原创研究文章

前面。减轻。，14November 2022
秒。营养基因组学
卷9 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fnut.2022.1019259

黑豆中富含花青素的提取物通过脂肪组织中的多基因组作用模式在大鼠中发挥抗糖尿病作用

卡拉Damian-Medina ¹，

德拉甘Milenkovic ²，

尤兰达Salinas-Moreno ^3.，

Karla Fabiola Corral-Jara ⁴，

Luis Figueroa-Yanez ⁵，

Erika Marino-Marmolejo⁶而且

尤金尼亚Lugo-Cervantes ^{1 *}

¹墨西哥哈利斯科州瓜达拉哈拉市，哈利斯科州技术与设计研究与援助中心(CIATEJ)食品技术单元
²美国加州大学戴维斯分校营养学系
^3.国家林业、农业和畜牧业研究所(INIFAP)，瓜达拉哈拉，哈利斯科，墨西哥
⁴Université克莱蒙特奥弗涅，INRAE, UNH，克莱蒙特费朗，法国
⁵工业生物技术单位，哈利斯科州技术与设计研究与援助中心，瓜达拉哈拉，哈利斯科，墨西哥
⁶墨西哥哈利斯科瓜达拉哈拉市哈利斯科州技术和设计研究与援助中心医疗和制药生物技术股

黑豆(BB)是一系列植物生物活性化合物的重要来源，包括多酚，特别是花青素。一些研究支持食用BB与健康益处有关，包括预防2型糖尿病(T2DM)。然而，BB在脂肪组织(AT)上的潜在健康特性的分子机制仍然很大程度上未知。本研究的目的是调查BB摄入的多基因组效应，并确定可能介导T2DM对AT的调节网络。雄性Wistar糖尿病大鼠连续5周食用富含花青素的黑豆提取物。利用RNAseq测定AT、蛋白编码和非编码RNA谱的整体基因表达。使用多种生物信息学工具进行生物功能分析。总体基因表达谱的评估在BB食用后发生了显著变化，406个显著差异表达基因，33个miRNA和39个lncRNA和3个snRNA。功能分析表明，这些基因在调节PI3K信号、NIN/NF-kB信号、胰岛素分泌和内质网(ER)组织等方面发挥重要作用。有趣的是，转录因子如GATA2或POU2AF1被证明可以通过BB提取物直接与多酚代谢物相互作用，或通过与细胞信号蛋白如PKB、AKT或PI3K相互作用来调节其活性，这些蛋白可以控制转录因子活性，从而影响脂肪形成的调节。 Therefore, the constant consumption of an anthocyanin-rich black bean extract may have anti-diabetic protective effects by modulating gene expression, resulting in a promising alternative for T2DM patients.

简介

根据国际糖尿病联合会(IDF)的数据，在过去40年里，2型糖尿病患者的患病率从1.08亿上升到5.37亿。2型糖尿病是一种由于细胞无法对胰岛素作用作出反应而引起的疾病。这种疾病与体重过重及久坐不动而导致的肥胖密切相关(1)．肥胖被认为是一种复杂的慢性进行性疾病，其定义为由能量摄入和能量消耗失衡引起的异常或过度脂肪组织堆积，从而导致轻度、慢性、全身性炎症。饮食是导致肥胖的主要危险因素(2)．2015年在加拿大成年人中进行的一项横断面研究显示，超加工食品消费占每日能量摄入总量的24-73%，与研究人群中较高的肥胖患病率相关(3.)．另据报道，高脂肪饮食和大量摄入红肉(4，5)，以及高糖摄入(6)损害健康，导致肥胖，并增加非传染性疾病(NCD)的风险，如2型糖尿病(T2DM)、痴呆、心肌梗死、中风、高血压、脂肪肝疾病和癌症(7)．一般而言，肥胖与较低的生活质量和预期寿命有关，估计可降低5-20年，具体取决于非传染性疾病的严重程度(8)．

脂肪组织对全身能量平衡起着至关重要的作用(9)，在维持脂质和葡萄糖稳态中发挥重要作用。以甘油三酯形式储存的脂肪倾向于积聚在皮下和内脏的储存库中，增加其大小并产生肥大、增生和全身代谢功能障碍(10)．肥胖与2型糖尿病的主要联系机制是脂肪组织产生的胰岛素抵抗伴随胰腺β细胞胰岛素分泌受损。游离脂肪酸通过MyD88和trif介导的下游通路刺激NF-κB和P38 MAPK信号通路，继而激活脂肪细胞和巨噬细胞中TLR4的表达，增加内质网应激，产生ROS，促进促炎细胞因子的分泌，引发低度全身炎症的初始阶段(11)．脂肪组织分泌的促炎脂肪因子有单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素1-β (IL-1β)和白细胞介素6 (IL6) (12)．肥胖诱导胰岛素抵抗的潜在细胞机制始于系统性TNF-α的增加，TNF-α刺激胰岛素受体底物(IRS) IKK、p38 MAPK、JNK和PKC的活性;损害酪氨酸磷酸化，增加脂肪组织、肌肉和肝脏中胰岛素抵抗的风险(13)．

控制热量摄入、健康饮食和增加体力活动的生活方式改变被认为是成功治疗的根本基础(2)．摄取高蛋白、低血糖指数食物及低脂肪，有助糖尿病患者(9)．此外，最近的研究表明，摄入新鲜水果和蔬菜与降低2型糖尿病的发病率有关。在一项随机对照试验中，已解释并证明富含水果和蔬菜的饮食如何改善血糖和胰岛素分泌(14- - - - - -17)．此外，研究还表明，存在于水果、蔬菜、香料、豆类、食用花卉、蘑菇和药用植物中的生物活性化合物是预防和控制2型糖尿病的潜在候选者(18，19)．

水果和蔬菜是生物活性化合物的丰富来源，特别是多酚类，对人体健康有许多积极的影响。多酚是植物的次生代谢产物，可以防御病原体、疾病、捕食者、紫外线辐射、寄生虫和氧化剂(20.)．多酚是一种天然的抗氧化成分，可防止脂质氧化和氧化酸败(21)．多酚分为类黄酮和非类黄酮;类黄酮分为12组，包括黄酮醇、黄烷醇、黄酮类、黄烷-3-醇、花青素、黄酮、异黄酮和二氢查尔酮。非类黄酮包括酚酸、木酚素和二苯乙烯。摄取多酚后，它们会进行重要的新陈代谢(22)，它们在小肠和大肠的肠上皮细胞开始，然后被吸收进入循环。一旦进入肝细胞，黄酮类化合物中的羟基就会进行葡萄糖醛酸化、甲基化和硫酸化，以便进入血液循环。下一步是它们流入所有器官，最后通过尿液排出。在大肠内，结肠菌群会产生广泛的分解，将原来的多酚结构分解成低分子量的酚类代谢物，这将产生更好的化合物可吸收性，并将其传递到第二阶段代谢(23)．

花青素是水果和蔬菜中含有的红色、紫色和蓝色的亲水色素。最丰富的花青素是糖基化形式的花青素，飞燕草苷，malvidin, peonidin, petunidin和pelargonidin。花青素通常与糖分子有关，通常是葡萄糖，然而，鼠李糖，半乳糖，和芦糖也可以存在。花青素在预防肥胖和糖尿病方面发挥着重要作用。不同的研究表明，花青素一旦被吸收，可以正向调节骨骼肌和脂肪组织中的GLUT4;其他作者得出结论，这些植物化学物质可能会影响胃肠道微生物群，影响宿主健康(24，25)．富含花青素的食物之一是BB。BB的种子颜色主要由花青素和缩合单宁(原花青素)的存在决定。作为BB中发现的主要类黄酮之一，花青素已被证明可以决定种皮的颜色，但也被证明具有生物活性和潜在的健康特性(26)．

BB被认为有助于2型糖尿病的治疗。BB中的花青素具有很强的抗氧化能力，可以抑制自由基并具有抗炎活性(27)．我们之前讲过在网上从这个角度来看，BB中发现的多酚，特别是花青素，可以调节参与T2DM通路不同机制的蛋白质的活性(28)．分子对接结果显示，花青素3-葡萄糖苷、飞鸽素3-葡萄糖苷和佩尼丁3-葡萄糖苷对11β-HS、GFAT、PPARG、PTP、RTKs和PTP具有更强的亲和力，这些蛋白质与调节炎症、胰岛素抵抗、氧化应激、糖脂代谢、胰岛素分泌和碳水化合物吸收等不同生物标志物的机制相关(28)．花青素生物效应的作用模式仅归因于其直接的抗氧化特性。然而，近年来，这些生物活性化合物发挥更复杂的分子作用机制，包括调节基因表达、细胞信号或DNA甲基化(29)．大多数研究使用了有针对性的方法，因此全球机制仍然鲜为人知。

综上所述，本研究的目的是表征BB中富含花青素的提取物的抗糖尿病特性，并使用RNAseq方法破译这些生物活性化合物对糖尿病大鼠模型脂肪组织的作用分子机制。

材料与方法

提取制备

我们之前报道过BB提取物的化学成分(28)．从BB中提取多酚是用最近收获的BB进行的，这些BB被细磨，直到获得面粉的稠度。将面粉与乙醇(99.9%)和盐酸(0.1%)的溶液混合。将混合物在室温下搅拌4小时，并遮盖光线。提取液在13000转/分下离心20分钟，收集上清液，在38°C和90转/分下蒸发，直至乙醇完全除去。提取液在−20°C保存过夜，并在−50°C和250 mBar条件下冻干3天。多酚粉保存在4°C，直到它们使用(28)．

动物实验

动物实验由美国哈里斯科州技术与设计研究与援助中心(CIATEJ A.C.)的实验动物护理与使用内部委员会(CICUAL)根据墨西哥官方标准NOM-062-ZOO-1999批准，该标准涉及实验动物的生产、护理和使用技术规范以及与传染性生物危险废物管理相关的NOM-087-ECOL-SSA1-2002。此外，应用了《生物操作规程》(UEP-PNO-BIO-001)和《动物实验实验室规程》(REG-SM/BM-01)。从Envigo RMS S.A de C.V.购买雄性Wistar大鼠24只，约150±20g，置于标准环境条件(温度25°C，相对湿度60±5%)下12 h光/暗循环的SPF屏障环境中，在驯化阶段免费提供水和标准饮食(Envigo Teklad T.2018S.15)。驯化2周后，将大鼠随机分为3组(n= 8)，即HE(未治疗的健康组)、BB (260 mg/kg/天黑豆提取物治疗的诱导T2DM动物)和DB(该组灌胃1ml /天水)诱导T2DM动物。试验期间，高脂组饲喂标准饲粮，BB组和DB组饲喂碳水化合物含量为42.7%、脂类含量为42%、蛋白质含量为15.2%的高脂饲粮(Envigo Teklad TD.06414)。HFD喂养5周后，大鼠禁食12小时，不限量饮水。HE组大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液。Skovsko报道的方法支持我们的T2DM归纳，(30.)，长时间给药HFD联合单次低剂量链脲佐菌素对胰腺b细胞产生部分损伤，并伴有HFD引起的脂毒性、糖脂毒性、胰岛素抵抗和高胰岛素血症。BB组和DB组大鼠腹腔注射单次低剂量链脲佐菌素，N-(甲基亚硝基氨基甲酰)-α- d -葡萄糖胺(STZ) (Sigma-Aldrich)溶液(25 mg/kg)，溶解于柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L, pH 4.5)。通过血糖仪(Accu-Check Active)从尾静脉测量血糖，证实了糖尿病诱导的成功^®,罗氏。巴塞尔，瑞士)，所有的测量都是在注射后3天的禁食和餐后期间进行的。空腹血糖高于200mg /dl表明T2DM大鼠模型建立成功。用1ml水稀释BB提取物，灌胃31天。每周每2天从尾静脉检测空腹血糖水平。每天量化水和食物的消耗量，每周监测一次体重。

样品采集和制备

治疗结束时，腹腔注射3%戊巴比妥钠(0.3 ml/100 g体重)麻醉大鼠。心脏穿刺采集血液样本，13000转/分离心15分钟，回收血浆，在−20℃下按500 μl等份储存直至使用。腹膜后脂肪组织用PBS冲洗，并立即用液氮冷冻。冷冻样品保存在−80°C。保存的血清样品在4°C下解冻。使用大鼠胰岛素ELISA试剂盒RayBio定量胰岛素水平^®．桃树角，佐治亚州。用商业比色试剂盒测定血清样本中的总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平。肿瘤坏死因子α (Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-a)采用ELISA试剂盒(RayBio^®肿瘤坏死因子。桃树角，GA)根据制造商协议。

RNA提取与测序

根据RNeasy脂质组织迷你试剂盒(Qiagen UK)提出的方案从脂肪组织样本中提取RNA。测序文库由cDNA随机片段制备，随后是5 '和3 '连接适配器。通过PCR扩增连接片段，并在琼脂糖凝胶上观察。MAcrogen(首尔，韩国)在Illumina HiSeq4000上进行了RNAseq双链下一代测序，每组重复3次。所有RNAseq数据均可在GEO数据库中获得，登录号为GSE215903。

生物信息学分析

差异表达基因

生物学条件(DB、BB和HE)的两两比较采用t检验和Fold Change (FC)。使用Benjamini-Hochberg程序对多次测试进行校正，以控制错误发现率(FDR)。探头与fdr调整P> 0.05为条件间差异表达。使用ShinyGO v0.66检测差异表达基因(mRNA、miRNA和lncRNA)的基因类型¹（31)．

路径和网络分析

交互网络采用Cytoscape软件3.7.2版本构建。²利用Cytoscape中的metscape工具识别基因本体和相互作用^3.．

蛋白质相互作用

STRING软件版本11.0⁴用于蛋白质-蛋白质相互作用分析，包括物理和功能关联，网络构建和相互作用次数最高的蛋白质的鉴定。

Database-predicted microrna的

用MIENTURNET对鉴定出的mirna的靶基因进行搜索⁵．基于网络的mirna基因目标富集可视化也使用MIENTURNET (http://userver.bio.uniroma1.it/apps/mienturnet/)．

转录因子分析

利用生物信息学工具enrichment鉴定了活性可被多酚调控的邮件转录因子⁶．利用trust和TRANSFAC数据库寻找潜在的转录因子。

对接分析

我们之前用UPLC-ESI/qTOF/MS对BB提取物的组成进行了表征。我们发现，飞燕草苷3-葡萄糖苷、飞燕草苷3-葡萄糖苷和Malvidin 3-葡萄糖苷是提取物中三种主要的花青素(28)．因此，我们认为有必要使用SwissDock对接分析工具，通过分子对接来测试已识别的转录因子及其调控细胞信号蛋白与花青素代谢物之间的潜在结合相互作用⁷．在pdb中搜索并下载蛋白质的3D结构。格式从UniProt数据库⁸．代谢物化学结构从PubChem数据库下载⁹并转换为MOL.2格式。

IncRNA靶相互作用分析

我们使用生物信息学工具LncRRIsearch来识别差异表达lncRNA的潜在靶点。但是，该数据库缺乏与鼠形无法进行RNA-lncRNA相互作用分析。

统计分析

所有数据均以均数±标准差表示。采用双向重复测量方差分析和Tukey检验分析样本间的差异。的价值p< 0.05为差异有统计学意义。使用GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc.， San Diego, CA, USA)进行统计分析和绘图。我们使用免费软件G* power V.2.5对动物数量进行了F检验:固定效应方差分析-一种方法。

结果

糖尿病小鼠的病理特征

低剂量注射STZ后，BB组和DB组大鼠与HE组大鼠相比，空腹血糖水平明显升高，这一趋势在治疗5周内均可观察到(图1一个)，并在治疗结束时，如图1 c．此外，服用STZ可导致BB组和DB组小鼠体重下降(图1 b)，但脂肪组织重量(图1 d)．这些发现证明了Wistar大鼠T2DM诱导的成功。

图1

图1所示。食用5周富含花青素的BB提取物对(一)空腹血糖;(B)体重;(C)治疗结束时的血糖水平;(D)脂肪组织重量;(E)胰岛素水平;而且(F)肿瘤坏死因子-α水平。数值代表平均值和标准差(n= 8)。^**p≤0.01;^＊＊＊p≤0.001，^{*⁣*⁣* *}pBB与DB对应值比较时，≤0.0001。

黑豆提取物对T2DM大鼠的生化影响

糖尿病患者的两个主要特征是体重下降和血糖水平的慢性升高。暴露在图1时，各组大鼠体重逐渐增加，血糖水平正常。但HE组大鼠生长速度较慢。相反，STZ给药后，各组大鼠体重均开始下降，血糖水平较HE组明显升高。此外，BB组和DB组大鼠给药后体重均有下降趋势。BB对大鼠空腹血糖水平的影响见图1一个，从中可以明显看出，BB组大鼠在治疗1周后血糖水平逐渐下降。治疗结束时，BB组大鼠表现出显著(p< 0.05)降低空腹血糖水平。胰岛素水平呈现下降趋势，尽管BB组和DB组之间的下降不显著(图1 e)．此外，BB组TNF-α水平显著降低(p与DB组比较< 0.05)(图1 f)．

黑豆提取物显著调节脂肪组织的整体基因表达谱

为了确定BB提取物对脂肪组织基因组谱的影响，我们进行了全局RNAseq。经过统计分析，我们鉴定出566个显著差异表达基因。进一步了解已鉴定的差异表达基因，发现其中406个为蛋白编码基因(mrna)， 33个为miRNA家族基因，39个为长非编码基因，3个为snrna, 85个为未鉴定基因(图2)．这些基因的折叠变化在- 1.15到- 13.45之间波动，在- 1.14到22.91之间波动。这些数据表明，BB提取物的摄入可显著影响脂肪组织中蛋白质编码基因和蛋白质非编码基因的表达。然后将差异表达基因列表提交给功能生物信息学分析。

图2

图2。用富含花青素的黑豆提取物治疗糖尿病大鼠，差异表达的mrna、miRNAs和lncRNAs数量的饼图。

功能分析:差异表达基因的基因本体、网络和通路分析

为了探究显著调节蛋白编码基因的细胞功能，我们首先利用metscape和Cytoscape工具进行了基因本体富集分析。基因本体分析p值表明，黑豆提取物影响了许多生物功能类别，包括细胞底物连接组装、磷脂酰肌醇磷酸盐结合、脂肪垫发育、半胱氨酸型内肽酶活性的调节等(图3一)．此外，我们对过度代表的基因本体进行了网络分析p-value <0.05，最小计数为3，富集因子>1.5被收集并根据相似度分组(图3 b)．为了更详细地了解由黑豆提取物显著调控的蛋白质编码基因调控的细胞功能，我们随后使用metscape工具(图4)．结果表明，富含花青素的BB提取物改变了胰岛素分泌、细胞-底物连接组装、ER组织、磷脂酰丝氨酸结合、磷脂酰肌醇3-激酶结合等T2DM发病过程中重要通路的基因表达。另一方面，BB提取物还改变了下调NIK/NF-kappaB调控、细胞外刺激响应调控、细胞结组装正向调控、细胞群体增殖负向调控、细胞粘附分子负向调控、肌动蛋白丝聚合等信号通路的基因表达。

图3

图3。(一)丰富基因本体(GO)术语在输入基因列表的条形图，以p值。(B)选择用于创建网络分析的丰富术语的子集。相似度为> 0.03的项由边连接。较大的节点代表较大的基因集。分析在metscape中进行，并使用Cytoscape工具进行可视化。

图4

图4。中上调和下调差异表达基因的通路富集分析(一)BB组(用富含花青素的黑豆提取物治疗糖尿病大鼠)。(B)DB组(未治疗的糖尿病大鼠)。

我们的下一步是使用STRING数据库探索由黑豆提取物摄入量差异表达的基因的潜在蛋白质-蛋白质相互作用。分析揭示了所识别的蛋白质之间的相互作用网络，如图所示图5一个以及在网络中形成节点的基因。下一步是选择与其他基因相互作用次数最多的基因，这些基因可能在多基因组效应中发挥重要作用。UBB(泛素B)的相互作用达到12次，MST1R(巨噬细胞刺激1受体)和RRAS2 (RAS相关2)的相互作用达到11次，或INS1(胰岛素-1前体)或INPPL1(肌醇聚磷酸酶样1)等蛋白质具有5次或5次以上的相互作用(图5 b)．有趣的是，GeneTrail对枢纽蛋白的通路富集分析显示，这些基因参与胰岛素信号、糖尿病成熟发病、胰岛素抵抗、肌醇磷酸盐代谢或AMPK信号通路(图5 c)．

图5

图5。蛋白质-蛋白质相互作用网络。(一)糖尿病大鼠中由富含花青素的黑豆提取物调节的基因编码的蛋白质之间的相互作用。(B)在网络中形成主要相互作用节点的顶级基因。(C)基因编码的枢纽蛋白通路富集分析。

转录因子可能参与BB提取物的营养基因组效应

我们的下一个目标是确定参与观察到的基因变化的转录调控因子，即可以被黑豆提取物改变其活性并影响已识别的显著调控基因表达的转录因子。为此，我们使用了TRANSFAC和JASPAR数据库，并使用了浓缩铀平台。在鉴定的前10个转录因子中，GATA2、POU2AF1、IRF3、GATA1、NR2F2或PPARA (表1)．这可能表明，摄入BB提取物后产生的循环多酚代谢产物可能与转录因子和/或细胞信号蛋白相互作用，调节其活性。为了验证这一假设，我们使用3D在线对接服务器搜索了黑豆主要代谢产物与这些蛋白质相互作用和结合的能力。我们评估了飞燕草苷3-葡萄糖苷、飞燕草苷3-葡萄糖苷和malvidin 3-葡萄糖苷3种主要代谢产物的结合能力:飞燕草苷3-葡萄糖苷与GATA2 (图6）;飞燕草苷3-葡萄糖苷对POU2AF1 (图6 b）;petuidin 3-glucoside to GATA2 (图6 c；petuidin 3-glucoside to POU2AF1 (图6 d）;malvidin 3-glucoside to GATA2 (图6 e)和malvidin 3-glucoside合成POU2AF1 (图6 f)．我们观察到petunidin 3-葡萄糖苷与POU2AF1具有-6.4 kcal/mol的潜在结合能力，petunidin 3-葡萄糖苷与GATA2 (- 6.2 kcal/mol)和POU2AF1 (- 6.2 kcal/mol)的潜在结合能力。这些结果表明，BB中的花青素可以与细胞信号蛋白相互作用并产生其激酶活性的变化，从而调节下游细胞信号蛋白的活性，进而调节转录因子的活性，从而导致所观察到的基因表达的改变。

表1

表1。食用富含花青素的黑豆提取物调节差异表达蛋白编码基因的潜在转录因子。

图6

图6。在网上黑豆提取物中主要花青素与潜在转录因子相互作用的对接分析。(一)飞燕草苷3-葡萄糖苷到GATA2;(B)飞燕草苷3-葡萄糖苷对POU2AF1;(C)petuidin 3-glucoside to GATA2;(D)petuidin 3-glucoside to POU2AF1;(E)Malvidin 3-glucoside to GATA2;(F)Malvidin 3-glucoside to POU2AF1。

miRNA -识别它们的目标和功能分析

我们的基因表达分析也让我们推测BB不仅可以导致蛋白质编码rna的表达改变，还可以导致非编码rna的表达改变，如mirna。我们观察到33种miRNAs的表达变化，包括Mir615、Mir152、Mir219a1和Mir384。利用已有的数据库，我们对已鉴定的miRNAs的靶基因进行搜索，最终鉴定出近500个靶基因。这些靶基因和鉴定的mirna形成了一个相互作用的网络，如所述图7．为了确定受这些mirna影响的潜在细胞功能，我们交叉检查了Mienturnet数据库，以揭示来自KEGG (图7 b)及反应组(图7 c)数据库，即与每个miRNA相关的通路被黑豆提取物识别为差异表达。其中确定的通路有PI3K信号通路、Ras信号通路、1型糖尿病、胰岛素受体底物1相关通路、胰岛素样生长因子调控等。

图7

图7。差异表达miRNA及其靶mRNA的生物信息学分析。(一)miRNA网络与富含花青素的黑豆提取物及其目标mRNA的消耗显著调节。(B)食用富含花青素的黑豆提取物调节与miRNA相关的KEGG通路。(C)食用富含花青素的黑豆提取物调节与miRNA相关的反应组通路。

富含花青素的黑豆提取物调控的IncRNA

正如我们在材料和方法部分提到的，我们无法在LncRRIresearch web服务器上进行RNA-lncRNAs相互作用分析。然而,在补充图1我们列出了39个lncrna及其折叠变化，这些变化是由富含花青素的BB提取物调节的。

与疾病的相关性

除了鉴定受不同类型rna影响的细胞机制外，我们还旨在鉴定与已鉴定的差异表达基因相关的疾病。我们使用了enrichment数据库OMIM疾病工具，该工具将差异表达基因与疾病相互连接，揭示了它们在预防或发展这些疾病中的可能作用。我们观察到我们在BB组和DB组之间差异表达的基因与代谢疾病、营养紊乱、心血管疾病和免疫系统疾病显著相关(表2)．

表2

表2。食用富含花青素的黑豆提取物与已知人类疾病的基因表达谱的关联。

讨论

在本研究中，我们研究了在饮食链霉素诱导的2型糖尿病患者中，BB富含花青素提取物对脂肪组织的潜在健康益处和多基因组作用模式。4周膳食补充后，我们发现黑豆提取物改善了2型糖尿病和胰岛素抵抗的症状，控制了血糖水平和促炎细胞因子。RNAseq的使用揭示了这些生物活性化合物在脂肪组织中通过调节蛋白质编码、miRNA、转录因子和lncrna的表达来发挥复杂的多基因组模式作用(图8)，调节炎症、新陈代谢和细胞信号传递等过程。

图8

图8。总结图显示了补充富含花青素的黑豆提取物对糖尿病大鼠的多组学结果和基因组修饰。

近年来，人们对天然和无毒抗糖尿病药物的研究特别感兴趣。植物是生物活性化合物的重要来源，对健康有许多有价值的影响。功能食品含有生物活性化合物，如果经常和持续地通过饮食摄入，可以发挥超出其天然特性的健康益处(32)．花青素是一类重要的多酚类物质，其特点是:(a)抑制碳水化合物代谢酶;raybet雷竞技下载地址(b)葡萄糖转运蛋白表达或活性降低;(c)抑制糖原分解和(d)通过花青素分解产物修饰肠道菌群(33)．在这项研究中，我们发现一种富含花青素的BB提取物可以改善糖尿病大鼠的血糖水平。花青素在T2DM中的作用之一是通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶来抑制餐后血糖。在Törrönen等人进行的一项研究中，作者评估了天然富含花青素的浆果对健康成人志愿者餐后葡萄糖水平的影响。另一项研究表明，食用含有越桔、黑醋栗、蔓越莓、草莓和35克蔗糖的富含花青素的果泥，在15和30分钟后，与只食用蔗糖的对照组相比，葡萄糖水平较低(34)．使用在网上而且在活的有机体内研究中,pelargonidin-3 -O草莓中的-芦丁糖通过抑制α-葡萄糖苷酶(35)．花青素的另一个作用机制是它们对葡萄糖转运蛋白的影响。研究表明，富含花青素的浆果提取物显著降低了Caco-2细胞中的钠依赖和钠不依赖转运蛋白，并降低了编码SGLT1和GLUT2的基因的表达，表明花青素可以调节葡萄糖吸收速率(36)．肝脏中糖原分解的过度表达将葡萄糖释放到血液中;糖原合成酶激酶(GSK3β)是一种抑制糖原合成酶(GS)将糖原转化为葡萄糖的关键肝酶。Herrera-Balandrano等人研究了从蓝莓花青素提取物(BAE)中提取的malvidin的降糖作用，并观察到BAE可以通过抑制胰岛素不依赖通路中的GSK3β和糖原合成酶来改善胰岛素敏感性(37)．此外，最近的一项系统综述描述了花青素还可以通过调节肠道菌群组成来发挥其健康作用，特别是通过增加拟杆菌门和减少厚壁菌门．这些变化将导致短链脂肪酸的产量增加，肠道通透性和pH值降低，杯状细胞数量增加，绒毛结构改善(38)．对糖尿病朱克大鼠进行的一项研究表明，补充了紫土豆和越桔中富含花青素的提取物后，结肠微生物群和花青素肠道微生物群衍生的代谢物的失调减少，盲肠糖水平增加，同时丰富度增加Peptostreptococcaceaesp.和Parabacteroides在冒号中。这些结果表明，花青素通过调节肠道菌群可以影响肠道功能，从而预防T2DM (39)．

我们的RNAseq分析首次表明，富含花青素的BB提取物可以影响脂肪组织中大量基因的表达，不仅是蛋白质编码基因，还包括mirna或lncrna等非编码基因。据我们所知，很少有研究报道BB花青素以及分离花青素对脂肪组织的多基因组效应。研究发现，BB中的花青素3-葡萄糖苷可上调GLUT4基因的表达在体外在3T3-L1细胞中(40)．富含黄酮类化合物和皂苷的BB提取物还被证明具有调节脂肪生成关键基因表达的能力，如SREBP1c、ABCG5、CPT1、SREBP2、FAS、HMGCR、INSIG1和INSIG2 (41)．据报道，在小鼠饮食中添加BB可调节结肠组织中SCFA g蛋白偶联受体(GPR-43, GPR109a, GPR-41)的表达，以及调节上皮屏障完整性的基因的表达:occludin, JAM-A, E-cadherin和连接/细胞骨架连接器ZO-1 (42)．最近观察到，黑豆浓缩物通过减少脂肪生成和增加脂肪酸氧化来改善高脂肪-蔗糖饮食大鼠的肝脏脂肪变性(43)．然而，这些研究存在一个重要的缺陷，即使用靶向方法来评估少数特定基因的表达。近年来罕见的研究表明，花青素可以影响大量具有多模态作用的基因。例如，来自黑莓的花青素影响了人类志愿者循环免疫细胞中600多个基因的表达，包括mirna(微小rna) (44)．另一项研究表明，富含花青素的越橘提取物能够调节ApoE-/-小鼠海马中超过1600个基因的表达(45)．

在摄取BB提取物后，使用406个差异表达基因对脂肪组织进行富集途径分析。这使我们能够证明，黑豆提取物可以影响糖尿病大鼠脂肪组织中调节细胞信号通路的基因，与磷酸酶活性、磷脂代谢、磷脂酰肌醇3-激酶结合、磷脂酰丝氨酸结合和ER组织相关的通路。另一方面，我们也发现了参与NIK/NF-κB信号通路调控、对细胞外刺激反应的调控、细胞连接组装的正向调控、细胞群体增殖的负向调控以及细胞因子介导的信号通路的负向调控的下调通路。值得注意的是，虽然DB组NIK/NF-κB信号通路的调控上调，但我们观察到BB组BB提取物的治疗下调了这一通路，这表明提取物具有抵消T2D作用的能力。这一途径在脂肪组织上的生物学相关性是脂肪细胞转录组重编程的关键功能，以应对营养过剩和代谢应激。抑制NF-κB信号通路对肥胖引起的脂肪组织炎症具有代谢优势(46)．另一方面，NF-κB诱导激酶(NIK)是局部和全身代谢过程中免疫和炎症的关键控制因子。在脂肪组织中，NIK通过激活非典型NF-κB通路促进脂肪生成，Pflug等人证实，当NIK不足的小鼠饲喂高脂饮食时，整体脂肪量减少，胰岛素敏感性增加，能量消耗增加(47)．此外，抗炎作用也归因于花青素从木槿L.降低了lps诱导细胞中TLR4的抑制能力，随后降低了MyD88和IRAK4的磷酸化，导致NF-κB失活(48)．黑豆还被证明可以抑制IκB磷酸化，从而阻碍NF-κB易位，从而抑制iNOS的转录和iNOS以及COX-2的翻译(49)．综上所述，这些结果表明BB提取物可以通过对抗T2DM诱导的基因组修饰来发挥健康特性。

FFAs水平升高、炎症、营养过剩、蛋白质折叠不足和局部缺氧是肥胖的特征，并可导致内质网应激。这导致肥胖动物脂肪组织氧化应激增加(50)．BB组ER组织通路正向调控，DB组无正向调控。ER在脂肪组织炎症中发挥重要作用，通过JNK、IKK的磷酸化和JNK介导的IRS1/2的磷酸化参与NF-κB信号的激活，触发未折叠蛋白反应(UPR)，并涉及PERK (pkr样ER激酶)、IRE1(需要酶1)和ATF6(激活转录因子6)等途径(51)．J774A曝光。1macrophages to a cyanidin-3-O-galactoside-rich aqueous extract ofSambucus ebulusL. (SE)可抑制lps诱导的促炎基因转录，如IL-1β， IL-6, TNF-α， Ccl2, Icam-1, Fabp4, COX2, iNOS, Noxo1, IL-1ra和Sirt1。SE还可引起iNOS、peIFα、ATFα和C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白水平的降低(50)．同样的,石榴以高含量多酚植物L. (PGF)灌胃糖尿病大鼠4周。据观察，50 - 100 mg/kg的剂量可以改善内质网应激信号，包括IRE1, XBP-1的激活，以及较低水平的IREα， XBPs和CHOP (52)．因此，我们提取的花青素还具有调节内质网应激基因表达的能力，这是抗糖尿病作用的另一个重要分子靶点。我们的生物信息学分析也显示，磷脂酰肌醇3-激酶结合信号通路在BB组上调。该途径在脂肪组织中的重要性是由于其在脂肪肥厚中的作用，从而增加组织免疫细胞浸润、纤维化和脂肪溶解。降低IRS-1激活和akt诱导的葡萄糖摄取，并加剧全身胰岛素抵抗和T2DM的发展。不同的因素，如脂肪细胞因子和脂肪肥大，通过阻碍PI3K/ akt介导的脂肪分解抑制，降低葡萄糖利用能力，降低SREBP刺激脂质合成的能力，产生胰岛素抵抗(53)．最近的研究表明，甘薯叶多酚可能通过调节IR、IRS-1、PI3K、AKT和GLUT-4基因的mRNA表达，以剂量依赖的方式上调糖尿病小鼠胰岛素介导的PI3K/AKT/GSK-3β信号通路的重要介质(54)．

通过对差异表达基因的生物信息学分析，可以鉴定出其活性受BB提取物影响并导致检测到的营养基因组修饰的潜在转录因子。这些转录因子包括GATA2, POU2AF1, IRF3, GATA1, NR2F2或PPARA。有趣的是，其中一些转录因子已被确定在脂肪组织发育和/或糖尿病中发挥作用。例如，GATA2在糖尿病发展和相关疾病中起着重要作用(55)．据报道，在2型糖尿病期间观察到的高胰岛素血症可激活NR2F2，从而诱发不同疾病的发展(56)．ppar在脂质和葡萄糖稳态、胰岛素抵抗和代谢综合征的发病机制中起核心作用，并在脂肪组织中活跃。研究表明，酚和其他分子与ppar结合会导致其活性发生显著变化，是治疗2型糖尿病的重要模式。（57)．类似地，IRF3被描述为脂肪组织炎症的主要转录调节因子，并参与维持系统葡萄糖和能量稳态(58)．一项研究还观察到脂肪组织中的IRF3促进脂肪炎症和胰岛素抵抗(58)．这些来自我们生物信息学分析的观察结果揭示了BB提取物在其观察到的健康特性基础上的重要调节因素。

此外，我们的基因组分析显示，富含花青素的黑豆提取物也可以调节microRNAs的表达。MicroRNAs (miRNAs)是短的非编码rna，可以与mrna结合，导致翻译抑制的改变。据估计，人类基因组中约有2200个miRNA基因，可以调节60%以上基因的转录水平。因此，它们可以调节许多主要的细胞功能，如发育、分化、生长或代谢(59)．此外，已有研究表明，基因表达的改变在疾病的进展中发挥着重要作用。其中，miRNA可能在糖尿病和代谢紊乱的发展中发挥重要作用(60，61)．另一方面，先前的一些研究表明，花青素可以调节这些非编码rna的表达。例如，研究表明，花青素及其肠道微生物代谢产物的混合物在生理相关浓度下可以影响分离的人原代内皮细胞中mirna的表达(62)．此外，一项研究表明，在与营养相关的剂量下，在小鼠饮食中添加不同的多酚可以显著影响肝脏中miRNA的整体表达谱(63)．被黑豆提取物鉴定为差异表达的miRNAs包括miR-152、miR-219a1、miR-384或miR-615。研究观察到miR-152在脂肪细胞中表达，并能刺激前脂肪细胞的脂质积累，同时伴有一些促脂肪基因的高表达、脂肪生成和肌内脂肪形成(64)．在服用或不服用药物的T2D患者中，其表达也发生改变(65)．miR-219a1已被认为在脂肪发育中发挥作用。同样，也有研究证明miR-615在人体脂肪组织中表达，且其表达随肥胖而变化(66)．此外，在糖尿病患者中也发现了该miRNA的表达(67)．与mirna一起，我们的分析还揭示了长非编码rna的表达变化。lncrna的生物成因不同于mrna，可与DNA、RNA和蛋白质相互作用，调节染色质功能，改变细胞质mrna的稳定性和翻译，并干扰信号通路(68)．由于它们的大的作用模式，它们影响许多细胞和因此生理病理过程。研究显示，它们可调节脂肪生成和脂肪组织功能(69)及糖尿病(70)．只有少数研究表明，多酚是非编码rna表达的有效调节剂。例如，表儿茶素代谢物可以在生理相关条件下调节人脑内皮细胞中这些mirna的表达(31)．因此，我们的研究提供了关于豆科植物及其生物活性影响这类rna表达的能力的新颖和原始数据。然而，由于缺乏已知的这些lncrna的生物学功能及其靶标，调控的细胞和分子过程仍有待确定。综上所述，我们的研究结果表明，富含花青素的黑豆提取物通过调节糖尿病患者脂肪组织中mirna和lncrna的表达来发挥保护作用。

结论

我们采用转录组学、microRNomic、lncRNomic和蛋白质组学等多基因组学方法，揭示了富含花青素的黑豆提取物对糖尿病大鼠脂肪组织的调节作用，表明这些代谢物可以调节磷脂代谢、磷脂酰肌醇3-激酶结合、磷脂酰丝氨酸结合和ER组织以及NIK/NF-κB通路中大量的相互作用。与我们的假设一致，我们可以认为暴露于BB提取物的糖尿病大鼠脂肪组织中的基因表达谱与在糖尿病大鼠中观察到的基因表达呈负相关。本研究中观察到的基因表达变化可能与BB在其他代谢疾病中的保护性抗糖尿病作用有关。未来的研究需要使用这种多组学方法，不仅包括基因组研究，还包括健康影响的研究。

数据可用性声明

所有RNAseq数据均可在GEO数据库中获得，登录号为GSE215903 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE215903)．

道德声明

该动物研究由哈利斯科州技术与设计研究与援助中心(CIATEJ A.C.)的实验动物护理和使用内部委员会(CICUAL)审查和批准。

作者的贡献

EL-C提供资金获取、监督和项目管理支持。EL-C、KD-M、YS-M、LF-Y、EM-M参与构思、研究设计、编辑稿件。KD-M, DM, KC-J进行实验工作，进行数据分析，解释结果，编辑稿件。所有的作者都做出了平等的贡献，并批准了手稿的最终版本。

资金

这项工作得到了FORDECYT-CONACYT(墨西哥国家科学技术委员会)项目(No. 2017-292474)的支持。

致谢

我们感谢María Guadalupe Jorge-Espinoza和Ruben Piña-Cruz在动物实验方面的建议和支持。KD-M感谢墨西哥科学委员会(CONACYT)授予她博士学位的奖学金(514687)。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2022.1019259/full#supplementary-material

补充图1 | .富含花青素的黑豆提取物调节lncRNA及其折叠变化的列表。

脚注

参考文献

1.世界卫生组织。糖尿病事实和数据。日内瓦:世界卫生组织(2021年)。

谷歌学者

2.维尔玛S，侯赛因我。肥胖和糖尿病:最新进展。糖尿病代谢综合征。(2017) 11:73-9。doi: 10.1016 / j.dsx.2016.06.017