循环hsa - mir - 5096预测gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT积极性和调节生长抑素受体2表达:一种新型miR-based检验胰腺神经内分泌肿瘤gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

Gastro-entero-pancreatic神经内分泌肿瘤(GEP-NETs)是罕见的和异构神经内分泌系统引发的恶性肿瘤,包括胰腺(PanNETs)和回肠网(SINETs)。净疾病展品变量攻击性取决于网站的起源、品位、阶段,功能(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。PanNETs代表不到5%的胰腺癌,虽然发病率和患病率上升(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。PanNETs包括肿瘤广泛的临床行为,常常懒惰和诊断在高级阶段(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。如今,PanNETs早些时候可以诊断和治疗更新算法和指导方针提出了(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。最新更新第五版(2019年)世界卫生组织(世卫组织)确定一个小说G3 PanNET分子子集,其中包括高分化肿瘤增殖指数高(> 20%)(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。尽管小说的分层分类帮助病人,改善预后和对治疗的反应(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),大量的临床和生物学行为的差异依然存在,使个性化治疗和预测具有挑战性的高级PanNETs (gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。生长激素抑制素受体(SSTRs) 80%的GEP-NETs表示,和PanNETs显示异构模式SSTRs表达式从50%提高到100%,与同种型2是最普遍的一个(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。肽受体放射性核素治疗(PRRT),针对SSTR2,表明cytoreductive潜力和长期疾病无进展生存(PFS)不可切除的转移性疾病患者(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。尽管PRRT延伸PFS,大约15 - 30%的晚期分化良好型的患者GEP-NETs进展治疗期间或PRRT后六个月至一年(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。PRRT将取决于未来的优化改善病人分层(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。目前,分子功能成像正电子发射计算机断层扫描(PET / CT)用于PanNETs管理和更新欧洲神经内分泌学会(硅谷动力)共识辐射、核医学和混合成像推荐gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}镓(Ga) -DOTA-somatostatin analog-PET / CT对肿瘤分期,术前影像,re-staging。宠物用gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTA-somatostatin类似物显示SSTRs过度表达病变。尽管SSTR2-specific的敏感性和特异性gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC-PET / CT已经证明,它的临床效用受到异构SSTR2的表达。事实上,异构SSTR2表达的低水平的挑战gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTA-somatostatin analogs-PET / CT敏感性(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),因此资格SSTR2-based疗法,如PRRT (gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。尽管高SSTR2的表达可以被认为是一个适当的预测应对PRRT, PET / CT扫描gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTA-somatostatin类似物并不能代表一个预后参数PFS的(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。除了基于生长激素抑制素受体的功能成像(SRI) 2-deoxy-2[氟18]fluoro-D-glucose (gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG) PET / CT也推荐给优质高分GEP-NETs,尤其是PanNETs,通常显示更高的葡萄糖代谢和侵略性。gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG积极的病变与预后差相关,积极的行为和抗肿瘤PRRT即使在低品位,分化良好型的GEP-NETs (gydF4y2Ba26gydF4y2Ba少),高分化SINETs通常显示明显的放射性标记的葡萄糖和低敏感性gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG-PET / CT扫描(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

尽管功能成像gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTA-somatostatin类似物,gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG-PET / CT被广泛用于PRRT资格评定和预测,大约60%的患者先进GEP-NET不应对PRRT。有临床需要测量和监控的预后和预测生物标志物可以补充年级,阶段,和成像,改善患者分层解决更多的定制治疗PanNETs (gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

血液生物标记很容易评估,微创,重现性好,可用于实时定量监测。此外,液体标记克服局限性的组织特定的信息,提供一个实时快照的疾病和肿瘤的代谢。循环microrna是行之有效的疾病生物标记物检测和监控。Exosome-encapsulated循环microrna可以交付到目标细胞促进旁分泌信号和代表microrna的首选源的数量、质量和稳定性(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。我们试图确定循环microrna关联gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG功能成像和侵略性的肿瘤代谢GEP-NETs,评估他们的准确性预测生物标志物来提高PanNET患者的临床管理。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

研究设计gydF4y2Ba

等离子体收集从分化良好型的G1, G2和G3 GEP-NET患者(n = 24)强制不受任何治疗,在177年之前至少一个月lu-dotatate周期开始和整个miRNome下一代测序(上天)执行。microrna的微分表达式之间的分析gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT阳性(n = 12)和负(n = 12)患者的筛查组(n = 24)。因为增加葡萄糖摄取和更高的预后的力量gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT在PanNETs描述,以识别特定疾病代谢特征,生物信息学分析应用于筛选组(n = 24)考虑PanNETs (n = 6)和SINETs (n = 18),分别。microrna的微分表达式gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT积极和消极PanNET和SINET子集进行分离。之间的差异表达micrornagydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT积极和消极患者血浆样本中验证了RT / qPCR两种不同验证群PanNETs (n = 38)和SINETs (n = 30)。包括执行额外的microrna表达水平比较健康的捐赠者(n = 17)。随后,我们只专注于PanNET队列进行进一步的分析。评估验证microrna的潜在PFS的独立预测指标和操作系统,单独或与其他规范的临床、病理和成像特性在PanNETs评估。的基础上获得的结果在等离子体的显著相关性PanNETs的临床和病理特征,我们最近关注的最佳候选人microrna, hsa - mir - 5096,探索其关系gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC-PET / CT越野车gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}和SSTR2的表达。microrna然后SSTR2相对表达检测和量化飞行员独立群PanNET组织标本(n = 9)为了评估如果负相关gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC-PET / CT越野车gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}(镜像SSTR2的表达),观察到等离子体,可以检索到肿瘤组织。计算输出分析量化相对microrna的SSTR2的表达,在单细胞水平提供基本原理探索这种逆相关关系背后的机制gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba在PanNET临床前模型。gydF4y2Ba

临床信息GEP-NET病人和健康的捐赠者gydF4y2Ba

从2016年10月到2019年9月,分化良好型的患者,先进、转移,瘫痪经病理或细胞学上证实G1, G2和G3 GEP-NET进入非随机性勒克斯(NCT02736500)和LUNET (NCT02489604)临床试验。每个病人参加临床试验> = 18岁男女提供一个基于RECIST进步疾病(PD)。患者显示适当的血液、肝脏和肾脏参数(血红蛋白> = 10 g / dL;绝对中性粒细胞计数(ANC) > = 1.5 * 109 / L;血小板> = 100 x 109 / L;胆红素≤1.5 X多人(正常上限),ALT < 2.5 X多人(< 5 X多人出现肝转移),肌酐< 2 mg / dL)登记。符合条件的患者未接受其他PRRT、广播或化疗,包括卡培他滨从前一个月到两个月后,177年完成lu-dotatate(单独或联合)周期。从先前的放射性核素治疗患者天真radiopeptides(例如,gydF4y2Ba^{111年gydF4y2Ba}Inpentetreotide,gydF4y2Ba^{90年gydF4y2Ba}Y-DOTATOC)或其他放射性药物(如gydF4y2Ba^{131年gydF4y2Ba}I-MIBG,gydF4y2Ba^{131年gydF4y2Ba}我)。每个包括病人提出了衡量疾病常规成像评价(CT或MRI)。入学时是由SSTR-2评价gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC-PET / CT和所有包括病人显示gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC-PET / CT吸收(SUVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba})> 9,从而考虑积极和镜像SSTR2的表达。病人进入勒克斯临床试验显示gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG越野车gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}在磁共振扫描> 2.5,而病人LUNET是负的。对于这个生物回顾性研究,筛选群GEP-NETs (n = 24)和验证群PanNETs (n = 38)和SINETs (n = 30)患者包括高分G1, G2和G3之前晚期转移性疾病gydF4y2Ba^{177年gydF4y2Ba}Lu-DOTATATE PRRT跟进中位数为23.3个月(范围:6.5 - -60.9)。gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba对病人和健康的人口、临床和病理特征。所有的病人提供了一个签署了知情同意的血液撤军,之前gydF4y2Ba^{177年gydF4y2Ba}Lu-DOTATATE PRRT和下游基因分析。本研究经当地伦理委员会批准(CEROM),没有批准。6711/5.1/2016,根据执行良好的临床实践标准和《赫尔辛基宣言》。研究协议修改允许的组织学证实G1, G2和G3 PanNETs标本评价hsa - mir - 5096和组织SSTR2的相对表达水平。gydF4y2Ba

等离子体标本的收集gydF4y2Ba

静脉穿刺收集血液样本的基线,之前gydF4y2Ba^{177年gydF4y2Ba}Lu-DOTATATE PRRT。血液被收集在一个3毫升K3-EDTA无菌容器集合。全血在2500 g离心10分钟房间温度来获得gydF4y2Ba血小板免费gydF4y2Ba等离子体。等离子体是小心翼翼地转移到新的15毫升锥形管(猎鹰™)第二个离心2500×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟进一步去除细胞碎片。至少1毫升的上层清液收集和储存在-80°C,直到需要。健康的捐赠者群体样本也和治疗,同时收集血液撤军减少血浆成分的差异。gydF4y2Ba

小- RNAgydF4y2Ba外来体纯度gydF4y2Ba一部分降水gydF4y2Ba

解冻,冷冻血浆样本沉淀使用Exoquick™,大堡礁根据制造商的协议获得exosome-enriched分数小rna。Exoquick™,大堡礁允许20 - 100纳米囊泡的降水和提取他们的内容。颗粒包含exosome-enriched分数rna在200 ul resuspended无菌PBS (1 x)。Qiazol™提供低温贮藏和添加了相关的外来体裂解microrna的提取。gydF4y2Ba

小rna,包括microrna与miRNeasy血清/血浆分离设备(试剂盒猫没有。/ ID: 217184)根据制造商的协议。一毫升血浆样本作为输入小rna的提取。小rna exome-enriched分数隔绝,被筛选了56μL RNase-free水。gydF4y2Ba

整个miRNome门店分析和管道的分析gydF4y2Ba

血浆标本筛查群24 GEP-NET异常患者整个miRNome挥动。小RNA转录转换为编码cDNA库。图书馆准备创建与NEBNext多路小核糖核酸库预备组Illumina公司(美国新英格兰生物学实验室Inc .)。图书馆从每个样本都汇集在一起,Illumina公司NextSeq 550平台上运行,75次(美国Illumina公司)。获得的基类库文件被转换为FASTQ文件和数据质量评估FastQC软件(RRID: SCR_014583)。二次分析使用docker4seq包[docker4seq, RRID SCR_017006):gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)。具体来说,从分析中读取短于14个核苷酸被丢弃;剩下的读取从适配器序列使用Cutadapt软件(修剪RRID: SCR_011841;gydF4y2Bahttps://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

修剪读取映射与前体microrna的序列从miRBase下载虾(释放21)的算法(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。计算矩阵生成的映射用作DESeq2输入(RRID: SCR_000154) Bioconductor包(RRID: SCR_006442 (gydF4y2Ba33gydF4y2Ba);,识别差异表达之间的micrornagydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG /宠物积极和消极组。内生控制RT / qPCR是从捷选出来的数据为每个原始数据通过考虑以下标准:至少5读取每个样本和一个日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba标准偏差值< 16。gydF4y2Ba

生物信息学的分析包含主成分分析(PCA)排除差的样品数量的读取。只有microrna显示至少一个被认为是阅读的一个样本。microrna微分表达式之间的分析gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG / PET / CT积极和消极GEP-NET病人进行了考虑日志gydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC形容词p值< 0.1 > = 1。第二步校正应用于排除样本偏差是由于肿瘤的起源。gydF4y2Ba

差异表达的定量PCR验证候选micrornagydF4y2Ba

独立的技术验证候选人RT / qPCR microrna是由两个截然不同的分化良好型的验证群38 PanNETs和30 SINETs。互补冰冻和解冻RNA得到C1000触摸热循环(生物rad™,赫拉克勒斯、钙、美国);使用TaqMan™微rna逆转录工具包(应用生物系统公司™;福斯特城、钙、美国。猫没有。/ ID: 4366596),循环条件是根据制造商的协议。TaqMan™微rna逆转录协议是TaqMan优化的多路复用gydF4y2Ba^®gydF4y2Bamicrorna分析引物的以下目标:hsa - mir - 3133, hsa - mir - 4311, hsa - mir - 5096, hsa-let-7i-3p规范化与hsa-miR-30d参考管家microrna(多路复用组1);hsa - mir - 519 - c - 3 - p, hsa - mir - 582 - 3, hsa - mir - 3614 - 5 - p, hsa - mir - 1246和hsa - mir - 423 - 3 - p参考管家microrna(多路复用组2)。gydF4y2Ba

通用主没有)和混合TaqMan™microrna测定特定的探测,为每个目标microrna的使用根据制造商的协议(美国应用生物系统公司™,促进城市CA。猫没有。/ ID: 4440040)。RT / qPCR分析进行了使用应用生物系统公司™7500实时PCR系统(应用生物系统公司™;猫没有。/ ID: 4351104)。gydF4y2Ba

表达水平的单一目标microrna规范化hsa-miR-30d折叠得到浓缩的2gydF4y2Ba^{-ΔCTgydF4y2Ba}方法,相应的样本。此外,gydF4y2Ba“预测”gydF4y2Ba(P1, P2, P3和P)创建的产品折叠充实(2gydF4y2Ba^{-ΔCTgydF4y2Ba})的单一的microrna,改善单一目标和预后(见gydF4y2Ba补充表gydF4y2Ba,gydF4y2Ba图S2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

miR-proteingydF4y2Ba原位gydF4y2Ba检测gydF4y2Ba

一种新型半自动miR-proteingydF4y2Ba原位gydF4y2Ba染色协议开发的同步检测hsa - mir - 5096和SSTR2表达的蛋白质。MiRCURY LNA microrna的检测探针对hsa - mir - 5096, U6小核,gydF4y2Ba积极的控制gydF4y2Ba探测器(试剂盒,瓦伦西亚,CA;猫没有。/ ID: 99002 - 15)和消极的争夺控制探测器(试剂盒,瓦伦西亚,CA猫没有。/ ID: 99004 - 15)。每个探针标记'dig 5 ' 3。在开始之前,double-DIG-LNA探针被加热变性(90°C 4分钟),然后稀释至50 nM伊什缓冲区(miRCURY LNA microrna的伊什缓冲区Set-FFPE)。第一阶段(组织准备、透化作用和杂交)一直在执行手动模式根据miRCURY LNA microrna的检测探针协议,而第二阶段(信号检测)是自动使用Ventana超基准平台(Ventana医疗系统,图森,亚利桑那州,美国)。自动化协议包括内源性过氧化物酶阻断,酪蛋白阻塞(16分),孵化(37°C 1 h)与主prediluted鼠标anti-DIG抗体(Ventana医疗系统),揭示了米尔信号检测OptiviewDAB检测设备(Ventana医疗系统),由总部统一链接器孵化(12分钟),合多聚体孵化(12分钟),和放大Optiview民建联放大工具包(12分钟)。启示录SSTR2蛋白表达进行直接在Ventana基准超细胞调节后超CC1 (Ventana医疗系统)24分钟和酪蛋白阻塞,使用抗体anti-SSTR2 (UMB1-C Terminal-ab134152-Abcam)在Ventana抗体稀释剂,孵化(37°C 1 h),发现Ultraview普遍的红色碱性磷酸酶检测设备(Ventana医疗系统)。最后,幻灯片和苏木精复染色8分钟II (Ventana医疗系统)和8分钟发蓝处理试剂(Ventana医疗系统),在自来水洗用肥皂把液体盖玻片,脱水在炉子和安装与二甲苯和EUKITT安装介质(Sigma-Aldrich,默克公司,达姆施塔特,德国)。具体地说,这个协议作为第一标记揭示的米尔布朗使用anti-DIG抗体其次是蛋白质与anti-SSTR2抗体检测用红色。 Labeling with digoxigenin (DIG) allows miR- staining stability after double immunohistochemical rounds performed on the automated Ventana platforms. Additionally, our approach avoids antigen retrieval which typically occurs when immunohistochemistry is performed prior to ISH. For this purpose, we compared the results obtained from the single IHC for SSTR2 expression with those obtained with the miR-protein protocol and we assessed that there were no differences in terms of protein expression (Source Data not shown, see Availability of data and materials section for data repository). IHC whole slides images were acquired with the high-resolution slide scanner Aperio CS2 using the focus-ISH algorithm with a 40x magnification, which provides scanned images with the accuracy and resolution required for ISH.

和工具gydF4y2Ba软件界面开发gydF4y2Ba

分析标记表达单个核的组织样本,我们设计了一个用户友好的开源图形用户界面(GUI)需要一个最小的用户交互。GUI命名gydF4y2Ba分析核轻拍(和)工具gydF4y2Ba它允许自动段核和提取强度/ single-nuclei级别的形态学特征。创建和工具使用Matlab(美国马萨诸塞州MathWorks, Inc .)。源代码,独立的可执行版本、文档和示例图片可供下载从:gydF4y2Bahttps://sourceforge.net/p/andtool/gydF4y2Ba。首先,所有获得的RGB图像纠正不均匀照明的减去背景估计的标准ImageJ /斐济滚球算法。然后,使用颜色的RGB图像是纯粹的反褶积ImageJ /斐济插件实施“FastRed-FastBlue-DAB”形态(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。FastRed通道用于细分视图分为三个领域的杰出类型的感兴趣区域(roi。,”dark-red”, “light-pink” and “white” ROIs) according to the local intensity and two fixed thresholds (hereafter named Th1 and Th2, with Th1 lower than Th2), manually defined from the user just once for all the images to be analyzed. The “dark-red” ROIs are those regions with intensity values of the FastRed channel between 0 and Th1; the “light-pink” ROIs, with intensity values between Th1 and Th2; the “white” ROIs, with intensity values between Th2 and 255. Nuclei have been detected using the FastBlue and the DAB channels. To detect the nuclei, we used an intensity-based k-mean classifier automatically subdividing the single channels into three regions: white background, weak cytoplasmic signal, and nuclear signal. The standard watershed segmentation algorithm was then used to analyze the nuclear signal and split touching objects to proceed in a single-nuclei analysis. Objects with size not compliant with that of a nucleus were filtered out to compute the masks of the real nuclei. Single-nuclei intensity/morphological features and region-based statistics were computed using the intensity maps created by subdividing the sample areas in dark-red, light-pink and white ROIs. Two types of nuclei have been considered: the ones positive for the DAB staining, and the ones positive for the FastBlue staining but not positive for DAB (see补充文件S2gydF4y2Ba软件分析管道和手册)。和工具软件分析认为每样10字段。该软件旨在识别三种不同水平的SSTR2表达核:高“深红色的”面具(0-Th1强度范围确定的软件,与阈值Th1: 100);中间为“亮粉红色”面具(软件识别的强度范围Th1-Th2,阈值Th2: 190)和消极的“白色”面具(识别软件的强度范围Th2 - 255,与255年对强度的最大值在8位灰度转换)。当代和工具能够识别领域与米尔积极核民建联渠道积极性。相关分析进行了策划的平均百分比hsa - mir - 5096阳性细胞核对整体分析细胞在不同SSTR2表达区域。斯皮尔曼测试用于确定r2和p值。gydF4y2Ba

细胞培养gydF4y2Ba

hsa - mir - 5096和SSTR2表达在NT-3评估,BON-1和QGP-1细胞系(RRID: CVCL_VG81;CVCL_3985;CVCL_3143)。NT-3细胞培养在培养皿中涂有胶原IV型从人类胎盘(Sigma-Aldrich, Homefield路,哈佛希尔,英国;猫没有。/ ID: 27663) RPMI中补充10% FCS、青霉素、链霉素和L-glutammine 1%, 15毫米玫瑰都与EGF (20 ng / mL;PreproTech,落基山,新泽西州),FGF2 (10 ng / mL;PreproTech,落基山,新泽西州)和没有生长因子(bFGF;EGF) (gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。BON-1和QGP-1在DMEM培养基中培养高葡萄糖和RPMI中分别补充10% FCS、青霉素、链霉素和L-glutammine 1%, 15 mmhepes。gydF4y2Ba

hsa - mir - 5096模拟和抑制剂治疗gydF4y2Ba

评估SSTR2 downmodulation NT-3细胞系,3×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞被镀成6-well盘子涂以胶原IV型从人类胎盘。24小时后,15和30 pmol hsa - mir - 5096 miRCURY放大器microrna的模仿,争夺(试剂盒,瓦伦西亚,CA)使用RNAiMAX转染试剂(表达载体转染gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba美国,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。相反,评估SSTR2 up-modulation NT-3细胞系,5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞被镀成12-well盘子涂以胶原IV型从人类胎盘;在1.75和2.5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2BaBON-1 QGP-1被镀成标准12-well盘子,分别。然后,100 nM pmol hsa - mir - 5096 miRCURY放大器microrna的抑制剂,争夺(试剂盒,瓦伦西亚,CA)使用RNAiMAX转染试剂(表达载体转染gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba美国,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。收集细胞和培养基后48和72 h转染。固定体积的350 ul的试剂盒gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba试剂加入了干球和miRNeasy迷你包50(试剂盒,瓦伦西亚,CA的猫没有。/ ID: 217004)是用于RNA提取量化hsa - mir - 5096和SSTR2 RNA水平。gydF4y2BaSSTR2gydF4y2Ba表达NT-3细胞系进行RT / qPCR 48 h和72 h后模仿和抑制剂转染。表达式值被表示为(Ct)值归一化的看家基因产生HPRT (2gydF4y2Ba^{−ΔCTgydF4y2Ba}方法),然后代表比例的表达式。gydF4y2Ba

免疫荧光gydF4y2Ba

评估SSTR-2蛋白表达后抑制hsa - mir - 5096gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba在QGP-1 miRCURY LNA、我们进行免疫荧光染色细胞生长和转染盖玻片幻灯片。QGP-1细胞被固定在4°C 10分钟10%福尔马林,permeabilized Tween-Triton 0.3%在PBS和屏蔽1%牛血清(BSA)前孵化与人类生长激素抑制素R2 / SSTR2 PE-conjugated鼠标IgG2A抗体(克隆# 402038)在室温下2 h。Dapi染色用于复染色细胞核。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

样本大小(n = 24)筛查人群的GEP-NET成立所需的2倍的基础上改变,一个σ= 0.5从先前的知识,80%的力量,一个罗斯福(错误发现率)的0.05和non-differentially表达基因的比例为98%,使用ssize。twoSamp R包。此外,平衡病人的轴承gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba正积极(n = 12)和消极(n = 12)被认为是为了避免偏见的微分表达式分析。样本容量的验证群PanNETs (n = 38)和SINETs (n = 30)决定考虑勒克斯的入学率和LUNET临床试验,GEP-NET疾病的患病率和发病率低,总会在技术或分层要求,共同组(FDG +;FDG -),出现溶血样本和经济可行性。考虑退学率达到10%,这是可行的招收至少66名患者的研究。额外的17个健康的捐赠者群体的平衡的年龄,性别和血液撤军时间被认为是血液和随后的分子与PanNETs撤军。健康志愿者群体的样本大小是设计成符合病人的人口,考虑到与健康志愿者不是本研究的目标。值得注意的是,报道gydF4y2Ba补充文件S1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba,我们排除年龄hsa的混杂因素,mir - 5096水平PanNETs和健康的捐赠者。分类数据被表示为绝对数字,百分比,在连续变量显示为中值和范围。常态分布的连续数据是通过Shapiro-Wilk测试评估的。microrna规范化值(2表达水平gydF4y2Ba^{-ΔCTgydF4y2Ba})之间的比较gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT积极和消极组。Wilcoxon Mann-Whitney测试,分别应用卡方测试连续数据和分类数据。三组之间比较克鲁斯卡尔-沃利斯和邓恩测试用于测试使用gydF4y2Ba因果gydF4y2Ba比较。gydF4y2Ba

接受者操作特征(ROC)曲线,定义为一个阴谋灵敏度vs 1-specificity,执行,评估候选人microrna的性能及其组合预测宠物积极性,6个月((音译)PFS和12-mo OS。AUC(有95%的信心- CI)计算作为一种常见的准确性和测量值的范围从0.5到1.0:更高的值对应于一个更好的性能测试值。AUC值高于0.7被认为是可接受的值。Roccomp占据命令是用于比较ROC曲线。对于每个曲线,roccomp报告汇总统计和提供了一个平等的测试曲线下的面积,使用一个算法提出了DeLong和Clarke-Pearson (gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

截止值较高的敏感性和特异性进行评估。操作系统计算的时间从开始日期PRRT治疗死亡日期或最后的随访中,在PFS从日期开始计算时间PRRT疗法的进步疾病、死亡,或最后的随访中。活着的病人最后审查访问当病人无疾病进展审查最后肿瘤评估。用来估计kaplan - meier(公里)曲线的生存函数和生存率较被用来比较不同的子组的操作系统或PFS。操作系统和中值平均PFS计算,95%置信区间(95% ci)报道。单变量和多变量Cox回归模型进行评估潜在的独立临床参数的探究的意图与PFS和操作系统有关,包括microrna的兴趣。这些模型已经进行了探索性的意图,应该在扩大后的队列进行验证。PFS阈值包括变量的多变量模型的假定值0.10。进一步评估将对潜在的独立因素之间的共线性。分析探讨成像参数没有考虑任何阈值。 Outcome evaluation was performed using a complete case analysis, without any type of imputation. Transfection efficacy and statistical significance for在体外gydF4y2Ba实验评估参数t检验,比较表达式中值(+ / -标准差)。三组之间比较克鲁斯卡尔-沃利斯和邓恩测试用于测试使用gydF4y2Ba因果gydF4y2Ba比较。gydF4y2Ba

所有统计分析使用占据/ SE 15.1版本Windows(美国StataCorpLP,大学城,TX)。时间民国R包被用来绘制时间AUC曲线和95%置信区间。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

循环exosomal miRNA-signature作为代理预后的生物标志物gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT在PanNET病人gydF4y2Ba

为了确定预后和可度量的microrna与传播gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT GEP-NET患者的积极性,我们从先进的转移性GEP-NETs评价血浆标本,比较gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT正面和负面的病人。在筛选步骤中,等离子体的分化良好型的G1, G2和G3 GEP-NETs (n = 24)收集在基线,在177年之前lu-dotatate PRRT和全miRNome使用下一代测序(上天)进行(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。分析是进行筛查的分化良好型的(G1, G2和G3) GEP-NETs比较gydF4y2Ba^18gydF4y2BaFgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba正/ CT阳性(n = 12)和负(n = 12)肿瘤。主成分分析(PCA)被排除在外的24个样品由于数量差读取。门店分析确定了2588 microrna。其中,2474 microrna显示至少一个阅读的样本进行了分析。生物信息学分析显示hsa - mir - 1246, hsa - mir - 4311和hsa - mir - 485 - 5 - p差异表达microrna(日志gydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC > = 1;轮廓分明的假定值:< 0.1)之间gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT积极和消极GEP-NET患者(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。第二步分析认为SINETs和PanNETs分别评估如果疾病特定签名的存在,并透露8 microrna (hsa - mir - 1246;hsa - mir - 5096;hsa-let-7i-3p;hsa - mir - 3133;hsa - mir - 3614 - 5 - p;hsa - mir - 483 - 5 - p;hsa - mir - 519 - c - 3 - p;hsa - mir - 582 - 3 - p)之间的差异表达gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT积极和消极PanNETs患者(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。相反,没有microrna与gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba在SINET F-FDG PET / CT地位子集(数据没有显示)。最后,hsa-miR-30d出现最低的miR -标准差标准化读取的数量在所有情况下系列(真是的系数< 0.05),因此根据其稳定性被选为内生参考比较。完全一群10个非冗余的microrna被认为是为验证RT / qPCR SINETs (n = 30)和PanNETs (n = 38)组,分别。三个循环microrna (hsa - mir - 4311,假定值:< 0.001;hsa - mir - 5096,假定值:< 0.0001;hsa-let-7i-3p假定值:< 0.00001)显著相关gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba在PanNETs F-FDG-PET / CT地位只子群(gydF4y2Ba图2汉英gydF4y2Ba)。褶皱变化三个microrna的表达值被合并为“gydF4y2Ba预测gydF4y2Ba”来测试他们的预后能力相结合。”gydF4y2Ba预测gydF4y2Ba”数学,乘以单microrna的褶皱浓缩获得的价值在不同的组合。我们计算3二进制”gydF4y2Ba预测gydF4y2Ba”结合,hsa - mir - 4311 * hsa-let-7i-3p (P1), hsa - mir - 5096 - 5 - P * hsa-let-7i-3p (P2), hsa - mir - 4311 * hsa - mir - 5096 - 5 - P (P3),和1三元预测相结合,hsa - mir - 4311 * hsa - mir - 5096 - 5 - P * hsa-let-7i-3p褶皱变化(P)。”gydF4y2Ba预测gydF4y2Ba“与18 f-fdg-pet / CT显著相关。褶皱变化表达式值三个microrna并结合”gydF4y2Ba预测gydF4y2Ba“报告gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S2gydF4y2Ba。统计分析,根据18 f-fdg PET / CT排除年龄贡献miR-signature predictivity (gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充文件S1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

单一的microrna的预测能力关系到18 f-fdg PET / CT积极评价。ROC分析显示,高循环表达式hsa - mir - 4311的水平,hsa - mir - 5096和hsa-let-7i-3p单独或合并为“gydF4y2Ba预测gydF4y2Ba“可以预测gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT有重大auc的积极的结果在0.81和0.95之间,与P2 (hsa - mir - 5096 - 5 - p * hsa-let-7i-3p)表现最好的表演(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

总的来说,三个预后microrna从exosomal检索部分PanNET患者的血浆(n = 38)和被发现与18 f-fdg PET / CT积极性。我们发现他们的褶皱变化可以组合成益生元分析物”gydF4y2Ba预测gydF4y2Ba“类似predictivity Pan-NET队列。然而,我们假设使用益生元分析物生物标志物在单一microrna应该给予更高的精度随着病人数量的化验将会增加。之间的统计比较单一的microrna的AUC值和“gydF4y2Ba预测gydF4y2Ba“报告gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

有鉴于此,进行了进一步的分析,揭示hsa - mir - 5096单独或组合,作为临床使用最佳人选预后的生物标志物,表现出最好的性能预测不同的端点。gydF4y2Ba

循环exosomal hsa - mir - 5096是一个潜在的PanNETs生存的独立预测指标gydF4y2Ba

ROC分析单一microrna(基线)进行PanNET病人的子集(n = 38),随后处理gydF4y2Ba^{177年gydF4y2Ba}Lu-DOTATATE PRRT和显示,hsa - mir - 5096最佳预测6 PFS (AUC: 0.8966;95%置信区间:0.76 - 1.00;gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)和12个月的操作系统(AUC: 0.8929;95%置信区间:0.72—-1.00;gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。与时间有关的(范围:3 - 24个月)对PFS ROC曲线分析表明,hsa - mir - 5096维护预后AUC值24个月(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba;TimeROC包R软件被用来提供一个估计的时间ROC曲线和相关的与时间有关的AUC的审查数据)。此外,循环hsa - mir - 5096表达水平(截止:70)著名PanNET患者预后不良反应到PRRT PFS(假定值:< 0.001;gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)和操作系统(假定值:< 0.05;gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

重要的是,hsa - mir - 5096出现的准确地预测6 PFS (AUC: 0.8636;95%置信区间:0.68—-1.00;gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)的子群gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT阳性患者,以更积极的疾病。具体来说,截止70年导致敏感性100%,特异性68%确定病人的一个子集进展之前,不受益gydF4y2Ba^{177年gydF4y2Ba}Lu-PRRT治疗(p值< 0.01;gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)。值得注意的是,刘/ YudengydF4y2Ba标准计算gydF4y2Ba截止给出我们平等的表现gydF4y2Ba内部gydF4y2Ba截止(70)定义为所有调查临床端点,从而充实其健壮性(数据未显示)。最后,尽管hsa - mir - 5096是一个准确的预测也为12-mo操作系统gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT积极的子集(AUC: 0.8571;95%置信区间:0.63—-1.00;gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba),截止70年不能明显分层gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT阳性患者12-mo OS预测(假定值:0.22;gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba)。重要的auc,敏感性和特异性值6总体和PFS和操作系统gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT积极PanNET病人所示gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

此外,考虑整体PanNET病人,多变量模型PFS包括规范二显示,患者PanNET hsa - mir - 5096 > 70年进步的疾病的风险更高,所示gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba(人力资源:4.24,95% CI: 1.39—-12.93,假定值:0.011)。gydF4y2Ba

此外,第二多变量模型考虑hsa - mir - 5096循环水平的关系与功能成像参数,进一步证实患者hsa - mir - 5096 > 70年进步的疾病的风险更高,所示gydF4y2Ba表3 bgydF4y2Ba(人力资源:5.98,95% CI: 1.28—-24.86,假定值:0.023)。单变量Cox回归模型对操作系统进行探究的意图和报道的3.53人力资源hsa - mir - 5096(95%置信区间:0.94—-13.22,假定值:0.060)。总之,统计分析支持hsa - mir - 5096作为一个准确和独立预测PanNET PFS的病人和70以上确定的增加水平gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba最穷的PFS F-FDG-PET / CT阳性患者gydF4y2Ba^{177年gydF4y2Ba}Lu-PRRT治疗。gydF4y2Ba

反向与hsa - mir - 5096表达式gydF4y2BaSSTR2gydF4y2Ba表达PanNETgydF4y2Ba

进一步评估其临床影响PanNET管理、签名的microrna的表达水平与几个二特性,包括gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC PET / CT SUVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}。有趣的是,增加循环hsa - mir - 5096的表达水平较低(截止:70)联系gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC PET / CT SUVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}(曼惠特尼测试,在PanNET患者(p值< 0.05)gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。与先前的观察,根据负协会68年ga-dotatoc PET / CT SUVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}和gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG-PET / CT积极性的病人显示低和高水平的hsa - mir - 5096(截止:70;斯皮尔曼:p < 0, 0169;r2: 0, 4928);观察(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。自gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC PET / CT SUVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}镜子SSTR2表达水平在PanNET患者中,观察到的负相关表明,hsa - mir - 5096可能参与SSTR2监管也在组织级别。证实这一假说,半自动immune-miRNA-ISH方法加上专用的管道的分析(和工具软件)成立并应用于检测和量化hsa - mir - 5096和SSTR2表达上同时FFPE肿瘤组织样本。八个独立的G1, G2 (n.5)和G3 (n.3) PanNET FFPE肿瘤组织标本首先回顾了由一个专家病理学家SSTR2的表达水平。两个是负的,四人坦率地积极(100%;3 +)和两个显示SSTR2异构表达式(gydF4y2Ba图6 c, DgydF4y2Ba)。和工具软件分析n = 8 PanNET FFPE样本,考虑10 roi(感兴趣的区域)/病人,76年总roi (4 roi退学由于存在组织折叠在一个案例中样本),导致197847672像素的提取,对应于平均价值为15186±7547分析细胞样本。我们提取的深红色的使用和工具软件、亮粉红色和白色面具分别为每一个roi。随后,我们应用一个基于像素分析那深红色的(SSTR2积极),亮粉红色(SSTR2低)和白色(SSTR2负)面具显示27%那深红色的像素,对应老实说阳性细胞的数量;22%的亮粉红色像素,对应于低表达的细胞的数量;和51%的白色像素的负面表达区域(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba)。相关分析证实了一个重要的反关联hsa - mir - 5096阳性细胞的数量和SSTR2表达水平PanNET组织(枪兵;r = 0, 4676;p < 0, 0001;gydF4y2Ba图6 fgydF4y2Ba)。重要的是,较低的地区/中度SSTR2的表达,这也为PRRT定义病人资格,显示一个中频hsa - mir - 5096阳性细胞核。这些观察同意一个机械模型,hsa - mir - 5096表达细胞可以通过旁分泌有助于肿瘤的异质性和镶嵌性SSTR2的干扰可能会妨碍PanNET PRRT瞄准和无效的响应。这些结果表明,hsa - mir - 5096 PanNET表达的肿瘤细胞,逆循环hsa - mir - 5096水平之间的相关性gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC PET / CT SUVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}值,镜子也发生相互作用在组织级别。gydF4y2Ba

hsa - mir - 5096调节SSTR2的表达gydF4y2Ba

为了调查的作用机制hsa - mir - 5096 SSTR2表达,我们进行了生物信息学分析与基于网络的软件后,TargetMiner, TargetScanVert miRDB。这一分析显示,在3’utr SSTR2 (NCBI基因ID: 6752;基因库加入:NM_001050.03)港口4潜在结合位点hsa - mir - 5096(加入miRbase: MIMAT0020603;序列:GUUUCACCAUGUUGGUCAGGC)。特别是,两个不同的序列(GUGAAAA;网站4日GGUGAAA)分布在基因的3’utr (723 - 729;3001 - 3007和1008 - 1015;分别为2290 - 2260年),并预测CACUUU和CCACUUU序列的识别hsa - mir - 5096。结合位点的存在表达支持的一个可能的监管gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba直接在PanNET RNA干扰肿瘤细胞(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

为了验证这个假设,我们执行gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba实验在胰岛瘤NT-3细胞系,分化良好的新成立的临床前模型低级PanNET (gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。重要的是,神经内分泌表型和形态以及增殖率和不同的表达SSTR NT-3细胞亚型可以调节生长因子的存在(bFGF / EGF)在文化(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。SSTR2和hsa - mir - 5096基础表达水平具有负相关性在NT-3细胞,培养既与无(w / o)和生长因子(GFs) (gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)。特别是SSTR2的表达显著增强(p值< 0.005)在NT-3细胞培养在标准RPMI GFs (w / o),特点是低扩散率(10.9 + / - 0.7天)和低ki - 67百分比(20%)(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。相反,hsa - mir - 5096结果显著下调(p值< 0.005)在这些条件下,确认其与SSTR2表达和负相关协议与我们的机械模型。此外,NT-3细胞ectopically对待hsa - mir - 5096 -模仿而种植没有bFGF和EGF (SSTR2gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba/ hsa - mir - 5096gydF4y2Ba^低gydF4y2Ba内源性表达)。正如所料,异位交付hsa - mir - 5096gydF4y2Ba通过gydF4y2BamiRCURY LNA转染导致显著增加细胞内hsa - mir - 5096 /模拟not-transfected和争夺控制相比,确定转染效率(p值< 0.0001;gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)。NT-3细胞治疗与hsa - mir - 5096模拟72年人力资源减少SSTR2 mRNA水平的51%相比scramble-treated细胞(p值< 0.005;gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)。相反,NT-3细胞治疗与hsa - mir - 5096 -抑制剂而培养生长因子(SSTR2gydF4y2Ba^低gydF4y2Ba/ hsa - mir - 5096gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba内源性表达)显示,SSTR2成绩单数量显著增加(+ 42%,p < 0.005;gydF4y2Ba图7 dgydF4y2Ba)。这些调节的大小是符合文学,的确高数量的细胞内hsa - mir - 5096模拟检测到RT / qPCR,对应于一个适度的目标的调制,由于飙升的非功能性/激活部分模拟(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)。进一步证实hsa - mir - 5096的功能作为公认的SSTR2表达的转录后调制器,其基础表达水平研究还在临床前模型的高档PanNET: QGP-1和BON-1细胞,具有高增殖率和高ki - 67百分比(大约80%)。QGP-1 BON-1显示显著不同数量的SSTR2,反向与hsa - mir - 5096明显不同(p < 0.001和p < 0.01,分别;gydF4y2Ba图7 egydF4y2Ba)。鉴于其高hsa - mir - 5096,与低SSTR2的表达有关,QGP-1细胞被选为模型来恢复SSTR2表达优质PanNET细胞hsa - mir - 5096 -抑制剂治疗。重要的是,QGP-1治疗细胞显著增加了39%的SSTR2成绩单(p < 0 01);gydF4y2Ba图7 fgydF4y2Ba)反映SSTR-2 upregulation蛋白免疫荧光染色法如图所示的水平(gydF4y2Ba图7 ggydF4y2Ba)。所有这些结果表明交付特定的非编码小分子阻碍hsa - mir - 5096活动成PanNET细胞可以转化为gydF4y2BaSSTR2gydF4y2Ba记录增加稳定性和更高的SSTR2细胞膜上。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

本研究侧重于先进、转移性和不实用的高分PanNETs,通常路由到PRRT,针对SSTRs与放射性标记生长抑素类似物(介绍)。尽管如此,虽然gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC PET / CT SUVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}功能成像用于驱动PRRT资格以及预测其功效,SSTR2的表达异构PanNETs影响PRRT敏感性和准确性(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。事实上,尽管gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC PET / CT SUVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}有助于分层PanNET患者中,约60%的病人不响应SSTR-based PRRT。值得注意的是,PanNETs经常显示增加葡萄糖代谢网相比,从其他网站。确实。SINETs据报道低的新陈代谢的肿瘤gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG-PET / CT显示低预后的力量。另一方面,相关的攻击行为gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG-PET / CT差的积极性和PFS PRRT处理时,表明葡萄糖代谢的关键作用的发展PRRT难治性肿瘤表型(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。有趣的是,我们表明,特定的microrna显著调节PanNET患者的血液中,但不是在镜子SINET这可能和1的一个内在特征小肠肿瘤中葡萄糖代谢和18 f-fdg PET / CT可能不会这样关键的预后作用在肿瘤侵犯,不同于与胰腺神经内分泌肿瘤的起源。在这种情况下我们的研究可能表明分子信号,代谢和行为的网,以及预后18 f-fdg PET / CT的力量,可能会有所不同根据不同网站的起源。由于这些理由GEP-NETs不应该被认为是在一起作为一个独特的实体,而是分离肿瘤个体的预后和管理。事实上,这项研究表明SI-NETs子集表示更高水平的循环hsa - mir - 5096相比,PanNET病人和/或健康的捐赠者(数据未显示),然而hsa - mir - 5096无法与增加肿瘤代谢或18 f-fdg PET / CT积极性。因此,功能性成像gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CTgydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC PET / CT显示预后和预测,但有一定的局限性,如难以量化的吸收和缺乏标准化从多个病灶吸收。在这个框架中,它仍然是临床相关性gydF4y2Ba我)gydF4y2Ba更好地理解这些肿瘤的生物学,研究分子机制导致PRRT耐火表型;gydF4y2Ba(二)gydF4y2Ba改善预后和预测算法和提供更好的接受PRRT PanNETs分层。多国、多学科的Delphi共识鼓励multi-analyte测量使用提供更准确的信息增殖,代谢和转移特性网(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。在这种背景下,结合gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba空间和功能成像的肿瘤可衡量的循环记录(mrna和ncRNAs)应该是首选,可能是一个关键的战略实时疾病监测和预测在不久的将来gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。目前,唯一的批准gydF4y2Ba体外诊断gydF4y2Ba网是净(试管)工具。最近,网络是结合分级和用于生成一个PRRT预测系数(PPQ)网。然而,净不考虑肿瘤代谢的贡献和直接相关gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG-PET / CT状态(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)。我们的结果显示一个潜在作用hsa - mir - 5096单独和组合成预测P2 oligo-analytegydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG /宠物积极性PanNET患者(gydF4y2Ba补充表S2、S3gydF4y2Ba)。在这种背景下,gydF4y2Ba“预测”gydF4y2Ba可能是有用的构建multi-analyte试验,考虑到数学的可能性结合两个或两个以上的microrna的预后力量在一个血撤军。然而,我们没有观察到任何auc值之间的显著差异,单一hsa - mir - 5096的表演比”gydF4y2Ba预测gydF4y2Ba“在6-mPFS 12-mOS;虽然P2可以最好的预测gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT端点只有当multi-analyte测量是首选(见gydF4y2BaS3补充文件gydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充数据S2-S4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba表S2、S3gydF4y2Ba)。此外,ROC曲线和公里分析显示,hsa - mir - 5096可以执行作为一个准确和独立预测患者PanNET PFSgydF4y2Ba^{177年gydF4y2Ba}Lu-DOTATATE PRRT准确率达到了90%。在我们的回顾性研究中,我们分析展览一个度量可比目前的净区分PanNET稳定疾病进行性疾病有85%的准确度,考虑51-transcripts通过一个专门的算法分析的表达提供了目前世界上由一个实验室(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)。临床意义的结合gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT值的积极性hsa - mir - 5096 > 70标识一个小说后预后类别特征是最穷的PFSgydF4y2Ba^{177年gydF4y2Ba}Lu-DOTATATE PRRT。截止70年类似的刘/ Yuden性能gydF4y2Ba标准计算gydF4y2Ba截止,但避免了假阳性gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT,防止过度消极的病人(hsa - mir - 5096 < 70)。临床相关性,同样的截止70年的执行不同的端点,从而增加这个标记的临床效用和促进的解释结果。尽管进一步外部验证独立群PanNET病人所需,hsa - mir - 5096凸轮被视为一个同伴的生物标志物gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT改善PanNETs分层和predictivity PRRT功效。在这种背景下,hsa - mir - 5096评估构成低复杂性、微创检测,需要基本的和已经在医院广泛扩散设备正在评估。hsa - mir - 5096可能还考虑作为一个潜在的候选人“II型”生物标志物(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)。预后的影响描述hsa - mir - 5096都是独立的标准临床参数考虑,除了分级预计由于不同生物的积极的和消极的gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET / CT PanNETs。有趣的是,循环hsa - mir - 5096显示轻微的负相关gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}Ga-DOTATOC PET / CT SUVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}68年,这种负相关ga-dotatoc PET / CT SUVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}与gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG-PET / CT积极性的病人显示低和高水平的hsa - mir - 5096(截止:70;gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba),标识的子群gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG-PET积极SSTR2受体的密度较高,患者类似gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG-PET消极,这可能有助于解决PRRT安排防止过度治疗和支持的角色hsa - mir - 5096作为病人的分层的同伴生物标志物。这些观察结果进行了考虑样本容量相对有限;因此我们克服这个限制,进一步证实了逆相关SSTR2和hsa - mir - 5096还在单细胞水平上PanNET组织标本。在这种情况下,我们设置miR-ProteingydF4y2Ba原位gydF4y2Ba协议在同一组织切片检测标记,使用半自动和健壮的过程也让我们节省宝贵的病人的资料。值得注意的是,这部小说miR-Protein检测和专用和工具软件的分析提供microrna的同步检测和蛋白质,其次是标准化的,运营商独立测量,将定性gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba启示定量分析。具体地说,我们的小说染色工作流自动化和避免抗原退化通常发生在免疫组织化学伊什之前执行。此外,使用DAB-brown染色,与典型的蓝色用于伊什标签,是至关重要的,以确保microrna的染色稳定性和歧视DAB-brown正从负核(与苏木精复染色)允许和工具软件分析。我们相信我们的结果维持hsa - mir - 5096直接参与SSTR2营业额成PanNET细胞。事实上,hsa - mir - 5096异位超表达PanNET胰岛瘤NT-3 SSTR2记录细胞导致明显降低,而hsa - mir - 5096抑制显著提高SSTR2表达QGP-1和NT-3确凿的直接目标和监管PanNETs SSTR2的特征gydF4y2Ba^低gydF4y2Ba/ hsa - mir - 5096gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba表现型。值得注意的是,NT-3细胞生长因子治疗的特点是增加了ki - 67%, hsa - mir - 5096诱导和减少SSTR2水平,符合一个更积极的表型和数据中观察到病人。从这个角度看hsa - mir - 5096似乎有助于新陈代谢切换导致PanNET细胞谱系分化。值得注意的是,hsa - mir - 5096参与了胶质母细胞瘤生物学和报道过表达在乳腺癌和高亲和力结合约725目标基因(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

一些局限性必须承认我们的研究结果的正确解释。由于懒惰GEP-NETs性质及其罕见,尤其是PanNETs鉴于勒克斯的升学率和LUNET临床试验我们意识到的样本大小筛选和验证组相对有限,包括不同的肿瘤类型,使我们的病例分析不均匀分布在原产地主站点。具体来说,应该考虑单变量Cox回归模型探究的,提供指示生物标志物的独立predictivity,进一步验证扩大军团是可取的。此外,回顾设计,入学率,可能影响的人口分布验证队列在性方面,年龄或年级。为了克服这个限制,我们反驳时代贡献microrna签名放松管制的等离子体PanNET患者(gydF4y2Ba补充文件gydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba),我们介绍了清晰和严格的入选标准,进行了临床和组织的综合评价参数,以及执行放射检查蒙蔽了所有基线和挑起图片为了最大化的信息价值和质量数据来源于这个调查。为了提供足够的统计能力,鲁棒性和可译性临床管理我们鼓励进一步验证外部,扩大和独立的潜在人群。monocentric性质的研究和疾病的罕见也代表限制由于病人来自不同地区的后续其他地方执行,造成失访,防止收集足够的和均匀的随访病例系列。这里,我们评估了hsa - mir - 5096循环水平基线,关注它的表现作为患者预后的生物标志物分层PRRT治疗之前,单独或结合hsa-miR-let7i (P2,如果multianalyte评估者优先)及其在生物学和SSTR2 PanNET调制功能的作用,提供潜在的治疗化合物的概念证明。在这种背景下,我们执行gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba实验NT-3最具代表性的细胞,为低品位PanNET研究和验证细胞模型。事实上,NT-3细胞表达SSTR1, 2、3和5 (gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)亚型和我们的分析集中在gydF4y2BaSSTR2gydF4y2Ba它包含多个目标序列hsa - mir - 5096在其3 ' utr因为其在PanNETs患病率和临床意义,PRRT的目标。有趣的是,我们也发现,3’utr SSTR3港口一个hsa - mir - 5096预测结合位点(TargetScan_Vert源)。SSTR3也可能确定SSTR营业额的调制和信号净疾病。此外,TargetScan_Vert基础分析还报道5结合位点的3 'utr生长激素抑制素基因(SST)。风场是一个结合的短肽SSTRs施加抑制性影响神经内分泌细胞,包括细胞生长激素释放抑制。事实上,风场模拟是用来治疗神经内分泌疾病与新颖的表观遗传监管者SST信号或SSA-mTOR抑制剂最近提出的联合治疗肿瘤的控制。与古典SSA治疗方案,预计未来先进疗法改善病人的管理网络。实际上,hsa - mir - 5096 - 5 - p可以干扰受体和配体downmodulating整个信号,从而阻止hsa - mir - 5096 - 5 - p可能导致减少肿瘤的生长和对PRRT敏感性增加。考虑到这一点,即使它是超出了本研究的范围,我们相信风场和SSTR3值得进一步探索与这里microrna的定义。此外,观察优质PanNET BON-1 QGP-1细胞系进一步支持存在hsa - mir - 5096 SSTR2轴和hsa - mir - 5096介导干扰SSTR2成绩单。 Accordingly, hsa-miR-5096 inhibitor was more effective on QGP-1 cells in triggering a significant SSTR2 upregulation since QGP-1 display higher levels of hsa-miR-5096 and lower SSTR-2 amounts compared to BON-1 cells. Our results lay the conceptual basis for a novel therapeutic for PanNET management, in order to sensitize tumor cells to PRRT via the delivery of specific hsa-miR-5096 inhibitory molecules.

结论gydF4y2Ba

总结我们的研究导致候选人预后和低microrna的签名很容易可收回PanNET患者的血浆。hsa - mir - 5096的潜在临床效用单独或结合hsa-let-7i-3p依赖其预后力量在预测代谢侵略性这将帮助与PRRT PanNET分层治疗。此外,我们的研究表明,PanNET肿瘤细胞可以产生大量的居民hsa - mir - 5096 downmodulating SSTR2 biofluids自分泌的机制或脱落数量增加gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba液,导致SSTR2表达受体细胞gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba旁分泌机制。这种机制可能导致肿瘤异质性的发展耐火材料PRRT表型和/或复发。重要的是,我们的研究表明,治疗方法旨在干扰hsa - mir - 5096活动,抑制其针对SSTR2 3 ' utr序列,将增强SSTRs表达和提高肿瘤细胞对PRRT或其他SSTR-targeted疗法。目前正朝着这个方向努力提供PanNET患者更多和更有效的治疗选择。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

这项研究中给出的数据存入欧洲Genome-phenome存档(EGA)库,加入EGAD00001010840数量。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

涉及人类受试者的研究回顾和批准Centro di Coordinamento某IRST IRCCS Unita di Biostatistica e Sperimentazioni Cliniche (CEROM),没有批准。6711/5.1/2016。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

MB,毫米,GP的构思和开发研究的想法。MB进行实验。钢筋混凝土和马门店执行分析。MB,麻省理工学院,和FF分析数据。SS和搞笑手术标本。MB和SR设置协议和执行miRNA-ISH /包含IHC肿瘤组织标本。垫和扫描图像和FP获得设计和提供了软件和工具。JS请提供NT-3, QGP-1 BON-1细胞系和造成深刻的观察,讨论数据和技术支持。MB起草了手稿。MB,垫、FP FN和MM负责数据解释和修订后的手稿。 All authors read and approved the final version of the manuscript for submission.

确认gydF4y2Ba

这项工作已被卫生部支持”研究项目CAR-T血液恶性肿瘤和实体瘤细胞”的保护下进行联盟对抗癌症(ACC)网络(rcr - 2019 - 23669115)。我们要感谢CRB研究所(生物)的加工、储存和提供肿瘤标本。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2023.1136331/full补充材料gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

非国大,绝对中性粒细胞计数;AUC,曲线下的面积;CT断层;gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG 2-deoxy-2——[氟18]fluoro-D-glucose;硅谷动力,欧洲神经内分泌学会;外汇期货,Fold Enrichment; GEP-NETs, Gastro-entero-pancreatic NETs; HR, Hazard Ratio; IVD,在体外gydF4y2Ba诊断;多分,gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂化;公里,kaplan meier;网,神经内分泌肿瘤;门店,下一代测序;95%可信区间,95%置信区间;操作系统,整体存活率;PanNETs胰腺网;PD,进步的疾病;宠物,正电子发射断层扫描;PFS,无进展生存; PCA, Principal Component Analysis; PRRT, Peptide Receptor Radionuclide Therapy; ROC, Receiver Operating Characteristic; RT/qPCR, Real Time quantitative PCR; SINETs, Ileal NETs; SSTR, Somatostatin receptor; SUV_{马克斯gydF4y2Ba}最大标准摄入值;3’utr, 3 '非翻译区;世卫组织、世界卫生组织。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba