Atractylenolide我抑制EMT和增强的抗肿瘤效应cabozantinib在前列腺癌通过针对Hsp27

1。介绍

前列腺癌(PCa)是一个男性泌尿生殖系统恶性肿瘤,容易发生骨转移(1)。潜在的具体目标是很难开发靶向药物和临床治疗(2,3)。

热休克蛋白(休克)发挥重要的生物作用在前列腺癌分子监护人参与发病机理、诊断、治疗和预后的各种肿瘤(4,5)。Hsp27被认为是类似的生物标志物前列腺特异膜抗原(6)。其中,增加热休克蛋白家族成员Hsp27的表达与前列腺癌去势抵抗(7)。Hsp27促进耐药性、入侵和骨转移,使前列腺癌更难以治疗(8)。Hsp27涉及不仅在细胞热休克反应,而且在氧化或化学压力(9)。Hsp27参与肿瘤浸润和转移的过程中,和它的功能被越来越多的关注。在肝细胞癌(HCC), shRNA-mediated Hsp27沉默可以减少扩散,迁移和入侵肝癌细胞(10)。Konda et al。(11要求Hsp27)证实,致癌基因细胞生存和Hsp27可能干扰靶向治疗的效果。因此,针对Hsp27在前列腺癌可能是一个很有前途的肿瘤治疗策略。

ATL-1是一种倍半萜烯内酯化合物从粉末中提取白术macrocephala,菊科,抗炎和抗肿瘤活动(12- - - - - -16)。ATL-1对白血病有显著的抑制作用,膀胱癌和黑色素瘤(17)。最近的研究表明,ATL-1可以增强的敏感性卵巢癌紫杉醇通过阻断TLR4 / MYD88-dependent信号通路(18)。然而,很少有研究对前列腺癌ATL-1的抗肿瘤效应,及其分子机制仍不清楚。因此,本研究调查的分子机制ATL-1抑制前列腺癌细胞的扩散。

在这项研究中,ATL-1人类前列腺癌细胞的影响进行了研究。阐明ATL-1机制抑制前列腺癌细胞的扩散通过检测细胞活力和细胞凋亡的变化。这项研究提供了一个依据ATL-1的临床应用和发展的一个新想法其他药物治疗前列腺癌。

2。方法

2.1。生物信息学分析

通过使用人类的蛋白质图谱(http://www.proteinatlas.org/)为目的的数据库选择Hsp27基因搜索。前列腺癌肿瘤类型。分析Hsp27的表达在前列腺癌组织。同时,单细胞测序的结果Hsp27在前列腺组织分析人类蛋白质图谱(http://www.proteinatlas.org/)。由LinkedOmics中的Hsp27基因进行分析(http://www.linkedomics.org/login.php)。去KEGG功能富集分析Hsp27基因中的进一步分析。

2.2。细胞培养

前列腺癌细胞DU145和曲泽从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)和接种rpmi - 1640中含10%胎牛血清(Gibco,生活技术,罗克维尔市,医学博士,美国)。传统文化和通过在37°C, 5%二氧化碳培养箱(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。

2.3。细胞转染

对数生长期的细胞,而细胞转染的指令Lipofectamine 2000转染工具包。细胞分为:空白组(空质粒)、Hsp27超表达组。DU145曲泽细胞被播种到6-well板块在2×10⁵/好。后添加Hsp27超表达质粒,中了6 h。转染48小时后,这些细胞被洗3次与PBS和胰蛋白酶化收集的细胞。质粒转染的影响被qPCR检测方法。

2.4。中存在

收集验证了转染细胞,提取总RNA提取的RNA严格按照指令和反转录相关工具(豆类生物技术有限公司,大连,中国)。很快reverse-transcribe成互补DNA(互补)。严格按照存在指令,GAPDH是用作检测内部参考。三个复制井设置为每个示例,最后20μL体积的反应系统。其中,2μL逆转录产品,10μL SYBR绿色混合1μL正向和反向引物,和6μL的水。反应条件是95°C 30年代,60°C 30年代,72°C 45 s,共有40个周期,并为5分钟72°C。HSP27、F: 5“-CAGTCCAACGAGATCACCATC-3”和R;5“-CAGTCTCATCGGATTTTGCAG-3”。bcl - 2 F: 5 -ATGCCTTTGTGGAACTATATGGC-3, R: 5“-GGTA TGCACCCAGAGTGATGC-3”。伯灵顿,F: 5 ' -TGAAGACAGG GGCCTTTTTG-3’, R: 5 ' -AATTCGCCGGAGACACTCG。钙粘蛋白F: 5′-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3′, R: 5′-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3′。 Vimentin, F: 5′-GAG AACTTTGCCGTTGAAGC-3′, R: 5′-GCTTCCTGTA GGTGGCAATC-3′. GAPDH, F: 5’-GGTGAAGGTCGGAGT CAACG-3’, R: 5’-CAAAGTTGTCATGGATGCACC-3’. The relative expression of target gene mRNA was detected by 2^-ΔΔCt方法。实验进行了3次。

2.5。由MTT测试

72 h文化后,添加20μL MTT (5 g / L) (Beyotime、上海、中国)解决每个好,分别。4 h后上层清液被孵化器孵化,和150年μL DMSO (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)被添加到每个。沉淀的溶解是10分钟在室温下颤抖,和吸光度由标仪探测到490海里。细胞增殖活性(%)=实验组吸光度/空白对照组吸光度×100% (MultiskanEX,实验室系统,芬兰赫尔辛基)。

2.6。TUNEL实验

细胞接种在polylysine-coated细胞玻璃盖玻片的密度1×10⁶细胞/毫升。孵化24 h在恒定的温度和湿度。治疗后,固定用4%多聚甲醛在室温下30分钟。孵化与H₂O₂在甲醇15分钟。接下来,0.1% Triton x - 100柠檬酸钠渗透的解决方案是孵化10分钟2 - 8°C。孵化后,TUNEL染色溶液(Beyotime、上海、中国)准备根据TdT)的比例(1μL)和荧光素标记的dUTP解决方案(9μL)。然后,50μL TUNEL染色的解决方案是添加到每个样本。孵化后37°C 1 h,每个样本添加30μL DAPI染色解决方案5分钟。细胞用PBS洗净后,在黑暗条件下在荧光显微镜下观察。凋亡细胞显示蓝染色后荧光。每组凋亡细胞的比例计算和分析的统计方法。

2.7。统计分析

SPSS 20.00软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)被用于统计。测量数据被表示为平均值±标准偏差。比较两组是由两个独立样本T检验。比较多个组是由单向方差分析。p< 0.05被认为是统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。Hsp27的表达在前列腺癌和功能富集分析中的基因

人类的蛋白质图谱数据库用于分析Hsp27的表达变化paracancer前列腺癌组织和肿瘤组织。免疫组织化学染色结果表明,Hsp27有较高的阳性表达率在前列腺癌肿瘤组织相比paracancer组织(图1 a, B)。中的Hsp27基因在前列腺癌进行了分析通过LinkedOmics数据库网站(图1 c)。去KEGG Hsp27的功能富集分析中的基因进行了进一步的分析。功能富集分析的结果表明,该通路的功能Hsp27中的正相关的基因主要富集在肿瘤耐药性,氧化磷酸化和细胞代谢(图1 d)。富集分析显示Hsp27co-expression呈正相关基因主要影响细胞能量代谢过程,细胞应力纤维束,细胞定位等。图1 e)。

3.2。单细胞测序的结果Hsp27在前列腺组织

结果表明,Hsp27主要是表达在前列腺腺体细胞、基底前列腺细胞和泌尿道上皮细胞(图2一个)。的结果图2 b显示,Hsp27广泛参与多种细胞功能。包括b细胞、巨噬细胞、t细胞、nk细胞等等。的结果图2 c表明,Hsp27也会影响成纤维细胞的功能。图2 d显示,Hsp27主要表达在细胞质中,也影响细胞骨架。

3.3。Hsp27的影响过度DU145和曲泽细胞生存和凋亡

存在分析Hsp27 DU145和曲泽细胞稳定转染空载体(DU145和曲泽模拟)或人工Hsp27 (DU145和曲泽Hsp27)。结果表明,Hsp27 mRNA的表达水平显著增加在转染细胞(图3一)。细胞治疗Hsp27超表达质粒,和细胞生存能力被MTT试验检测。结果表明,超表达Hsp27显著增强DU145和曲泽细胞活动(图3 b)。进一步研究Hsp27在DU145的影响和曲泽前列腺癌的细胞,细胞凋亡被TUNEL分析检测。显示在图3 c,凋亡细胞的比例Hsp27-treated细胞与对照组相比显著降低。PARP apoptosis-related基因的表达水平caspase-3,伯灵顿和bcl - 2在DU145曲泽细胞overexpressing Hsp27和模拟细胞中存在进行了分析。后结果表明,Hsp27过度,caspase-3 PARP和伯灵顿表达水平下降,而bcl - 2表达水平调节(图3 d)。的结果图3 h表明,Hsp27 co-expression负相关的钙上皮标记。细胞实验还表明,过度的Hsp27抑制钙粘蛋白的表达。Hsp27的co-expression呈正相关,间叶细胞波形蛋白。细胞实验结果还表明,过度Hsp27上调波形蛋白的表达(图3我)。

3.4。抑制ATL-1 Hsp27的细胞存活率和诱导细胞凋亡减少

结合这些结果,推测Hsp27扮演重要的角色在DU145和曲泽细胞的恶性发展。Hsp27的表达水平检测到存在。在细胞治疗ATL-1, Hsp27表达下调(图4一)。在治疗人类前列腺癌DU145和曲泽细胞ATL-1 72 h,细胞生存能力被MTT试验检测。结果表明,ATL-1可以显著抑制DU145曲泽细胞活动(图4 b)。DU145细胞凋亡和曲泽细胞被TUNEL检测试验。有几乎没有对照组凋亡细胞。与对照组相比,凋亡DU145和曲泽ATL-1细胞治疗组显著增加(图4 c)。此外,进一步的检测表明,ATL-1治疗后,caspase-3 apoptosis-related基因的表达水平,PARP和伯灵顿调节(图4 d-f)。bcl - 2抗凋亡基因的表达水平的降低ATL-1治疗后(图4 g)。这些结果表明,ATL-1可以抑制增殖和诱导凋亡的DU145并通过Hsp27曲泽细胞。此外,我们分析了影响ATL-1 EMT的标记。细胞实验的结果表明,钙粘蛋白的表达上调DU145 ATL-1治疗后和曲泽细胞(图4 h),而波形蛋白的表达下调(图4我)。

3.5。ATL-1抑制Hsp27提高cabozantinib的抗肿瘤效应

药物组合的优势降低化疗药物的副作用。这个项目分析ATL-1是否有协同效应与cabozantinib对抗肿瘤。MTT试验表明,ATL-1和cabozantinib抑制DU145曲泽细胞活动。然而,细胞活性下降后的最高学位ATL-1和cabozantinib治疗组(图5一个)。细胞凋亡的研究结果表明,联合ATL-1和cabozantinib组细胞凋亡率最高(图5 b)。Apoptosis-related基因检测结果表明,caspase-3, PARP和伯灵顿表达水平最高的ATL-1 + cabozantinib集团(图5汉英)。bcl - 2的表达水平是最低的ATL-1 + cabozantinib集团(图5 f)。ATL-1结合cabozantinib显著调节钙粘蛋白和抑制波形蛋白表达(图5 g, H)。

3.6。Hsp27调节eIF4E和介导细胞的保护

Hsp27在前列腺癌细胞,抑制细胞凋亡对eIF4E通过其监管的影响。因此,我们分析了在eIF4E ATL-1治疗的效果。EIF4E DU145和曲泽细胞稳定转染空载体(DU145和曲泽模拟)或人工Hsp27 (DU145和曲泽Hsp27)分析了使用中存在。结果表明,eIF4E Hsp27过度后表达上调(图6)。随后,eIF4E曲泽和DU145细胞的表达水平存在ATL-1处理进行了分析。结果表明,eIF4E ATL-1治疗后下降的表达水平(图6 b)。细胞的可行性DU145曲泽模拟和DU145曲泽Hsp27细胞接受EIF4E-SiRNA和cabozantinib被MTT分析量化。结果表明,Hsp27无法改变细胞的敏感性cabozantinib eIF4E沉默时(图6 c)。我们使用人类的蛋白质图谱数据库分析eIF4E免疫组织化学的变化在人类前列腺癌组织。结果表明,eIF4E人类前列腺癌肿瘤组织中高度表达(图6 d)。

3.7。超表达EIF4E促进耐药性的前列腺癌

通过地理数据库我们下载的开源数据(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE17451EIF4E-KI) (图7)。进一步分析去KEGG功能富集分析前列腺癌后EIF4E超表达。功能富集分析的结果表明,过度的EIF4E增强细胞增殖,细胞迁移和血管生成(图7 b)。此外,前列腺癌耐药后增强upregulation EIF4E (图7 c)。这个分析的结果与本研究的结果相一致。这进一步证明了本研究的理论假设。

4所示。讨论

前列腺癌有高度的恶性肿瘤和复杂的发病机理(19)。十分重要的临床意义研究前列腺癌的发病机制为其诊断、治疗、预后和疗效评估(20.)。研究发现,许多中药可以影响前列腺癌的生物学过程,抑制复发、转移和预后的前列腺癌密切相关(21,22)。

ATL-1属于倍半萜烯内酯,是我(atractylenolide的主要活性成分之一13)。研究发现,ATL-1具有较强的抗肿瘤作用白血病(12),膀胱癌(13)和黑色素瘤(14)。然而,很少有研究的抗肿瘤效应ATL-1在前列腺癌和抗肿瘤的分子机制尚不清楚。本研究的目的是探讨ATL-1对PCa的迁移和入侵细胞的影响及其机制。入侵和转移能力的两个基本特征是恶性肿瘤,和PCa进步阉割抗前列腺癌(CRPC),两个重要的表演。ATL-1还可以抑制细胞的浸润和转移。

TUNEL分析结果表明,积极的所有ATL-1治疗组的细胞凋亡率增加,表明ATL-1能促进细胞凋亡,进一步证明ATL-1在PCa的抑制作用。bcl - 2、Bax信号通路是一种典型的细胞凋亡信号,调节细胞凋亡的许多肿瘤细胞(23,24)。在这项研究中,ATL-1机制调节bcl - 2、Bax信号通路在肿瘤细胞进行了研究。ATL-1可能促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤的生长通过调节相关蛋白bcl - 2、Bax的表达信号通路。Hsp27在调节中起着重要的作用的发生、发展、转移、凋亡和耐药性的肿瘤,可以作为疾病的预后不良的指标。抑制Hsp27可以反向epithelial-mesenchymal转换(EMT) (25,26),减少基质金属蛋白酶(MMP)的活性,并抑制增殖、迁移和入侵的肿瘤细胞(27)。Hsp27也是integrin-linked激酶(家族)的目标,促进膀胱癌细胞的迁移(28)。此外,Hsp27超表达与上皮卵巢癌腹膜转移(29日)。在这项研究中,ATL-1对肿瘤转移的抑制作用与Hsp27在前列腺癌细胞。Hsp27的表达及其在前列腺癌细胞增殖能力减少ATL-1对待。随后,cabozantinib测试在前列腺癌的抑制作用存在ATL-1细胞系。与对照组相比,ATL-1结合cabozantinib减少细胞增殖和细胞凋亡明显增加。

Hsp27参与SGC7901细胞耐药性的研究者用耐药菌株,这是一个重要的分子机制诱导细胞的多药耐药性,并可以作为临床治疗目标改善胃癌患者对化疗的敏感性(30.,31日)。在这项研究中,我们还发现ATL-1靶向抑制热休克蛋白Hsp27增强的抗肿瘤效应cabozantinib在前列腺癌化疗。

5。结论

在这项研究中,沉默Hsp27和ATL-1可以抑制PCa的增殖和诱导凋亡的PCa在体外。ATL-1可能是有前途的药物治疗抑制Hsp27的PCa。需要更多的研究来阐明如何在PCa ATL-1调节Hsp27的表达。此外,ATL-1是否还可以调节Hsp27的表达在活的有机体内还有待进一步研究。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)中可以找到这篇文章/补充材料。

道德声明

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作者的贡献

ZT型设计的研究。PQ进行实验和分析数据。PQ进行了数据分析。PQ和ZT型写论文的初稿,所有作者的贡献。所有作者的文章和批准提交的版本。

的利益冲突

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