胶质重构和脉络膜血管病理与Choroideremia眼睛从两个捐助者

介绍

Choroideremia (CHM)是一种罕见的隐性、查证和x染色体相关疾病影响个人(1- - - - - -3)。个人经验CHM出现不同程度的病理但大多数在青春期发展夜盲症。视力丧失开始在青少年时期和进展患者有很少或没有视觉功能由60岁(4)。

CHM基因编码Rab护送蛋白1 (REP-1) (5)。REP-1是一种膜贩运蛋白表达在很多组织,包括视网膜和RPE。虽然有证据表明REP-1调节视网膜毛细血管网络和choriocapillaris (CC)以及蛋白质翻译后修饰和分子贩卖RPE细胞内(5- - - - - -7),我们还不了解REP-1缺陷导致CHM临床特征。尽管REP-1表示在许多细胞在视网膜上,RPE细胞被认为是第一个影响CHM (7,8)。最近成像技术的进步,然而,已经引起了争议,变性是哪里来的(8- - - - - -13)。CHM患者的多模式成像研究在揭示不同疾病阶段早期RPE损失之后,光感受器外节(PR OS)损失和外层视网膜制管(体育)影响边境地区(6,14)。运动在最严重的病例观察(14)。除了公关操作系统的变化,最近的成像数据表明外部限制膜的增厚(ELM)在疾病过程的早期,在失去RPE指出,光学相干tomograophy(10月)(11,15- - - - - -17)。已经推测这个榆木增厚Muller细胞重构结果应对公关变化或压力信号,这发生在临床观察到的变化。

虽然在其他视网膜胶质改造已经证明一种退化(18- - - - - -22),建议在一个电子显微镜研究CHM供体眼(23),它尚未完全研究在化学加工。同样,尽管脉络膜的变化观察临床,病理评估有限的脉络膜的损失已经完成。在目前的研究中,我们调查,利用免疫组织化学和透射电子显微镜(TEM),神经胶质重构和激活以及脉络膜的变化及其与RPE损失从两个CHM患者的眼睛。

方法

捐赠者的信息

捐赠1是一位81岁的白人男性,他死于心肌梗塞。除了CHM,捐赠者患有帕金森氏症和老年痴呆症。捐助2是一个74岁的白人男性死于心脏病发作。没有注意到其他主要病史捐赠。虽然这些捐助者已证实诊断CHM,没有遗传信息是可用的。

组织收集和处理

眼睛是收到直接通过Choroideremia研究基金会捐款。眼睛被EverSight收获和装上湿冰(捐赠1)和狮子眼库(捐助2)。收到国家的疾病研究与控制组织交换(NDRI) 30小时内验尸。眼睛从捐赠1收到39小时验尸。眼睛从捐赠者2固定在5%福尔马林在航运之前24小时后期实验室。货到后在实验室里,我们删除了前房,使用Stemi解剖范围(卡尔蔡司Meditec制造公司),视网膜成像的洗眼杯。从每个捐赠者,我们低温贮藏加工另一只眼睛flatmount免疫组织化学如下所述。为控制眼睛、视网膜脉络膜的解剖和固定在2%多聚甲醛(准备在0.1甲次砷酸盐缓冲;PFA)。RPE /脉络在1% EDTA孵化dH2O在室温下2小时前删除RPE与温和的移液和修复2% PFA的脉络。所有CHM眼睛,然而,包含密集疤痕使它不可能从脉络膜视网膜解剖除了在遥远的边缘。 The retina/choroid was fixed and stained together when they could not be separated. In parts that we could separate, the RPE was removed as described above before dissecting and fixing the choroid.

低温贮藏

一只眼睛从每个捐赠者低温贮藏根据我们发表方法(19,24,25)。短暂,我们固定的眼睛2小时在5%蔗糖含有2%在PBS PFA,然后放在增加蔗糖的浓度在分离后杆之前,低,鼻、颞叶和优越的碎片和冻结在2:1 20%蔗糖溶液最佳切削温度的解决方案(TissueTek)。8微米厚的矢状横截面削减在徕卡低温恒温器(徕卡生物系统)。

透射电子显微镜法

一块从每只眼睛gluteraldehyde固定在2.5%和2% PFA TEM(0.1甲次砷酸盐缓冲)。组织处理(如前所述)(19,26)。眼睛部分嵌入的横截面可以被削减。使用日立H7600电子显微镜图像采集。

免疫组织化学

免疫组织化学flatmounts或执行cryosections如前所述(19,27)。flatmounts,组织固定过夜,然后屏蔽5%山羊血清准备在1 xtbs Triton-X100 1%和0.1%牛血清白蛋白(TBST-BSA)。组织培养在初级抗体(见表1;稀释TBST-BSA) 4°C 72小时然后48小时在二级抗体(稀释1:200;看到表1)以及Ulex Europaeus凝集素(UEA)在TBST凝集素(1:10 0)。抗体孵化项目是紧随其后的是三个洗TBST(20分钟)。Cryosections被封锁2%山羊血清(TBST-BSA准备)在孵化前20分钟在初级抗体鸡尾酒2小时和二次抗体与DAPI(1:10 0) 30分钟。二次抗体在TBS的准备。TBS是用来洗抗体孵化项目之间的部分。我们收集所有图片蔡司710共焦显微镜使用禅宗软件。映射图像,我们获得了平铺的图片(有10%的重叠)的组织块在1024 x1024-pixel分辨率Z栈使用5倍的目标。激光功率、针孔和获得受试者之间没有改变每一个标记分析。

计算血管面积百分比

血管面积和CC直径百分比计算(如前所述)(28)。短暂,我们出口的最大强度预测5 x平铺的图像使用禅宗全解析度的Tiff图像,打开软件在Adobe Photoshop(密室,Adobe Systems Inc .)。三个区域(相当于1毫米²每个)随机选择从后杆,赤道和外围和粘贴到一个新文档(27)。调整后的阈值和水平,图像在ImageJ保存和打开。图像转换为二进制和噪音减少(此句在每张图片)在计算黑到白比之前,产生血管区(百分比29日)。

结果

总值摄影

控制眼底视网膜显示健康血管拱廊可见(图1一个)。相比之下,CHM视网膜都是多云的和含有大量色素针状体(图1 b, C)。视网膜血管清晰可见,但出现异常,减少的数量。正如上面提到的,我们不能单独的视网膜脉络膜的CHM眼睛由于密集的疤痕。

脉络膜血管的分析

而视网膜和脉络膜不能分开,隔离的共焦平面允许我们分析脉络膜的船只。控制显示脉络膜组织致密CC (图2 a - c)。相比之下,只有减少大型船只仍在大部分的CHM脉络(图2 d)。CC直径后波兰人从18.3下降10.75(+ / - -2.1)µm控制(+ / - -2.1)µm CHM眼睛。同样,在赤道,CC直径减少到9.75(+ / - 2.1)µm CHM眼睛而控制保持在19.3(+ / - -2.1)µm。在遥远的边缘,然而,CC直径是类似于控制(控制:24.5 + / 4µm CHM: 23.2 + / 3µm)。后极血管面积百分比减少从78(+ / - 0.17)控制到17.1 (+ / - 4.7)CHM眼睛。观察类似的模式在mid-periphery血管面积百分比是71.6(+ / - -1.42)相比,控制到12.7(+ / - -3.6)在化学加工的眼睛。然而,在外围血管面积百分比相当保守(控制:62.5 + / - 4,CHM: 56.9 + / - 9.9)。我们还观察到与保存CC离岛CHM (图2 g, H)。这些区域似乎与完整的RPE。

视网膜血管密度

与控制视网膜显示典型的视网膜血管争端用树枝从拱廊和无血管的区域周围的小窝(图3 a, C)。然而,两个CHM视网膜显示严重减毒脉管系统。捐助2的视网膜上,主要的拱廊完好无损,但更少的枝子被观察和深入二级毛细血管主要缺失(图3 b, D)。船只没有组织。不幸的是,甚至很难辨别捐赠者1中的视网膜血管的flatmount形象。

神经胶质重构和膜的形成

控制视网膜,沾GFAP和波形蛋白表现出统一的星形胶质细胞模板模式类似于视网膜血管(图4一)。几个孤立的胶质细胞观察扩展到vitreo-retinal表面。通过鲜明的对比,这两个CHM眼睛有致密的膜状般的结构由GFAP和vimentin-double阳性细胞以及细胞阳性只有这些蛋白质之一。这个密集结构可视化视网膜拱廊和星形胶质细胞困难的低倍镜下(图4 b)。以下这个膜和视网膜的复杂性是更好的可视化在较高放大(图4 c, E)。如图所示,许多细胞表面和过程占据了vitreo-retinal CHM眼睛。这些细胞有不同的形状和他们创造没有组织结构。vitreo-retinal表面在一个领域,神经胶质细胞有一个帐篷形的外观,这表明视网膜上牵引(图4 b箭头所指)。当成像到更深的飞机,星形胶质细胞的光染色可见视网膜血管与凝集素染色(图4 d, F)。星形胶质细胞并未反映的GFAP染色形态和良好定义的模式控制。同样,船只被减毒的CHM眼睛,如上所述。在视网膜上的捐赠1,检查顺序Z堆栈图片显示一些更深层次的继发性视网膜血管和只有偏远地区GFAP-positive星形胶质细胞。相反,整个Z-stack紊乱Muller细胞过程观察,很难区分视网膜层(数据未显示)。

正如上面提到的,两个CHM眼睛的视网膜上RPE /被scar-like脉络结构。成像的视网膜flatmounts榆树,或者后两极的脉络,在面临了视网膜下胶质细胞形成第二个vitreo-retinal表面膜状般的结构很相似。这是形成鲜明对比的扇染色控制视网膜(图5一个)。在CHM眼中,视网膜下胶质细胞对GFAP阳性和波形蛋白(图5 b-g)。虽然这些似乎主要Muller细胞过程中,膜的密度很难排除细胞体也退出了视网膜。虽然pre-retinal胶质膜覆盖整个视网膜、视网膜下的神经胶质仅限于RPE领域/ CC萎缩。有一个非常明确的边界在遥远的外围神经胶质膜结束的地方。直接相邻的这是完整的RPE细胞以及一个更复杂的比在其他领域CC (图5 g, H)。

横截面的伙伴眼睛每个捐赠者也用于更好地理解胶质结构变化。后杆的部分捐赠1与波形蛋白染色(Muller细胞)和层粘连蛋白(ILM和血管),验证了穆勒vitreo-retinal表面细胞(图6曹磊)。这些部分也证实视网膜纹理迷路了。Muller细胞过程和脱臼核似乎占据了大部分的内部和外部视网膜。而控制Muller细胞部分被罚款和线性(图6 a - c),这些CHM捐赠者的增厚,歪斜的和无组织的(图6 e, G, H, J)。部分从捐赠者2显示类似的结果(数据未显示)。

小胶质细胞也与前和视网膜下胶质膜

为了确定小胶质细胞被激活,与和视网膜下胶质膜,我们染色下象限的CHM视网膜与GFAP和电离钙绑定衔接分子1 (IBA-1),小胶质标记。我们观察到许多IBA-1阳性细胞在前(图7 a - c)和视网膜下胶质膜(图7 d-f)。小神经胶质细胞圆形在外观和缺乏流程,展示他们认为激活,膜。的眼睛从捐赠者2,在视网膜下,我们观察到一个土块的色素细胞,这可能是迁移或分离RPE骨骨针,包围Muller细胞过程和活化的小胶质细胞(图7胃肠道)。Z-stack焦平面的视网膜内同样的形象,这种色素丛仍然存在色素细胞在周围地区(图7 j-l)。这些可以迁移RPE或骨骨针。

神经胶质外层部分的吞噬作用

我们彩色控制和CHM捐赠cryosections GFAP和视紫红质来验证胶质激活并确定是否感光部分依然存在。对于这一分析,我们使用从mid-peripheral视网膜部分,因为这是我们观察到的一些完整的RPE总值和flatmount分析照片。GFAP染色在控制视网膜局限于星形胶质细胞在神经纤维层(图8 a, B)。视紫红质是局限于感光部分(图8 a, C)。支持我们的flatmount结果,包含GFAP CHM眼睛⁺流程在整个极薄视网膜(图8 d, E)。如前所述,Muller细胞是歪斜的,似乎是占主导地位的剩余的视网膜细胞类型。DAPI染色证明完全缺乏纹理在视网膜上。尽管先进的疾病状态,观察rhodopsin-positive碎片(图8 d, F)。这碎片似乎硝唑Muller细胞进程(图8 d-f)。因此,我们怀疑这些碎片可以代表吞噬光感受器外段。我们与IBA-1彩色相邻部分,视紫红质,看看小胶质细胞至少部分负责视紫红质。我们没有观察到co-localization IBA-1与视紫红质(图8胃肠道)。

神经胶质细胞的超微结构

TEM分析被用来检查CHM眼睛的超微结构。这种分析证实,穆勒在CHM视网膜细胞过程突出和失去了线性形态(图9箭头)。我们还观察到Muller细胞过程占据视网膜下空间和扩展到布鲁赫膜(图9 b)。重要的是,Muller细胞紧密连接观察视网膜下空间(图9 d)。我们也观察到光感受器外节内碎片Muller细胞(图9 c、G),支持我们的免疫组织化学观察胶质细胞中的视紫红质(图8 d-f)。细胞外囊泡,液的大小,也表示可能退出Muller细胞在视网膜以及视网膜下空间(图9 d-f)。我们还观察到一个内层视网膜冷凝面积骨骨针Muller细胞包围流程(图9 h)。这是让人联想到结构的报道在捐赠1 flatmount沾IBA1和GFAP (图7胃肠道)。pre-retinal胶质膜也验证了TEM (图9我)。ILM的缺失或非常薄的在一些地区和Muller细胞形成endfeet没有好。

讨论

在这个报告中,我们已经提供了广泛的组织病理和免疫组织化学证据Muller细胞激活和重塑从两个CHM病人的眼睛。此外,脉络膜和视网膜血管密度严重降低后和赤道地区的眼睛。自捐助者报告本在第七和第八年,很难辨别对于病理过程从他们的眼睛。确定病理变化,即使在发达阶段,然而,可以直接当我们如何对待CHM帮助病人。

降低视网膜血管并不奇怪因为公关损失和CHM眼睛视网膜变薄。视网膜血管密度稀疏也被报道与光学相干断层扫描血管造影(OCT-A) (16)。减少可能的生物反应视网膜神经元死亡。之间的相关性视网膜血管密度和变薄支持捐助2的观察,他7岁年轻,有更多的保护视网膜血管比他捐赠1和视网膜变薄并没有那么严重。然而,重要的是要注意,减少视网膜厚度和脉管系统最近观察到患者的帕金森病(30.)。因此,捐赠1帕金森氏症的诊断可能是一个混杂因素在他的视网膜变薄。最近的一项研究用10月和八面体与视网膜和脉络膜的血管密度与厚度的变化在视网膜层CHM病人在30年代(16)。Arrigo和他的同事注意到,神经节细胞层,外核层,RPE和脉络膜薄萎缩性地区相比健康的区域。相比之下,内部核和内网状层薄萎缩性和保存地区。毛细血管丛深处也有较低的血管密度比正常的病人在萎缩性和健康领域。CC,然而,只有减少萎缩性地区。基于这些观察,作者推测内视网膜变化,分开RPE损失,可能导致减少视网膜血管(16)。尽管视网膜血管损失,一些船只的持久性,尤其是内心的视网膜,表明结构支持新细胞,如干细胞替代治疗。

正如所料,CHM眼睛的脉络严重衰减。只有大血管幸存在大部分的脉络,有CC船只出现在最外围的CHM眼睛。孤立的CC群岛也观察到在其他领域。虽然我们只观察到的区域与守恒的CC幸存的RPE细胞,所获得的数据没有提供证据关于RPE或CC是否受影响。目前的研究在我们的实验室调查幸存的RPE细胞的状态,这可能提供线索关于疾病病理。尽管许多人认为RPE细胞的第一影响CHM,脉络膜的病理过程的变化的贡献不能被排除。卡梅隆和他的同事们的研究报告,使用电子显微镜,增加产量的脉络膜内皮细胞基底膜的66岁CHM供体眼(23)。这些作者认为脉络膜血管壁的变化导致减少腔大小和指出类似的虹膜血管的变化。在虹膜血管变化之前的地区色素上皮缺陷。这些作者推测脉络膜内皮细胞可能导致CHM病理缺陷。虽然我们没有观察到这些脉络膜血管壁的变化,这可能是由于CHM捐赠者的更高级的阶段眼睛在这项研究。进一步研究CHM脉络膜的变化,在组织和利用细胞培养技术,可以帮助确定治疗目标。

根据我们的观察,RPE和CC都出现在外围脉络,没有观察到只有RPE地区或CC,似乎他们迷失在继承。支持了这个观点,最新的成像研究发现不同的结果对细胞影响的第一个(11,17,31日- - - - - -33)。也有可能多个细胞类型导致的病理CHM。因此,CC的损失应该是一个重要的考虑因素在决定治疗方案。例如,可能会有一个简短的窗口RPE损失后后续CC退化发生在RPE替代疗法是最有益的。

我们也调查了retina-choroidal疤痕的结构,防止删除CHM眼睛的视网膜。这种视网膜下膜状般的结构复杂,似乎包含多个层Muller细胞过程和细胞。IBA1-positive小胶质细胞和巨噬细胞中也观察到这种胶质结构,但不像穆勒突出细胞。穆勒过程贯穿布鲁赫膜和脉络,放入鞘中脉络膜的船只,如flatmount分析所示。这个观察证实了早先的电子显微镜研究表明胶质过程脉络膜的一侧的布鲁赫膜66岁CHM捐赠(23)。虽然早些时候报告了胶质细胞的极性被破坏与endfeet脉络膜的布鲁赫膜,我们没有观察到这一现象在我们的分析。这可能是由于晚期的捐赠者的眼睛和神经胶质的增加过程中视网膜下空间。鉴于穆勒神经胶质的瓦解,如果有人改变极性,这并不让人感到意外。我们观察到缺乏正常Muller细胞在ILM endfeet。类似胶质重构和膜的形成一直在观察区域的萎缩地理萎缩(18),视网膜色素变性(个人观察,未发表),视网膜脱离(34)和视网膜变性(35)。相信Muller细胞扩展他们的流程来响应绑定合作伙伴在榆树的丧失,细胞,为了创建一个新的榆树穆勒与其他细胞。事实上,我们确实观察视网膜下Muller细胞之间的紧密连接的空间。这可能是有益的,保护视网膜从视网膜下的物质空间。另外,这种膜可以创建一个从到达视网膜屏障,阻碍治疗。特别是,光感受器或RPE细胞移植会阻止他们的目标位置Muller细胞过程。此外,基因治疗也会困难,因为胶质疤痕会阻碍当地所需的视网膜脱离的视网膜下注射。也不知道如何将这些Muller细胞移植与本机RPE或感光前体在细胞替代疗法。

我们还没有确定是否Muller细胞构成视网膜下膜保持正常功能或如果他们过渡到更多的纤维细胞。同样,穆勒的自我平衡的功能细胞在视网膜,混乱和失去了线性形态,在CHM眼中也可能受到影响。虽然我们不能确定在疾病过程的早期Muller细胞发生变化,10月的一项研究表明视网膜增厚和变化在榆树光感受器或RPE损失(11,17)。这些作者推测Muller细胞的变化是由于装修,一个想法得到数据的支持。因为它是不可能与组织在当前的研究中,未来的研究将调查穆勒这装修如何影响细胞的功能。如果中断Muller细胞功能,这可能加剧光感受器丧失。上述10月/八面体研究指向穆勒Arrigo和他的同事在疾病的早期细胞参与过程可能发生与RPE损失(15)。穆勒在视网膜细胞的变化考虑干细胞治疗也很重要。一个重要的考虑是Muller细胞是否会恢复正常,并能够支持细胞移植。

pre-retinal胶质膜包含穆勒(GFAP和vimentin-positive)细胞和星形胶质细胞(仅为GFAP阳性)。类似的神经胶质细胞膜被报道与电镜(CHM眼睛23)。视网膜神经胶质的封孔观察供体2表示的可能性pre-retinal膜会对视网膜造成的牵引,导致视网膜脱离或黄斑孔。事实上,黄斑孔在CHM患者(已报告36)。此外,该膜的能力可能会影响intravitreally注射治疗达到视网膜外层。此外,激活Muller细胞释放炎性细胞因子和可能会加剧炎症反应,可与基因治疗相关联。

液在穆勒和周围细胞的存在表明,这些细胞用液作为一种沟通的方式。据我们所知,Muller细胞液尚未报道在人类捐献的眼睛。另外,我们观察到Muller细胞吞噬周边视网膜的感光碎片捐赠1。这种观察意外被先进的疾病阶段,但直到最近表明,边缘光感受器幸存下来。

我们承认,长时间的CHM眼睛是本研究的不足。我们有信心,然而,在给出的结果,因为我们正在使用的抗体已被证明能够承受长时间事后剖析在我们手和其他不影响疗效。也,我们不是比较表达水平除了GFAP的表达是大幅度增加Muller细胞的化学加工的眼睛。Muller细胞的过度装修或损失的脉络膜血管不会发生由于事后剖析时间增加。这些稀有的CHM眼睛使它值得报道的结果,尽管事后延迟。

总之,我们的研究结果表明,对于任何细胞或基于基因疗法成功治疗CHM,他们之前必须采用早期有广泛的神经胶质瘢痕和脉络膜血管的损失。是很重要的,因为成像功能改善,临床医生意识到潜在的神经胶质在ILM或视网膜下膜形成空间这可能确定治疗的最佳方式交付。关键是我们理解所有参与细胞的病理变化,这样我们就可以确定新的治疗靶点可能减缓甚至阻止CHM疾病进展。很明显,治疗CHM将发展成为我们理解疾病的过程改进。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。

道德声明

书面知情同意了个人(s)的出版的任何潜在的可识别的图像或数据包含在本文中。

作者的贡献

GL眼组织捐款,和我一起,设计实验和解释数据。我执行flatmount免疫组织化学,共焦显微镜,数据分析,和写手稿。DM协助共焦成像图准备和写作的手稿。IB总值收集照片,眼睛准备组织学评估(flatmounts或低温贮藏)和削减cryosections。RD和KC cryosections免疫组织化学研究和辅助共焦成像。RG TEM和准备样品进行了TEM分析。所有作者审查和编辑的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

Choroideremia研究基金会(GL) BrightFocus基金会(MME), NEI / NIH EY01651 (GL &我),EY031044(我),EY001765(威尔默眼科研究所)和研究预防失明无限制的格兰特(威尔默眼科研究所)。

确认

这手稿是献给我们的导师,朋友和合作者,GL,因为这将不可能没有他的远见,奉献精神和智慧。我们不能足够表达我们的感谢捐赠者及其家属为他们捐款。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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