏症的镇痛效果。
尽管CVB-D是一种安全有效的心血管药物广泛使用在中国,一些动物实验报告管理系统时一些潜在的毒性相对较高剂量或长时间(刘et al ., 1982;赵et al ., 2011;的贝利,2020张)。在这项研究中,我们表明,i pl. CVB-D应用可以产生强大而持久的镇痛效果(图1 d、E、G),这表明当地CVB-D /局部应用程序可能提供了一个安全的方式治疗某些形式的痛苦。
我们的研究表明,CVB-D有效和持久缓解PTX-induced热过敏(图8)。这一发现,结合最近的报告CVB-D的承诺在体外和在活的有机体内抗增殖活动(吴et al ., 2015;江et al ., 2020;Zhang et al ., 2020;周et al ., 2020;刘et al ., 2021;曾庆红等人。,2021年),同时也增加了潜在的应用在癌症治疗和化疗CVB-D: CVB-D和PTX可能会提供一个有前途的机会,同时加强PTX的抗癌效果,减少不必要的神经性症状。
在这项研究中,我们首先证明CVB-D,从中医心血管药物b . microphylla,展品强烈和持久antinociceptive行动一些炎症的小鼠模型和神经性疼痛。第二,我们证明CVB-D的镇痛效应主要是通过抑制Cav3.2现代镇痛药物开发的一个关键目标。第三,我们发现一个潜在的CVB-D改善与PTX化疗相关的棘手的神经性过敏而同时发挥其抗癌效果。总之,我们提供一个令人信服的理由和依据进行临床研究,把CVB-D疼痛管理。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到相应的作者
道德声明
动物研究是审查和批准的动物保健和使用委员会在中国科学院昆明动物研究所,中国科学院。
作者的贡献
YN构思这个项目。DS进行电生理学和动物实验,分析了相应的数据和写的手稿。YG设计并进行电生理实验。SL发起和电生理实验进行。YN享有监督实验和修订后的手稿。所有作者手稿准备和修改。
资金
这项研究得到了国家自然科学基金(32070393),第二个青藏高原科学考察和研究(步骤)项目(2019 qzkk0502 - 0304),云南的自然科学基金(202001 as070040和202001 av070010),一万人才计划为年轻云南省一流的人才(ynwr - qnbj - 2020 - 277),中国科学院“西部之光”的年轻学者计划(2021)和联合项目(2021)、国家重点实验室基金的植物化学与西部植物资源(P2020-KF10)。
确认
我们要特别感谢风雷张(中国科学院昆明动物研究所、中科院、中国)为她帮助采购老鼠和化学药剂。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.1081697/full补充材料
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关键词:Cyclovirobuxine D Cav3.2,v2.2,进行了microphylla,镇痛效果
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收到:2022年10月27日;接受:2022年12月12日;
发表:2022年12月21日。
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