原始研究的文章

前面。肿瘤防治杂志。,08 June 2023
秒。血液恶性肿瘤
卷13 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fonc.2023.1192829

与clinicogenomic特性和免疫细胞比例相关体外在急性髓系白血病药物反应

凯尔·a·Romine¹

丹尼尔底部 ^1、2

威廉Yashar ^1、3

尼古拉长^1、4

马修Viehdorfer ¹

香农·k McWeeney ^{1、2 *}

杰弗里·w·Tyner ^{1、5 *}

¹骑士癌症研究所,俄勒冈健康与科学大学,或者美国的波特兰
²生物信息学和计算生物学,医学信息学和临床流行病学、俄勒冈健康与科学大学,或者美国的波特兰
³俄勒冈健康与科学大学医学院的波特兰,或美国
⁴血液学和医学肿瘤学,医学系,俄勒冈健康与科学大学,或者美国的波特兰
⁵的细胞,发育和癌症生物学,俄勒冈健康与科学大学,或者美国的波特兰

作品简介:的实现小分子和免疫疗法在急性髓系白血病(AML)一直挑战由于遗传和表观遗传变异的病人。有许多潜在的免疫细胞的机制可能影响小分子或免疫治疗反应,然而,这一领域仍然可以理解。

方法:这里我们执行细胞富集分析来自560多个AML患者骨髓和外周血样本击败AML数据集来描述AML的功能免疫景观。

结果:我们识别多种细胞类型,明显与AML临床和遗传特性,我们还观察到显著的免疫细胞比例的相关性体外小分子和免疫治疗反应。此外,我们生成一个签名的晚期疲惫的T细胞(T_前女友AML)和鉴定单核细胞的比例是高的强烈关联增加这些免疫抑制T细胞的比例。

讨论:我们的工作,这是通过一个新的“细胞”模块来访问我们的可视化平台(Vizome;http://vizome.org/),可以利用调查潜在的贡献不同的免疫细胞在AML的生物学的许多方面。

介绍

与急性淋巴细胞白血病是一种血液癌症平均5年存活率约29% (1)和异常淋系细胞的特点是不受控制的扩张通常被称为“爆炸”。在2020年,美国有60530新病例的白血病AML包含大约1/3(19940),但不成比例占将近一半的死亡(11180 23100所有白血病)(SEER)。AML基因异构癌症,最常见的突变基因,FLT3, NPM1,DNMT3A,只有包含大约30%的AML患者(2)。靶向治疗的发现极大地扩大在过去的十年中,仍有许多混杂变量,抑制反应的病人。理解这些潜在变量影响药物的反应是至关重要的实现持久缓解的患者量身定制的药物治疗方案。

血癌,AML细胞是唯一坐落与大量的免疫细胞在骨髓或外围。众多报道所描述的不同机制AML细胞与免疫细胞通过分泌干扰体内平衡和/或增加反应促炎细胞因子(3- - - - - -5),促进T细胞衰竭(6- - - - - -8)。此外,集团已经开始调查某些体细胞突变之间的联系和扩大免疫抑制细胞类型,如TP53突变和亚群增加(9)或DNMT3A突变衰减T_H1巨噬细胞极化(10)。然而,这些研究是有限的小病人军团或局限于小鼠模型。这促使我们描述的功能免疫景观AML通过反褶积的散装RNA-seq从560年AML患者样本映射到一个广阔的临床注释和数据集体外药物反应。

结果

免疫的AML

评估免疫的AML我们得分大部分RNA-seq数据各种细胞类型的注释比例使用伊势亚R包(11)560年AML患者在击败AML的数据集(12)(图1一个,补充图S1A)。这些细胞类型比例可以探索和可视化使用我们击败AML数据可视化平台,Vizome (http://vizome.org/)。正如预期的那样,我们发现骨髓抽取样本的比例降低了淋巴数量比外周血样本(补充数据S1B-E)。我们验证的准确性伊势亚分数进行比较与流式细胞仪测量从临床血液学/病理学检测和发现强关联的伊势亚预测与流式细胞仪测量细胞类型(图1中)。调查潜在的重叠与病人的特性,我们进行层次聚类和细胞类型的患者使用ConsensusClusterPlus R包(13)(图2一个)。我们评估产生的集群和发现k = 8集群最稳定(S2A补充数据,B)。我们进一步表征这些集群基于其特定诊断和突变状态。我们第一次带注释的集群与特定的诊断对于每个标本(图2 b)。有趣的是,集群1,它有更高的比例为多个CD4和CD8 T细胞的血统,也丰富了改变标本和最低的比例新创aml的集群。接下来,我们评估每个集群的突变模式(图2 c)。我们发现,T细胞高集群1丰富RUNX1和EZH2突变。相反,集群8,T细胞谱系的最低分数是丰富PDS5B和TP53突变。TP53突变aml曾被报道与增加免疫抑制有关(9,14)和TP53突变与预后显著恶化和结果(2,9)。此外,威廉姆斯等人发现,TP53突变患者丰富高表达抑制性T细胞免疫检查点分子在AML患者(15)。综上所述,我们认为集群的AML患者表现出低T细胞签名与新创TP53突变AML相关联。

图1

图1免疫AML的景观。(一)热图代表log2改变免疫细胞比例估计计算了252年的伊势亚AML患者外周血样本吸入等。细胞类型分组和欧氏距离的患者样本相关性。当已知,而复发新创状态、ELN2017注释和特定的诊断,如中定义2,表示左轴。(中)比较临床细胞类型比例由临床流式细胞术,这是采自电子医疗记录的血液学/病理临床流式细胞术结果(2,12),在标本采集和伊势亚估计(B)单核细胞,(C)中性粒细胞,(D)嗜酸性粒细胞,(E)CD8 + T细胞和淋巴细胞。由皮尔森相关意义。固体黑线代表线性最适合线和两侧的虚线表示的95%置信区间。

图2

图2随机聚类识别与诊断和突变状态。(一)伊势亚分数用于生成组患者使用ConsensusClusterPlus R的包。每一列表示一个病人,每一行对应一个细胞类型。患者集群使用PAM和欧氏距离。额外的热图显示相应的范盖伦以前计算的细胞类型¹²覆盖在上面。(B)从临床疾病阶段确定注释来注释8集群中确定集群的共识。(C)突变频率计算总数的比例患者各自的集群。队列的频率计算的样本在所有8集群和减去从个体群频率来确定每个集群的频率变化。数据Log2转换表示。前3 - 4突变和颜色红色突出显示。

免疫细胞特征预测小分子的反应和结果

我们下一个决定细胞类型的相关性体外小分子反应在同一患者样本。我们限制相关性与大于20只包括抑制剂独特的病人反应。这个截止了152独特的抑制剂单一药物疗法(图3一)。我们和其他人前所述BETi venetoclax或palbociclib具有相反的反应单核细胞的aml,即BETi敏感度最高的单核细胞的aml (16)而venetoclax (17- - - - - -21)和palbociclib (16)在未分化的aml最敏感。我们可以复制这些模式的响应作为venetoclax和palbociclib展出阻力与单核细胞高分数而BETi样品,第一项- 015,显示灵敏度高的样本中单核细胞分数,因此,这种方法验证。我们确定了许多新型抑制剂反应之间的相关性和不同的细胞类型。关注反应样本与亚群比例高,排名前三的抑制剂与增加有效性nvpaew - 541, bms - 754807,胰岛素和二甲双胍,目标信号通路的差别通过抑制或对这些igf - 1受体(图3 b)。此外,我们可以关注全球单一药物的反应。考试的FDA批准hypomethylating代理(协会)、阿扎胞苷(图3 c),显示阻力与分数的增加脂肪细胞(r = 0.18),单核细胞(r = 0.17),中性粒细胞(r = 0.16),然而,Th1细胞(r = -0.13)和MPP细胞(r = -0.17)与阿扎胞苷敏感性。我们下一个评估病人的结果与单个细胞类型比例。我们发现Treg签名明显与生存在骨髓吸入物,然而,T_H2 T细胞和巨噬细胞签名与糟糕的生存在外周血标本(图3 d, E)。亚群之前已被证明是与AML预后差(6,22)。总的来说,我们描述一个小说,公开与哪一个可以利用的工具,审问inhibitor-immune AML细胞相互作用以及它们如何可能会影响生存。

图3

图3细胞类型比例与小分子抑制剂反应AML患者样本。(一)相关性散点图显示所有抑制剂和细胞类型。抑制剂相关性计算使用体外曲线下的面积值来自2和限制抑制剂至少20独特的患者样本。红色的三角形表示BETi第一项- 015反应和突出单核细胞和疾病预防控制中心的相互关系。黑色三角形表示BCL2i venetoclax突出了单核细胞和肝星状细胞。蓝色三角形表示palbociclib相关性和突出了单核细胞。绿色的三角形表示Treg相关性和突出IGF-1Ri NVP-AEW541, bms - 754807和二甲双胍。(B)情节的抑制剂AUC相关性对比。亚群只在一个计算。(C)情节的所有细胞类型和协会azacytidine,突出强烈的正相关性在蓝色、红色和负相关性计算。(d e)斯皮尔曼相关系数计算总体存活率之间相应的病人(D)骨髓和(E)与外周血样本。伊势亚细胞类型。红色虚线标志意义阈值为每一个情节。的兴趣点用红色突出显示。

单核细胞高患者样本已经降低了体外ICB治疗反应和更高的特克斯签名

我们预测未来问任何细胞类型签名体外免疫检查点的回应。Lamble和小坂et al。8)最近评估银行独立委员会的功效治疗49骨髓抽出物样品中击败AML数据库。其中,18 T细胞功能失调——由增殖能力和细胞因子分泌减少。这些样品的功能失调的T细胞,9有救了体外治疗anti-PD1封锁,和6是耐火材料。我们首先问是否有伊势亚细胞类型得分显著不同这两个组之间,发现单核细胞显著高于anti-PD1耐火材料样品(图4一)。我们发现这个特别有趣的范盖伦et al。(25)曾指出,单核细胞的aml免疫抑制特性。银行独立委员会疗法被认为特别振奋祖疲惫的T细胞(TPEx)和保持最高的抗肿瘤活性(23,26)。相反,疲惫的CD8 T细胞(特克斯),从TPEx晚期分化,减少了效应器功能和抗肿瘤活性。此外,患者高特克斯/ TPex比率对银行独立委员会疗法(27,28)。因此,考虑到我们之前的数据表明单核细胞/单核细胞的aml关联体外anti-PD1阻力和anti-PD1阻力与疲惫CD8的比例增加⁺T细胞,我们生成一个定制的T细胞衰竭签名使用之前沉积序列数据(24,29日,30.特克斯)调查是否该签名与更高比例的单核细胞和单核细胞的分化程序(图4 b)。我们接着问哪个单元类型与特克斯分数,不包括CD8 + T细胞,确实发现单核细胞显著正相关,而未分化的骨髓细胞如肝星状细胞,gmp, CMPS负相关(图4 c)。我们接下来问这是否特克斯评分预测体外通过关联特克斯分数PD-1 anti-PD1治疗反应反应名称。最后,我们决定与特克斯突变相关的分数。我们只限制这一分析包括突变重复至少5个不同的标本。这使得27总反复出现的基因突变。对于这组,我们评估斯皮尔曼相关突变及其相关特克斯得分。我们发现- itd NPM1特克斯分数有显著负相关。没有积极得分特克斯突变相关,表明T细胞疲劳可能是分开在AML突变状态(图4 d)。然而,这也可能是由抽样误差由于小数量的突变。总之,我们发现高单核细胞分数与抵抗anti-PD1疗法体外。

图4

图4单核细胞的签名与体外抗免疫检查点封锁,增加T细胞疲惫的签名。(一)热图显示总细胞比例估计与anti-PD1体外响应样本被Lamble和小坂et al . 2019。意义是通过双向方差分析的计算所有细胞类型(n = 9 PD-1应答器,n = 6 PD-1耐火材料),* * * p <。001年,* * * * p < 0.0001。(B)特克斯从外周血样本分数分布在击败AML数据库。特克斯分数是通过创建一个签名生成以前丰富基因测序数据上基于疲惫的T细胞(23)和(24)。更高的分数与估计疲惫的T细胞的比例增加。(C)火山情节展示了斯皮尔曼特克斯评分之间的相关性从伊势亚和其他细胞类型。各式各样的例子细胞类型与显著的积极或消极的充实以红色突出显示。(D)对于每个重复AML突变,我们计算特克斯分数变异和野生型之间的差异(显示为点)。这种差异报告的标准化的效果(玻璃的三角洲相对于野生型;轴)。纵轴表示突变与增加特克斯得分在右边,左边和特克斯得分下降。FDR-corrected意义上的这些差异给出轴用虚线表示在0.05水平。

讨论

能用该细胞对药物反应和生存的贡献是一个积极发展的领域,但有很多剩余的问题。这里我们调查AML的免疫微环境更好地理解底层机制的药物,免疫细胞的相互作用,并提供一个白血病研究人员询问这个轴的工具。利用在网上方法我们描述的微环境~ 600 AML患者骨髓和外周血吸入等。我们验证这些方法使用可用的临床流式细胞仪的数据,可用的地方,发现伊势亚反褶积准确预测细胞类型比例。我们的数据确定了TP53 PDS5B突变aml和潜在不免疫活性显著下降比例的天真和效应器CD8 + T细胞。此外,我们发现,T细胞丰富的集群主要是改变了aml,强调免疫失调的潜在重要性复发和改变设置。我们进一步相关152小分子抑制剂和细胞类型比例确定无数交互。我们可以验证这些方法通过调查BETi之间的相关性,venetoclax,和palbociclib单核细胞的反应已经被美国和其它拴在单核细胞的分化(16,19,20.)。此外,我们发现出乎意料的反应IGF1R /胰岛素抑制剂潜在拴在亚群,表明胰岛素生长因子受体信号作为一个潜在的高亚群患者合理的治疗策略。研究已经证明,激活IGF-1R诱发亚(31日),胰岛素抵抗与降低亚(32)。我们的在网上数据显示,这个通道轴AML患者和其增强效果可能由针对亚群。最后,我们描述潜在的单核细胞和单核细胞的分化aml预测之间的联系体外银行独立委员会的回应。我们签名表明单核细胞显著增加AML和样品不正常T细胞中耐火材料请疗法。我们进一步测试这个连接通过生成一个签名筋疲力尽的T细胞,ICB治疗已知驱动电阻,发现他们确实与单核细胞显著关联签名。未来的研究将集中在生物验证新型抑制剂细胞类型的相关性,以及关联使用功能的进一步验证体外免疫检测数据。

方法

伊势亚浓缩RNA-seq数据的得分

之前把数据(2,12)再加工使用Kallisto v0.46.2 (33)相对于运用GRCh37 v75记录。能够表达来自总结转录丰度值。抑制剂反应变量调用,表达数据处理,临床注释是公开在我们Vizome数据可视化平台(http://vizome.org/aml2;看到https://biodev.github.io/BeatAML2/常见问题)。临床流调用用于比较伊势亚(v1.1.0)比例也来自击败AML数据集。

的热图

热图被log2转换生成的细胞比例估计为所有独特的AML患者外周血样本吸入物(n = 252)。细胞类型的皮尔森和欧氏距离的患者样本的相关性。R包“Pheatmap”被用来生成所有的热图。聚类的细胞类型和标本进行使用ConsensusClusterPlus (v1.54.0)使用分区在medoids (PAM) (34基于欧氏距离的内部集群和集群外的平均链接层次聚类。

临床流数据

流式细胞仪数据挖掘从电子医疗记录来自临床血液学/病理测试(如前所述)(2,12)。

抑制剂和细胞类型相关性

Inhibitor-cell类型相关性为所有生成抑制剂在击败AML数据库至少20独特的患者样本。具体药物的可行性分析和数据处理中可以找到Tyner et al . 2018 (2)和底部et al . 2022 (12)。这导致152独特的抑制剂单方或联合疗法。斯皮尔曼相关系数被生成的所有样本比较抑制剂区域的曲线下(auc)与伊势亚细胞类型比例。

Anti-PD1疗法和细胞类型比例

体外基于Lamble aPD1反应测定和小坂et al。8),确定6 anti-PD1耐药和9 anti-PD1反应样本。意义之间的所有细胞类型anti-PD1耐火材料和应答器计算使用双向方差分析和表示的热图。

晚期疲惫T细胞分数

晚期疲惫的T细胞分数计算使用伊势亚(“rawEnrichmentAnalysis”函数)与组基因来自Jadhav et al。(23和人等。24)和计算AML外周血样本。

统计测试

除非另有说明,*代表P值小于。05年,* *不到。01,* * *不到。001年,* * * * than.0001少。

数据可用性声明

公开的数据集进行分析。这些数据可以在这里找到:所有原材料测序数据,以及相关的临床注释提交dbGaP和基因组数据共享和公开。dbGaP研究ID是30641年加入ID是phs001657.v2。p1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gap/cgi-bin/study.cgi?study_id=phs001657.v2.p1)。此外,所有的数据都可以通过我们的在线访问和查询,交互式用户界面,Vizome,vizome.org/aml2。

道德声明

涉及人类受试者的研究回顾和俄勒冈健康与科学大学的机构审查委员会批准。书面知情同意参加本研究参与者提供的法定监护人/近亲。

作者的贡献

基米-雷克南:正式的分析、调查、可视化、方法论、原创作品草稿,writing-review和编辑。DB:正式的分析、调查、可视化、方法论、writing-review和编辑、资源、数据管理。王寅:方法,writing-review和编辑。问:资源。MV:数据管理。SM:正式的分析、调查、可视化、方法论、writing-review和编辑、资源、数据管理。JT:概念化、资源形式分析,监督资金收购,调查、可视化、方法论、原创作品草稿,项目管理,writing-review和编辑。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

该项目资金提供了部分由美国国家癌症研究所(U01CA217862, U54CA224019 U01CA214116)和NIH / NCATS CTSA目前UL1TR002369 (SM)。JT收到V癌症研究基金会的资助,加布里埃尔的天使癌症研究基金会的癌症研究基金会的银家庭基金会,美国国家癌症研究所(R01CA245002 R01CA262758)。

的利益冲突

作者JT已经收到Acerta研究支持,贴水,Aptose,数组,阿斯利康,星座,基因泰克,基列,Incyte,詹森,二氧化钛,Meryx,佩特拉,薛定谔,西雅图遗传学、锡罗斯,武田,Tolero是Recludix制药公司的顾问委员会。作者证明所有化合物进行本研究选择不输入任何我们的行业合作伙伴。

其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2023.1192829/full补充材料

引用

1。登女士,Ershler WB, Jemal耶茨JW,贝尔先生的结果老年急性髓系白血病患者:先见的分析数据/ 3年。癌症(2013)119:2720-7。doi: 10.1002 / cncr.28129