mir - 92 a和整合素表达在维管组织的膜增生性糖尿病性视网膜病变

1介绍

糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的并发症之一。博士大致分为四类,是一个温和,温和,或严重non-proliferative博士(NPDR)与视网膜渗透率的增加和毛细血管闭塞,博士和增殖(PDR)的特点是新的,异常血管的形成维管组织的膜(有限)。有限体积法的形成发生在缺血性的接口和非缺血型视网膜和视神经(1)。不管博士阶段,炎症过程,细胞外基质(ECM)的增长,和血管生成在一起构成一个博士在PDR的病理特点,炎性环境由ECM的增加生产、趋化因子等主题趋化因子配体2 (CCL2)和高血糖增加有限体积法形成的易感性(2)。ECM、趋化因子和炎症中起关键作用有限体积法的形成。此外,有限体积法与各种细胞的迁移和增殖有关,如巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和骨骨髓来源的细胞(3)。

整合蛋白家族的多功能酶分子与α和β亚基作为义务在细胞表面形成(4)。整合蛋白,通过纤连蛋白结合配体如ECM蛋白质,vitronectin,层粘连蛋白,胶原蛋白,骨基质蛋白,血小板反应蛋白,和血管性血友病因子,初步作用在细胞间和cell-to-extracellular交互。(5)在视网膜上,整合蛋白密切参与内部限制膜(ILM),因此在cell-matrix交互(扮演必不可少的角色6)。毛细血管基底膜增厚导致整合素表达的增加(博士7,8)。的α_vβ₃整合蛋白表达在基底和内皮细胞腔的表面和活跃的增殖内皮细胞(9,10(博士)和炎症细胞9)。激活α_vβ₃整合素维持巨噬细胞炎症反应过程(11)。先前的研究证明增加α的水平_vβ₃,α_vβ_5,和α₅有限体积法的整合蛋白PDR患者(12,13)

小分子核糖核酸是高度保守的非编码RNA分子参与调节基因表达。新兴的研究表明,microrna的监管机制发挥重要作用的发病机制的microrna测定博士从糖尿病小鼠视网膜内皮细胞显示增加microrna的表达参与视网膜炎症(14)。我们之前报道,mir - 92 a是独特的监管循环血管生成细胞(机电)的博士;有趣的是,mir - 92——据报道在啮齿动物表达下调与糖尿病视网膜(14)。先前的研究表明,mir - 92 mRNA的目标整合素α_v和整合素α₅(15)。然而,mir - 92 a和整合素表达有限体积法不是探索。这项研究表明,有限体积法的PDR个人mir - 92 a的差别表现出对这些并发增加α₅和α_vβ_3,因此提出一个新颖的机制mir - 92 - a -整合素轴在博士的有限体积法形成。

2材料和方法

2.1收集有限体积法膜和玻璃

我们招募了活跃的纤维血管增生而产生由于PDR患者和控制人非糖尿病和运营期间去除黄斑术后玻璃体切除术。该研究机构审查委员会批准(IRB, # 1809532202),印第安纳大学医学院的,按照世界医学协会的道德规范。之前获得知情同意收集有限体积法膜和玻璃。膜被立即在冰冷的汉克的平衡盐溶液(Ca^{+ +}和毫克^{+ +}免费),玻璃样品分别被冻结了。有限体积法是分成块,总RNA cryosectioning或隔离处理。的玻璃样本也为RNA隔离处理。

2.2 mir - 92 a和整合素表达水平使用中存在

使用试剂盒总RNA分离试剂(ThermoFisher科学、沃尔瑟姆,MA)制造商的指示。核糖核酸的纯度测试使用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计(ThermoFisher科学)。额外的RNA进行了净化轮使用RNAEasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国),确保260/280比例的RNA ~ 2。10 ng的RNA是使用应用反转录Biosystems-TaqMan-MicroRNA逆转录工具包(ThermoFisher科学),量化只有成熟的microrna。mir - 92 a miRNA-specific底漆(hsa-miR92a-3P # 000431, ThermoFisher科学)和管家控制RNU6B (# 001093 ThermoFisher科学)和RNU48 ((# 00106, ThermoFisher科学)被用来量化mir - 92 a的水平有限。

500 ng的RNA反向转录使用上标™很互补脱氧核糖核酸合成装备(# 11755 - 050 ThermoFisher科学)。以下引物(ThermoFisher科学)ITGAV(# Hs00233808_m1),ITGB3(# Hs01001469_m1),ITGA5(# Hs01547673_m1)和管家控制ACTB (# Hs99999903_m1)。中存在的反应是使用ViiA7执行实时PCR系统(ThermoFisher科学)。

2.3整合素染色的有限体积法

有限体积法膜被存储在Tissue-Tek 10月(樱花FineTek-USA)复合cryosectioning之前。8μm厚度的部分是获得使用徕卡CM3050低温恒温器(布法罗格罗夫,IL)其次是染色使用整合素α₅(1:10 0 # CBL497微孔伯灵顿,MA)或α_vβ₃抗体(1:10 0 # MAB1976微孔)。CD31抗体(1:10 0 # ab28364 Abcam,剑桥,MA)被用来染色内皮细胞。以下二次抗体被使用,Alexa萤石555山羊anti-mouse (1:800 # A21422 ThermoFisher科学)或Alexa萤石488山羊anti-rabbit (1:800 # A11034ThermoFisher科学)。幻灯片是安装在Vectashield(向量实验室,伯林盖姆,CA)包含DAPI越来越多的媒体。为每个膜三个免疫荧光图像被使用蔡司lsm - 700共焦显微镜(白色平原,纽约)。荧光强度的量化使用ImageJ图像处理软件(16)。

2.4统计

mir - 92 a表达式值表示为2^dct关于个人管家microrna、RNU6B RNU48水平。个人有限样本作为三个技术复制和平均运行。最后的图表中的数据被表示为±SEM,其中n对应各自的有限样本,生物复制。离群值被确定使用Grubb 0.05(α)的方法。mir - 92 a表达的统计分析进行了使用双尾未配对t检验使用GraphPad棱镜软件(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、www.graphpad.com9.4.1)版本。荧光强度的视网膜显微照片分析了利用线性混合模型EM意味着随后各自组的比较与最小二乘设计使用IBM SPSS统计数据(美国纽约www.ibm.com/products/spss-statistics)。统计意义被认为是在假定值小于0.05。

3的结果

3.1减少在有限体积法膜mir - 92 A

研究mir - 92 a水平有限体积法膜,我们获得了有限体积法膜从PDR的个人。非糖尿病患者接受手术的外层膜黄斑是用作控制。mir - 92 a含量大大减少对管家控制(RNU6B-p < 0.001;RNU48-p < 0.01)的有限体积法PDR主题(图1)。虽然mir - 92 a的水平降低了玻璃样品PDR患者,差异无统计学意义(补充图S1)。

3.2增加αvβ3α5在有限体积法膜整合蛋白

mir - 92 a是一种已知的阻遏的整合素α₅,α_v(15);研究mir - 92有限体积法减少是否加上整合素表达的增加,我们首先确定mRNA的表达整合蛋白ITGAV, ITGB3 ITGA5,对应于整合素α_v,β₃和α₅分别。有一个ITGAV mRNA(增加2.26倍图1 c;p < 0.05),增加3.5折ITGB3 mRNA (图1 d;p < 0.05),增加2倍ITGA5 mRNA (图1 e;p < 0.05)。

接下来,外层膜是整合素αcryosectioned和染色_vβ₃或α_5,内皮细胞和CD31抗体标记。二次抗体控制背景染色(都很小补充图S2)。PDR的细胞膜主题为α彩色明亮_vβ₃抗体相比,控制膜有限体积法(图2 a, B)。的α₅整合素染色表现出相似的变化对PDR膜染色;总的来说,α的强度₅染色是光明PDR-FVMs相比控制外层膜(图2 c, D)。

4讨论

有限体积法的形成是PDR的特征;我们的研究已经确定了小说的有限体积法病理机制通过展示mir - 92 a的参与,整合素轴。我们的研究的重要发现包括,mir - 92 -减少有限体积法与整合素α的增加有关₅和α_vβ₃,因此,假定mir - 92——可能是一个重要的抗炎目标PDR的发病机理。

我们报告一个减少mir - 92 a水平有限体积法对PDR患者;符合我们的发现,先前的研究表明减少mir - 92 a在玻璃的PDR (17)和啮齿动物视网膜糖尿病患者(14)。当我们看到一个减少在玻璃mir - 92 a,这种差异是无关紧要的。值得注意的是,先前的研究,无法验证mir - 92玻璃PDR (17- - - - - -19)和等离子体(19,20.)尽管减少或者增加mir - 92 a水平数组平台;这表明,玻璃可能不是一个理想的组织研究mir - 92 a水平变化在上下文博士,博士也严重程度可能影响mir - 92 a的水平。

在最初,mir - 17 - 92集群被发现参与肿瘤发生,新兴的研究多年来显示其胚胎发育的重要作用,免疫疾病、心血管疾病、衰老和神经退行性条件(21)。mir - 17 - 92集群是内皮细胞中高度表达;特别是,mir - 92已经被证明可以促进血管生成针对pro-angiogenic mRNA的蛋白质,如内皮一氧化氮合酶(以挪士)和整合素α₅(15)。mir - 92——据报道,被激活在肿瘤细胞和神经母细胞瘤,它充当一个内源性血管生成抑制因子(15)。在我们的研究,我们推测,mir - 92 -减少有限体积法的扮演了不可或缺的角色帮助博士的炎性环境mir - 92 -减少并发增加整合素水平可能促进了有限体积法形成PDR博士的个人。没有整合素表达的变化,mir - 92水平与黄斑外层膜的主题;然而,我们也不能排除,黄斑控件可以展览mir - 92 a的变化水平,包括可能增加mir - 92 a;这是一个研究的局限性。尽管如此,考虑到现在的文学(14,17),减少mir - 92中观察到PDR表明潜在的糖尿病微环境的介入调停mir - 92 -减少。mir - 92报告作为负调节巨噬细胞炎症的表演通过MAP2K4, TLR4和TLR2(差别导致了对这些22)。我们确认这个断言在先前的研究表明,mir - 92的超表达降低机电toll样受体(通常)和炎性细胞因子如TNF-α和IL1-β(23)。

PDR的特点是有限体积法的形成。炎症过程、血管生成和增长的ECM组件,如纤连蛋白和胶原蛋白(24),构成一个先前的研究(博士的病理特点12)和我们的发现证明增加水平的整合素α_vβ₃和α₅个人PDR的维管组织的膜。虽然不是建立直接联系,我们相信mir - 92 -减少扮演了不可或缺的角色在博士整合素表达的增加,考虑其作为负调节整合素的分子。我们认为最佳mir - 92 a的水平可能是必要的减少的严重程度博士确实,我们此前报道称,一群人仍然保持较高水平的博士免费mir - 92 - a和减少通常受试者相比减少TLR可能涉及到博士,发达c-Jun NH2-terminal激酶(物/ c-Jun)通路(22)。

总之,我们的研究发现,mir - 92 -减少有限体积法与整合素α的增加有关₅和α_vβ_3,这可能有助于病理PDR。此外,我们的研究为未来铺平道路包含博士microrna的疗法在治疗患者的治疗策略。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

涉及人类受试者的研究回顾和批准的机构审查委员会,印第安纳大学医学院的。# 1809532202 (IRB)。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。

作者的贡献

概念化,AB;方法,QL;验证、QL;QL形式分析;资源、AB啊;数据管理,QL;原创作品草稿准备,AB;writing-review和编辑,QL,啊,和AB型;可视化、AB;监督、AB; project administration, AB; funding acquisition, AB. All authors contributed to the article and approved the submitted version.

资金

这项研究是由美国国家眼科研究所,格兰特数字R01 EY027779 R01 EY032080 AB和印第安纳大学授予价值啊。美国眼科支持一种无限制的补助金从研究防止失明。

的利益冲突

AB是一个临时员工药剂师在CVS卫生/安泰。

其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

作者免责声明

手稿的内容并不反映的CVS健康/安泰。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fopht.2023.1116838/full补充材料

引用