原始研究的文章

前面。肿瘤防治杂志。,03 February 2023
秒。胃肠道癌症:Hepato胰胆肿瘤
卷13 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fonc.2023.1073820

MUC16和TP53的家人粘住,在胰腺癌肿瘤基质的异质性

Ramakanth Chirravuri-Venkata ^{1 __},

Vi大坝^{2 __},

罗摩克里希纳Nimmakayala ^{1 __},

Zahraa Wajih Alsafwani^{1 __},

Namita Bhyravbhatla¹,

Imayavaramban看到 ¹,

Moorthy p Ponnusamy ¹,

和蛇 ¹,

Maneesh耆那教徒的 ¹,

达里奥Ghersi ^{2 *}和

萨伦德k·巴特拉 ^{1、3 *}

¹生物化学与分子生物学、内布拉斯加州大学医学中心,奥马哈市东北,美国
²跨学科信息学学院大学内布拉斯加州奥马哈市东北,美国
³埃普利研究所研究癌症和盟军疾病和巴菲特癌症中心,内布拉斯加州大学医学中心,奥马哈市东北,美国

MUC16 / CA125是为数不多的古老癌症生物标志物仍用于目前的临床实践。间皮是一个丰富的MUC16来源和主要贡献者基质PDAC异质性,我们调查的规定单独MUC16在肿瘤和间质箱内。使用单细胞转录组的轨迹构造KPC的基质细胞肿瘤表现出连续性之间的运动轨迹MUC16-expressing间皮的细胞和其他CAF子集。进一步,肿瘤组织MUC16全身淘汰赛(KPCM)失调肌动球蛋白标记的组装和纤维母细胞分化(iCAF和myCAF),表明MUC16 extra-tumoral作用控制CAF分化。尽管我们发现mesothelium-derivative旁观者在正常胰腺间质细胞,这些细胞的比例在入侵PDAC更高,尤其是在TP53缺乏肿瘤。此外,我们也详细MUC16的规定,喀斯特,SOX9, TP53的家庭成员(TP53和TP63)使用从淘汰赛multi-omics数据模型,PDAC细胞系和人类PDAC组织。

介绍

粘蛋白的出现16 (MUC16 / CA125)作为卵巢癌生物标记在1980年代是一个主要的里程碑在生物标志物的研究领域(1)。的临床效用MUC16作为危险分层的辅助诊断手段,早期诊断和鉴别诊断仍是当代有关癌症诊断。跨膜黏蛋白MUC1和MUC16支持癌症恶化通过改变纯合子和杂合的信息粘附潜力(2)。尤其是MUC16,积分调节复杂的过程就像信息连接的完整性,细胞骨架结构、信号转导和入侵过程(3,4)。虽然一些文献表明colocalization MUC16的顶端部分黏膜纤毛的上皮细胞角蛋白,发现其他地方展示其超表达在角质层分离和角质化(5,6)。MUC16表达不仅是特定于上皮细胞也发现在其他细胞如成纤维细胞和间皮的内脏和生殖器官的细胞(5,7)。

MUC16蛋白c端部分的经历protease-mediated乳沟1型基质金属蛋白酶。循环水平往往与结缔组织中参与癌症恶化的大小和手术恢复(8,9)。多功能间皮的细胞支持结缔组织开发作为collagen-producing细胞的主要来源和最近公认为关键效应器cycling-recycling事件在正常胰腺以及PDAC进展(10,11)。细胞谱系研究证明mesothelial-derived血统赋予内在几个器官再生潜力,包括胰腺,没有干预从神经嵴或循环细胞(12)。重要的是要注意,组成型表达和分泌的MUC16间皮的细胞比其他细胞,高数倍的包括卵巢癌细胞(13)。间皮的标记的条件敲除,要肿瘤1 (WT1),一个假定的MUC16转录监管机构,导致多器官衰竭与胰腺外分泌腺(损失14)。尽管WT1调节胚胎发育和组织维护,其信号通路纠缠与已知癌基因和肿瘤抑制(TP53, TP63 SPP1) (15,16)。

组织学检查大部分胰腺肿瘤显示频谱导管hyperplasia-carcinoma鳞状上皮化生,引起猜测,由于化生的鳞状细胞癌很可能改变腺癌(17)。由于TP53家庭成员的角色像TP63鳞状腺癌的重组,许多研究试图deconvolute isoform-specific TP63监管(18)。应该注意的是,TP63经常工作在陪伴TP53允许DNA-damage-dependent存活或生长抑制(19)。TP53改变自己改变TP63的拼接;因此,TP53的高倾向改变PDAC肿瘤可能促进肿瘤的TP63-mediated分子重组。此外,TP63基质景观也导致全球变化更明显的中性粒细胞的浸润和炎症战乱国家(20.)。

在PDAC,浸润肿瘤细胞显示高表达MUC16相对匹配PanIN高3细胞与肿瘤大小相关,浆膜浸润和淋巴结转移(3)。MUC16的表达主要是讨论在PDAC肿瘤上皮细胞的上下文。然而,在PDAC mesothelial-derived细胞的渗透扩展的列表可能的MUC16备用源和监管。使用公开数据,我们进行分子鉴定上皮肿瘤细胞和间皮衍生品的PDAC分离肿瘤基质MUC16监管。

方法

处理scRNA人类PDAC组织的数据

人类PDAC 16 scRNA数据组织和PBMCs(加入不:GSE155698)和基质细胞(DAPI -_CD45 -_CD31 -_EPCAM)从4 KPC (Kras-LSL-G12D;Trp53-LSL-R172H;Pdx1-Cre) C57BL6 / J小鼠分别获得NCBI-GEO数据存储库中,然后处理使用修R包如下规定(21,22)。scRNA数据处理为数据处理和聚类根据最佳实践修R工具包中概述文档(https://satijalab.org/)。scRNA数据(GSE155698)的42692个细胞从16 PDAC组织被认为是分析。样品属于组织11 (PDAC_TISSUE_11A & 11 _b)并不包括在分析时处理两种不同的核心设施。42692个细胞,16635个细胞遇到质量控制阈值(太读< 5% & nFeature_RNA > 200),并随后使用标准(对数)归一化处理规模10000倍。排名前2000的高度可变特性确定使用方差稳定转换(威仕特)被用于主成分分析(PCA)。35第一主成分(捕捉变化的83.6%)被用于执行细胞集群基于类型分组。每个集群的集群前30名标记是用来注释与细胞类型使用集群Enrichr数据库(23)。我们进一步确定钙粘蛋白(背景)表达上皮细胞和分层的基于MUC16-expression(分成上下值表达式组)来识别差异表达基因。

处理scRNA KPC基质细胞的数据

肿瘤基质亚型的RNA-seq处理数据(也称为莫菲特数据;n = 357)从NCBI地理库检索(加入不:GSE71729)。只有主PDAC样本(n = 145)被用于下游分析。基质细胞的规范化scRNA数据之前(DAPI、CD45、CD31 EPCAM -) (GSE129455)从4 KPC (Kras-LSL-G12D;Trp53-LSL-R172H;Pdx1-Cre) C57BL6 / J小鼠用于执行集群和血统轨迹分析。我们使用前2000名变量特性构造的主要组件。最近邻图计算使用前50名的主要组件,随后集群。基质细胞表达的一个子集Mesothelin (Msln)或Muc1 Muc16(3565细胞)被用来创建三个细胞组:A) Muc1-expressing细胞(928);b) Muc16-expressing细胞(148); and c) Msln-expressing (2491 cells) for lineage trajectory analysis (补充方法1)。前500名变量特征子集的确定之后,用于主成分分析。UMAP减少和细胞轨迹使用前20名主成分分析。间皮的细胞表达高选择性标记(Wt1、Muc16 Msln, Upk3b, Upk1b)被选为根细胞推理轨迹。我们使用一个更大的群Upk1b-expressing间皮的细胞(617细胞)发现早期基因表达变化与mesothelial-mesenchymal过渡。除了层次聚类,我们也使用任意相关措施来识别基因关联的间皮的差别与损失/对这些标记。

微分表达式使用scRNA数据测试

测量中值被切断了gene-expression-based细胞组分层,除非否则提到。亚组分析的微分测试是通过使用FindMarkers年代eurat R的函数。

KPC和KPCM组织的rna序列的分析

RNA序列进行胰腺肿瘤获得KPC (KrasG12D / +;Trp53R172H / +;Pdx-1 Cre)和KPCM (KrasG12D / +;Trp53R172H / +;Pdx-1 Cre, Muc16 - / -)小鼠。排列的顺序读取使用HISAT2老鼠基因组。的基因数量估计使用功能计数和随后被规范化使用DESeq2 R包。

分析时间——mesothelial-mesenchymal可塑性有关

大部分RNA-seq父母间皮的细胞,流式细胞仪的数据排序eGFP +间皮的细胞肿瘤(CT1BA5 & BMFA3)获得从NCBI地理(加入不:GSE196740)。预处理和标准化进行了使用DESeq2 R包(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html微分表达式分析之前)。

scRNA-seq分析解决基质异质性在转基因小鼠模型(GEMMs)

GEMM scRNA数据模型正常,KPC晚,KPfC晚,早期断裂韧性和断裂韧性晚从NCBI获得地理(GSE125588)。对数据进行对数转换比例因子10000前下游分析。基质细胞被确定基于PDPN表达式。基于标识的epithelioid-like细胞标记借用拟时间轨迹结果(Muc1 Clu)。间皮的细胞被确定使用标记(Muc16、Cldn15 Upk1b)。

细胞类型的注释

笛卡尔的特定类型细胞基因表达数据(descartes.brotmanbaty.org)发展数据库(657细胞从15个器官)和人类的蛋白质图谱(www.proteinatlas.org)(51 13细胞组织)都从各自的网站下载(24,25)。

TCGA-PAAD分析

处理过的TCGA-PAAD RNA-seq (FPKM-UQ规范化)和临床数据是来自UCSC齐娜数据门户(https://xena.ucsc.edu/)。分子亚型根据贝利的分类方案的信息可从以前公布的来源(26,27)。微分表达式分析样本群不同亚型,与一个FDR-corrected假定值阈值为0.05的统计意义。突变的预处理文件、临床信息和拷贝数变异来自cBioPortal (cbioportal.org)。TP63被检索到的数据拼接变异UCSC齐娜数据门户。信息关于TP63亚型从RefSeq访问(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/),Ensembl-UCSC ID转换完成使用biomart运用资源。只在“癌症样本归类为胰腺腺癌类型详细的“临床信息(n = 176)被认为是分析,其中,样品MUC16 z分数表达式> 1被指定为“MUC16-overexpressing”。

组织学亚型分析

MUC16的规范化表达QCMG-PDAC (n = 96)和相应的临床信息组织学亚型sample-wise收购从cBioPortal web服务器(cbioportal.org)。

假定的转录因子识别

信号通路的项目(SPP)数据库,运用网站用于转录因子结合位点的识别MUC16和TP63 (28,29日)。我们也访问碧玉转录结合位点概要文件使用Enrichr网络服务器(https://maayanlab.cloud/Enrichr/)进行验证。

再分析/评估RNA-seq来自其他来源的数据

我们使用了author-deposited微分基因表达数据在NCBI地理(GSE140484)在胰腺肿瘤种植使用orthotopically植入TP63-expressing SUIT2细胞NOD-scidγ(NSG)老鼠。同样,(log2(µlog-2-fold差异_上海/µ_月)在p53基因的表达R172H /空鼠PDAC细胞治疗doxycycline-inducible控制(月)或anti-p53成分(sh1 & sh2)估计使用数据存入NCBI地理(GSE114502)。Trp53fl / + KRAS基因的rna序列数据喀斯特Trp53fl / + TAp63fl / fl获得ArrayExpress(加入代码:e - mtab - 4415),预处理和规范化使用Kallisto /侦探DESeq2 FPKM函数。然后我们计算(log2(µlog-2-fold差异_{KPTAp63fl / fl}/µ_KPC))的基因表达和名义假定值(t)。

CCLE细胞株蛋白质组学分析

有关的数据拷贝数变化和蛋白质丰富的比率CCLE-PAAD细胞系(n = 15)从cBioPortal访问(cbioportal.org)和DepMap web门户网站(depmap.org)。标准化的基因和蛋白质丰度数据被用来执行细胞系使用MUC16创建的分组之间的微分表达式分析蛋白表达(MUC16-high & MUC16-low)。

HPA细胞类型签名

单个细胞类型的基因签名的人类蛋白质图谱数据估计使用一个片面的学生学习任务(p < 0.05)。我们只考虑一个基因作为一个特定的细胞类型的基因签名,如果基因并不在超过三个细胞类型(24)。

GSEA分析

GSEA分析使用内部生成的HPA细胞类型的基因签名(见HPA细胞签名方法部分)MUC16-high和TP63-high群与1000年TCGA-PAAD表型排列。

笛卡尔发育基因签名和分析

笛卡尔发育注释(https://descartes.brotmanbaty.org/MUC16-high和TP63-high组织的差异表达基因)的访问使用Enrichrweb服务器(23)。一个基因被认为是胰腺间皮的特异性签名如果间皮的细胞表达基因的分数明显高于其他细胞(p < 0.05)。我们排除了其他起源的基因表达分数间皮的细胞分析。此外,分数的细胞表达的签名必须高于胰腺间皮的细胞相对于其他细胞/细胞类型(22,30.)。

免疫原性

预测绑定关联使用9 mer肽序列的突变基因进行MHCPan和MHCFlurry TCGA-PAAD队列。的sample-wise免疫原性负载被用来执行微分基因组和转录组分析以及生存分析。

Immunophenotype分析

In-silico immunophenotyping TCGA之前规范化和莫菲特PDAC RNA seq数据集进行使用CIBERSORT LM22签名(使用标准的参数31日)。双尾学生学习任务是用来评估统计学意义的组的分析。使用皮尔逊方法进行相关测试,被认为具有统计显著性,p值< 0.05。

统计分析

组/子组之间的假设检验是利用t检验进行的。报告的假定值估计使用箱线图stat_means_compareggplot2包的函数。

结果

身上诱发细胞的身份变化MUC16-expressing间皮的细胞

间皮的细胞进行间充质转变在协助修缮的癌症和组织损伤的表型。最近的单细胞研究证明mesothelium-derived战乱国家,两间皮的特点是他们的表达以及纤维母细胞标记、渗透调节的PDAC肿瘤肿瘤基质对话。同样的,其他一些研究也指出,表达丰富的间皮的标记(Sciellin / SCEL Mesothelin / MSLN MUC16)在入侵前在胃肠道癌症与贫穷相关的结果(3,32,33)。我们还指出一个代表MUC16-high表达的间皮的签名样本TCGA-PAAD队列注释使用笛卡尔胰腺细胞的转录特征(补充图1 a, B;补充文件1)(25)。确定MUC16之间的关系和间皮的可塑性,我们使用scRNA fibroblast-enriched基质细胞的数据(DAPI -_CD45 -_CD31 -_EPCAM)从四个KPC老鼠和识别一小部分(2%;158/8524的细胞)Muc16-expressing间皮的细胞。然而,我们注意到共享的表达间皮的标记(Upk1b Upk3b, Wt1、Msln)在更大的子集基质战乱国家(图1一个)。所有基质细胞的聚类分析显示不同的CAF亚种群的存在特点是要么myeloid-like (Cd14-expressing),肌上皮和平滑肌(SMC) (Caldesmon / Cald1)和间皮的(Muc16、Upk3b Upk1b)转录活动。绝大多数(~ 75%;6393/8524的细胞)表达的战乱国家myopeithelial / SMC Cald1标志,其中约40%(3370/8524细胞)表达Mesothelin (Msln)。虽然Msln-expressing细胞表现出高度的异质性对epithelioid-like没有明确承诺,间皮的,或SMC分数,一个子集(~ 23%;800/3370的细胞)细胞显示独特的转录形象的特点是他们的表达细胞角蛋白(Krt7 Krt19)、上皮膜抗原(Muc1)和髓系标记(Cd14、Kcnn4) (图1一个)。

图1

图1间皮的细胞可塑性在基质和肿瘤隔间:(一)在Msln-expressing高度可变的基因,Muc1-expressing基质,间皮的(内消旋)细胞对伪时间进行描述。最左边的部分的热图包括Muc16-expressing和其他细胞间皮的不定地表达间皮的标记(Wt1、Upk3b Muc16, Upk1b, Msln)。Muc1-expressing细胞聚集在最右边的部分情节显示co-expression细胞角蛋白(Krt7, Krt19 Krt18)、上皮(Muc1、背景,Elf3 Cldn2)和髓系标记(Spp1 Kcnn4)。Muc1-expressing细胞观察后在伪时间轨迹。间充质细胞桥接Muc16-expressing之间的路径和Muc1-expressing细胞表现出高的表达间充质标记(Vim, Tgfb1 Cald1, Cd63, Sparc)变量间皮的的表达与上皮细胞。注释栏在顶部代表伪时间(上),细胞集群(中间),加入的三个分层军团(内消旋,MUC1-exp MSLN-exp)(底部)。(B)集群在转录路径和轨迹推理分析显示连续性三个预定义的细胞类型包括:a) MUC16-expressing间皮的,b) Mesothelin-expressing (Msln)和c) MUC1-expressing KPC基质细胞(n = 3365)(C)UMAP表示PDAC基质细胞表达选择特定的基因不同的细胞类型,DNA修复,化生(Cd14、Onecut2 Pdgfra, Muc1, Xrcc5)(D)早期转录变化与mesothelial-mesenchymal细胞状态描述的热图中紧密连接的损失和酶基因(Cldn3、Gjb3 Prkcz, Cdh3, Cd200, Cldn15, NrxN)与骨桥蛋白的获得(SPP1)和MMP的表达。(E)小提琴的预选标记显示过度氧化应激/氧化还原信号(Gsta1、Gsto1 Gsta4, Gsr), Polycomb复数相关基因(Muc1, Clu, Cd24a Cd14)和DNA损伤/衰老(Muc1-expressing基质KPC细胞Xrcc4 Vegfa)。(F)热图描绘了细胞间粘附的差别TME-induced对这些基因在FACS-sorted eGFP间皮的细胞从老鼠PDAC获得肿瘤(BMFA3和CT1BA5)相比,父母间皮的细胞。(G)PDPN-expressing基质细胞的高分数相对于肿瘤细胞在迟到KPfC模型比在正常胰腺组织(上)和其他PDAC小鼠模型;虽然间皮的细胞分数比较不同PDAC小鼠组织(中间);的频率Muc1-expressing细胞更突出的PDAC年末组织(中间);KPC PDAC PDPN-expressing基质细胞的组织显示过度激活状态(Tnf,液态氧,Sparc和白细胞介素6)相比KPfC组织(底部)。

从现在起,我们将使用术语“epithelioid-like”来指代这些战乱国家由于他们co-expression上皮细胞和髓系标记。因此,检查如果共享Msln表达式表明他们的共同进化或共同的血统,我们构建细胞轨迹只有间皮的(Muc16-expressing) Msln-expressing Muc1-expressing细胞(3565细胞)。集群和轨迹分析了三个不同的细胞集群连续轨迹路径(图1 b)。转变对伪时间也显示出逐渐丧失间皮的标记(Muc16、Upk3b Upk1b)的增益与核糖体亚基的表达(Rps27a, Rpl23a Rpl17),细胞周期重新和骨桥蛋白信号(Spp1, Cd44, Cdkn2a Ccnd1)(ρ< -0.4和p < 0.0001) (图1 a, C)。此外,老化/ DNA修复基因的超表达(Xrcc4、Vegfa Clu) galectins (Lgals2 Lgals3)和氧化还原谷胱甘肽基因(Gsta1、Gsta4 Gsr, Gsto1)在Muc1-expressing战乱国家意味着衰老途径背后出现(图1 e)。我们也独立相比Muc16-expressing间皮的战乱国家间皮的战乱国家,一个更大的部分是被Upk1b表达式(~ 5%;459/8525),我们发现高表达的细胞骨架,基因信息粘连,结(Cldn3、Gjb3 Prkcz, Cdh3, Cd200, Cldn15, Nrxn2)在Muc16-expressing间皮的细胞。相比之下,Upk1b-expressing间皮的细胞表现出细胞外基质降解相关基因的表达增加(Mmp2、Mmp9 Mmp14), MYC-regulated核糖体亚基(Rpl13, Rpl23 Rpl34),细胞循环/扩散(Cdkn2a Ccnd2, Cd44, Ccnd1)间充质粘附(Itgb5, Tgfb1 Fn1),骨桥蛋白(Spp1)和HLA-class II (Cd74) (图1 d)。

由于纯分数低MUC16-expressing间皮的PDAC组织相比,正常的胰腺细胞,我们假设肿瘤微环境(开心的)影响MUC16表达和细胞间皮的身份。流式细胞仪的分类eGFP间皮的细胞从老鼠PDAC肿瘤(BMFA3和CT1BA5)显示信息附着力下降(Muc16, Cldn15 Cdh3)和ERM Ezrin蛋白(Ezr)和伴随的间充质(Acta2 Tgfb1)的过度表达,蛋白酶(Mmp2、Mmp14 Timp1, Timp3)和细胞周期(Myc Cdkn2a)基因与父母间皮的细胞(图1 f)。我们进一步用scRNA数据正常胰腺(60天),早期(40天),后期(60天除了KPC KPC老鼠6个月大的牺牲)肿瘤组织从多个鼠标PDAC模型(KPC(喀斯特^{LSL−G12D / +}Trp53^{LSL−R172H / +}Ptf1a^{Cre / +}),断裂韧性(喀斯特^{LSL−G12D / +}Ink4a^{fl / fl}Ptf1a^{Cre / +})和KPfC(喀斯特^{LSL−G12D / +}Trp53^{fl / fl}Pdx1^{Cre / +}))量化分数浸润间皮的细胞。我们看到Pdpn-expressing基质细胞是更高的KPfC后期组织(21%)相比,正常和PDAC组织从其他老鼠模型(4 - 9%)。尽管Muc16-expressing间皮的细胞分数很低在所有小鼠组织中,他们的存在在迟到KPfC(~ 4%)和正常组织(~ 7%),但不是KPC(后期)组织。相比之下,epithelioid-like细胞的渗透在所有PDAC末组织更加明显,地位较高的年末KPfC组织。KPC的基质细胞和断裂韧性的组织被认为是处于“激活”状态相对于KPfC PDAC组织由于其超表达的标记同事(Lox) Col3a1, Sparc和白细胞介素6 (图1 g)。

MUC16影响成纤维细胞极化的损失导致肌原纤维组织失调

我们之前努力发现MUC16调节内皮细胞绑定,lymphangiogenesis (NRP2 VEGFC),和粘附完整性(34)。并行,scRNA 15 PDAC组织样本数据还显示高渗透的细胞表达SMC /纤维母细胞标记(PDPN、COL5A1 COL22A1, TIMP3, SPARC, WT1、GFPT2)比例较高的样品/分数MUC16-expressing肿瘤上皮细胞(n = 7) (图2一个)。我们陪同纸KPCM实验模型(KrasG12D / +;Trp53R172H / +;Pdx-1-Cre;Muc16 - / -)表明,淘汰赛的Muc16肿瘤细胞显著减少α-SMA (Acta2)在战乱国家水平。此外,KPCM老鼠的PDAC组织也显示α-SMA +细胞浸润减少,表明瘤内Muc16可以改变基质细胞的损失函数(34)。在myofibroblast Muc16损失造成了相当大的减少(α-SMA +)渗透,我们调查如果Muc16纤维母细胞极化损失与全球变化。KPCM肿瘤组织的转录组(n = 3;25-week-old)没有证明改变panCAF标记Podoplanin (Pdpn),但显示的差别明显对这些基因参与细胞骨架,平滑肌收缩,肌原纤维组织和粘着斑(p < 0.05)相对于同龄KPC (n = 3;同时老)PDAC样本(图2 b)。具体来说,KPCM组织显示减少β-连环蛋白的转录(Ctnnb1)和增加的表达iCAF标记(Tnf, S100a4 Cxcl13)和免疫检查点(Cd274) (p > 0.05)。相反,KPC组织显示,过度的染色法(myCAF)标记(Myh11 Myl9, Des;p < 0.05)。几个经典的肌动球蛋白丝标记的失调的myCAFs表明Muc16有extratumoral myCAFs保持肌原纤维组织的角色。(图2 c, D)。

图2

图2的转录差异MUC16淘汰赛(KPCM老鼠)肿瘤相比KPC PDAC组织表明肿瘤基质的变化环境:(一)箱线图描述细胞的比例表达SMC /纤维母细胞标记样本MUC16-expressing和低频率高的细胞。(B)表达下调基因的富集分析KPCM组织相比,KPC肿瘤显示代表名额不足的途径的SMC维护和收缩。(C)β-连环蛋白的差别,对这些基因的转录KPCM肿瘤明显相对于KPC组织。(D)iCAFs热图说明了基因标记(Tnf, S100a4 Cxcl13), myCAFs (Myh11 Myl9, Des)和免疫检查点(Cd274) KPC (n = 3)和KPCM (n = 3)小鼠显示;KPCM myCAF标记的差别一致对这些组织表明MUC16 CAF极化的旁分泌调节。

TP53之间的相互作用和TP63调节MUC16以及粘蛋白的分子特性

MUC16维护信息的胞质尾粘附完整性由于其潜在的相互作用与ezrin / radixin moesin (ERM)蛋白质交联的肌动蛋白细胞骨架4)。一些蛋白质,保持肌动蛋白组装、信息附着力、粘着斑TP53的直接监管下家庭成员,TP53和TP63 (23,30.)。肿瘤子类型化研究副MUC16 withbasal /鳞状亚型表达倾向于高基质参与(31日)。因此,我们使用了scRNA数据来自15个人类PDAC组织细胞(16635)集中MUC16评价。在这些样本,MUC16表达式只是限于两个上皮肿瘤细胞集群,而其他黏蛋白的表达(如MUC1)更均匀分布在上皮和SMC /肌上皮细胞集群(补充图2 a, B)。MUC1的co-expression指出至少在70%的细胞黏蛋白表达(MUC4 5 ac, 20日和16)。在某种程度上,这些发现也可再生的PDAC细胞系,特别是,强烈MUC16之间的相关性被发现和MUC1蛋白水平(R = 0.68;p = 0.002) (图3一)。

图3

图3MUC16表达肿瘤的分子特征:(一)一个强大MUC1和MUC16蛋白表达之间的相关性被发现在CCLE PDAC细胞系(n = 18)(左);箱线图表示MUC16表达式之间的显著差异MUC1-high (n = 10)和MUC1-low (n = 8)表达细胞系。(B)基因过表达的山脊情节MUC16-expressing单个细胞相对于其他上皮细胞(钙粘蛋白表达)在15 PDAC病人。(C)发现的转录因子编码/ CHEA推定地调节的过表达基因在高MUC16-expressing PDAC肿瘤(TCGA-PAAD;z分数> 1;n = 22)。(D)热图的差异表达基因4分子亚型TCGA-PAAD组(n = 149)后,贝利的分类;注释栏上面说明了不同的亚型,突变,基因拷贝数的状态标志(SMAD4, MYC CDKN2A,喀斯特,TP53)在各自的样品(n = 149)。(E)的重要upregulation MUC16鳞状亚型肿瘤与其他肿瘤亚型(p < 0.05)。(F)MUC16表达式和二变量之间的相关性:a)生存(上),b)的基因组改变(左下),c)肿瘤切除的最大尺寸(右下角),和d)肿瘤状态描述。(G)箱线图显示过度MUC16的组织学分类PDAC和adenosquamous亚型相比IPMN-derived PDAC样本(n = 93;p < 0.05)。(H)日志褶皱MUC16的差异(Log2FC)的表达变化,鳞状标记(SPRR1A、SPRR3A TACSTD2, GPR87, KRT5), cell-junction基因(CLDN4、CLDN23 GJB5)之间TP63 OE SUIT2细胞系相对于控制图形总结。

scRNA-seq分析也揭示了一个独特的转录概况MUC16-expressing细胞相对于其他上皮细胞(钙粘蛋白表达)由于其高依赖糖酵解(HK2、ENO2 ELF3, CLDN3)和展开的蛋白质反应(YWHAZ, ASS1)通路(图3 b;补充图2一个)。尽管MUC16-expressing细胞也表达了其他古典黏蛋白(如MUC20 MUC4 & MUC1)基因的co-expression TP63监管过程像角化(平台、SPPR1A SPRR3, SCEL),紧密连接(CLDN3)和女性抵抗(CEACAM5、CEACAM7 TACSTD2, GPR87)区别的(图3 b;补充图2 c)。符合scRNAseq分析,MUC16 overexpressing样本(n = 22;的z分数> 1)TCGA-PAAD队列(n = 176)显示,超表达的基因受TP63(编码/ CHEA;p < 0.05) (图3 c;补充文件1)。此外,贝利亚型分析使用的模式显示MUC16 upregulation样本分为鳞状分子亚型(26,35)。与其他肿瘤亚型,鳞状上皮肿瘤得分差几个预后指数(肿瘤重量,部分基因改变,组织学分级)并显示标志基因的基因改变的频率增加(SMAD4, MYC,喀斯特,TP53) (图3 d, E;补充文件2)。同样,MUC16-overexpressing TCGA-PAAD肿瘤也注册可怜的几个二尺度(部分基因组改变,肿瘤状态,肿瘤切除的最大尺寸,和生存)(图3 f)。

分析使用的组织学亚型QCMG-PAAD队列(n = 96)指出重大MUC16的过度新创腺癌(n = 70)和adenosquamous (n = 7)癌症相比,PDAC-originated从导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMNs) (n = 12) (图3 g)。由于其庞大的规模、复杂性与转录和转录后调节MUC16是他们给的。然而,最近的工作表明TNF-responsive NFkb MUC16发起人地区结合位点。除此之外,我们显示CTCF的存在和TP63结合位点附近的转录开始MUC16网站(TSS)和启动子区域,分别为(补充文件3)。TP63基因本身包含一个CTCF的启动子结合位点。

进一步检查MUC16和TP63之间的关联,我们使用的异形胰腺肿瘤增长orthotopically植入TP63-expressing SUIT2细胞NOD-scidγ(NSG)老鼠,看到重要的超表达MUC16和其他基底亚型标记(CLDN4、SPRR1A SPRR1B, SPRR3, KRT5, DSG3),和粘附蛋白(DSG3、PKP1 NECTIN1, CLDN4, CDH3, CLDN1) (图3 h)。

我们评估如果TP53功能状态可能会影响MUC16表达式。CCLE-PAAD数据集,我们发现纯合缺失更频繁(Fisher精确p-val = 0.04) MUC16-high (55%;比在MUC16-low (n = 9) 0%;n = 6) (图4一)。虽然这些结合我们之前发现的细胞周期进程和失败TP53-mediated CDK控制MUC16-expressing细胞,目前尚不清楚为什么MUC16 TCGA-PAAD队列在TP53突变体,包括功能突变体(图4 b)。在相同的行,我们之前也表明overexpressing MUC16-cter本身会使TP53允许细胞生存通过JAK2 / STAT3 / GR轴(36)。TP63和TP53共享控制~ 1000常见的基因组结合位点基因参与细胞周期、凋亡、DNA损伤修复途径。除此之外,TP53还直接控制TP63转录剪接的亚型,在TP53 gain-in-function突变所示TP63下调最长的同种型,同种型1(也称为TAp63alpha)。首先,我们看到TP63之间强烈的相关性和TP53表达式TCGA-PAAD队列(ρ= 0.27;然而,p < 0.05),样品具有高表达TAp63alpha比p63-delta只限制在样品的一个子集(n = 34)有更高的发病率删除TP53突变和低表达(图4 c)。相信TAp63控制和调节TP53的一些功能,如细胞凋亡和细胞桥粒维护,尤其是在后者的不足。

图4

图4Tp53, Tp63同步调节MUC16 SOX9,喀斯特信号:(一)MUC16蛋白表达为TP53拷贝数改变在15 CCLE PDAC细胞系(TP53 non-mutant)(左)。TP53的发病率变化在细胞系表现出对(n = 9)和低(n = 6) MUC16蛋白表达(右)。(B)MUC16超表达在喀斯特和TP53突变PDAC样本显示使用箱线图(TCGA-PAAD)(左);MUC16明显不同的表达在不同类型的TP53突变除了WT(右)(C)TAp63比Tp63三角洲与TP53 mRNA表达(左);TP53删除的保留和TP53错义突变是在样品高TAp63 Tp63分别表达率和低TAp63 Tp63δ(右)。(D)TAp63基因敲除小鼠细胞系(TAp63 fl / fl, TP53 + / fl喀斯特)喀斯特,差别显示对这些SOX9、claudins (Cldn4、Cldn3 Cldn6, Cldn7)和胶原蛋白(Col4a3, Col4a4 Col8a1) concomittant upregulation TP53的凋亡信号(TP53 Unc5b Scara3)。(E)p53击倒利用RNA干扰(成分)KRAS-R172H /空鼠PDAC upregulation显示细胞信号转导(ITGB2 ITGA2), EMT (Twist1)和祖亚型相关转录因子(HNF1A GATA6, HNF4A)相对于亲代细胞;barplots log2褶皱的变化表示。

尽管我们发现TP63 MUC16发起人地区结合位点,我们假定RAS-mediated信号可能需要的食物整体粘液性转换,就像我们以前证明(37,38)。评估如果喀斯特信号需要功能TP63 TP53缺乏肿瘤,我们使用小鼠PDAC细胞系喀斯特Trp53^{fl / +}和喀斯特Trp53^{fl / +}TAp63^{fl / fl}基因型,发现转录因子的表达下降(喀斯特、Sox9, Twist1君)和淋巴血管生成/神经周的入侵(Nrp2 Vegfc)喀斯特Trp53^{fl / +}TAp63^{fl / fl}细胞系(p > 0.05)。有趣的是,当我们还指出TP53表达的高表达Trp53^{fl / +}TAp63^{fl / fl}细胞系,我们假设缺乏TAp63α异构体可能还原氧化应激凋亡信号通过TP53 (Scara3、Unc5b Trp53) (p < 0.05) (图4 d)。

失去了TP53放大刺猬、血管生成和粘液性表型

如前面部分所示,我们发现增加基质中介KPfC模型相对于KPC模型。我们还观察到~ 50%的样本TCGA-PDAC队列要么TP53删除突变,杂合的删除,或两者兼而有之。这样的频率TP53 loss-in-function事件更明显的粘蛋白的分子亚型:鳞状上皮(27%)和祖(44%)(图3 d;补充文件2)。重要的是要注意,TP53突变作为占主导地位的消极功能;因此,我们预计,这种突变可能覆盖相关的WT。我们注意到的upregulation刺猬(i.h.h(嘘),血管生成(VEGFA、F11R FOSL1, PDLIM3, EYA1, SFRP1, TJP1, RAC1),糖酵解(HK2 ENO2, ELF3) SMAD信号(SMAD3 SMAD2) NFkB (RELA)和杯状细胞转录信号(SPDEF)丧失改变TP53的样品(补充图3)。我们假设TP53的杂合的损失不仅限于TP53,涉及在染色体拷贝数变化轨迹的水平。这些发现表明,旁分泌血管生成信号由缺氧条件可能使这些肿瘤增加mesothelium-derived成纤维细胞的浸润,明显在KPfC小鼠模型(图1 g)。我们进一步怀疑丧失TP53促进祖表型而不是鳞状TP53-gain-in-function突变体的表型特征。使用p53 R172H /空鼠PDAC细胞接受doxycycline-inducible控制(月)或anti-p53成分(sh1 & sh2),我们展示upregulation (Itgb2 Itga2)信号转导过程,EMT (TWIST1)和祖转录因子(Hnf1a, Hnf4a Gata6) anti-p53成分(sh1 & sh2)细胞系(图4 e)。另一方面,我们也显示之间的相关性DNp63delta和TP53的错义突变,逐步增加TP53的变化被发现的高级质量表达式TCGA-PAAD样本(图4 c)。

MUC16和免疫原性

MUC16显示重要co-expression抗原(肿瘤抗原和自身抗原)和急性期反应物,如转谷氨酰胺酶(TGM2), CEACAMs、c反应蛋白(CRP)和碱性磷酸酶(ALPP) (补充文件1)。我们预测执行绑定的亲和力9 mer肽的基因识别突变在TCGA-PAAD样品使用MHCPan和MHCFlurry和估计sample-wise公认的免疫原性负载。样品至少1确定免疫原性肽(n = 70)显示,贫穷的生存概率(p = n),一个更高比例的TP53突变(p < 0.05),片面的弗希尔精确和MUC16超表达(p < 0.05) (图5一个)。此外,高的PDAC细胞系MUC16 CCLE数据库中的蛋白表达也表现出显著的upregulation免疫调节蛋白(CD274、HLA-F CD74、mx₁,背景,和C3) mRNA和蛋白水平(p < 0.05) (图5 b)。

图5

图5微分MUC16表达肿瘤免疫概要:(一)样本与预测之间的生存概率(左)免疫原性加载显示。样品与检测免疫原性加载显示贫困生存(p > 0.05),更高比例的TP53错义突变(p < 0.05),高MUC16表达(p < 0.05)。(B)免疫调节基因调节MUC16-high mRNA和蛋白水平表达PDAC CCLE细胞系(n = 9)相比MUC16-low表达细胞系(n = 6) (p < 0.05);log2褶皱的变化与绿色和紫色酒吧代表分别信使rna和蛋白质含量(C)选择标记基因表达的热图的莫菲特PDAC队列。前三列注释描述水平相关性估计(斯皮尔曼方法)MUC16和免疫细胞之间的分数(巨噬细胞、NK细胞亚群,和CD8 T细胞)。(D)三角矩阵代表之间的重叠(& Jaccard指数相似系数)标记的PDAC巨噬细胞细胞集群(集群1 & 13),小鼠肿瘤相关巨噬细胞(mTAMs),循环单核细胞、巨噬细胞循环,Hofbauer(胚胎/发展)细胞。

使用散装RNA seq数据,我们观察到过度角化的标记(SCEL SPRR3, PPL SPRR1B) MSLN, MUC1和MUC16样品与基质细胞浸润(激活基质)。此外,这些样本的immunophenotype MUC16 mRNA表达之间的相关性和假定的分数方面表现出显著的免疫细胞子集,特别是巨噬细胞(r = 0.26, p < 0.05)和t调节细胞(r = 0.21, p < 0.05)。相反,MUC16表达与细胞CD8 T细胞的分数负相关(r = -0.18, p < 0.05)和NK细胞(r = -0.21, p < 0.05) (图5 c)。MUC16-expressing肿瘤显示明显高于浸润的巨噬细胞表达mesothelial-specific标记(GFPT2 PDPN, WT1)与成纤维细胞相似,我们试图找出如果这些子集可能共享mesothelium-driven发展途径。与HPA免疫细胞签名相比,PDAC巨噬细胞表现出更紧密的转录相似比循环myeloid-derived发育(Hofbauer绒毛)巨噬细胞细胞CD36的签名因其过度,DAB2 HBEGF, SPP1 (图5 d)(34)。

讨论

PDAC发展引发了一连串的事件包括基质细胞中介,autoantigenicity和粘连形成(39)。最近,不知不觉间皮的可塑性的作用被认为是疾病进展的主要调制器塑造肿瘤基质环境(10)。我们工作了化生的变化由mesothelial-derived PDAC肿瘤细胞和基质。血统的轨迹由KPC基质细胞表现出连续性在转录路径Muc16-expressing间皮的细胞,间叶细胞/肌上皮细胞(Cald1和/或Msln-expressing)和Muc1-expressing类上皮细胞。金属蛋白酶的表达(Mmp2、Mmp14)和细胞周期标记(Ccnd1, Ccnd2 Cdkn2a),骨桥蛋白(Spp1)和压力MYC-regulated核糖体基因(Rps23、Rpl13 Rpl23a, Rpl34)间皮的细胞MUC16表达式间皮的细胞呈负相关。此外,间叶细胞标记物的表达像TGFB1间皮的细胞表达较低的一个子集MUC16表明,细胞循环返回和ECM降解可能可能先于间叶细胞分化。MUC16-expressing间皮的细胞被发现在低数字在人类和滑PDAC组织,我们在此表明,这是由于增加TME-mediated MMP在MMT激活。mesothelial-derivatives MUC16的差别,对这些MT1-MMPs表达式也赞同MUC16-like分泌的增加,其他地方(9)。不同的KPC Muc1-expressing基质细胞组织的出现可能是由于细胞衰老由polycomb复数相关(Onecut2, Muc1、Cd14 Clu), DNA修复(Xrcc4 Clu)和氧化应激(Gsr, Gsto1 Gsta1, Gsta4) (23,40- - - - - -42)。

MUC16-expressing上皮细胞显示一个独特的转录形象相对于其他mucin-expressing细胞由于其超表达的肿瘤抗原(CEACAM5 CEACAM7),角化/鳞状(SPRR3, SPRR1A TACSTD2),和附着力(PARD6B、CLDN4 MYH14, CLDN7, DSG2, LAMC2)。由于co-expression MUC16-expressing鳞状标记的肿瘤,我们解剖TP63之间的关联,TP53 MUC16,我们也发现,TAp63介导SOX9和喀斯特信号像TP53-gain-in-function突变体(图6)。很可能TAp63同步和DNTp63粘住基底细胞扩张,血管生成,细胞衰老和鳞状分化转移。我们已经证明之前,MUC16促进TP63效应器的表达参与血管生成(NRP2、SDC1 PTHLH),因此MUC16可能发挥了重要作用TP53的收敛和TP63通路(34)。

图6

图6插图描绘了TP53基因改变对肿瘤微环境的影响和TP63-mediated肿瘤细胞重新编程。

此外,高渗透的基质细胞,尤其是myofibroblasts表达TIMP3和PDGFR,可能会产生纤维和细胞外基质在MUC16-expressing肿瘤。我们假设这些基质细胞mesothelial-derived由于mesothelial-specific标记的保留,WT1和PDPN。KPCM组织的基因表达谱相对于KPC显示的差别相当大的对这些actinomyosin myofibroblast所需中间纤维分化和细胞间连接完整,支持其更全面的PDAC (extratumoral)的作用。另一方面,增加大量巨噬细胞在MUC16-high肿瘤可能是由于TP53障碍像展示了其他地方,而不是MUC16表达本身(43)。

结论和未来的发展方向

的MUC16-expressing PDAC肿瘤显示高抗原负载,微分极化mesothelium-derived战乱国家,倾向TP53损失增加。这些特征可能累积和反映预后的负担与PDAC MUC16表达有关。此外,基因组和转录失调TP53的家庭成员(TP53和TP63)可能对粘液性信号表现出更广泛的影响由于喀斯特的调制和SOX9活动。这个信号调制也伴随着基质细胞比例的变化和可能的结果改变生物行为和癌症细胞的生长。另一方面,全身肿瘤组织的基因敲除模型的差别MUC16显示对这些细胞骨架,平滑肌收缩,肌原纤维组织和粘着斑途径除了深刻转录的变化成纤维细胞亚型标记。我们期望未来的研究来解决,如果减少myofibroblast极化MUC16缺乏肿瘤结果重塑肿瘤基质对话和MMT受损的过程。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,GSE212777。

道德声明

老鼠研究遵循美国公共卫生护理和使用“服务”的指导方针下的实验室动物的机构批准协议的动物保健和使用委员会,内布拉斯加州大学医学中心。

作者的贡献

手稿RC-V执行数据采集、研究和准备。VD进行数据分析和开发免疫原性in-silico管道。RN进行研究和图的修改。咱独立重新分析数据,验证了管道,和开发的最终报告。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

作者/工作,在某种程度上,是由国家卫生研究院的基金支持(P01 CA217798, R01 CA210637, P30 CA036727,和R01 CA228524)。

确认

我们的工作涉及的手稿协作参与多个UNMC人员和UNO,我们致以感谢生物信息学实验室UNO的成员。分析包含在这个手稿TCGA从根本上依赖于开放数据访问计划,例如,cBioPortal CCLE, NCBI地理。

的利益冲突

某人是一种乐观的诊断和治疗的联合创始人,Inc .剩下的作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2023.1073820/full补充材料

缩写

KPC KrasG12D / +;Trp53R172H / +;Pdx-1 Cre;KPCM KrasG12D / +;Trp53R172H / +;Pdx-1 Cre Muc16 - / -;PDAC,胰腺导管腺癌;,TCGA,癌症基因组图谱;TP53,肿瘤蛋白质53个;MMT, Mesothelial-Mesenchymal过渡。

引用

1。韧皮RC Jr .)捐助M,拉撒路H,纳德勒LM,科尔文RB, Knapp RC。反应性的单克隆抗体与人类卵巢癌。中国投资(1981)68:1331-7。doi: 10.1172 / JCI110380