子宫内膜癌的侵袭性细胞系的雌二醇,被传统医学在临床相关的剂量Guizhi涪陵

1介绍

子宫内膜癌(EC)来自细胞的过度增殖和传播从子宫壁,构成全球最常见的妇科恶性肿瘤,第六女性最常见的癌症,影响大约每100000名妇女(171,2)。这些癌症是由子宫内膜腺体细胞和子宫癌症病例占75 - 80% (3,4)。子宫内膜癌历来分为类型I (endometroid)和II (non-endometroid)根据临床、病理和分子特性,以及病人的预后(3,5)。I型endometroid肿瘤与无对手的雌激素作用,高体重指数(BMI)、激素receptor-positivity和子宫内膜增生,更有利的预测。相比之下,II型子宫内膜肿瘤或正常BMI较低有关,消极的激素受体状态,子宫内膜萎缩,较差的预测(5)。Bokhman分类方案已用于电子商务研究和一般为低品位endometroid癌症仍然是有效的;然而,在优质endometroid和浆液性癌,重叠的组织学特性躲避这种传统分类方案(6)。当前视图承认EC与多样化的形态,包括一组异构的疾病临床和遗传特性。

基因组分析endometroid、浆液性和混合endometroid和编制的浆液性肿瘤癌症基因组图谱研究网络(TCGA) 2013年(7)支持电子商务的分类分为四个亚型:第1类:钢管(聚合酶ε核酸外切酶域突变肿瘤的特点是高突变率PTEN,PIK3R1,PIK3CA,FBXW7和喀斯特相关基因,更有利的预测;二班:MSI (Microsatellite-instable (hypermutated)],包括低品位endometroid肿瘤显示突变率高、微卫星不稳定性喀斯特和PTEN突变;3班:补偿中子测井(人类基因组低)肿瘤也被称为endometroid亚群体的变异率低品位较低的肿瘤和频繁CTNNB1突变;类4:人民币(人类基因组高)肿瘤也称为“浆液性亚群体”包括浆液性、混合,以及一些三年级endometroid肿瘤,复发性的特征TP53突变和糟糕的结果。Travaglino et al。(荟萃分析的研究8)表明,菲戈(国际Gynecologie联合会et d 'Obstetrique)类别定义为等级I和II(少于50%分化腺组织)掉进了补偿中子测井和MSI组有利的结果,而菲戈三级(超过50%腺组织和分化)掉进了极点,CNH组预后较差。

我们的研究利用两个子宫内膜癌细胞系:(我)石川属性菲戈年级我(低级)endometroid癌细胞;和(2)mfe - 280与属性的菲戈三级(高级)endometroid癌细胞。石川细胞系最初成立的endometroid癌症从39岁的绝经前妇女,和已被证明表达雌激素和孕激素受体(9)。根据Expasy Cellosaurus数据库,石川细胞系(CVCL_D199)PTEN突变,MSI TGCA-based分类一致。mfe - 280细胞系来源于复发,低分化从78岁的绝经后子宫内膜癌患者(10)。基于Expasy Cellosaurus数据,mfe - 280细胞系(CVCL_1405)TP53基因突变,CNH TGCA分类一致。

endometroid癌症的病理特征与条件,促进雌激素anti-proliferative行动优势当选的孕激素,例如多囊性卵巢综合征的情况下,未产妇,激素替代疗法,肥胖、高血压和葡萄糖耐受不良(代谢综合征)(3),所有可能采取行动增加子宫内膜肥厚(11)。孕激素不足已被建议作为一个关键组成部分的风险增加endometroid癌症患者的相关危险因素的雌激素替代疗法或肥胖,肥胖是更紧密地与低品位的风险比优质肿瘤(12,13)。Endometroid癌症通常是由独特的在早期诊断绝经后子宫出血的症状(14)。结果改进的如果及时开始治疗(3,15),但可用的治疗方案的有效性仍然有限。一线治疗是手术(切除子宫和卵巢)(15)虽然这并不排除复发,妥协生育率和生育能力随着更年期的症状由于切除卵巢会加剧心理和性痛苦(16)。选择生育爱惜使用化疗,放疗,黄体酮治疗将受益于更多的临床试验数据建立长远利益与怀孕相关的结果。尽管合成孕激素可以有效的早期阶段和低级的癌症(特别是17),大部分患者未能实现完整的反应并显示癌症复发(18,19)。联合疗法(如无线电和化疗)可以限制区域内传播的器官,但仍然不能控制广泛转移或提高整体生存,尤其是在高级别肿瘤患者和广泛的子宫肌层的和淋巴血管侵犯(15)。非手术和无毒的生育能力保留治疗方案是必要的。

一个很有前景的候选药物干预是中国传统医学,Guizhi涪陵(这里称为涪陵),一个草本提取物与药用价值首先指出在第三世纪的汉代张医师仲景涪陵用于治疗痛经(20.)。涪陵一直探索治疗子宫内膜异位,慢性炎性疾病,脑缺血、再灌注损伤、慢性痛经,子宫肌瘤(21,22)。抗肿瘤效应涪陵已确定的癌症包括膀胱(23)、肝细胞(24)和颈(21)。我们的分析发表的文献确定有限数量的研究测试了涪陵和候选信号通路的影响在生殖障碍的动物和细胞模型;对此进行了总结表1。

之前的研究表明治疗高剂量的涪陵导致细胞死亡(表1),同时减少侵袭性,可能是由于间接损失的细胞生存能力。高剂量的小鼠模型的涪陵卵巢癌抑制肿瘤生长和远处转移,并减少了在体外卵巢癌细胞的增殖和侵袭性(25,28)。在乳腺癌,涪陵的抑制细胞入侵是未知的;然而,高通量筛选(高温超导²)分析基因表达后暴露在涪陵建议PI3 / Akt(参与的可能性29日),一个肌动蛋白改造途径参与细胞的能动性。宫颈癌海拉细胞接受低剂量的涪陵显示抑制细胞死亡,作为总结表1。被忽视的角色低剂量的涪陵限制入侵细胞的扩散和转移等过程值得进一步探索。

涪陵的有利影响子宫内膜异位已经被人类临床研究支持。涪陵治疗后子宫内膜异位症复发的风险下降了10个随机临床试验的荟萃分析,是涪陵的管理结合标准anti-progesterone疗法米非司酮(RU486) (32)。治疗组合不仅降低了副作用的风险与RU486(不规则阴道出血,潮热、肝功能异常),但也改善妊娠结局(32)。涪陵目前正在调查在澳大利亚新西兰的注册临床试验(ACTRN12619000807156)作为“一个临床试验,以测试一个修改传统中药治疗子宫内膜异位症的”(33,34)。在这个实验中,子宫内膜异位患者正在接受六个涪陵(Gynoclear)胶囊(每天3.3克)口服,连续12周。在承认涪陵组件及其药物处置和新陈代谢仍有待定义,我们可以仍然作为起点估计平均成年女性(~ 50升的体液),系统性摄入40毫克/公斤可以大致估计的有效剂量每天大约70µg /毫升。虽然不是为了给出定论,这估计提供了一个有用的起点为框架剂量测试实验工作调查涪陵的生物学机制的行动。

子宫内膜异位和子宫内膜癌的共同特性的分子发病机制、增生和抗细胞凋亡(35- - - - - -37)。然而,令人惊讶的是涪陵对子宫内膜癌的影响以前没有评估。在这里工作评估与广泛的涪陵剂量治疗两个等级的EC细胞系。这里使用的低剂量涪陵用于估计相关在活的有机体内人类子宫内膜异位的临床研究;所示的高剂量相当于那些之前工作杀死各种生殖癌症细胞类型。结果这是第一个表明涪陵non-cytotoxic较低剂量是非常有效的抑制剂的侵袭性高,低档子宫内膜癌细胞。这些影响是一致的建议涪陵子宫内膜异位症患者的临床益处。

涪陵显示了临床管理承诺作为一种新颖的兼职低品位和优质的子宫内膜癌,但等待功效测试证实这个想法在活的有机体内。

2材料和方法

2.1化学药品和试剂

杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM # 12430),胎牛血清的边后卫,GlutaMAX™(# 35050061), penicillin-streptomycin(# 15070 - 063),苯酚red-free DMEM / F12(# 21041025)从默克公司购买(Sigma-Aldrich;澳大利亚悉尼新南威尔士)。17β-estradiol (e8875 - 250毫克;将这里称为雌二醇)、合成孕激素(P0130-25G),雌激素受体拮抗剂,ICI182,780(129453-61-8)和孕激素受体拮抗剂米非司酮,将这里称为RU486 (M8046)从默克公司获得。从牛胰腺胰岛素(I6634-25mg)也来自默克。

2.2细胞培养

石川3-H-12-Luc (JCRB1579石川,购买2019年1月在通道4)和mfe - 280 (ECACC 98050131,购买2021年1月通过68)细胞系来源于CellBank澳大利亚(https://www.cellbankaustralia.com;澳大利亚新南威尔士州癌症研究所)。细胞培养是保持re-animation < 6个月后,证实为支原体阴性使用MycoStrip™测试套件。乳腺癌细胞系T47D(雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)阳性细胞株最初从54岁来自胸腔积液患者乳腺癌浸润(38,39)慷慨提供的式样Hickey副教授,罗马爵士米切尔癌症研究实验室、阿德莱德医学院。三重阴性乳腺癌细胞株mda - mb - 231 D阿德尔森教授所提供的慷慨,阿德莱德大学。

石川细胞在DMEM补充维持10%的边后卫,100单位/毫升每个青霉素和链霉素,和GlutaMAX™(2毫米)。mfe - 280细胞在DMEM / F12补充维持10%的边后卫,100单位/毫升每个青霉素和链霉素,和0.005毫克/毫升胰岛素。24小时用类固醇激素治疗之前,酚红的培养基是改变自由DMEM / F12 (21041 - 025;ThermoFisher科学、Tullamarine维克澳大利亚)补充10% heat-inactivated charcoal-stripped的边后卫(CS-FBS)准备如前所述40)最小化pseudo-estrogenic的边后卫和酚红的影响41,42)。

2.3涪陵准备

涪陵胶囊(商品名Gynoclear)从Metagenics购买澳大利亚(昆士兰),开了在一个无菌的环境。涪陵粉含量是溶解在车辆二甲亚砜(DMSO)创造一系列的2500 x股票的解决方案(0.25 - 7.5 g / ml在DMSO),进而稀释1:2500到文化媒体最后剂量实验测试。对照组治疗和vehicle-treated (0.04% DMSO)。Gynoclear胶囊包含Carthamus tinctorius(红花)肉桂(桂皮),茯苓(Hoelen),芍药属suffriticosa(牡丹),芍药(牡丹)92毫克每丹参(红色sage)在90毫克,大致相等的比例由干重(34)。

2.4定量实时聚合酶链反应

实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)是用来量化雌激素receptor-α基因(ESR1)雌激素receptor-β基因(ESR2)和孕激素受体基因(PGR)转录水平。激素受体阳性乳腺癌细胞系T47D作为积极的控制,而PSMC4和IPO8被用作2 ddct标准化(管家基因43)。两个独立的实验完成了三个复制。被使用的引物ESR1= F: GGAATGATGAAAGGTGGGATACG R: GCATCCAACAAGGCACTGAC、产品长度= 221个基点,退火温度;60°C。ESR2= F: GCTCGCTTTCCTCAACAGGT R: TGGGCAAGTATAATGGCTTGCAG、产品长度= 130个基点,退火温度:60°C,PGR= F: AGGTCTACCCGCCCTATCTC R: AGTAGTTGTGCTGCCCTTCC、产品长度= 198,退火温度:60°C, IPO8 = F: GGTGGGGTGTGAGGTAATCC, R: ACTGGTTGAGCTCGTTCTCG,产品长度;201个基点,PSMC4 = F: TGGAGGTGCAGGAGGAATACA, R: CTGTGGTAGAGCCCACGATG。产品长度= 162个基点。短暂,RNA提取细胞系使用RNeasy工具包(试剂盒,猫。74004)按照制造商的指示。RNA在30µl核糖核酸酶的筛选了自由水。量化的总RNA是由Nanodrop分光光度法,和完整性检查通过260/280和260/230波长比率。18岁和28 s波段的完整性评估在2%琼脂糖凝胶电泳分离的rna。1.5µg RNA是反向转录cDNA使用QuantiTect cDNA转换工具包(猫。205331)按照制造商的协议。短暂,RNA与gDNA擦缓冲区被加热3分钟42°C。添加RT和RT底漆后最后的20µl, RNA在42°C孵化15分钟和95°C 2分钟,立即放在冰。qPCR于3000年完成了转子基因。反应进行了最后的10µl 5µl赛博绿色(KK4601 Kapa主混合),1µl(1:10 0稀释)cDNA、1µl 10毫米正向和反向引物混合物和3µl核糖核酸酶游离水。qPCR反应涉及初始变性在95°C 3分钟紧随其后40 95°C的周期为3秒和结合退火扩展60°C 20年代。分析是使用标准的2 ddct方法完成的。IPO8和PSMC4作为参考的基因。反应在两个独立的实验进行了一式三份。

2.5免疫印迹

蛋白质提取T47D(积极的控制),mda - mb - 231(负控制)(44,45使用里帕),石川和mfe - 280细胞裂解缓冲和1%的蛋白酶抑制剂。蛋白质是量化使用皮尔斯™660海里蛋白质测定试剂(22660)。简单地说,50µg蛋白质添加到井和分离electrophoretically 10% SDS PAGE和转移到硝酸纤维素(46)。蛋白质和PGR孵化(1:1000 D8Q2J,猫没有。8757、细胞信号、丹弗斯、马、美国)在4°C一夜之间一系列洗涤1 x TBS-T紧随其后。孵化与二次抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白(ab216773 1:5000) IRDye^®完成1 h .α-微管蛋白(ab7291 2µg /毫升)被用来加载控制在同一膜。二次抗体用于α-微管蛋白(ab216772, 0.2µg /毫升)。公关的特异性抗体被公关-乳腺癌细胞系验证,mda - mb - 231 (补充图S1)。

2.6细胞生存能力分析

细胞生存能力评估使用成熟的方法(通过测量代谢活动47)。石川细胞和mfe - 280被镀在96孔板在10³细胞每100年µl DMEM和10%的边后卫。24小时增长后,媒体没有药物,与车辆,或涪陵(从100年到3000年µg剂量/毫升)被添加。24小时孵化后,100µl MTT试剂(M5565从默克公司在无菌磷酸盐缓冲盐水稀释1/10)被添加到每个。细胞被孵化为4.5 h (37°C, 5%的公司₂),然后MTT的解决办法是删除和甲瓒产品于100年解散µl DMSO /。箔覆盖板在室温下搅拌在一个瓶15分钟,然后评估板阅读器(吸光度570海里)。三个独立实验完成了3到4复制。

2.7伤口关闭试验

石川和mfe - 280细胞被镀在3 x 10⁴每口井的细胞和孵化24小时允许增长接近满confluency伤口之前的一代。圆形的伤口是由短暂吸入用无菌的微量吸液管提示按出版协议(48)。井清洗去除碎片;然后媒体没有药物,与车辆DMSO,或涪陵(80 ug /毫升)增加了和盘子被孵化24 h。伤口关闭百分比量化是通过使用图像J (National Institutes of Health);imagej.nih.gov / ij)和GraphPad棱镜(美国圣地亚哥CA)软件来计算最终的伤口区域24小时标准化的初始区域相同的伤口在0 h,按出版协议(48)。三个独立实验完成了5复制。

2.8细胞入侵检测

Transwell入侵进行了使用8µm孔隙过滤器Boyden钱伯斯(康宁# 3422)准备每0.025毫克/毫升的40µl基底膜基质(E1270-10ml,默克公司很多# 087 m4177v) (49)。实验一天,人工基底膜水化与50µl血清媒体1 h在37°C。细胞系生长在T75烧瓶血压得到较好的控制大约60% confluency,然后饿死在媒体有2%血清以前优化时间(30 h石川细胞和15 h对mfe - 280)。采用无血清胰蛋白酶化后,细胞系停牌媒体没有药物,车辆,或涪陵。细胞(2 x10⁵每口井)被添加到上院;众议院含有700 ul媒体有10%作为化学引诱物的边后卫。24小时后孵化(37°C, 5%的公司₂),未侵入细胞cis一侧被轻轻用棉签,反式一边和剩余的入侵细胞与70%乙醇固定,沾0.4%结晶紫和成像。入侵细胞的数量每标准化的视野被数(治疗失明)两个独立的研究人员和平均。荷尔蒙的测试效果,细胞株和最佳剂量的孵化E2(1海里石川细胞mfe - 280和100点),或P4(100海里)48 h。涪陵(80µg /毫升)添加的入侵检测与细胞接种到参议院。ICI182,780 (100 nm)和RU486(1µm)添加治疗与E2或P4前2小时。两个独立的实验完成了两个复制。

2.9球体入侵检测

准备好盘子,polyhema (P3932-10G)涂层解决方案是由0.3克/毫升polyhema晶体溶解在95%的乙醇,动摇了48 h在37°C。96好圆底板块(康宁- 3799)被涂上一层30µl polyhema /在黑暗中,然后暴露于紫外线播种前2小时细胞。大众生产球体癌细胞,石川和mfe - 280细胞系被播种到井的密度5 x10³细胞完全DMEM /毫升,板块在600转离心3分钟,然后在37°C 5%孵化有限公司₂48小时,在冰上冷却15分钟。50µl 250毫克/毫升基底膜基质在DMEM被添加到每个;盘子是离心机(600 rpm在4°C 5分钟)和孵化1 h允许人工基底膜集。在时间为零,媒体不含药物,同等剂量的车辆,或涪陵100µg / ml被添加(50)。延时拍摄图像相同的球状体(0)24、48、72和96 h使用NIS-elements软件(尼康,东京,日本)。参数球体面积、周长、和细胞集群的数量(粒子)传播到周围的基底膜基质环境量化使用NIH图像软件;利率的变化测定数据绘制作为时间的函数和符合简单线性回归。三个独立实验完成了8到9复制。

2.10统计

D 'Agostino-Pearson分布正常测试的测试。单向方差分析是用来评估跨多个组显著差异(相对于车辆控制;p < 0.05),紧随其后因果比较(未配对t检验参数;曼惠特尼非参数;参见图传说)。在箱形图,矩形包含数据值的一半,胡须显示全部,水平线表示中位数的值。平均数据(在x - y情节)平均值±标准偏差(SD)。

3的结果

3.1雌激素和孕激素受体的表达在子宫内膜癌细胞系

雌激素受体的mRNA转录水平(ESR1和ESR2)和孕激素受体(PGR)测定在两个细胞系使用实时定量聚合酶链反应图1。两个EC细胞系表现出低的表达ESR1(图1一个),ESR2(图1 b)相比T47D乳腺癌行作为一个积极的控制。然而,一个相对较高的表达ESR2被发现在mfe - 280细胞相比ESR1。这个发现支持这一事实低品位EC与正相关ESR1地位和更好的预测,而高ESR2表达式(因此减少ESR1来ESR2比)在优质EC与短无病生存和预后不良(51)。的表达PGR信使rna (图1 c在石川细胞株)证实,mfe - 280年,是微不足道的。

蛋白表达的公关亚型PRA和复审委员会评估免疫印迹(图1 d)。蛋白表达PRA和复审委员会确认的石川细胞系但不是mfe - 280中发现。缺乏孕激素受体的表达优质电子商务及其与不良预后的相关性前面描述的(52)。ER和PR EC(损失是一个独立的预后因素53),区分高和低风险组的重要临床指导治疗。

3.2激素调节的可行性和在子宫内膜癌侵袭性细胞系

影响卵巢激素受体信号在石川和mfe - 280细胞的可行性评估使用MTT试验,总结了图2。治疗生理剂量雌二醇(下午1点到100海里)48 h引起细胞系(没有改变在细胞生存能力图2 a, B)。与之前的工作(在协议54),生理剂量的孕激素1海里以上减少石川细胞生存能力图2 c)。相比之下,mfe - 280细胞显示减少生存能力只有在最高浓度,100海里的孕酮(图2 d)。这些数据提供的第一评价激素敏感性mfe - 280细胞。

激素雌二醇和孕酮对石川和mfe - 280细胞的侵袭性量化通过测量transwell入侵通过细胞外基质屏障层(图3)。石川和mfe - 280细胞被孵化的雌二醇和孕酮的浓度(下午1点到100海里)48 h。数据显示在箱形图显示雌二醇的影响人工基底膜侵袭性产生了钟形曲线对石川和mfe - 280细胞。剂量依赖性增加细胞入侵雌二醇的存在显示百分比最大影响100 nm石川和点mfe - 280细胞,和减少响应在更高浓度(图3一)。

石川的孕激素导致剂量依赖性降低侵入细胞1 - 100 nm (图3 b所观察到的),显示效果相应浓度在月经周期(13)。然而,孕激素没有影响mfe - 280细胞的侵袭性(图3 b),或许反映出不同功能或亚型的孕激素受体表达的细胞株(55)。石川细胞治疗与孕激素受体拮抗剂RU486似乎导致小额外的抑制作用但没有影响progesterone-insensitive mfe - 280细胞。米非司酮在石川入侵细胞的抑制作用是支持的事实,当石川细胞治疗1µM米非司酮12 h, downregulation观察与细胞粘附相关的基因(56)。然而,当细胞与100 nM co-treated孕酮和1µm RU486,无显著的变化被视为入侵而孕激素或RU486孤单。Co-treatment mfe - 280细胞孕激素和RU486没有造成重大变化相比,入侵控制(补充图S2)。

Estradiol-enhanced两细胞系侵袭性逆转的雌激素受体(ER)抑制剂ICI182,780 100 nm (图3 c),证明增强的反应是雌激素受体介导的。这个概要文件符合已知的雌激素活动模式描述的女性月经周期,在此期间雌激素对子宫内膜产生最大影响附近的一个上限50点;除此之外,子宫内膜受体浓度变得麻木了,雌激素反应下降的幅度13)。

图片说明入侵响应(对应于数据中总结图3 a - c)所示图3 d, E。石川细胞显示最大1 nM雌二醇入侵,和mfe - 280细胞显示最大入侵在100点。石川细胞孕激素剂量依赖性抑制入侵引起的,但是没有影响mfe - 280年入侵细胞。

3.3涪陵减少石川的侵袭性和mfe - 280细胞通过细胞外基质屏障,并减少运动性

涪陵提取物治疗导致剂量依赖性抑制石川和mfe - 280细胞的侵袭性,以transwell化验量化百分比通过细胞外基质细胞迁移障碍(人工基底膜)在24小时(图4)。箱线图直方图显示两个细胞系(涪陵减少侵袭性图4一按可比涪陵),收益率报50%抑制剂量的58µg /毫升石川和52µg mfe - 280细胞系/毫升(图4 b)。代表性的图片为每个治疗了入侵的结果图4 c。

确定涪陵也抑制了二维表面迁移率在两种细胞系,圆形的伤口是在盘子的融合性的细胞,和伤口闭合的利率被NIH-Image软件分析量化,孵化后80µg /毫升的涪陵或车辆(DMSO) 24 h。涪陵显著地抑制迁移,缓慢关闭伤口在两个细胞系相比控制(vehicle-treated)组(图5)。图片说明伤口闭合所示图5 a, B。伤口关闭(百分比图5 c)计算通过标准化测量伤口面积24 h后孵化的初始区域相同的伤口后立即测量伤口形成(见方法)。

3.4涪陵覆盖estradiol-mediated侵袭性的强化

评估的影响涪陵estradiol-mediated侵袭性的增加,两种细胞系都孵化与雌二醇48 h的存在和缺乏涪陵。涪陵阻塞侵袭性均匀,覆盖其余雌二醇对入侵的影响(图6)。治疗细胞雌激素受体拮抗剂ICI182,780(100海里;与雌二醇治疗前两小时)不改变涪陵的屏蔽效应,表明涪陵抑制子宫内膜癌细胞的能动性独立于雌激素受体拮抗剂。然而,可能的交互与ER-α涪陵,ER-β和新描述的G -蛋白结合雌激素受体gp (57,58)仍未被探索,为进一步的工作提供一个有趣的领域。

孕酮单独屏蔽石川细胞入侵(如上所述)图3)。涪陵的影响应用结合孕激素的抑制入侵测试通过预处理细胞与100 nM黄体酮transwell入侵前48小时化验有或没有涪陵(图7)。涪陵就比独自孕激素在更有效抑制石川细胞入侵(图7基于transwell-migrated细胞(的数量),图7 b)。涪陵显示生成的块级别没有添加剂孕激素的影响;结合涪陵和黄体酮的影响并非不同于涪陵治疗在抑制的能动性。孕激素受体拮抗剂RU486同样没有添加任何显著的影响结合涪陵时,表明涪陵可能作用在途径接近细胞运动性的直接机制,和下游的激素受体信号。

3.5涪陵减少石川的传播肿瘤细胞球体

实体瘤球体群众产生了石川和mfe - 280癌症细胞系,嵌入在一个细胞外基底膜基质环境评估的组织侵袭性细胞集群分布模型。当由球状体石川细胞孵化100µg /毫升的涪陵96 h,癌细胞的扩散速度集群到周围区域与对照组相比显著降低(图8)。图片图8说明石川的健壮的分散细胞,被涪陵。相比之下mfe - 280细胞表现出相对较低的利率的传播核心肿瘤条件下测试(图8 b)。时间流逝的一系列图像允许评估利率出现新的石川细胞集群(粒子)作为时间的函数在文化、和显示明显降低利率在涪陵治疗(图8 c),量化框块每小时的出现率(图8 d)。mfe - 280显示更低的数字(注意规模较小的轴)和涪陵没有明显的影响(图8 e)。

没有差异的区域或增加周边的球状体在0到96 h,比较控制和涪陵治疗(图8 f, G)。相当于增长证实肿瘤细胞的生存能力没有受损,而涪陵强烈阻止能动性,这不是间接受损细胞生存能力的结果。

3.6剂量的涪陵,是有效控制侵袭性不是有毒

涪陵对细胞活力的影响在24小时的治疗评估使用剂量范围从10到3000µg /毫升(图9)。高剂量的涪陵受损细胞生存能力(在500µg /毫升到3000µg /毫升)在石川(图9)和mfe - 280 (图9 b)细胞系。相比之下,涪陵不是低到中度有毒的剂量范围(10µg /毫升到100µg /毫升)被发现(见图4上图)是有效抑制入侵。剂量反应曲线绘制在对数尺度(图9 c)表明,涪陵的剂量对half-maximal减少可行性更高,“碳足迹”是7 - 11倍比需要half-maximally块细胞系侵袭性。

4讨论

子宫内膜癌是一个临床问题,尽管它仍然是处理不当的发生率较高,严重影响女性的生活质量。结果这里支持小说涪陵,可能是一个有价值的兼职,可以用来控制子宫内膜癌通过阻止癌细胞侵入周围组织在低剂量(无毒)。预防癌细胞侵袭性的有效剂量相媲美被人类作为药用补充剂。防止癌细胞扩散的成功可以提高并行标准临床治疗旨在消除原发性肿瘤。

目前治疗子宫内膜癌的选择有限。化疗和放疗目标快速分裂的细胞(59),但造成不利影响等棘手的呕吐,腹泻、免疫抑制和脱发(60- - - - - -64年)。兴趣已经升级传统中药被认为工作通过协同组合的药物在疾病条件下改善结果包括癌症(26,65年),推动消费趋势对补充和替代疗法(66年)。正在进行的研究是行动定义的可能机制。子宫内膜异位症和癌症之间常见的分子和遗传特性(35,37涪陵)促使我们假设可能在子宫内膜癌有益,一个想法,没有我们的知识测试。在这里工作了涪陵的影响在减少子宫内膜癌侵袭性两个细胞系,归类为菲戈成绩我和III (mfe - 280)。石川细胞系(67年progestin-responsive)被认为是一个模型类型的EC (68年)。mfe - 280细胞系更具代表性的复发性和低分化子宫内膜癌抗激素治疗(69年)。

本研究的主要结果是涪陵的示范抑制侵袭性高和低等级的EC细胞,这种效应是实现在剂量估计与那些被用于临床测试和传统。在一个正在进行的临床试验(33,34),患者诊断为子宫内膜异位与涪陵估计为最终接受治疗在活的有机体内剂量的~ 70µg /毫升涪陵,在相同范围内的集成电路₅₀这里定义值(即。,52和58µg/ml Fuling were effective in blocking invasiveness in two grades of EC cell lines (see图4)。临床试验的结果可用时将实质性的利益。

第二个重要的结果,这项工作是控制入侵扩散所需剂量的涪陵没有细胞毒性,建议涪陵(人类使用已经批准)有潜力作为辅助治疗可以抑制EC入侵扩散之前和期间的临床干预措施旨在消除原发性肿瘤。如果成功,将预测使用涪陵作为辅助疗法减少癌细胞逃避和EC复发。之前在活的有机体内涪陵的研究已经进行了子宫内膜异位症动物模型,但考虑到高剂量的涪陵通常管理,结果的兴趣主要集中在细胞死亡(30.),可能不符合生理提出背后机制在人类健康的好处。

这里显示结果的机制涪陵块侵袭性似乎是独立的雌激素和孕激素的途径。涪陵持续抑制入侵在所有情况下,覆盖在细胞系雌二醇的增效作用。雌激素受体拮抗剂ICI 182780添加了一个小但可辨别的级别的抑制涪陵的影响,表明一个累加效应。孕酮(100海里)抑制侵袭性在石川细胞如预期的那样,但涪陵抑制入侵的大小是更大的,而不是co-application逆转的孕激素受体抑制剂RU486。mfe - 280细胞株用于我们的研究没有对孕激素治疗,支持其他工作表明孕激素受体表达下调或产生耐药性逐渐随着等级的EC和贫穷的预测(51,52,70年,71年)。在这里工作了mfe - 280侵袭性被涪陵,突出该代理作为一个新的策略来解决优质候选人,低分化子宫内膜肿瘤不应对常规激素疗法。涪陵在其他的研究中已被证明影响多种细胞内途径在不同癌症类型(表1的差别),包括对这些MMP-9, TGF-βupregulation肿瘤抑制基因。这里使用的细胞内途径受到低剂量的影响及其能动性控制有待定义的链接。

涪陵优点勘探作为一种辅助治疗结合其他EC疗法(72年)。例如,ICI182,780 (fulvestrant)是一种建立fda批准的药物临床使用激素受体阳性转移性乳腺癌(73年),但很少有试验探索ICI182,780治疗子宫内膜癌的功效。欧共体在第一阶段试验中,药物被发现良好的耐受性和完全缓解雌激素使子宫内膜生长(74年)。然而在第二阶段,变化起来,只有0 - 3%的患者表现出一个完整的响应(定义为病变消失)(75年,76年);11.4 - -13%的病人显示部分响应(肿瘤大小减少50%);和29%继续显示稳定的疾病(保持原来的肿瘤大小)(75年)。基于广泛的影响,描述了传统的草药,涪陵可以检测效果增强疗效或减少剂量需要代理,如ICI182,780抵消耐药性,或者等支持性护理在癌症的女性卵巢癌(26)。

醋酸甲羟孕酮迄今为止一直是标准疗法治疗转移性或不实用的子宫内膜癌,并保留生育能力;然而,成功率会很低(15 - 25%)和高复发,部分是由于获得抗孕激素治疗(18,77年,78年)。孕激素受体缺乏优质或转移性子宫内膜癌有效地消除这种治疗晚期癌症患者(52)。六个随机对照试验的荟萃分析显示,激素治疗没有改善晚期或复发的子宫内膜癌患者的生存(70年)。涪陵的可能性可以控制这些耐先进的癌症是一个令人兴奋的前景。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

作者的贡献

概念化和方法论、SK、AV。调查、SK、AV。原创作品草稿准备,SK,唉。Writing-review和编辑,AY, CR。监督,是的,CR。融资收购,唉。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项研究由澳大利亚研究理事会资助(批准号19 arc_dp190101745)啊;阿德莱德大学的研究培训奖学金SK和AV。

确认

我们感谢美国Nourmohammadi先生的技术援助和培训在这项研究中使用的一些方法。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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