卫星神经胶质细胞驱动大鼠超痛觉启动模型从急性到慢性疼痛的转变

1.简介

慢性疼痛是人类最常见的临床症状之一，其特征是周围神经系统(PNS)和中枢神经系统(CNS)的可塑性改变，也称为外周和中枢敏化(Ji等，2018；文森特,2020)．据报道，哺乳动物慢性疼痛的外周神经元中大量的功能蛋白和信号通路被改变或改变(Meade and Garvey, 2022年；Zheng等，2022)．它们被认为直接或间接地导致慢性疼痛，可能是疼痛治疗的目标(伯塔等人，2017年)．虽然已经发现了许多与慢性疼痛相关的外周感觉神经元的变化，但这些变化的触发因素仍然未知。

近十年前，hyperalgesic priming (HP)动物模型首次被用于研究初始阶段的慢性疼痛与急性疼痛的区别(Price等，2018；眩光等，2019年)．在该动物模型中，急性炎症刺激恢复后，足底内注射PGE2被发现产生持久的痛觉过敏，明显超出其导致急性疼痛的能力(法拉利等，2013年)．蛋白激酶Cε (PKCε)已被确定为参与这一现象的关键分子，它在背根神经节(DRG)神经元中的激活诱导急性疼痛向慢性疼痛的转变(Fang等，2021；Wang等，2021)．我们小组最近发现，在该模型中，神经元上一些受体表达的变化，如mGluR5的上调和GABAAR的下调，参与了DRG中PKCε的激活(王等，2020，2021)．然而，目前尚不清楚PNS中的非神经元细胞是否参与疼痛转移和PKCε激活。

在PNS中，感觉神经元的体被卫星神经胶质细胞(SGCs)紧紧包裹，从而防止突触接触(Hanani和Spray, 2020年)．越来越多的证据表明，在神经损伤或外周炎症期间或之后，感觉神经节中的SGC激活有助于疼痛(Ceruti 2021)．SGCs的激活诱导生物活性物质的释放，包括ATP、谷氨酸、细胞因子和趋化因子，如肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1β和CCL2 (Ji等，2019；Hanani和Spray, 2020年)．这些物质作用于外周痛觉神经元以诱导神经炎症，并改变疼痛相关离子通道的功能或受体的表达水平以启动外周敏化(蒙塔古等人，2018；Valdez-Morales等人，2022年；徐等，2022)．此外，SGCs表达外周神经元释放物质的受体，最显著的是CX3CR1和P2X7受体(Souza等，2013；Neves等人，2020年)．PNS中的这些受体也对慢性疼痛有很大的影响(Silva和Malcangio, 2021年；Hu等，2022)．此外，紧密接触允许感觉神经元和SGCs之间的双向通信和功能相互作用，包括相邻神经元和SGCs的激活。SGC和感觉神经元之间的串扰的发现提出了有趣的问题，SGC激活是否导致疼痛转移，SGC激活是否导致PKCε激活，或者PKCε表达增加是否诱导SGC反应?

为了进一步探索疼痛转变的外周机制，我们使用RNA测序(RNA- seq)对HP模型大鼠和假性HP模型大鼠的同侧DRG组织进行了全基因组表达谱分析。许多差异表达基因被鉴定出来。研究了这些基因的分子和细胞功能以及它们所涉及的信号通路。我们还将我们的数据集与之前发表的经典慢性疼痛模型的数据集进行了比较。通过分析我们的发现，CXCL1被确定为DRG中从急性疼痛到慢性疼痛转变的关键分子。我们的工作揭示了sgc在HP大鼠模型中驱动从急性疼痛到慢性疼痛的转变，这是理解疼痛转变机制的重要发现。我们的发现可能为在初始阶段确定新的和有效的慢性疼痛治疗靶点提供进一步的见解。

2.方法和材料

2.1.动物

成年雄性SD大鼠[体重180-230 g)(动物证号:;本研究采用SCXK(Hu) 2013-0016，中国科学院上海实验动物中心]。在浙江中医药大学实验动物中心[SYXK(哲)2013-0184]，每笼饲养5只动物，环境受控(25°C±2°C, 50%±10%)，光照/暗循环12 h，并提供食物和水随意．本研究中所进行的所有动物实验均符合有关动物伦理使用的机构和政府规定，并得到浙江中医药大学附属实验动物中心(批准号:浙江中医药大学附属实验动物中心)的批准。iacuc - 20180319 - 12)。

2.2.超痛觉启动模型

卡拉胶(Car)和PGE2购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)。注射前用10%乙醇配制PGE2原液(1 μg/μl)，与生理盐水混合至100 ng/25 μl。将Car溶于浓度为2%的生理盐水中保存。

如前所述，痛觉过敏启动被诱导(Wang等，2021)．麻醉大鼠7 d后足底注射Car 100 μl(第一次注射)，PGE2 25 μl(第二次注射)诱导HP。假性HP组用等量生理盐水(NS, 0.9% NaCl)代替Car。

2.3.行为测试

分别在第1次注射前、第1次注射后4 h和7 d、第2次注射后1 h和24 h量化痛觉行为。在实验期间，实验者对研究条件一无所知。

爪缩回阈值(PWTs)使用von Frey细丝(Stoelting, IL，美国)，采用如上所述的上下法进行测试。将Von Frey细丝(0.4、0.6、1、2、4、6、8、15和26 g)按压在同侧足跖外侧表面。第一根灯丝所施加的力相当于4克。然后根据响应是负的还是正的，选择具有更高或更低力的灯丝。响应记录为X或o。计算结果使用前面描述的函数(Chaplan等人，1994年)．

2.4.RNA-Seq的组织制备

共5只大鼠分为HP组和假性HP组。根据实验设计，PGE2注射后24 h，异氟醚深度麻醉，生理盐水经升主动脉灌注。灌注后，收获L4-L5 DRGs并在-80°C保存。用TRIzol试剂提取总RNA, NanoDrop 1000分光光度计测定RNA浓度和纯度。RNA完整性用2% (m/v)琼脂糖凝胶电泳检测。在这些测试之后，6个足够质量的样本(每组3个样本)被送往微阵列分析。

2.5.RNA-Seq文库的建立和RNA-Seq

用Bibo-Zero TM磁性试剂盒中的试剂处理每个样品中约1 μg总RNA以耗尽rRNA。用随机引物反转录合成cDNA，进行末端修复和3 '腺苷酸化。适配器被连接到这些3 '腺苷化cDNA片段的末端。为了富集cDNA片段，采用PCR Primer Cocktail和PCR Master Mix进行多轮PCR扩增。最后，用AMPure XP Beads对PCR产物进行纯化，并通过两种方法进行质量控制和定量:使用Agilent 2100 Bioanalyzer检查片段大小分布，使用实时定量PCR (qPCR) (TaqMan Probe)对文库进行定量。符合条件的文库在HISeq 4000平台(北京基因组研究所，中国深圳)上进行配对末端测序。

2.6.生物信息学分析

原始读数(主要测序数据)进行质量控制。有关总的读取和读取的映射比率的信息显示在表1．生物信息学分析如前所述(Chen等，2020)．简而言之，SOAPnuke (v1.5.2)删除了包含测序适配器的读取、低质量碱基率高的读取和未知碱基率大于5%的读取。然后以FASTQ格式保存干净的读取。随后，使用HISAT2 (v2.0.4)将干净的reads映射到参考基因组。然后使用Ericscript (v0.5.5)和rMATS (v3.2.5)分别检测融合基因和交替剪接基因。使用Bowtie2 (v2.2.5)将干净的reads与华大基因建立的数据库基因集进行比对，其中包括已知的和新的编码转录本。然后用RSEM (v1.2.12)计算基因表达量。整个生物信息学分析过程由华大基因完成。

2.7.差异表达基因的聚类分析和筛选

通过火山图过滤鉴定显著差异表达mrna (DeRNAs)。用于筛选上调和下调mrna的阈值为|log2(折叠变化)| > 1.2 (p< 0.05)。利用Bioconductor R软件中的“pheatmap”包进行分层聚类和热图生成。由Tom博士(华大基因)进一步对DeRNAs进行通路(KEGG)和基因本体(GO)富集分析。在GO富集分析中，根据基因富集的生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)等术语对基因进行注释和分类。在KEGG通路分析中，通路按照富集分数进行排序。

2.8.蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析如前所述(Chen等，2020)．简而言之，相互作用基因检索搜索工具(STRING)用于获得有关预测和实验确定的蛋白质相互作用的信息。该数据库所作的预测来自邻近、基因融合、共发生和共表达分析;数据库;还有文本挖掘。在上传重叠基因列表后，使用基于web的STRING数据库来预测PPIs通过搜索栏。基于相互作用，建立PPI网络，然后使用Cytoscape软件进行可视化。

2.9.微阵列数据来源

本研究选择了来自神经性疼痛和炎症性疼痛模型的两个独立数据集，即备用神经损伤(SNI)和完全弗洛因德辅助(CFA)模型。SNI (GSE30691)和CFA (GSE24431)数据集从Gene Expression Omnibus (GEO)下载https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/．CFA模型中的基因与p< 0.05和fold change的绝对值>1.5根据原文鉴定为差异表达基因(Chang等人，2010)．SNI模型中的基因与p≤0.01和绝对log2(fold change) >1.25根据原文鉴定为差异表达基因(科斯蒂根等人，2010年)．

2.10.按注射

如前一份报告所述，药物直接注射至DRG (法拉利等，2007年)．简单地说，大鼠被吸入2% (v/v)异氟醚麻醉。将G30针插入第5和第6腰椎之间的椎间隙。当骨的阻力减弱时，针被认为已经到达空间，并观察到爪退缩反射。

2.11.实时定量PCR

从L4-L5 DRG组织中提取总RNA，使用随机六聚体引物逆转录为cDNA。采用EvaGreen荧光染色法进行RT-PCR定量。cDNA使用CFX96™实时PCR检测系统(Bio-Rad，美国)进行qPCR。所用引物的序列见表2．GAPDH作为内参基因。每个样本重复测量三次，并通过扩增图分析数据点的完整性。相对RNA水平由2^——ΔΔCt方法。

2.12.免疫荧光

DRGs切片厚度为12 μm。将切片用5%正常驴血清(1% Tween 20)在37℃下封闭1小时，然后用兔抗gfap抗体(在5%正常驴血清中1:1000,Abcam，美国)在4℃下孵育过夜。然后将切片在荧光素AffiniPure驴抗兔IgG (Alexa 488共轭，Abcam，美国)中37°C孵育1小时。使用Imager M2 (Zeiss, Germany)获取L4和L5 DRGs中GFAP表达的图像。计数超过50个周长被gfap阳性sgc包围的神经元，数据以相对于该区域神经元总数的百分比表示(沃里克和哈纳尼，2013)．

2.13.西方墨点法

用于western blotting的方法已在前面描述过。简言之，从L4-L5 DRGs组织中提取总蛋白。采用含1% PMSF (Beyotime，中国)和蛋白酶/磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Applygen，中国)的RIPA裂解缓冲液(Beyotime，中国)提取蛋白质。采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。蛋白质样品(20 μg)在5% SDS-PAGE凝胶上分离，电泳转移到聚乙烯醇二氟化乙烯(PVDF)膜上(Bio-Rad，美国)。将膜与5%低脂牛奶在TBST中室温孵育1小时，与兔抗pkc ε(1:1000, 5%正常山羊血清，Abcam，美国)和抗gfap(1:1000, 5%正常山羊血清，Abcam，美国)在4℃孵育过夜，并与辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗兔IgG (1:500, Abcam，美国)室温孵育1小时。内对照采用兔抗gapdh (HRP偶联)(1:1000,CST，美国)抗体。用ECL试剂盒(Pierce，美国)观察膜，用ImageQuant LAS 4000系统(EG，美国)获取信号。采用ImageQuant TL 7.0分析软件(GE，美国)测量各条带的密度。将目标蛋白在第一组动物体内的平均表达量设为1，将所有动物体内的相对表达量归一化为第一组的水平。

2.14.统计分析

图中数据以均数±sem表示。学生的t -检验用于比较两个独立样本，而方差分析(ANOVA)之后的Bonferroni的多重比较检验用于比较三个或三个以上的样本。p< 0.05为有统计学意义。

3.结果

3.1.Car/PGE2注射诱导卫星神经胶质细胞反应性，并参与HP模型的慢性疼痛期

Car注射后PGE2注射，建立经典动物模型HP模型，可用于研究急性疼痛向慢性疼痛的转变(法拉利等，2015年)．左后爪足底内Car/PGE2注射导致持久的机械性痛觉过敏(图1一个)，并显著上调DRG中GFAP的表达(图1 b)，提示SGC反应性的诱导。此外，DRG中被gfap阳性细胞包围的神经元比例显著增加(图1 c)．总的来说，这些结果表明Car/PGE2注射可诱导同侧DRG中的sgc反应性。为了确定scg对Car/ pge2诱导的持久疼痛是否必要，我们检查了氟柠檬酸盐(Fc)对HP模型大鼠的影响。PGE2注射前向同侧L5 DRG注射Fc (2 nmol, 3次)预防SGC反应性显著减弱Car/PGE2诱导的持久痛觉过敏(图1 d)下调腰椎DRG中GFAP的表达(图1 e)．先前的研究表明，DRG中的PKCε激活是疼痛转变起始的分子标记(Wang等，2021)．我们之前的研究也表明，抑制PKCε高表达可逆转HP模型大鼠的慢性疼痛(Fang等，2021)．在这里，我们测试了阻断SGC反应性的诱导是否会影响L5 DRG中PKCε的表达。在足底注射PGE2前向DRG注射Fc可显著下调DRG中GFAP的表达(图1 e)，这表明PKCε在DRG中的激活可能是对SGC反应性的响应。

3.2.急性疼痛向慢性疼痛转变过程中差异mRNA表达的概述

由于SGCs产生了一些细胞因子和趋化因子，我们进一步使用RNA-Seq对HP和假性HP模型大鼠的同侧DRG组织进行了全基因组表达分析(注射PGE2 24小时后)。

在注射PGE2 24 h后，分析HP模型大鼠和假性HP模型大鼠由急性疼痛向慢性疼痛转变过程中涉及的DeRNAs。结果显示，与假HP组相比，HP组有355个mrna表达显著差异，其中146个mrna表达上调，209个mrna表达下调(图2一个)．上调最多的mrna是LOC103693999、LOC103690175、Chchd2、RGD1564887和Rpl30 (表3)．下调最多的mrna是LOC108348064、LOC679565、Kdm4d、Stra8和LOC108348079 (表4)．DeRNAs的层次聚类分析显示，三个假HP样本聚类在一起，三个HP样本聚类在一起，结果高度一致(图2 b)．

基于数据集，两个基因的表达变化超过10倍;其中1个基因LOC103693999表达上调，1个基因LOC108348064表达下调。此外，18个基因表达变化在5- 10倍之间，其中10个基因表达上调，8个基因表达下调。详细信息包括前20个上调和前20个下调的DeRNAs表3，4．在我们确定的derna中，一些已知与炎症或疼痛过程有关，如IL-1β，锌指蛋白和TACR1 (NK1)。总的来说，这些结果表明疼痛转变可能与DRG的炎症反应有关。

3.3.实时定量PCR检测mRNA表达

为了验证RNA-Seq结果的可靠性，随机选取6个mrna进行表达分析。三种上调的mrnas -解旋酶(hell)，N选择含有-乙酰转移酶结构域(Natd1)、杀手细胞凝集素样受体C3 (Klrc3)和3个由视黄酸8 (Stra8)、蛋白多糖3 (Prg3)和透明带糖蛋白2 (Zp2)刺激的下调mrna。本实验采用PGE2注射24 h后假HP模型大鼠和HP模型大鼠采集L4-L5 DRG组织。与假手术组相比，HP组hell、Natd1和Klrc3 mRNA表达明显上调(图2 c- - - - - -E)．PGE2注射24 h后，其他3种mrna均显著下调(图2 f- - - - - -H)．qPCR显示这些mrna的表达变化趋势与RNA-Seq结果一致，支持了RNA-Seq数据的可靠性。

3.4.疼痛转移过程中derna的功能预测

为了探索急性疼痛向慢性疼痛转变的分子机制，我们进一步对不同组之间的DeRNAs进行了氧化石墨烯富集和通路分析。

HP组中DeRNA上调最显著富集的BP项为急性炎症反应和臭氧反应(图3一)．HP组中DeRNA下调最显著富集的BP项是参与后肾形态发生的间充质-上皮转变、对碱性pH的响应和胶原代谢过程的调节(图3 b)．

HP组中DeRNA上调最显著富集的CC项为核小体、黏附灶、胞质大核糖体亚基和细胞外泌体(图3 c)．HP组中DeRNA下调最显著富集的CC项为细胞外间隙、弹性纤维和细胞外区域(图3 d)．

HP组中上调的DeRNA最显著富集的MF项为转录因子活性、IgM结合、IMP环水解酶活性(图3 e)．HP组中下调的DeRNA最显著富集的MF项为γ-氨基丁酸:钠转运体活性、转运体活性和神经递质:钠转运体活性(图3 f)．

进一步对假HP组和HP组之间的DeRNAs进行KEGG通路富集分析。但很少有通路达到显著富集的标准(FDR < 0.05)。因此，我们确定了基因上调和下调最显著富集的前3条通路。它们是甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢，药物代谢-其他酶，破骨细胞分化(图3 g)和细胞因子-细胞因子受体相互作用、氮代谢和细胞凋亡(图3 h)．

3.5.确认DRG中的CXCL1在HP模型中介导疼痛转移中起关键作用

我们假设，识别经典疼痛模型和HP模型之间重叠的dedna可能有助于识别疼痛治疗的潜在靶点。然而，很少有重叠的DeRNA被鉴定出来。这些DeRNAs被列在补充图S1．

随后，我们对假HP组和HP组之间差异表达的基因进行了PPI分析(图4一)．我们发现神经炎症相关基因的表达在两组之间有显著差异。通过PPI分析，IL1B、TNF SF4、Cxcl1、Xcl1、Gnb3、Gng13和Foxp3被鉴定为主要的枢纽基因，MCODE工具(图4 b)．因为先前的研究表明，IL-1β和TNF-α在许多疼痛模型中广泛参与SGCs与神经元的相互作用，并有助于神经炎症(Souza等，2013；Matsuda等人，2019)，研究PGE2注射后24 h腰椎DRG中IL-1β和TNF-α mRNA的表达水平。芯片数据显示Car + PGE2注射24 h后IL-1β和TNF-α mRNA表达水平明显升高，qPCR证实了这一结果(图5一个，B)．这些结果与上述Car + PGE2注射诱导SGC反应性的发现一致，因为之前的研究表明IL-1β和TNF-α在DRG中主要由SGCs分泌(Matsuda等人，2019)．

CXCL1通过介导中枢神经系统和PNS中的神经元-胶质细胞相互作用，有助于神经性疼痛和炎症性疼痛(席尔瓦等人，2017)．因此，我们进一步检测了HP模型建立24 h后DRG中CXCL1是否高表达。Car+PGE2注射24 h后CXCL1 mRNA表达水平明显升高(图5 c)．为了进一步证实CXCL1在疼痛转化中的作用，我们将抗CXCL1抗体直接注射到L5 DRG中。在DRG中注射抗cxcl1抗体可显著提高HP大鼠的疼痛阈值，但PGE2注射后1小时无明显变化(图5 d)．此外，PGE2注射24小时后，它还显著阻止了L5 DRG中PKCε的激活(图5 e，F)．然而，抗cxcl1抗体注射并没有抑制L5 DRG中sgc的激活(图5 e，G)．总的来说，这些结果表明CXCL1参与sgc介导的PKCε激活和疼痛转移。

4.讨论

神经炎症是一种发生在PNS和CNS的炎症形式，长期以来一直被认为是慢性疼痛的关键机制。然而，周围神经炎症如何导致慢性疼痛仍不清楚。在这项研究中，我们在DRG中检测到一个神经炎症过程，涉及sgc的激活和CXCL1释放的增加，从急性疼痛过渡到慢性疼痛。在不抑制sgc激活的情况下，阻断CXCL1的功能部分地预防了慢性疼痛。结果表明，PNS外周痛觉感受器产生的神经炎症可能导致慢性疼痛。

神经胶质细胞的过度激活和细胞因子和趋化因子的增加是神经炎症的两个特征(Ji等，2014)．SGCs与中枢神经系统中的星形胶质细胞具有相同的生物学特性(Ceruti 2021)，在PNS的神经炎症期间被激活(Matsuda等人，2019)．先前的研究报道，神经损伤或持续炎症不仅会引起神经元变化导致外周敏化，还会导致DRG中sgc的激活(Blum等人，2014；舒尔特等人，2022)．众所周知，SGCs过度激活有助于外周神经炎症和病理性疼痛通过SGC-neuron交互。先前的一项研究表明，DRG中sgc的激活水平，因急性外周炎症而增加，恢复到正常水平，并且这种现象伴随着炎症的消退(Souza等，2013)．此外，动物持续的炎症性疼痛和神经病理性疼痛往往伴有持续的炎症和神经损伤。上述结果表明，痛觉刺激的存在可能是SGC激活所必需的。在这里，我们观察到HP模型大鼠SGC激活的持续时间明显长于仅注射PGE2的大鼠。由于注射PGE2 24 h后HP模型大鼠未见明显外周炎症或神经损伤，结果表明即使在无痛觉刺激的情况下sgc仍保持激活状态。KEGG通路分析预测的氮代谢功能下降可能是SGC持续激活的潜在机制，因为外周神经元释放的NO能够激活SGC (Hanani和Verkhratsky, 2021)．

许多研究表明，阻断SGC激活不仅可以缓解炎症性疼痛，还可以缓解神经病理性疼痛(密封,2016)．在本研究中，通过直接向DRG(左L5)注射Fc(降低SGC激活和功能)，我们发现选择性阻断SGC激活不仅可以防止Car注射后PGE2引起的持久机械性痛觉过敏(>24 h)，还可以缓解急性疼痛(1 h)。SGC激活能够诱导痛觉过敏或异常痛，正如先前的研究所证明的(Ceruti 2021)．假HP模型大鼠注射PGE2 24小时后未观察到PWTs的显著下降，如图所示图1一个．结果表明，PGE2在该时间点没有上调GFAP的表达。此外，先前的一项研究表明，注射Car后GFAP的表达水平增加，但恢复到正常水平，这一现象伴随着炎症的消退(Souza等，2013)．HP模型大鼠的PWTs在Car注射后7天恢复到正常水平，如图所示图1一个．结果表明，即使Car激活sgc，注射7天后GFAP表达水平恢复正常。PGE2注射(Car后7天)显著提高了GFAP的表达水平，如图图1 b以及被gfap阳性细胞包围的神经元的百分比，如图所示图1 c．上述结果表明，仅注射PGE2可暂时诱导SGC反应，且这种SGC反应不能维持24 h。然而，Car注射后注射PGE2可诱导SGC反应24小时。先注射Fc后注射PGE2可抑制DRG中GFAP表达的增加。因此，我们认为Fc处理可以阻止PGE2注射24 h后GFAP表达的上调。DRG中的PKCε是PNS中痛觉敏化的主要介质，导致持久的痛觉过敏(>24 h) (约瑟夫等人，2003年；Parada等人，2003年)．在本研究中，Fc注射也降低了DRG中PKCε以及GFAP的表达水平。我们之前的研究表明，在腰椎DRG中阻止PKCε激活可以调节疼痛的过渡(Fang等，2021)．上述结果表明SGC激活参与了急性疼痛向慢性疼痛的转变。更有趣的是，Fc还可以缓解注射PGE2后1 h HP模型大鼠的急性疼痛，提示快速短暂的SGC激活可能参与了PGE2诱导的急性炎症性疼痛。这是后腿注射PGE2激活腰椎sgc的第一个线索。sgc在pge2诱导的急性疼痛和慢性疼痛中的参与差异尚不清楚，我们将进一步研究这一课题。

许多细胞因子和趋化因子已被报道参与神经元-胶质细胞或胶质细胞-神经元相互作用。例如，在患有神经病理性疼痛和炎症性疼痛的哺乳动物中，外周神经元分泌的ATP和CX3CL1分别通过各自的受体(即P2X7和CX3CR1)激活SGCs (Souza等，2013；刘等，2018)．前炎症细胞因子和趋化因子，如IL-1β， TNF-α和CCL2，被认为是sgc介导的外周神经元敏化的主要贡献者(波塔等人，2012年；Song等，2014；林等人，2019)．但HP模型大鼠与SNI/CFA模型大鼠DRG中DeRNA存在显著差异(补充图S1)，很少有人知道SGC激活在HP模型中如何维持痛觉过敏。本研究通过KEGG通路分析发现HP模型大鼠DRGs中的DeRNAs富集于多条信号通路中。在这些通路中，GABAAR能突触通路首先引起了我们的注意，因为我们之前的研究表明GABAAR表达的降低参与了疼痛的转变(Wang等，2021)．然后我们发现细胞因子-细胞因子受体相互作用和TNF信号通路也得到了丰富。细胞因子和细胞因子受体的相互作用主要介导神经元-胶质细胞的串扰，从而导致神经元兴奋和功能的改变。通过PPI分析，我们发现大量促炎细胞因子和趋化因子高表达。其中一些，如IL1β， CCL家族成员和TNF家族成员，已被证明与慢性疼痛有关。CXCL1也是KEGG通路分析和PPI分析鉴定的枢纽基因。先前的一项研究表明，抑制脊髓和三叉神经节中的CXCL1/CXCR1通路可显著缓解异位痛和痛觉过敏(席尔瓦等人，2017)．此外，DRG神经元中的CXCL1通路触发中性粒细胞募集和随后的机械性异位痛(Zhang等，2019)．最重要的是，之前的一项研究表明，短期应用CXCL1能够调节TRPV1+/IB4+ DRG神经元的活性(Deftu等人，2017，2018)．此外，IB4+ DRG神经元中PKCε的激活和TRPV1表达的增加在疼痛转变中发挥重要作用(王等，2018；Fang等，2021)．因此，我们推测CXCL1可能参与了急性疼痛向慢性疼痛的转变。结果显示，我们发现Car注射后注射PGE2后CXCL1 mRNA表达水平升高，与全基因组表达谱结果一致。此外，使用中和抗体阻断L5 DRG中CXCL1的功能部分改善HP模型大鼠的慢性疼痛，并显著降低PKCε的表达水平。上述结果表明CXCL1参与了急性疼痛向慢性疼痛的转变。

先前的研究表明CXCL1在外周伤害感受器刺激后由中枢神经系统的星形胶质细胞分泌(倪等，2019)．角节内注射抗cxcl1抗体未能调节PGE2注射24 h后DRG中GFAP表达的增加。因此，我们推测CXCL1由激活的sgc分泌，并诱导DRG中的PKCε激活。我们还试图通过免疫荧光染色来确定CXCL1蛋白和SGC标记物之间的共定位。抗体在DRG切片中未检测到CXCL1。这可能是因为CXCL1的表达水平低于一抗的检测范围。我们将进一步探索新的实验技术，如原位杂交或使用更敏感的一抗，以进一步研究CXCL1的表达和PNS中疼痛转移的机制。我们没有预期抗cxcl1抗体注射会增加GFAP表达或诱导SGC反应。然而，CXCL1的阻断增加了GFAP的表达。我们推测DRG注射可能影响GFAP的表达。根据中提供的数据图1 e， DRG注射不影响GFAP表达水平。由于HP模型大鼠也注射了DRG，目前仍难以解释为什么抗cxcl1组的GFAP表达水平高于HP组。抗cxcl1抗体注射诱导GFAP表达增加的原因有待进一步研究。

5.结论

本研究结果表明，L4-L5 DRGs中的SGC反应性有助于HP和急性疼痛。激活的sgc可能通过分泌CXCL1部分引起慢性疼痛。

数据可用性声明

该研究中提出的原始贡献已包括在文章/中补充材料，如有任何查询，可向通讯作者查询。

作者的贡献

JD和JuF:概念化。JuF:数据管理。JuF, JiF和JD:资金收购。JuF, SW, DX, XS, YL, BL:调查。SW, MY, DX和XH:方法论。写作——初稿。JuF:写作-评论和编辑。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

本研究由国家自然科学基金项目(no . 82174490)和浙江省医药卫生科技工程创新人才计划项目(no . 2021RC098)资助。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2023.1089162/full#supplementary-material

参考文献