TLR2-TLR4的参与,NLRP3 IL-17疼痛引起的实验性自身免疫性脑脊髓炎的小说Sprague-Dawley鼠模型

介绍

多发性硬化(MS)是一种使人衰弱的炎性脱髓鞘疾病的中枢神经系统(CNS)。而古典的症状包括运动能力损伤/残疾导致麻痹性痴呆和/或瘫痪,其他CNS-related在MS患者常见的症状,包括疼痛增加,据报道在近92%的患者(女士1)。尽管治疗fingolimod和富马酸二甲酯等开发对女士来说,这些治疗方法只是部分对经典和非经典的症状有效,会产生严重的副作用,包括增加疼痛(2- - - - - -5)。因此开发医学相关疼痛的治疗方法至关重要,发展更好的动物模型来评估这些治疗方法的疗效。

最常用的女士的啮齿动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)。,在实验性自身免疫性脑脊髓炎脊髓匀浆或髓鞘抗原如myelin-oligodendrocyte-glycoprotein (MOG)管理学科对中枢神经系统髓鞘诱导自体免疫反应。标准的运算单元模型产生运动障碍/障碍最终需要安乐死一旦它们变得太严重(6)。然而,除了运动能力损伤/残疾,运算单元也会产生大量的其他症状包括记忆和认知障碍(7- - - - - -11、焦虑和抑郁12,13),减少社会交往(14),和痛苦(14- - - - - -23),所有这些都还普遍报道症状的患者(女士1,24- - - - - -28)。建模等非啮齿类动物女士的症状,包括疼痛,通常需要策略来避免行为测试期间严重运动障碍/残疾可以干扰行为反应。在这项研究中,我们描述一个新的,低剂量模型在Sprague-Dawley MOG-induced实验性自身免疫性脑脊髓炎(SD)大鼠产生最小的运动能力损伤/障碍,因此研究优化EAE-induced疼痛,稳定时间。

是由持续的疼痛在实验性自身免疫性脑脊髓炎脱髓鞘以及各种促炎细胞类型和介质包括细胞因子释放神经胶细胞和T细胞。例如,我们已经表明,脊髓interleukin-1β(IL-1β)是必要EAE-induced暗刺痛(DA)大鼠(16),和其他证明IL-1βEAE-induced小鼠疼痛是必要的(20.)。结扎的toll样受体2和4 (TLR2-TLR4)危险分子模式(抑制)诱发NF-kB激活,质数nod样受体蛋白3 (NLRP3) inflammasome可以导致促炎细胞因子的生产IL-1β(29日,30.)。重要的是,NLPR3激活也被证明是必要的小鼠疼痛对实验性自身免疫性脑脊髓炎(31日)。此外,Th17细胞细胞因子interleukin-17 (IL-17)最近被证明是必要的EAE-induced疼痛(32)。最后,众所周知,中枢神经系统轴突的髓鞘脱失损害也可以导致持续的疼痛疾病如急性脊髓炎(横33),这表明脱髓鞘女士可能导致持续的疼痛。研究这些机制女士仍然困难,患者由于缺乏实验直接操纵这些分子在人类的工具。这为探索机制的重要性进一步凸显了实验性自身免疫性脑脊髓炎医学相关症状。总的来说,这些研究表明,治疗,抑制促炎的分子和/或改善remyelination将是有效的和医学相关疼痛治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎。

toll样受体2和4拮抗剂治疗疼痛是一个有前途的战略从女士(16),以及神经性疼痛从外围和中心起源(34- - - - - -37)。toll样受体2和4通常表示在胶质细胞(29日,38)以及较少的神经元(38,39)和T细胞(40,41)。重要的是,TLR2-TLR4s调节患者的白质(女士42- - - - - -44()以及在实验性自身免疫性脑脊髓炎42- - - - - -45)。各种研究表明TLR2和TLR4基因敲除的小鼠的疾病进展(调节实验性自身免疫性脑脊髓炎40,41,46- - - - - -48)。然而,报道一直模棱两可的结果,因为没有效果,增强运动能力损伤和减少实验性自身免疫性脑脊髓炎/残疾在这些研究都被观察到。值得注意的是,特定的基因敲除TLR2和TLR4的CD4 + T细胞运动能力损伤/障碍已经被证明可以降低实验性自身免疫性脑脊髓炎(40,41),这表明TLR2和TLR4表达在特定的细胞类型疾病可能扮演不同的角色在实验性自身免疫性脑脊髓炎的表情。然而,重要的是,所有这些研究采用淘汰赛的TLR2和TLR4感应之前实验性自身免疫性脑脊髓炎,这也可能阻断内源性促炎信号需要一个正常的MOG的炎症反应。

相比之下,我们曾表明,日常系统管理为靶标的低亲和力TLR2-TLR4拮抗剂,(+)环丙甲羟二羟吗啡酮((+)-NTX) (49- - - - - -51),反转疼痛引起的疼痛在DA大鼠模型低剂量实验性自身免疫性脑脊髓炎(16),而且证明了同样的待遇回报背腰脊髓胶质激活和NLRP3 IL-1β,IL-17 mrna控制水平(16)。TLR2-TLR4的角色,在这里,我们研究NLRP3,和IL-17这部小说引起的疼痛和相关的脊髓病变,MOG-induced实验性自身免疫性脑脊髓炎SD大鼠模型进行优化,以避免混淆hindpaw-associated运动能力损伤/残疾。

材料和方法

主题

受试者雄性SD(300 - 325克;Envigo)大鼠10至12周大的到来。老鼠被安置两个每笼在12 h光/暗周期(灯07.00 h)。实验在08.00和16.00之间h。所有程序都是按照协议进行博尔德的科罗拉多大学的批准机构动物保健和使用委员会。

Myelin-oligodendrocyte-glycoprotein管理

货到后,老鼠被随机分配到myelin-oligodendrocyte-glycoprotein重组_125年−1(MOG) (VU大学医学中心,荷兰,天才博士anne - marie面包车大坝)或车辆组组成的乙酸钠(pH = 3)和不完全弗氏佐剂(IFA)[σ;密苏里州圣路易斯;(52)]。最初的MOG剂量研究(实验1),老鼠收到100 -μl皮内注射MOG(0、4、8、16μg)注入底部的尾巴和检测运动能力损伤/障碍和疼痛。这些剂量选择基于我们的经验在SD大鼠,进行实验性自身免疫性脑脊髓炎的8μg MOG产生赤字的恐惧条件反射和海马胶质激活没有显著的运动能力损伤/障碍(10),以及我们的经验在DA大鼠进行实验性自身免疫性脑脊髓炎16μg MOG产生运动障碍/残疾标准实验性自身免疫性脑脊髓炎会混淆行为测试,而4μg MOG DA大鼠产生机械触诱发痛没有显著的运动能力损伤/障碍(16)。根据这些初步研究,我们选择研究8和16μg MOG剂量在SD大鼠专门为了避免下肢运动和感觉功能障碍可能混淆行为评估机械触诱发痛的冯·弗雷测试。重要,而16μg MOG剂量产生轻微的运动能力损伤/残疾,通常只涉及尾巴瘫痪,没有混淆疼痛测试、8μg MOG剂量没有运动能力损伤/障碍的同时仍然允许痛苦的表达。8和16μg MOG剂被用于实验2测试的有效性(+)-NTX扭转EAE-induced疼痛和运动障碍/残疾。这些老鼠也用于(即免疫组织化学研究。,Experiments 5–7), with their tissue collected on day 30 post-EAE induction [i.e., after approximately 2 weeks of (+)-NTX dosing]. In Experiments 3 and 4, which tested the ability of intrathecal delivery of NLRP3 antagonist MCC950 or an IL-17 neutralizing antibody to block EAE-induced pain, respectively, only 8 μg MOG dose was used.

系统性的反复急性注射剂量TLR2-TLR4拮抗剂纳曲酮(+)

大鼠在实验2收到皮下(+)-NTX(6毫克/公斤)或每天equivolume盐水注射三次(09.00,12.00,和15.00 h)大概2周的时间行为测试期间总共18毫克/公斤/天开始在17天post-EAE归纳。每个注射接种的体积是1毫升/公斤。这一剂量选择基于我们之前的研究证明这个剂量产生最大antinociceptive神经性疼痛的功效在这两个模型(34()和实验性自身免疫性脑脊髓炎10,16)。

急性鞘内注射MCC950和中和interleukin-17抗体

在不同组大鼠在实验3和4中,老鼠服用8μg撤走,和23 (MCC950)或21天后(中和interleukin-17抗体(anti-IL-17)],老鼠的鞘内注射接种NLRP3抑制剂MCC950(0、0.01、0.1或1毫克;实验3)或anti-IL-17(4μg免疫球蛋白控制或4μg anti-IL-17;实验4)在短暂的3%异氟烷麻醉。4μg鞘内anti-IL-17剂量选择基于试验研究(数据没有显示)。腰部剃,无菌清洁。18-gauge导针,中心删除,插入到L5 / 16种椎间空间。PE-10导管插入通过导针,预置这样的近端一端PE-10油管L4-L6腰椎脊髓休息。鞘内注射发生在20多岁的年轻人(15μl MCC950和40μl anti-IL-17后跟2μl无菌生理盐水冲洗)与30年代前延迟删除导管和导针。每个大鼠麻醉最多为5分钟,也没有产生可观测的神经损伤的过程。

行为测试

电动机得分

所有的测试进行盲目对小组任务。运动行为得分每天在所有老鼠评估症状的严重性实验性自身免疫性脑脊髓炎。电动机评分量化身体麻痹和得分是基于以下名称:0 =没有麻痹的迹象,1 =部分尾巴麻痹,2 =全尾瘫痪,3 =后肢无力,4 =部分后肢麻痹,5 =完全后肢麻痹,6 =部分上肢瘫痪。老鼠达到6分是安乐死如果瘫痪超过1天。安乐死老鼠得到7分。动物的运动成绩3或更高版本被排除在冯·弗雷机械触诱发痛测试以避免后肢运动和感觉功能障碍可能混淆行为测试;然而,重要的是,所有的数据分析和数据展示运动成绩在整个报告包括主题,得分3或更高版本正确评估TLR4拮抗剂的影响。这方面的实验性自身免疫性脑脊髓炎

机械触诱发痛测试

所有的测试进行盲目的小组任务。老鼠收到至少3点习惯化行为之前测试环境测试。冯·弗雷测试进行详细如前所述(53- - - - - -56)。评估进行了大约每周包括测试MOG政府之前,测试post-MOG政府确定的水平EAE-induced疼痛(所有实验),然后在前12天(+)-NTX后政府组织解剖(实验2)。·冯·弗雷测试异常性疼痛大约1 h在第二次的三个剂量的(+)-NTX或车辆一天(实验2)。评估也在鞘内(IT)后3个月和24小时管理NLRP3拮抗剂MCC950 anti-IL-17实验3和4,分别。10校准的对数级数Semmes-Weinstein单丝(冯·弗雷头发;Stoelting、木材戴尔,IL)应用随机向左和右爪子定义阈刺激强度需要引出一个爪子戒断反应。日志刚度的头发从manufacturer-designated 3.61 (0.40 g)到5.18 (15.14 g)细丝。行为反应被用来计算绝对阈值(响应)的50%概率拟合高斯积分心理使用最大似然函数拟合方法(57,58),如前面描述的(56,59)。这种拟合方法允许参数分析承担(57,58)。

免疫组织化学

MOG然后,4周后管理和连续(+)-NTX政府12天后,老鼠深深与戊巴比妥钠麻醉其后transcardial灌注生理盐水(pH值7.4),之后立即用4%多聚甲醛transcardial灌注为5分钟(pH值7.4)。腰椎脊髓在4%多聚甲醛/ 0.2你找找磷酸盐缓冲剂(PB, pH值7.4)24小时然后cryo-protected(15 20和30%)增加浓度的蔗糖PB (pH值7.4)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)。然后,5毫米代表部分腰椎脊髓被封锁在10月(费舍尔科学,沃尔瑟姆,MA),冻结在−80°C,和16岁分段μm低温恒温器(徕卡CM1850)。部分在−thaw-mounted和存储20°C到染色。

兔子电离分子钙结合适配器1 (Iba1),兔子胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和集群分化因子4 (CD4)染色,幻灯片与磷酸盐冲洗3 x (PBS) permeabilized 0.3%过氧化氢,冲洗3 x在PBS,阻塞1 h和10%正常山羊血清(门店),PBS Triton-X 0.3%,一夜之间和孵化24小时在4°C的2%门店与初级抗体在以下稀释比率:Iba1;1:1,000 (019 - 19741;GFAP Wako,里士满,弗吉尼亚州);1:10 0 (Z033401-2 Dako Carpinteria, CA),和CD4;1:200 (ab237722;Abcam, Cambridge, MA)。幻灯片被冲洗3 x PBS和孵化2 h在二级抗体稀释比例如下:山羊anti-rabbit;1:200(杰克逊免疫研究,西树林,PA)。幻灯片在PBS冲洗3 x,孵化avidin-biotin复杂(ABC)解决方案摘要稀释(向量实验室,伯林盖姆,CA) 2 h,冲洗3 x在PBS和孵化活动3、3′-diaminobenzidine (DAB) (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)10分钟。3,3′-diaminobenzidine与罪犯激活葡萄糖(10毫克/毫升)和幻灯片孵化了8分钟,冲洗3 x PBS,一夜之间干。幻灯片是在增加浓度的乙醇脱水(50,70、95和100%),清除在Citrisolv(费舍尔科学,沃尔瑟姆,MA),干,覆盖着DPX mountant (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。 For fluoromyelin staining, slides were stained with red fluoromyelin (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA) at 1:100 dilution in PBS for 20 min and then washed 3x with PBS. Slides were then coverslipped using Vectashield mountant (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Iba1、GFAP和CD4,黑白图像获得使用一个奥林巴斯BX61显微镜(奥林巴斯美国,中心谷,PA)与奥林巴斯套件CellSens维软件。fluoromyelin,标准TRITC过滤器(励磁558海里)被用来可视化红点的髓磷脂。所有图片的比较被使用相同的曝光和其他收购设置。所有图片都被在20 x放大,除了fluoromyelin被捕在10倍放大。进行微Iba1, GFAP和CD4,图像转换为32位,减去背景,然后调整阈值强调细胞体在盲目的治疗条件NIH ImageJ软件。平均荧光强度fluoromyelin使用NIH ImageJ软件进行了分析。数据表示为总面积为染色阳性(即。,Iba1 GFAP和CD4)或总荧光强度(即。fluoromyelin)感兴趣的区域(即内。、背腰背或腹侧细绳)。Iba1、GFAP和CD4污渍,每2 - 4图像感兴趣的动物在该地区被单独分析。由于缺少剩余的幻灯片,fluoromyelin污渍,2 - 8中每个动物图片都来自分析。对于所有污渍,背腰背分析,因为这个组织是直接相关的hindpaw机械触诱发痛(fluoromyelin数据显示没有区别,因此没有显示)。 Finally, for CD4 and fluoromyelin stains exclusively, ventral funiculus of the spinal cord was also analyzed as a region of interest as this region composed of white matter commonly displays myelin lesions and CD4+ cell infiltration in EAE (43- - - - - -45)。

统计分析

使用GraphPad棱镜v.9.31软件进行了统计分析。行为和免疫组织化学分析的数据双向方差分析。方差分析是Sidak紧随其后因果测试来评估特定实验组之间的差异。对于所有的测试,将统计意义p< 0.05。

结果

实验1。MOG量效曲线运动成绩和机械触诱发痛

我们第一次试图建立一个剂量的皮内撤走在SD大鼠产生显著水平的长期机械触诱发痛没有下肢运动障碍/障碍,从而与机械触诱发痛和其他行为测试。我们与MOG从而进行量效曲线,测试剂0、4、8、16μg。我们发现在SD大鼠4和8μg MOG剂量未能产生运动障碍/残疾,而16μg MOG产生2的5大鼠的运动能力损伤/障碍(图1;看到增强群体的分化与规模较小的轴,请参考补充图S1),这最终导致了安乐死的这些老鼠白天19 post-MOG。没有统计可靠的差异运动成绩在四周观察测试周期。

我们还测试了这些老鼠在实验1 MOG剂量,然后每周之后机械触诱发痛使用·冯·弗雷测试(图2)。所有剂量的MOG诱导全机械触诱发痛到了15天,持续了29天。Sidak的因果测试表明,MOG显著增加机械触诱发痛比较0μg MOG和4μg MOG (p< 0.0001),0μg MOG和8μg MOG (p< 0.0001)和0μg MOG和16μg MOG (p< 0.0001)组15天,22日和29 post-MOG。

实验2。重复的系统性(+)环丙甲羟二羟吗啡酮逆转EAE-induced机械触诱发痛

正如我们先前已经表明,TLR2-TLR4调解机械触诱发痛在模型(DA实验性自身免疫性脑脊髓炎16),我们下决定是否机械触诱发痛也是由TLR2-TLR4 SD大鼠模型。8和16μg MOG剂量进行测试,因为这允许评估(+)-NTX是否有效对轻度运动能力损伤/残疾以及轻微的运动能力损伤/障碍的存在是否会改变(+)的功效-NTX在SD大鼠机械触诱发痛。系统性管理6毫克/公斤/天(+)-NTX 3次17天post-MOG政府开始,之后的发展完整的机械触诱发痛。这一剂量选择基于我们之前的研究证明这种给药方案的疗效扭转机械触诱发痛在各种神经性疼痛模型(34- - - - - -37),以及(DA大鼠模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎16)。在实验1中,8μg MOG没有产生运动能力损伤/障碍(图3一;看到增强群体的分化与规模较小的轴,请参考补充图S2A),而16μg MOG产生运动能力损伤/障碍大鼠的一个子集(图3 b;看到增强群体的分化与规模较小的轴,请参考补充图开通)。具体来说,4 8老鼠发达运动能力损伤/残疾16μg MOG-saline集团,而2 8老鼠发达运动能力损伤/残疾16μg MOG - (+) -NTX组。此外,老鼠之一16μg MOG-saline组没有出现运动能力损伤/残疾天post-MOG 22日死亡原因不明。没有统计可靠的差异运动成绩在四周观察测试周期。

8和16-μg剂量的MOG诱导全机械触诱发痛到了17天,持续通过天29日和逆转(+)-NTX管理8 (图4一)和16μg (图4 b分别)MOG剂量。Sidak的因果测试表明,MOG显著增加8和0之间的机械触诱发痛μg MOG 7天(p< 0.0001)、17日(p< 0.0001)、29日(p< 0.0001)post-MOG (图4 b),16 - 0之间μg MOG 7天(p< 0.05)、17日(p< 0.0001)、29日(p< 0.0001)post-MOG (图4 b)。Sidak的因果测试也表明,12天重复的系统性(+)-NTX治疗显著逆转MOG-induced机械之间的异常性疼痛8μg MOG-saline和8μg MOG - (+) -NTX-treated组(图4一)和16之间μg MOG-saline和16μg MOG - (+) -NTX-treated组(图4 b在29日post-MOG天)。腰椎脊髓组织收集第二天(即从这些组。下面描述,30天)免疫组织化学实验。

实验3。鞘内管理NLRP3抑制剂MCCC950逆转EAE-induced机械触诱发痛

toll样受体2和4激动质数NLRP3 inflammasome,最终会导致生产的促炎细胞因子如IL-1β(63年,64年(必需的),神经性疼痛在实验性自身免疫性脑脊髓炎16,20.)。此外,(+)-NTX逆转EAE-induced脊髓NLRP3 mRNA在我们先前的实验在DA大鼠(与实验性自身免疫性脑脊髓炎16)。因此,我们推测,脊髓NLRP3可能发挥功能作用EAE-induced机械触诱发痛在这里给出的SD模型大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎。在另一组老鼠,我们因此鞘内注射NLRP3抑制剂MCC950 23天第八节μg MOG管理和评估大鼠机械使用·冯·弗雷测试异常性疼痛。在实验1和2 8μg MOG诱导全机械触诱发痛白天15 post-MOG,通过天23 post-MOG(保持稳定图5);双向方差分析比较所有MCC950政府在所有治疗组(即前几天。天基线(提单),8日,15日和23)表示的重要影响的一天(F₍₄₂₎= 97.37;p< 0.0001)。Sidak的因果测试显示显著差异在提单和天8之间的生理盐水组(p< 0.0001)、15日(p< 0.0001)、23日(p< 0.0001),在0.01毫克组之间的提单和8天(p< 0.0001)、15日(p< 0.0001)、23日(p< 0.0001),在0.1毫克组之间的提单和8天(p< 0.0001)、15日(p< 0.0001),21日(p< 0.0001)和1毫克组内提单和天8 (p< 0.00001)、15日(p< 0.0001)、23日(p< 0.0001)。鞘内的所有剂量的0.01、0.1和1毫克MCC950 23天post-MOG显著逆转EAE-induced机械触诱发痛3 h但不是24 h post-administration (图5)。Sidak的因果测试显示盐水和0.01之间的显著差异(p< 0.001),0.1 (p< 0.01)和1毫克(p< 0.0001)MCC950组3 h,但不是24小时post-intrathecal MCC950管理局(图5)。

实验4。鞘内管理interleukin-17中和抗体逆转EAE-induced机械触诱发痛

Th17细胞细胞因子IL-17已表现出必要的痛苦在周围神经损伤模型(60,66年- - - - - -68年()和实验性自身免疫性脑脊髓炎32()对实验性自身免疫性脑脊髓炎23,40,69年,70年疾病表达式(女士),71年)。因此,我们评估是否脊髓IL-17有助于机械触诱发痛在这里给出的SD模型大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎。为了验证这个假设,我们鞘内注射IL-17中和抗体在21天第八节μg MOG管理和评估大鼠机械触诱发痛使用·冯·弗雷测试在一个单独的组大鼠。在实验1 - 3,8μg MOG诱导全机械触诱发痛白天15 post-MOG,通过天21 post-MOG(保持稳定图6);双向方差分析比较时间点之前IL-17中和抗体政府在所有治疗组(即。天提单8 15,天(21)表示一个显著的影响F₍₂₁₎= 148.2;p< 0.0001)。Sidak的因果测试显示显著差异在提单和天8之间的免疫球蛋白g组(p< 0.001)、15日(p< 0.0001),21日(p< 0.0001)和8 (IL-17集团在提单和天内p< 0.05)、15日(p< 0.0001),21日(p< 0.0001)。鞘内管理4μg IL-17中和抗体或4μg免疫球蛋白控制在21天post-MOG显著逆转EAE-induced机械触诱发痛3 h但不是24 post-administration (图6)。Sidak的因果测试表明免疫球蛋白g之间的显著差异控制和IL-17中和抗体在3 h但不是24小时post-intrathecal IL-17中和抗体管理局(p< 0.0001)(图6)。

实验5。重复的系统性(+)环丙甲羟二羟吗啡酮逆转EAE-induced背角腰椎脊髓胶质免疫反应性

脊髓胶质激活已被证明是必要的神经性疼痛(29日),我们曾表明,脊髓背角胶质模型与免疫反应性在DA大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎EAE-induced机械触诱发痛,这两个被TLR2-TLR4逆转封锁日常系统管理(+)-NTX (16)。我们因此在SD大鼠诱发假设实验性自身免疫性脑脊髓炎脊髓胶质免疫反应性增加,也会被日常(+)-NTX管理。老鼠从实验2是用于这些研究,与他们的组织收集的30天post-MOG政府最后行为测试和13天后连续每日(+)-NTX剂量。两种剂量的MOG的增加表达小胶质免疫反应性标记Iba1 (图720 x照片补充图S340 x照片)和星形胶质细胞GFAP免疫反应性标记(图820 x照片补充图S440 x照片)在腰椎脊髓背角,这都是逆转0μg MOG控制水平(+)-NTX管理。Iba1 Sidak的因果测试显示0之间的显著差异μg MOG-saline和8μg MOG-saline (p< 0.05),0μg MOG-saline和16μg MOG-saline (p< 0.0001)8μg MOG-saline和8μg MOG - (+) -NTX (p< 0.05),8μg MOG-saline和8μg MOG - (+) -NTX (p< 0.001)。GFAP Sidak的因果测试显示0之间的显著差异μg MOG-saline和8μg MOG-saline (p< 0.05),0μg MOG-saline和16μg MOG-saline (p< 0.0001)8μg MOG-saline和8μg MOG - (+) -NTX (p< 0.05),8μg MOG-saline和8μg MOG - (+) -NTX (p< 0.0001)。

实验6。或反复系统性无论是实验性自身免疫性脑脊髓炎(+)环丙甲羟二羟吗啡酮改变腰背角和腹侧细绳CD4 + T细胞的免疫反应性

当我们在实验4,脊髓Th17细胞细胞因子IL-17 EAE-induced所需机械触诱发痛在SD大鼠模型(图5可能引起),我们假设实验性自身免疫性脑脊髓炎的CD4 +细胞浸润增加腰椎背角,(+)-NTX可能阻止这种效果。利用老鼠的组织在实验2中,然而,我们认为无论是MOG或(+)-NTX产生显著差异在腰椎背角CD4免疫反应性。MOG双向方差分析表明趋势增加CD4免疫反应性在这一地区,并没有达到统计显著性水平(图920 x照片;p= 0.06,请参考补充图S5A40 x照片)。

我们在腰腹侧细绳下调查CD4免疫反应性。我们假设腹侧细绳不会显示增加CD4免疫反应性由于缺乏运动能力损伤/障碍出现在模型中,CD4 +细胞浸润在白质通常与运动能力损伤/残疾和脱髓鞘病变(43- - - - - -45)。正如预测的那样,我们并没有发现任何明显的组CD4免疫反应性的差异在这个区域(图9 b20 x照片,请参考补充图S5B40 x照片)。

实验7。重复的系统性(+)环丙甲羟二羟吗啡酮不会改变EAE-induced腰腹侧细绳腰椎脊髓脱髓鞘

女士和髓鞘脱失是一个关键组成部分实验性自身免疫性脑脊髓炎(6,74年),我们想要探索这个SD大鼠模型MOG是否会诱发脊髓脱髓鞘通过免疫组织化学方法检测,以及这是否将逆转脱髓鞘TLR2-TLR4封锁。Fluoromyelin荧光染色的髓;因此,减少荧光显示领域的髓鞘脱失(65年,75年)。这是一个评估存在的髓鞘脱失使用fluoromyelin荧光强度的腰腹侧细绳从组织收集大鼠在实验2中。Myelin-oligodendrocyte-glycoprotein产生显著减少fluoromyelin荧光强度(图10)。Sidak的因果测试显示一个0到16之间的显著差异μg MOG (p< 0.05);然而,这减少了fluoromyelin染色强度不是由(+)-NTX尽管逆转的趋势增加fluoromyelin荧光强度后8和16μg MOG剂量(图10)。

最后,尽可能少的科目在SD大鼠模型显示重要的运动能力损伤/障碍4或以上(即。,only 3 out 16 subjects), we conducted a qualitative analysis for demyelination and CD4 immunoreactivity in lumbar ventral funiculus of two rats from the 16 μg saline group that displayed opposing severities of motor impairments/disabilities but equal levels of mechanical allodynia throughout the study (补充数据S6A,B)。值得注意的是,这个主题,显示更高的运动能力损伤/残疾不能检测机械触诱发痛最后一天(即。天29)由于运动能力损伤/残疾导致下肢损伤(没有数据点的箭头补充图S6)。有趣的是,河鼠,显示部分双边下肢瘫痪的时候解剖有更广泛的髓鞘脱失(补充图S6D)和CD4免疫反应性(补充图S6F)比老鼠显示没有运动能力损伤/残疾解剖的时候,只表示部分尾巴麻痹一天前解剖(补充数据S6C,E分别为脱髓鞘和CD4免疫反应性)。我们不能进行定量分析或评估的能力(+)-NTX逆转更广泛脱髓鞘或CD4免疫反应性的组织由于缺乏显示这些现象的学科。

讨论

这些研究的目的是描述一种温和MOG-induced SD大鼠模型的运算单元优化研究长timecourses EAE-induced疼痛没有混淆hindpaw-related运动能力损伤/残疾。我们的数据表明,(1)MOG剂量测试(4、8、16μg)产生完整的机械触诱发痛2周post-MOG,没有运动能力损伤/障碍产生的低剂量和大多是轻微的运动能力损伤/残疾在最高剂量,(2)TLR2-TLR4拮抗剂(+)-NTX逆转EAE-induced机械触诱发痛而不影响运动能力损伤/残疾,同时扭转增加小胶质和星形胶质细胞免疫反应性腰椎脊髓背角,(3)脊髓NLRP3和IL-17都必要EAE-induced疼痛在这个模型中,诱导髓鞘脱失(4)实验性自身免疫性脑脊髓炎的腹侧细绳在最高剂量测试,并没有逆转的帷幕,(+)-NTX治疗,和(5)CD4 + T细胞的渗透腰椎脊髓背角和腹侧细绳是不可靠地增加MOG政府之后,但在个人相关科目,并显示髓鞘脱失和严重的运动障碍/残疾。

疼痛反应行为建模以及其他复杂的行为通常需要三种策略来避免在实验性自身免疫性脑脊髓炎hindpaw-related运动能力损伤/残疾混淆行为测试。第一战略涉及到测试对象之前的发展运动能力损伤/残疾。各种研究已经使用这种策略和报告检测诱导后的第一周内疼痛实验性自身免疫性脑脊髓炎(15,20.,22,23)。虽然这种策略已被证明是非常有用的理解EAE-induced疼痛的机制和治疗的疗效治疗这样的疼痛,这种策略通常仅限于评估只感应后第一周内实验性自身免疫性脑脊髓炎,之前hindpaw-related电动机的发展障碍/残疾混淆行为测试。与之相反,另一个策略是减少剂量的抗原,辅助和/或代理(即血脑屏障破坏。、百日咳毒素)交付给受试者,允许测试更扩展timecourse痛感。使用此策略,主题不发展成严重运动障碍/残疾混淆行为测试或者要求安乐死。作为第一战略,几项研究已经报道延长疼痛行为使用低剂量的方法(在实验性自身免疫性脑脊髓炎18,19,21从我们的实验室),包括最近的研究中,男性和女性DA大鼠模型显示在低剂量MOG-induced实验性自身免疫性脑脊髓炎疼痛感应后至少2个月实验性自身免疫性脑脊髓炎(16)。重要的是,很多患者报告疼痛女士多年前的发展运动能力损伤/残疾和官方诊断女士(62年)。这一发现,结合电机扰动之前导致疼痛发作发现实验性自身免疫性脑脊髓炎(15,20.,22,23),可能有选择地模型表明,低剂量的实验性自身免疫性脑脊髓炎MS-associated早期疼痛,暗示重要性评估低剂量模型来更好地了解医学相关疼痛治疗和机制。最后,最后一个策略来避免hindpaw-related运动能力损伤/残疾是选择在实验性自身免疫性脑脊髓炎的主题和抗原结合,不会引起严重的运算单元。最常用的老鼠用于研究DA MOG-induced实验性自身免疫性脑脊髓炎、刘易斯、或棕色挪威大鼠由于敏感地开发可靠的运动能力损伤水平/残疾后MOG管理局(76年)。菌株如SD大鼠运动能力损伤/残疾不太常用的研究。在实验性自身免疫性脑脊髓炎特别是,迄今在SD大鼠的研究使用标准实验性自身免疫性脑脊髓炎脊髓匀浆对髓鞘产生自身免疫反应,并产生可靠的和严重的运动障碍/残疾标准剂量(77年,78年)。相比之下,采用第二个和第三个策略,我们最近报道增加内存赤字没有显著的运动能力损伤/残疾(低剂量MOG-induced SD大鼠模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎10)。在这里,我们这些发现扩展到类似低剂量的表征MOG-induced优化研究SD大鼠模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎EAE-induced疼痛。

我们发现TLR2-TLR4拮抗剂(+)-NTX逆转EAE-induced疼痛和神经胶质免疫反应性增加腰椎脊髓背角的SD大鼠模型中提出。这些发现与之前的研究一致使用模型的外围和centrally-induced神经性疼痛(34- - - - - -37疼痛模型(),以及在实验性自身免疫性脑脊髓炎16)。特别对实验性自身免疫性脑脊髓炎,我们已经表明,疼痛在DA大鼠模型低剂量MOG-induced实验性自身免疫性脑脊髓炎也逆转TLR2-TLR4拮抗剂治疗雄性和雌性老鼠使用类似timecourse和剂量治疗方案MOG和(+)-NTX (16)。在大鼠模型中,然而,性别差异被发现增加了星形胶质细胞的免疫反应性腰椎脊髓背角的只发生在女性而不是男性,而小胶质免疫反应性增加两性所示(16)。与之相反,在这里介绍SD大鼠模型,星形胶质细胞和小胶质免疫反应性增加腰椎背角的雄性老鼠。星形胶质细胞免疫反应性而可能增加男性DA大鼠需要更高的MOG剂量,重要的是要注意,运动能力损伤/障碍已经出现在DA大鼠模型的剂量4μg撤走,而运动能力损伤/残疾只出现在SD大鼠模型在最高剂量的MOG我们测试(即。,16μg)。这些数据表明,诱导的门槛提高星形胶质细胞免疫反应性似乎是男性DA大鼠高于雄性SD大鼠,以及女性DA大鼠。性别差异没有探索SD大鼠模型中,作为这里的明确目标是比较结果与之前的研究,大体上使用男性为主题。扩大SD雌性大鼠模型是未来研究的一个有价值的话题。性别差异被认为是一个重要的研究领域的研究,包括临床医学相关的疼痛,女性患者通常比男性更频繁地表达医学相关的痛苦患者(79年)。这些数据强调,发展各种模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎的重要性可以涉及不同的介质和细胞类型,评估治疗的疗效,探索新机制MS-associated疼痛。

在中枢神经系统、TLR2和TLR4在星形胶质细胞和小胶质细胞(主要是表达29日,38),但也存在神经元(38,39)和中枢神经系统浸润T细胞(40,41)。toll样受体2和4被激活的抑制分解的髓鞘和其他损害和炎症细胞,包括产品,如热休克蛋白60 (HSP60), HSP70,机动性高组框1 (HMGB1),α-突触核蛋白,透明质酸,纤维蛋白原和实验(61年,73年,80年- - - - - -86年)。结扎TLR2和TLR4然后诱发NF-kB激活,质数NLRP3 inflammasome并最终导致促炎细胞因子的生产IL-1β在各种啮齿动物模型已被证明导致疼痛在鞘内给药(29日,30.)。此外,我们曾报道,脊髓IL-1βEAE-induced男性DA大鼠疼痛是必要的(16),而在这里,我们表明,NLRP3 inflammasome SD鼠EAE-induced痛苦是必要的(图5)。符合这些发现,我们先前已经表明,每日治疗(+)-NTX逆转疼痛与脊髓NLRP3正常化和IL-1βmRNA在雄性大鼠(16),我们还报道说,这种治疗方案改变内存赤字DA和SD雄性大鼠模型,低剂量的实验性自身免疫性脑脊髓炎是同样与正常化EAE-induced增加海马胶质激活,和NLRP3 IL-1β,IL-17 mrna在雄性大鼠(10)。虽然我们没有明确测试脊髓IL-1β是否必要的痛苦在SD大鼠模型由于缺乏持续的资金,鉴于NLRP3的必要性疼痛在这个模型和NLRP3激活和IL-1β释放强烈的关系,IL-1β将预测也是必要的痛苦在这里给出的SD大鼠模型。SD大鼠模型中是否存在性别差异,这些措施还有待定义。最后,它曾被报道,IL-1β和NLRP3 EAE-induced电机干扰老鼠是必要的(72年,87年),它被认为通过Th17细胞的激活函数通过IL-1β和集落刺激因子(gm - csf)信号(88年)。未来的研究还应该调查是否这些通路可能是必要的对于EAE-induced SD大鼠的运动能力损伤/障碍使用脊髓匀浆作为抗原引起更严重的运动障碍/残疾,这里给出MOG-induced SD雄性大鼠模型不适合解决这个问题。

CD4 + T Th17细胞也表达TLR2 (41)和TLR4 (40)和释放的主要促炎细胞因子IL-17 Th17细胞最近被证明有助于EAE-induced疼痛小鼠(32),我们选择调查IL-17是否疼痛是必要的对实验性自身免疫性脑脊髓炎SD模型大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎。我们还研究了是否减少CD4 +细胞免疫反应性腰椎脊髓背角的与减少(+)-NTX治疗后疼痛。我们发现尽管脊椎IL-17 EAE-induced SD大鼠疼痛是必要的,也没有实验性自身免疫性脑脊髓炎(+)-NTX治疗腰椎水平背角CD4免疫反应性改变。有几个可能的原因这些研究结果之间的差异。一个可能的原因是,足够几CD4 +细胞渗透在这个模型低剂量实验性自身免疫性脑脊髓炎脊髓,他们避免通过免疫组织化学方法检测。与之相反,采用流式细胞术允许一小部分的评估不同T细胞的数量(89年)。支持这一假设,我们发现最高剂量的MOG SD大鼠模型(即进行测试。,16μg) produced a statistical trend to increase CD4 immunoreactivity that nearly reached a level of statistical significance (i.e.,p= 0.06;图9)。因此,流式细胞术能更敏感地检测这些细胞群的变化归纳后轻微的实验性自身免疫性脑脊髓炎。流式细胞术添加到未来的研究可能是有价值的,温和自然的模型低剂量实验性自身免疫性脑脊髓炎将不会产生尽可能多的CD4 +细胞浸润在标准运算单元模型。第二个原因我们可能没有检测到显著增加CD4免疫反应性是许多女士和T细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎不穿过血脑屏障,而不是区分在脑膜和/或血管周的位置(44)。由于限制在脊髓解剖用于免疫组织化学的方法在这些研究中,脑膜和血管周的区域没有保持不变,因此,不能排除,CD4 +细胞的一个重要的人口影响运算单元和/或(+)-NTX治疗在这些位置。未来的研究将需要设计分析脑膜/ SD大鼠模型血管周的细胞的数量。也有可能为免疫组织化学选择的计算(即。,1month post-MOG administration) was not early enough to observe the changes in CD4+ cell infiltrates, as T cell infiltration often occurs alongside the development of motor impairments/disabilities that typically begin approximately 2 weeks after MOG administration (43- - - - - -45),包括在研究在SD大鼠,用一个标准的实验性自身免疫性脑脊髓炎脊髓匀浆抗原(78年)。最后,CD8 + T细胞,存在于更高数量的脱髓鞘病变和在实验性自身免疫性脑脊髓炎患者女士比CD4 + T细胞。然而,尽管一些研究已经表明,CD8 +细胞可以释放IL-17在一些情况下,Th17细胞被认为是主要的细胞产生IL-17 (42,90年)。还有待确定CD8免疫反应性是否会增加更大程度比CD4免疫反应性在这里给出的SD模型大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎。最后,TLR2和TLR4在CD4 +细胞已被证明是必要的对于EAE-induced小鼠运动能力损伤/障碍(40,41),因此,他们也应该研究SD大鼠模型(即以适当的标准实验性自身免疫性脑脊髓炎,using spinal cord homogenate as an antigen) to determine whether they are also necessary for motor impairments/disabilities in SD rats.

最后,我们发现,最高剂量的MOG SD大鼠模型(即进行测试。,16μg) produced a significant decrease in fluoromyelin intensity in ventral funiculus of lumbar spinal cord (图10),表明脱髓鞘白质在这个剂量是持续的。然而,两周(+)-NTX治疗只产生一种趋势逆转这种效果,并没有达到统计显著性水平(图10)。还不知道更长的疗程可能被证明有效。此外,定性分析补充图S6表明一个老鼠有严重运动障碍/障碍是与一个健壮的fluoromyelin腹侧细绳的强度下降,而这fluoromyelin强度下降高度与CD4免疫反应性增加同样的老鼠。第二只老鼠接受16μg MOG但没有显示严重运动障碍/残疾等比较,没有发现包括fluoromyelin强度或CD4免疫反应性的变化,尽管这两个动物表达完整的机械触诱发痛整个研究(补充图S6)。这些数据表明,免疫组织化学代表性剖面的腰椎脊髓可能不能占脱髓鞘病变的空间位置的差异,发生在一个模型中,低剂量的实验性自身免疫性脑脊髓炎等,个别主题数据髓鞘染色强度和CD4细胞渗透有潜力成为极大地取决于倾斜部分包含一个病变。此外,正如一些主题显示严重运动障碍/残疾16μg MOG集团,也很有可能越来越不太严重的脱髓鞘病变相比,生产标准的运算单元模型。这个不幸的是很难评估的影响(+)-NTX这些现象。作为本研究的目标是产生一个低剂量研究SD模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎痛苦,未来的研究需要解决这些问题。我们的数据与之前的研究一致表明更严重的运动障碍/残疾与更严重的髓鞘脱失和炎性细胞浸润(91年,92年)。

总之,本研究提供的第一个特征低剂量MOG-induced模型优化研究SD大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的痛苦,以诱导稳定的异常性疼痛在许多周。我们发现剂量的8和16μg MOG可能产生长期的机械触诱发痛在缺乏运动能力损伤/残疾雄性SD大鼠,这是增加脊髓胶质激活和髓鞘脱失。此外,我们表明,脊髓NLRP3和IL-17 MOG-induced所需机械触诱发痛在这个模型。最后,我们表明,2周的系统性管理TLR2-TLR4拮抗剂(+)-NTX逆转MOG-induced机械触诱发痛和减少脊髓胶质激活而不影响脊柱T细胞表达或髓鞘脱失。多达92%的患者体验痛苦女士(1),包括许多患者报告疼痛多年前诊断(女士62年),这些研究结果突出的重要性,利用这些模型来探索机制和治疗可以改善疼痛,因此整体的MS患者的生活质量。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到通讯作者/ s。

道德声明

动物研究是科罗拉多大学波尔德分校IACUC进行审核和批准。

作者的贡献

正义与发展党:概念、方法验证、正式的分析,调查,原创作品草稿,writing-review和编辑,项目管理和资金收购。MC、KH和EM:调查,writing-review和编辑。TL, SL, BW, LT和为:调查。A-MVD和基米-雷克南:资源。SM:资源writing-review和编辑,融资收购。LW:资源、概念化、writing-review和编辑,项目管理和资金收购。

资金

这部分工作是支持美国国立神经疾病和中风研究所(R01NS097313),科罗拉多大学的生物科学计划,和校内的国家药物滥用研究所的研究项目和国家酒精滥用与酒精中毒研究所,国家卫生研究所。

确认

脊髓的图像图7- - - - - -10创建了BioRender.com(2021),从检索https://app.Biorender.com/Biorender-templates。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fpain.2022.932530/full补充材料

补充图S1。髓少突细胞糖蛋白(MOG) Sprague-Dawley (SD)大鼠产生任何运动成绩低剂量和温和的运动成绩更高的剂量。
图1这里是re-represented补充图S2规模较小的轴为增强组织的分化。

补充图S2。每天系统性管理TLR2-TLR4拮抗剂(+)环丙甲羟二羟吗啡酮((+)-NTX)运动成绩在不改变实验性自身免疫性脑脊髓炎Sprague-Dawley (SD)的老鼠。
图3这里是re-represented补充图S3规模较小的轴为增强组织的分化。

补充图S3。髓少突细胞糖蛋白(MOG)诱发腰椎脊髓背角Iba1免疫反应性逆转的日常系统管理TLR2-TLR4拮抗剂(+)环丙甲羟二羟吗啡酮((+)-NTX)。
图7Iba1免疫组织化学re-represented在40 x放大照片增强的分化的细胞染色。

补充图S4。髓少突细胞糖蛋白(MOG)诱发腰椎脊髓背角GFAP免疫反应性逆转的日常系统管理TLR2-TLR4拮抗剂(+)环丙甲羟二羟吗啡酮((+)-NTX)。
图8GFAP免疫组化图片re-represented在40 x放大增强的分化的细胞染色。

补充图S5。髓少突细胞糖蛋白(MOG)诱发腰椎脊髓背角GFAP免疫反应性逆转的日常系统管理TLR2-TLR4拮抗剂(+)环丙甲羟二羟吗啡酮((+)-NTX)。
图9CD4免疫组织化学re-represented在40 x放大照片增强的分化的细胞染色。

补充图S6。定性分析单个大鼠髓鞘脱失和CD4免疫反应性腹侧细绳与运动成绩,但不是机械触诱发痛。
两个人从16μg老鼠髓少突细胞糖蛋白(MOG)盐水对照组在实验2中显示的相同水平的机械触诱发痛而显示反对水平的运动能力损伤/障碍在整个研究过程中(补充图S1Avs。补充图印地)。显示更高的运动能力损伤的大鼠/残疾不能检测机械触诱发痛最后一天(即。天29)由于运动能力损伤/残疾导致下肢损伤(缺乏数据点的箭头补充图S1)。河鼠得分更高的汽车(B)显示髓鞘染色强度下降(D)和增加CD4免疫反应性(F)而电动机分值较低的老鼠(A, C, E)。没有这些数据的定量分析进行了由于缺少主题显示面板的现象描述B, D, F。

引用