优化Optogenetic激活的浦肯野细胞轴突调查浦肯野细胞——宽带突触

介绍

光遗传学是一种强大的工具,改变了神经回路的调查。基因的能力目标和光学激活不同的细胞群的突触前神经元功能电路映射允许精炼我们理解大脑的(Huber et al ., 2008;Cruikshank et al ., 2010;菲et al ., 2013)。有针对性的视蛋白基因分布在细胞膜中,可以检测到所有细胞车厢,包括soma,树突和轴突(内格尔et al ., 2003;Boyden et al ., 2005;刘易斯et al ., 2009)。光脉冲可以被集中到亚细胞车厢引起神经元活动,起源于在本地(Petreanu et al ., 2007;杰克曼et al ., 2014)。例如,针对轴突与焦光学刺激可以探头连接的有效手段,特别是在急性片突触前突仍在,即使他们的躯体损伤。然而,这种方法提出了一个问题:是否焦刺激神经元的轴突比焦需要不同的条件刺激的躯体。这是重要的地址,因为有几个最近的报告表明,焦轴突的刺激与抑制optogenetic工具矛盾产生的激发而不是抑制(Mahn et al ., 2016;梅西耶et al ., 2018)。这些研究强调经验的重要性为optogenetic实验测试条件。

小脑浦肯野细胞从小脑皮层通过突触传递信息到深小脑核神经元(宽带)(那么,Chan-Palay 1974;人,拉曼,2012年)。先前的研究已经表明,这种联系可以与名为“调查(ChR2),突触后反应引起optogenetically类似引起来自细胞外的电刺激(杰克曼et al ., 2014)。然而,引起动作电位参数optogenetically可以用不同的设备不同,例如领导和激光。研究神经元突触浦肯野细胞的属性——宽带连接optogenetically,我们首先需要理解如何引起适时的单一动作电位可靠地从浦肯野细胞轴突的刺激。这里,我们可靠地确定所需的实验条件激活浦肯野细胞使用的LED光源照明。我们发现焦点照明的浦肯野细胞轴突比somata需要更长的光脉冲,而轴突更容易从环境光干扰。最后,我们表明,这些经验决定条件使我们引起的突触反应宽带神经元。

材料和方法

动物

转基因小鼠半合的浦肯野特异性Cre[应变B6.Cg-Tg (Pcp2-cre) 3555 jdhu / J;股票数量:010536;PCP2-Cre)和纯合子小鼠频道- rhodopsin-2 / H134R融合增强YFP[应变:B6; 129 s-gt (ROSA) 26琼^{Hze tm32 (CAG-COP4 * H134R / EYFP)}/ J;物料编号012569;Ai32),或ChR2 H134R -EYFP,从杰克逊实验室获得(巴尔港,我,美国)和繁殖产生半合PCP2-Cre / Ai32老鼠表达修改ChR2浦肯野细胞(杰克曼et al ., 2014)。所有动物的程序被麦吉尔动物保健委员会批准,按照准则建立了加拿大动物保护协会。

急性切片制备

片是准备如前所述(Jayabal et al ., 2017;阿迪et al ., 2018)。雄性和雌性老鼠(P20奔跑)深感与异氟烷麻醉和斩首。大脑被移除,并立即放置在冰冷的人工脑脊液(ACSF;2.5在125 mM:氯化钠,氯化钾,2 CaCl₂1 MgCl₂1.25不₂阿宝₄25 NaHCO₃25,葡萄糖,洋溢着95% O₂-5%的公司₂保持pH值为7.3;同渗重摩∼317 mOsm)浦肯野细胞实验,或部分替代蔗糖切解决方案(50 mM:氯化钠,氯化钾的2.5,0.5 CaCl₂10 MgCl₂1.25不₂阿宝₄25 NaHCO₃蔗糖、葡萄糖25和111都洋溢着95% o2 - 5%股份有限公司₂保持pH值为7.3;同渗重摩∼317 mOsm)宽带实验。化学物质从Sigma-Aldrich购买(奥克维尔,在加拿大)和/或科学(CaCl费舍尔₂和MgCl₂;多伦多,加拿大)。旁矢状面的片小脑蚓部和paravermis削减使用徕卡1000年代VT振动叶片厚度200μm切片机。片都是培养在ACSF 37°C 30 - 45分钟,然后储存在室温下6 h。片通常是存储在一个最小化曝光室。然而,对于环境光实验中,片被存储在一个干净的玻璃室ACSF明亮的头顶灯光的实验室,并与卤素灯照亮可视化浦肯野细胞在急性片。在环境光条件下,片暴露在一个白色背景光的连续光谱。

成像

片与一个定制的双光子显微镜成像配备一个Ti:蓝宝石激光(媚态鸡尾酒;光谱物理、圣克拉拉、钙、美国)调到890海里和图像栈(1μm z-step)收购了ScanImage运行在MATLAB (Mathworks纳蒂克,妈,美国)(Pologruto et al ., 2003)。最大强度投影图像栈生成ImageJ(美国国立卫生研究院¹)。

电生理学

硼硅酸盐片吸量管(2 - 9 MΩ)拉拔与p - 1000机(萨特仪器,诺瓦托、钙、美国)。current-clamp实验的浦肯野细胞,内部解决方案包含(毫米):130葡萄糖酸钾0.5 EGTA 10玫瑰,4 Mg-ATP 0.4 Na-GTP 10氯化钠,氯化钾,以286 mOsm和pH值7.3与KOH(调整)。在宽带神经元电压钳实验的内部解决方案包含(毫米):150葡萄糖酸钾、氯化钾,10个消息灵通的,0.5 EGTA, 3 Mg-ATP, 0.5三磷酸鸟苷三盐、5磷酸肌酸- (di)三,297 mOsm和pH值7.2与KOH(调整)。录音是Multiclamp 700 b放大器(分子器件、桑尼维尔,美国)SliceScope Pro 3000显微镜(英国Scientifica, Uckfield)神经元片的温度维持在34°C±1°C和含氧ACSF沐浴。浦肯野细胞的静止膜电位>−40 mV被排除在分析之外。宽带电压钳记录的神经元细胞voltage-clamped−60 mV, R_在静止膜电位和监控。录音的R_在改变了超过25%被排除在分析之外。数据采集和分析使用自定义IGOR Pro采集和数据分析软件(Sjostrom et al ., 2001)(Wavemetrics,波特兰,或美国)。

光刺激

片表达ChR2使用Polygon400E图案的空间照明光刺激470 nm LED光源(Mightex,多伦多,加拿大),通过一个60 x水浸客观(奥林巴斯LUMPLFLN60XW、东京、日本)。光刺激的视觉识别感兴趣的区域划定使用PolyScan2软件(Mightex)。光刺激诱导而patch-clamping soma的浦肯野细胞或宽带神经元。我们使用40×40μm蓝色方块与估计焦平面光脉冲功率密度的100 mW /毫米²轴突和体细胞光刺激,或在某些情况下,环形光脉冲(∼20μm直径)被用于体细胞刺激。在浦肯野细胞轴突光刺激实验,照明面积是120 - 200的浦肯野细胞μm soma。这个距离变化由于颗粒细胞层的厚度的变化,但总是在白质接近记录的浦肯野细胞。轴突在宽带光刺激实验,区域照明是∼200μm宽带神经元soma,白质毗邻宽带。Interstimulus间隔15秒了唤起从浦肯野细胞动作电位somata或轴突和20年代引起突触后反应宽带。

数据分析

所有电生理数据分析使用自定义Igor专业数据分析软件(瓦特et al ., 2009)。动作电位测量延迟的时间从女士开始光刺激的动作电位的峰。抑制性突触后电流(万能),上升时间测量之间的时间20 - 80%的峰值。浦肯野细胞录音,抖动测量的可变性(表示为标准差,SD)的时间从一开始的光脉冲峰值的动作电位。宽带录音,抖动的突触后反应是测量的可变性(SD)时间达到峰值IPSC的20%。

统计数据

Mann-WhitneyU使用JMP软件测试执行(SAS、凯里、数控、美国)的意义(α)P< 0.05。数据报告为±SEM。对所有数据,n=数量的细胞N=数量的老鼠。

结果

我们想知道焦浦肯野细胞的光刺激会导致微分效应取决于目标亚细胞室。为了解决这个问题,我们首先确认ChR2表达的浦肯野细胞轴突ChR2 H134R -EYFP老鼠。符合之前已经报道过(杰克曼et al ., 2014),我们观察到健壮ChR2表达浦肯野细胞轴突位于小脑白质(图1一个)。

我们接下来试图测试空间是否有针对性的光刺激的浦肯野细胞可以可靠地引起轴突。虽然这已经被别人使用了短光脉冲激光器(杰克曼et al ., 2014),据我们所知这不是从LED光源的特点。我们从浦肯野细胞全细胞current-clamp录音somata和注入负电流,直到我们自发动作电位超极化细胞沉默。使用空间照明提供470纳米光从一个领导,我们应用一个40×40μm广场光脉冲的soma或刺激小脑白质轴突和逆向的动作电位记录。在轴突引起动作电位,我们在白质photostimulated同时监测体记录的存在引起动作电位(年代)。如果没有诱发动作电位在一个位置,将参数化转变我们的光刺激位置(在30 - 40μm步骤),直到诱发动作电位(图1 b)。如果我们无法引起动作电位照明多个刺激位置后,我们的结论是,浦肯野细胞的轴突可能削减。

一旦我们发现白质光刺激的位置,我们可以引起动作电位(图2一个),我们测试了photostimulus脉冲不同持续时间的探索所需要的条件引起单动作电位时光线传递到躯体(图2 b(左),C)和轴突(图2 b(右)D)。我们发现在动作电位的数量有变化引起光在给定时间跨细胞(图2 d)。

因为我们的目标是识别光刺激条件,可靠地引起单跨细胞动作电位,我们想要避免引发多个动作电位,尽管在大多数情况下,我们无法完成这个没有偶尔的动作电位失败(失败,用截止< 33.3%)。我们发现1 ms光刺激可靠地引起单动作电位与体细胞照明(0.98±0.12 1 ms, 1.55±0.15上升2 msn= 10细胞;N= 7小鼠;图2 e),但不与轴突照明(0.08±0.06 1女士,n= 7细胞;N= 6小鼠;图2 e)。最优光刺激引起单一动作电位持续时间为轴突刺激通常2或3 ms为单个细胞(2女士:0.81±0.26飙升;3女士:1.02±0.21飙升,图2 e)。我们试图确定最优最小光刺激引起的动作电位soma和轴突细胞,并发现所需的平均最小光时间轴突(轴突最小光时间:2.86±0.55毫秒;图2 f),明显长于somata (soma最小光时间= 1.10±0.10毫秒,n= 10,N= 7;P= 0.0003;图2 f)。这也比此前报道用激光光源(杰克曼et al ., 2014)。从光发作诱发动作电位的延迟也显著缩短soma比轴突(soma:延迟= 3.80±1.03毫秒;轴突:延迟= 6.07±1.02毫秒;P= 0.042;图2 g)。然而,尽管延迟发射单一动作电位与体细胞或轴突光刺激不同,我们没有发现显著差异的抖动诱发峰值(soma:抖动= 3.81±2.59毫秒;轴突:抖动= 2.42±1.66毫秒;P= 0.46;图2 h),这表明光刺激导致持续寿命从轴突和躯体动作电位。

自光刺激的浦肯野细胞轴突需要更长的光脉冲比躯体刺激诱发动作电位,我们想知道是否轴突可能更容易受到扰动,如暴露在背景白光,可能导致失活ChR2通道(林et al ., 2009)。为了验证这一点,我们暴露的浦肯野细胞在环境光片孵化和录音,和之前引起动作电位(图3一,参见“材料和方法”)。我们观察到脉冲持续时间的增加必要唤起一个动作电位从轴突相比暴露于环境光观察实验在弱光(P= 0.013;图3 b)。相比之下,我们并没有发现改变脉冲持续时间必须可靠地引出一个动作电位之间的soma环境光和低光照条件(P= 0.35;图3 b)。虽然高峰延迟显示倾向于增加环境光条件相比,低光照条件对soma和轴突(图3 c),这些差异并不显著。这些结果表明,浦肯野细胞轴突比somata更容易受到环境光,或许是由于ChR2渠道在轴突的假定低密度呈现photo-inactivation比例更敏感。

确定了环境中可靠地引起单适时的动作电位在浦肯野细胞的轴突,然后,我们试图确定是否这种模式允许我们强劲引出适时的宽带神经元的突触后反应。从宽带神经元后全细胞电压钳记录(图4一),我们的浦肯野细胞轴突与可变光刺激持续时间白质∼200μm修补细胞,并记录诱发万能(图4 b)。IPSC振幅增加适度增加photostimulus时间(图4 c),这可能是由于额外的动作电位引起光刺激持续时间较长的(图2 d, E),或者从被招募更多的突触前突长脉冲。诱发细胞则是快速崛起倍(0.88±0.06女士,n= 7细胞;N= 3老鼠,图4 d),平均变化< 0.2女士在不同刺激持续时间,符合快速动力学之前报道的突触(Pedroarena和施瓦兹,2003年;普和拉曼,2005年;Uusisaari Knopfel, 2008)。突触后反应的发病的抖动是低photostimulus持续时间,符合时宜动作电位(表1和图4 e)。

我们发现,随着光时间我们看到更多的多峰万能的实例(图4 b),这是符合我们观察到光长时间引起多个突触前动作电位(图2 b),但也反映了招聘更多的轴突较长的脉冲。根据我们上面的实证结果,我们得出这样的结论:一个2或3光刺激持续时间最适合女士可靠地引起适时的单突触前动作电位的浦肯野细胞轴突为了调查浦肯野细胞——宽带突触。

讨论

我们确定了光脉冲持续时间从470 nm领导要求引起的单一动作电位浦肯野细胞轴突在急性矢状切片从转基因小鼠表达ChR2浦肯野细胞。我们表明,轴突需要更长的脉冲持续时间比somata引起相同数量的动作电位,和轴突光刺激引起的时间延迟比体细胞光刺激飙升。我们还发现,轴突从背景曝光更容易受到扰动。最后,我们证明我们使用条件引起的单一动作电位的浦肯野细胞轴突的刺激让我们引起健壮的寿命及其突触后神经元的突触电流宽带。因为使用抑制optogenetic工具最近的一些研究表明,焦光刺激somata和轴突的收益率不同的结果,在轴突的刺激会导致矛盾的对活动的影响(Mahn et al ., 2016;梅西耶et al ., 2018),我们确认轴突光刺激所需的条件是否与浦肯野细胞从老鼠体细胞刺激transgenically表达EYFP-fused ChR2 (H134R)。我们发现我们可以引起的动作电位在soma和轴突与焦点光刺激,虽然所需轴突长光脉冲,并显示更长的延迟。这些光脉冲的时间比之前报道的是利用激光光刺激(杰克曼et al ., 2014)。

自从我们一块体吸管记录动作电位测量,我们预期的动作电位时要短延迟引起的躯体从轴突比。浦肯野细胞轴突已经估计∼1 - 10 m / s的传导速度(Khaliq和拉曼,2005年),所以考虑到轴突刺激位置之间的距离和体细胞补丁吸管(< 200μm分离),只有一小部分的增加延迟(0.2 ms)应归因于传导延迟产生的远端轴突动作电位的起始。其他几个因素可能导致延迟的增加引起的动作电位轴突的刺激。浦肯野细胞有髓鞘的轴突(永贝里et al ., 2016Ranvier)和动作电位旅游节点之间的轴突。不过,鉴于节间的间距范围在60和260μm (克拉克et al ., 2005),焦点光刺激的面积可能只是偶尔重叠郎飞氏结。支持,节间的间距Ranvier的节点已被证明是一个限制因素诱导的动作电位在有髓鞘的轴突(Arlow et al ., 2013)。因为光散射增加lipid-rich组织如小脑白质髓鞘是丰富的,低光强度可能达到浦肯野细胞轴突比躯体(马蒂斯et al ., 2012)。然而,尽管动作电位的延迟时间轴突,试验之间的抖动不是明显不同,表明动作电位能够可靠地引起轴突光刺激后和时间精度高。

我们发现,需要更长的光脉冲和浦肯野细胞轴突显示延迟超过somata引起动作电位,那么我们想知道他们可能有高度敏感性光扰动。为了验证这一点,我们接触片环境光和重复测量。所需的轴突长光脉冲在这种情况下相比,轴突保持在低光,虽然没有显著差异引起峰值所需的光脉冲持续时间从somata在低光照或环境光举行。这些结果可能是由于缓慢复苏从暴露于环境光引起的失活:ChR2 (H134R)复苏脱敏和失活的更慢比其他工程ChR2变异(林,2011)。因为transgenically ChR2表达不是特别Ranvier集群的节点有髓鞘的轴突(图1;Grubb Burrone, 2010;Arlow et al ., 2013),个人ChR2分子失活在一个地区已经有限的可用性可能大大减少photostimulus的功效。这个轴突敏感性支持我们的假设,浦肯野细胞轴突比somata是影响光扰动optogenetic实验,表明额外的应该小心当photostimulating轴突减少不必要的曝光。最后,我们确认参数引起的单一动作电位的浦肯野细胞轴突让我们引起暂时的精确宽带神经元的突触反应trial-to-trial抖动。我们建立最佳的参数引起单从浦肯野细胞动作电位轴突匹配条件我们观察到最佳引起细胞则在目标宽带神经元局部刺激突触前人口的浦肯野细胞(2或3 ms)。鉴于我们的光刺激脉冲的尺寸相对较大,因为在白质浦肯野细胞轴突束在一起,我们不希望刺激单轴突,而是小亚种群的浦肯野细胞的轴突。然而,进一步优化光刺激脉冲的大小和位置可能使我们能够可靠地photostimulate个人将来突触前突。我们的研究结果强调经验的重要性确定optogenetic从突触前神经元光刺激参数优化条件实验。我们希望我们的一些发现,轴突通常需要更长的光脉冲等类似的反应轴突和更容易受到背景环境光,一般特性可能会观察到在细胞类型和记录配置。然而,这项工作的主要结论是,重要的是要确定光刺激参数经验当需要精确的时间控制的动作电位optogenetic实验。

数据可用性声明

在这项研究中生成的数据集是可在请求相应的作者。

道德声明

所有动物的程序被麦吉尔动物保健委员会批准,按照准则建立了加拿大动物保护协会。

作者的贡献

公斤进行电生理实验和分析数据。AW构思的项目,并获得和分析双光子成像和电生理数据。两位作者设计了实验,解释数据,写了手稿,并批准了最终版本的手稿,同意负责所有方面的工作。

资金

这项工作是支持发现格兰特(05118)从加拿大自然科学和工程研究理事会,一个新的调查员格兰特(新Chercheur;189153)从昏聩de矫揉造作的性质等技术de魁北克(AW),和一个操作格兰特(130570)和项目资助(153150)从加拿大卫生研究院的研究。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

我们感谢Jesper Sjostrom定制Igor软件进行数据收集和分析。我们感谢瓦特实验室的成员对于这个项目的帮助和支持,并为关键的反馈在这个手稿。我们也感谢谭雅科赫技术帮助维护我们的转基因小鼠的殖民地。

脚注

1. ^https://imagej.nih.gov/ij/

引用