逆转录病毒介导的achaette鳞状复合物样1过表达后，出生后大脑皮层少突胶质细胞祖细胞增殖增强在活的有机体内

简介

出生后哺乳动物的大脑基本上没有持久的神经发生，除了一些特殊的小生境，如侧脑室的室管膜下区和齿状回的颗粒下区(Denoth-Lippuner和Jessberger, 2021年)．在所有其他大脑区域，由于疾病或损伤而失去的神经元无法被取代，导致不可逆的电路功能障碍和功能障碍。利用神经胶质的神经源性潜能，通过直接谱系重编程来产生新的神经元，已经成为一种潜在修复非神经源性脑区(如大脑皮层)病变回路的方法。庇隆和贝宁格，2015)．

基本螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子Ascl1 (Ascl1)协调皮层发育的多个方面，在某些方面是相反的，如细胞增殖和细胞周期退出，以及神经命运的选择(卡斯特罗等人，2011年；吉列莫特和哈桑，2017年)．一般认为，振荡水平的Ascl1表达促进祖细胞增殖，而高水平和恒定水平促进神经元分化(Imayoshi et al.， 2013)．

在腹侧端脑，Ascl1通过调节远端基因家族同源盒基因的表达来控制gaba能神经发生(Dlx祖细胞内的基因(Casarosa等人，1999年；Poitras等人，2007年)．利用其神经源性活性，我们先前证明了Ascl1在小鼠出生后皮质星形胶质细胞中的表达在体外足以将这些神经元重新编程为具有gaba能神经元特性的功能神经元(Berninger等人，2007年；海因里希等人，2010年)．同样，Ascl1被发现可以将培养的人类细胞(包括成纤维细胞和周细胞)重编程为神经元在体外（Karow等人，2012年；Chanda等人，2014)．最后，Ascl1和Dlx2在成年癫痫海马反应性胶质细胞中的共表达导致海马中间神经元的神经化学和电生理特征的诱导(Lentini等人，2021年)．除了在神经发生中发挥重要作用外，Ascl1在胶质瘤发生中也发挥重要作用。例如，研究发现，Ascl1缺失会导致背侧端脑新生儿少突胶质细胞生成减少，导致Ascl1缺失细胞中星形胶质细胞相对增加(Nakatani et al.， 2013)．这些研究提出了Ascl1是否诱导胶质细胞向神经元转化的问题在活的有机体内或潜在地调节胶质发生的其他方面，如增殖。

在这里，我们通过在出生后第5天(P5)将编码ascl1的逆转录病毒注射到小鼠大脑皮层来解决这个问题，即在胶质细胞群大规模扩张的时候(Psachoulia等人，2009年；Ge等，2012)．我们发现Ascl1只诱导非常有限的胶质到神经元的重编程在活的有机体内．相反，我们观察到少突胶质细胞祖细胞(OPCs)增殖活性急剧增加，但星形胶质细胞没有。这些数据不仅揭示了Ascl1在出生后早期星形胶质细胞中单独过表达时具有相当有限的神经元重编程能力，而且还揭示了不同胶质细胞类型对这种脑前基因的高度不同的反应。

材料与方法

细胞培养

出生后皮层星形胶质细胞是在出生后5-7天(P5-7)从C57BL/6J小鼠的皮层中分离出来的，这些细胞来自美因茨大学医学中心的转化动物研究中心。P5-P7星形胶质细胞的培养如前所述(海因里希等人，2011；谢里夫等人，2021年)．简单地说，分离后，细胞在Astromedium中扩增7-10天:Dulbecco 's Modified Eagles培养基，营养混合物F12 (DMEM/F12, Gibco, Carlsbad, CA, USA, 21331-020);10%胎牛血清(FBS, Invitrogen, 10270-106);5%马血清(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国，16050-130);1×青霉素/链霉素(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，MA, USA, 15140122);1× L-GlutaMAX补充剂(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, 35050-0380);1× B27增刊(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，MA, USA, 17504001);添加10 ng/μl表皮生长因子(EGF;Peprotech, Cranbury, NJ, USA, AF-100-15)和10 ng/μl碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2;Peprotech, Cranbury, NJ, USA, 100-18B)。 Cells were incubated at 37°C in 5% CO₂．当细胞达到70-80%合拢度时，用0.05%胰蛋白酶EDTA (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, 15400054)在37℃下分离细胞5分钟。随后将细胞播种到聚d -赖氨酸氢溴化物包被(PDL;Sigma, Merck, Germany, P0899)玻璃盖片(12毫米，Menzel-Gläser, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, 631-0713)置于24孔板中，密度为50,000-80,000个细胞/孔，在500 μl Astromedium中添加10 ng/μl EGF和10 ng/μl FGF-2。

质粒和逆转录病毒

以莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)为基础的逆转录病毒载体(海因里希等人，2011)在鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子(pCAG)的控制下表达Ascl1。一个绿色荧光蛋白(GFP)或DsRed报告蛋白被克隆在一个内部核糖体进入位点(IRES)的后面。为了生成pCAG-Ascl1-IRES-DsRed/GFP逆转录病毒构建物，通过从pCIG2父母载体中去除Ascl1编码序列，生成包含attL重组位点的编码序列的盒式磁带(李等，2014）通过Xho我/萨尔我有双重限制。分离片段插入pENTRY1A Dual Selection(赛默飞世尔科学公司，Waltham, MA, USA)中间向量线性化通过萨尔I.最终的逆转录病毒构建物随后通过LR Clonase II (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, 11791020)催化的重组获得，该重组物将目的载体pCAG-ccdB-IRES-DsRed或pCAG-ccdB-IRES-GFP中的ccdB盒替换为Ascl1编码序列。基于mmlv的逆转录病毒载体在pCAG启动子控制下，仅编码IRES后面的荧光蛋白GFP或DsRed (pCAG-IRES-DsRed/pCAG-IRES-GFP)转导(海因里希等人，2011)用于对照实验。病毒颗粒使用gpg辅助游离包装细胞产生水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)-伪型逆转录病毒颗粒(Ory等人，1996年)．通过转导HEK293培养物滴定病毒株。使用的病毒滴度在10的范围内⁷你/毫升。

逆转录病毒转导

在培养箱中培养4 h后，用1 μl逆转录病毒/孔转导细胞，在8% CO中37℃培养₂．1 d后，除去处理过的培养基，代之以500 μl B27分化培养基:DMEM/F12 (Gibco, Carlsbad, CA, USA, 21331-020);1×青霉素/链霉素(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，MA, USA, 15140122);1× L-GlutaMAX补充剂(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, 35050-0380);1× B27补充(赛默飞世尔科学，沃尔瑟姆，MA, USA, 17504001)。再用1 μl/孔的逆转录病毒处理细胞。1天后，用新鲜的B27分化培养基培养至1ml /孔。细胞共培养7天在体外固定前进行免疫细胞化学分析。

免疫细胞化学

细胞用4%多聚甲醛(PFA, Sigma, Merck, Germany, P6148)固定10-15分钟，用1× PBS (Gibco, Carlsbad, CA, USA, 70013-016)清洗三次，然后在4℃保存。清洗后的细胞首先在室温(RT)下用阻断液[3%牛血清白蛋白(BSA;σ,默克公司、德国、A7906)和0.5% Triton x - 100(σ,默克公司、德国、X100)与初级抗体稀释1×PBS)然后在屏蔽解决方案2 - 3 h rt与1×PBS三洗后,细胞被孵化与二次抗体1 h rt,细胞然后用DAPI复染色(σ,默克公司、德国、D8417)稀释1:1,000阻碍解决方案,然后洗了三次1×PBS之前安装和Aqua Polymount(美国Polysciences沃灵顿,PA, 18606 - 20)。使用以下一抗:β-Tubulin III(小鼠IgG2b, 1:10 00;Sigma, Merck，德国，T8660);绿色荧光蛋白(GFP，鸡肉，1:300,AvesLab，戴维斯，CA，美国，GFP-1020);GFAP(兔子，1:10 00，安捷伦，圣克拉拉，加州，美国，Z0334);红色荧光蛋白(RFP，大鼠，1:400,Proteintech Group Inc.，罗斯蒙特，伊利诺伊州，美国，5F8)。二抗在阻断液中稀释1:10 00，并偶联到:A488抗鸡(驴，Jackson Immunoresearch, Ely, UK, 703-545-155);Cy3抗小鼠(山羊，Dianova，汉堡，德国，115-165-166); Cy3 anti-rat (goat, Dianova, Hamburg, Germany, 112-165-167); Cy5 anti-rabbit (goat, Dianova, Hamburg, Germany, 111-175-144).

动物和动物程序

该研究是根据德国动物福利法、用于保护科学目的动物的欧洲指令2010/63/EU和1986年动物(科学程序)法的指导方针进行的，并得到了地方当局的批准(莱茵兰-普法尔茨州管理局，许可证编号23 177 07-G15-1-031;伦敦国王学院伦理委员会和英国内政部，允许编号PD025E9BC和PP8849003)。雄性和雌性C57BL/6J幼崽与它们的母亲一起从Janvier实验室(Le Genest-Saint-Isle，法国)或Charles River实验室(Walden，英国)购买。本研究用于命运定位实验的转基因mGFAP-Cre/EGFP小鼠雌雄均在室内生成。为此，小鼠中Cre重组酶的表达由小鼠GFAP启动子[mGFAP-Cre;B6.Cg-Tg(Gfap-cre)77.6 Mvs/2J, JAX024098] (格里高利等人，2009)与EGFP报告小鼠系[cagg -EGFP;Gt(ROSA)26Sortm1.1(cagg - egfp)Fsh/Mmjax, JAX032037] (Sousa等，2009)．将小鼠置于聚碳酸酯II型笼子(350 cm)中，在12:12 h的明暗循环中饲养²)．动物们得到了食物和水随意所有的努力都是为了减少动物的数量和它们的痛苦。手术前，动物皮下注射卡洛芬[利马德]^®(Zoetis, Parsipanny, NJ, USA)， 4 mg/kg体重，0.9% NaCl (Amresco, VWR国际，Radnor, PA, USA)。通过腹腔注射0.5 mg/kg美代托咪定(Pfizer, New York, NY, USA)、5 mg/kg咪达唑仑(Hameln, Hameln-Germany)和0.025 mg/kg芬太尼(Albrecht GmbH, Aulendorf, Germany)的0.9% NaCl溶液诱导麻醉。将病毒通过玻璃毛细血管(Hirschmann, Eberstadt, Germany, 9600105)拉入大脑皮层，得到20 μm尖端直径。简单地说，用手术刀片在皮肤上做了一个小切口，然后用针小心地打开头骨。每只幼犬都接受了0.5-1 μl的逆转录病毒悬浮液，用于体感觉和视觉皮层区域。注射后，用手术胶(3 M Vetbond, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, NC0304169)缝合伤口，静脉注射2.5 mg/kg Atipamezol (Pfizer, New York, NY, USA)、0.5 mg/kg Flumazenil (Hameln, Hameln- germany)和0.1 mg/kg Buprenorphin (RB pharmaceuticals, Richmond, VA, USA) 0.9% NaCl溶液终止麻醉。幼崽被放在一个温暖的盘子(37°C)上恢复，然后再回到它们的母亲身边。术后一周每天检查恢复状态。

组织制备和免疫组化

动物用120 mg/kg氯胺酮(Zoetis, Parsipanny, NJ, USA)和16 mg/kg Xylazine (Bayer，勒沃库森，德国)(0.9% NaCl溶液，i.p)致死性麻醉，经心灌注预先加热的0.9% NaCl，然后再用冰冷的4%多聚甲醛(PFA, Sigma, Merck, Germany, P6148)。采集大脑，在4%的PFA中4°C固定2小时至一夜。然后，使用振动仪(Microm HM650V, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)制备40 μm厚的冠状切片，并在−20℃的低温保护溶液中[20%葡萄糖(Sigma, Merck, Germany, G8270)， 40%乙二醇(Sigma, Merck, Germany, 324558)， 0.025%叠氮化钠(Sigma, Merck, Germany, S2202)保存在0.5×磷酸盐缓冲液15 mM Na中₂HPO₄⋅12 h₂O (Merck, Darmstadt, Germany, 10039-32-4);16mm NaH₂阿宝₄⋅2 h₂O (Merck, Darmstadt, Germany, 13472-35-0);pH值7.4)。

对于免疫组化，脑切片用1× TBS清洗3次15分钟[50 mM Tris (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, 15504-020);150 mM NaCl (Amresco, VWR International, Radnor, PA, USA, 0241);pH7.6]，然后在封闭溶液中孵育1.5小时:5%驴血清(Sigma, Merck, Germany, S30);0.3% Triton X-100;1×TBS。切片用闭塞液稀释的一抗在RT下孵育2-3小时，然后在4℃下孵育一夜。1× TBS洗涤3步后，用稀释后的阻断液二抗孵育1 h，用1× TBS洗涤2次，用1× TBS溶解1:10 00的DAPI孵育5 min，再用1× TBS洗涤3次。切片用1×磷酸盐缓冲液[30 mM Na₂HPO₄⋅12 h₂O (Merck, Darmstadt, Germany, 10039-32-4);33 mM NaH₂阿宝₄⋅2 h₂O (Merck, Darmstadt, Germany, 13472-35-0);pH值7.4]，并在Superfrost(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)显微镜载玻片上干燥。切片用甲苯进一步脱水，并覆盖有DPX支架的覆盖镜用于组织学(Sigma, Merck, Germany, 06522)或直接安装有延长™Gold (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, P36930)。使用以下一抗:achaet - sccute complex-like 1 (Ascl1，小鼠IgG1, 1:400, BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA, 556604);Doublecortin (DCX，山羊，1:250,Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-8066);绿色荧光蛋白(GFP，鸡肉，1:10 00,AvesLab, Davies, CA，美国，GFP-1020);胶质纤维酸性蛋白(GFAP，兔，1:300，安捷伦，圣克拉拉，加州，美国，Z0334);电离钙结合适配器分子1 (Iba1，兔，1:80，安捷伦，圣克拉拉，CA，美国，16A11);mCherry(鸡肉，1:300,EnCor生物技术，Gainsville，佛罗里达州，美国，CPCA-mCherry);红色荧光蛋白(RFP，兔，1:500,Biomol，汉堡，德国，600401379S); and SRY-Box 10 (Sox10, goat, 1:100, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-17342). Secondary antibodies were made in donkey and conjugated with: A488 (anti-chicken, 1:200, Jackson Immunoresearch, Ely, UK, 703-545-155); A488 (anti-rabbit, 1:200, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, A21206); A647 (anti-rabbit, 1:500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, A31573); A488 (anti-mouse, 1:200, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, A21202); A647 (anti-mouse, 1:500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, A31571); Cy3 (anti-chicken, 1:500, Dianova, Hamburg, Germany, 703-165-155); Cy3 (anti-goat, 1:500, Dianova, Hamburg, Germany, 705-165-147); Cy3 (anti-mouse, 1:500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, A10037); Cy3 (anti-rabbit, 1:500, Dianova, Hamburg, Germany, 711-165-152); and Cy5 (anti-goat, 1:500, Dianova, Hamburg, Germany, 705-175-147).

5-乙基-2 ' -脱氧尿苷掺入试验

动物在灌注前3小时接受单次注射50 mg/kg (0.9% NaCl和0.25% DMSO, i.p) 5-乙基-2 ' -脱氧尿苷(EdU, Sigma, Merck, Germany, 900584)，注射后12天。免疫组化方案修改如下，用于组合检测EdU:脑切片用TBS冲洗三次，然后在封闭溶液中孵育2 h[2.5%驴血清，2.5%山羊血清(当Sox10未染色时;Sigma, Merck, Germany, G9023)， 0.3% Triton X100 in TBS]。切片用闭塞液稀释的一抗在RT下孵育2小时，然后在4℃下孵育一夜(Sox10未染色时)，或在4℃下孵育72小时(Sox10染色时)。TBS洗三次后，用Click-iT EdU Imaging Kit反应鸡尾酒(500 μl: 1× Click iT EdU反应缓冲液430 μl, CuSO 20 μl) RT孵育30 min₄， 1.2 μl Alexa Fluor Azide 647, 50 μl Click iT EdU缓冲添加剂;赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国，C10340)。最后，切片用TBS冲洗三次，用DAPI (5 μM在PBS中)在RT下孵育5分钟，再用TBS冲洗三次，然后使用Mowiol (Cat# 17951-500, Polysciences，沃灵顿，美国，宾夕法尼亚州)补充DABCO (Cat# 15154-500, polyciences，沃灵顿，宾夕法尼亚州，美国)安装。使用以下一抗:红色荧光蛋白(RFP，兔子，1:500,Biomol，汉堡，德国，600401379S);SRY-Box 10 (Sox10，山羊，1:300,R&D系统，明尼阿波利斯，美国，AF2864)。使用以下二抗:山羊抗兔A568 (1:10 00;赛默飞世尔，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国，A-11011)，驴抗兔Cy3(1:1,1000，杰克逊免疫研究公司，伊利，英国，711-165-152)和驴抗山羊A647 (1:10 00;赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国，AB2535864) (A647, 1:10 00)。

成像和数据分析

共聚焦图像使用配备4个pmt的TCS SP5(徕卡微系统，Wetzlar，德国)共聚焦显微镜(分子生物学研究所，美因茨，德国)，4个激光器(405二极管，Argon, HeNe 543, HeNe 633)和使用20×干物镜(NA 0.7)或40×油物镜(NA 1.3)的快速共振扫描仪，或使用配备4个固体激光器(405,488,561，德国)的蔡司LSM 800共聚焦显微镜(卡尔蔡司显微镜，耶拿)获得。和633 nm)在20×物镜(NA 0.8)(发育神经生物学中心，伦敦国王学院)。或者，使用蔡司Axio成像仪获取图像。M2荧光显微镜，配备apoome(卡尔蔡司显微镜，耶拿，德国)在20×干物镜(NA 0.7)或63×油物镜(NA 1.25)。对于脑切片成像，采用以0.3 ~ 2.13 μm为间距的连续z -stack对整个切片厚度进行成像。

为在体外实验中，从不同动物的独立培养物中获得生物重复(n)。为每一个n，该值对应于两个技术重复(即两个覆盖页)的平均值。细胞定量采用4 × 4瓦扫描(单个瓦尺寸:624.70 μm × 501.22 μm)。为在活的有机体内实验中,n对应于动物的数量。定量是在等距切片(240或480 μm)上进行的，覆盖整个区域的转导细胞。对于mGFAP-Cre/EGFP小鼠的命运定位实验，每只动物在3-5个切片中定量细胞。

对于用于说明的图像，在Photoshop中统一调整每个通道的色彩平衡(Adobe, Mountain View, CA, USA)。如有必要，更改了查找表，以保持图形内颜色编码的一致性。在适当的情况下，在斐济(Fiji.sc)对呈现椒盐噪声的图片应用中值滤波器(despeckle)，并通过去除离群像素来过滤噪声。

统计分析

独立实验次数(n)和分析的单元格数在正文或图例中报告。数据以均值±标准差表示。采用SPSS Statistics 23 V5 (IBM, Armonk, NY, USA)进行统计分析。采用Shapiro-Wilk检验评估分布的正态性，采用Ascl1组与对照组差异的显著性进行分析t-测试独立样品或曼-惠特尼U测试(分别针对正态分布和非正态分布数据)。P-value在图中表示。图表在GraphPad Prism 5 (GraphPad, San Diego, CA, USA)中制备。

结果

achaette - sccute complex-like 1将出生后的皮质胶质细胞转化为神经元，效率非常低在活的有机体内

我们早期的工作表明Ascl1可以将培养的出生后星形胶质细胞重编程为神经元(Berninger等人，2007年；海因里希等人，2010年；Gascon等人，2016)．在这里，我们研究了Ascl1是否可以重编程增生性皮质胶质细胞走向神经元的命运在活的有机体内．皮质神经胶质细胞在出生后第一周通过局部增殖大量扩张，并可被逆转录病毒载体靶向(Ge等，2012；Clavreul等人，2019)．因此，逆转录病毒可以作为合适的载体来检验强制表达Ascl1可以诱导神经元重编程的假设。为了验证该方法，我们首先在P5时将仅编码报告基因(pCAG-IRES-DsRed)的对照病毒注射到小鼠大脑皮层，并在注射后3天(3 dpi)通过免疫组织化学分析评估转导细胞的身份(图1一个)．我们发现几乎所有转导细胞的胶质标记免疫阳性(图1 b)．大多数转导细胞对星形胶质标记物GFAP具有免疫反应性(67.0±8.9%，753个转导细胞分析)。n= 3只小鼠;图1 b, C)，其余为Sox10免疫反应的少突胶质细胞(29.6±6.1%，共分析753个转导细胞，n= 3只小鼠;图1 b, C)．我们很少发现转导细胞对微胶质标记物Iba1有免疫反应(0.9±1.0%，578个转导细胞分析，n= 3只小鼠;图1 b, D)．重要的是，对照转导的细胞中没有一个表达未成熟神经元标记物DCX(0.0±0.0%，578个转导细胞被分析，n= 3只小鼠;图1 b, D)．这些结果表明，在P5小鼠大脑皮层注射逆转录病毒在活的有机体内专门转导星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系。

为了检查强制表达Ascl1的后果，我们接下来注射对照(pCAG-DsRed)或编码Ascl1的逆转录病毒(pCAG-Ascl1-DsRed或pCAG-Ascl1-GFP)，并研究脑内因子是否可以通过免疫组织化学(图2一个)．基于先前7-14天内逆转录病毒介导的胶质-神经元重编程的证据，在12 dpi时进行分析在活的有机体内（海因里希等人，2014；Gascon等人，2016；Herrero-Navarro等人，2021)．在注射逆转录病毒的部位发现许多报告阳性细胞(图2 b)，并且Ascl1在经Ascl1转导的细胞中有效表达，而在对照转导的细胞中不表达(图2 c)．对照组细胞缺乏DCX表达(0.0±0.0%，2157个细胞被分析，n= 3只小鼠;图2 d, E)，证实控制载体没有诱导细胞命运开关。令人惊讶的是，ascl1转导的细胞对DCX也大部分保持免疫阴性(图2 d, E(Ascl1: 4.6±1.6%，分析了720个转导细胞，但只有少量(尽管有统计学意义)的细胞表现出未成熟的神经元样形态并表达DCX。n= 3只老鼠)(图2 d, E)．为了确认编码ascl1的逆转录病毒的生物活性，我们用对照(pCAG-DsRed或pCAG-GFP)或编码ascl1的逆转录病毒(pCAG-Ascl1-DsRed)转导皮质星形胶质细胞培养物(补充图1A)．用对照病毒转导后，几乎没有发现β-微管蛋白iii免疫反应细胞(0.1±0.2%，1,398个转导细胞分析)。n= 3个生物重复;补充图1B,C)．相比之下，经ascl1编码逆转录病毒转导的星形胶质细胞获得了神经元样形态，并表达β-微管蛋白III(27.3±3.8%，3061个转导细胞分析)。n= 4个生物重复;补充图1B,C)．总之，我们的结果表明，尽管Ascl1具有神经源性潜能在体外，在活的有机体内用Ascl1重新编程基本上失败了。

出生后皮质胶质细胞中achaite - scedcomplex -like 1的表达增加了表达少突胶质标记的细胞的相对数量

鉴于只有少数Ascl1转导的细胞被转化为神经元，我们检查了剩余的转导细胞是否对Ascl1有反应，神经胶质标记下调。因此，我们分析了泛少突胶质标记物Sox10和星形胶质标记物GFAP在ascl1转导细胞中的表达(图3 a - c)．与我们在3 dpi处的分析一致(图1)， 12 dpi时对照转导的细胞为胶质细胞，其中2 / 3的细胞表达星形胶质标记GFAP(63.3±12.1%，共分析1885个转导细胞，n= 3只小鼠)，另外三分之一表达Sox10(35.6±11.3%，共分析1885个转导细胞，n= 3只小鼠;图3 a, C)．正如预期的那样，GFAP和Sox10的表达在对照转导细胞中是互斥的(GFAP/Sox10阳性细胞的0.3±0.6%，分析了1885个转导细胞，n= 3只小鼠;图3 b, C而且辅助电影1)．在转导ascl1编码病毒后，我们观察到胶质标记物相对表达的显著改变。引人注目的是，只有1 / 5的转导细胞专一表达GFAP (Ascl1, 18.7±3.1%，848个转导细胞分析)。n= 4只小鼠)，与对照转导相比减少了三倍。有趣的是，GFAP表达的降低伴随着仅表达sox10的细胞的相对数量增加两倍(70.0±7.7%，848个转导细胞分析)。n= 4只小鼠;图3 c)．此外，在ascl1转导的细胞中观察到共表达Sox10和GFAP的细胞相对数量有适度但显著的增加(图3 b, C而且辅助电影2)．ascl1编码病毒转导后GFAP/ sox10免疫阳性细胞的检测(4.5±2.6%，848个转导细胞分析)n= 4只老鼠，图3 b, C而且辅助电影2)可能捕获处于“混合”胶质状态的细胞。总之，这些结果表明，尽管在很大程度上不能将增殖性胶质细胞重定向到神经发生，但这些细胞似乎对Ascl1过表达有反应。Sox10-与gfap阳性细胞相对数量的变化可能是:(i)星形胶质谱系向少突胶质谱系的转变;(ii)分别少突胶质细胞或星形胶质细胞系细胞增殖(和/或死亡)率的胶质细胞类型特异性变化。

遗传命运定位反对大量星形胶质细胞到少突胶质细胞祖细胞转换后的achaette鳞状复合物样1过表达

受到这一发现的吸引，我们使用mGFAP- cre /EGFP小鼠进行了遗传命运映射实验，以跟踪转导的星形胶质细胞的命运，其中通过cre介导的去除EGFP上游loxp侧的STOP盒，在具有活性mGFAP启动子的细胞(即星形胶质细胞)中特异性地实现永久绿色荧光标记。我们在P5 mGFAP-Cre/EGFP小鼠皮层中注入对照(pCAG-DsRed)或ascl1编码(pCAG-Ascl1-DsRed)逆转录病毒，并在12 dpi时定量表达EGFP和/或Sox10的细胞在rfp阳性转导细胞中的相对比例(图4)．根据我们的免疫组化分析(图3)，大多数用对照逆转录病毒转导的细胞呈egfp阳性(分析了585个转导细胞，n= 3只老鼠，图4 b，上面的饼图，黄色和白色的饼图扇区)，表明星形胶质的身份。虽然我们之前没有在对照转导中观察到共表达GFAP和Sox10的细胞(图3)，我们在这里记录了少量共表达EGFP和Sox10的对照转导细胞。其余的转导细胞没有命运映射(egfp阴性)，正如预期的那样，部分由sox10阳性少突胶质细胞组成(图4 b，上部饼图，粉色扇区饼图)。根据我们的免疫组化分析(图3)，我们注意到Ascl1转导后的相对分布非常不同(分析了878个转导细胞，n= 3只老鼠，图4 b，下饼图)。与我们之前的分析相似，我们发现ascl1转导的细胞中有较大比例的sox10阳性(图4 b，下饼图，白色和粉色扇区饼图)，与对照组相比。在egfp阳性细胞中也检测到sox10阳性细胞(图4 b(下饼图，白色饼图扇区)，这与观察到一些Ascl1转导的细胞同时表达GFAP和Sox10相一致。然而，最重要的是，我们的分析显示，绝大多数sox10阳性细胞仍然是egfp阴性(图4 a, B，下饼图，粉色扇区饼图)。综上所述，这些数据表明，在ascl1 -逆转录病毒转导的细胞中，所观察到的表达sox10的少突胶质细胞相对比例的增加，在很大程度上不是由于星形胶质细胞直接转化为少突胶质细胞。

achaite - scedcomplex -like 1诱导sox10阳性少突胶质细胞祖细胞增殖

为了研究Ascl1在OPCs和星形胶质细胞中促进更高增殖率的另一种可能性，我们在牺牲12 dpi前3小时全身注射胸苷类似物EdU来脉冲标记增殖细胞(图5 a, B)．出生后两周后，皮质神经胶质的扩张迅速下降(Psachoulia等人，2009年；Ge等，2012；Clavreul等人，2019)．因此，我们发现对照转导的细胞中没有一个包含EdU(0.0±0.0%，分析了218个转导细胞，n= 3只小鼠;图5 a, C)．引人注目的是，3 h EdU脉冲导致标记了大量ascl1转导细胞(14.1±4.7%，分析了177个转导细胞，n= 3只小鼠;图5 a, C)．对u -阳性ascl1转导细胞的鉴定分析表明，几乎所有细胞都表达Sox10(96.7±5.8%)，56个u -阳性ascl1转导细胞被分析，n= 3只小鼠;图5 d)，表明对少突胶质谱系的增殖状态有特定的影响。总之，我们的数据表明，Ascl1选择性地促进少突胶质细胞的细胞周期活性，而不是星形胶质细胞谱系，从而解释了Ascl1过表达后这两种谱系相对数量的变化在活的有机体内．

讨论

在本研究中，我们评估了Ascl1过表达在出生后早期大脑皮层胶质细胞增殖扩张期的影响。与之前的发现相反在体外（Berninger等人，2007年；海因里希等人，2010年；Gascon等人，2016我们发现Ascl1的神经胶质到神经元的转换在出生后皮层早期是非常低效的在活的有机体内．然而，Ascl1过表达改变了转导细胞中sox10阳性OPCs与gfap阳性星形胶质细胞的数量。虽然星形细胞到opc的转换可能发生了微小的贡献，但这种影响可以在很大程度上归因于opc中细胞周期活性的增加，如遗传命运定位和EdU掺入实验所示。总的来说，这些数据表明，Ascl1在不同的胶质细胞类型中对细胞周期活动有不同的影响，突出了细胞环境对Ascl1过表达后果的重要性。

由Ascl1引发的神经胶质到神经元的低转化率在活的有机体内与先前的研究报告一致，在成人损伤皮层的反应性胶质细胞中，逆转录病毒或慢病毒介导的Ascl1单独表达后，神经元重编程效率低下(海因里希等人，2014)、成人纹状体(牛等，2015)，及成人受损脊髓(Su等，2014)．与这些研究相反，另一项研究报告了腺相关病毒(AAV)介导的Ascl1在中脑背侧、纹状体和体感觉皮层的表达后，星形细胞非常有效地重编程为成熟神经元(刘等，2015)．然而，最近有报道称，在aav介导的Neurod1表达后，内源性神经元被误认为是胶质源性神经元，这可能是由于转基因序列特异性效应的作用在独联体（Wang等，2021)．因此，这是重编程效率明显差异的一个可能解释在活的有机体内与Neurod1类似，aav介导的Ascl1表达导致内源性神经元的标记。未来的研究需要将aav介导的重编程因子(如Ascl1)的表达与遗传谱系追踪相结合，以阐明似乎诱导的神经元的起源(Wang等，2021；Leaman等人，2022)．

Ascl1重编程效力的明显差异在体外而且在活的有机体内可归因于多种因素:(i)与星形胶质细胞相比，培养星形胶质细胞的细胞可塑性增强在活的有机体内尽管两人年龄相仿，增殖状态相似。这里所采用的培养和重编程星形胶质细胞的方案可以增强它们进行细胞命运转换的能力。事实上，之前的一项研究表明，允许星形胶质细胞成熟在体外导致重编程率急剧下降，这一效应可归因于REST/coREST抑制因子复合物的激活和伴随的表观遗传成熟(Masserdotti et al.， 2015)．在活的有机体内， REST/coREST复合物的活性可能已经更高，从而保护了星形胶质细胞的身份不受ascl1诱导的神经源性重编程的影响。(ii)另一个重要区别是当地环境明显更为复杂在活的有机体内．对于其他类型的细胞对经历重编程的细胞所施加的影响，我们几乎一无所知。然而,在体外研究表明，经过Ascl1和Sox2重编程的人类周细胞经历了一个神经干细胞样阶段，在此阶段，它们对几种细胞间信号通路，包括Notch信号通路(Karow等人，2018)．因此，可以想象，信号分子以及细胞在局部环境中分泌的细胞外基质成分可能会影响早期和更脆弱的重编程阶段，从而限制神经发生的进程。总体上非常低的转换效率表明，神经胶质细胞具有有效的保护机制，可以保护它们免受神经源性命运的影响。事实上，这些保护机制是有效的，即使面对强大的转录因子具有先驱因子活性，如Ascl1 (Wapinski等，2013；拉波索等人，2015年；Park等，2017)．

虽然Ascl1在星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系中没有诱导神经源性转化，但我们观察到病毒转导的星形胶质细胞与少突胶质细胞的比例发生了显著变化。这种转变主要是由于Ascl1过表达后sox10阳性opc的增殖增加，而星形胶质细胞到opc的转换可能只起了很小的作用。事实上，大约15%的表达ascl1的OPCs在3小时的时间窗口内合并EdU可能表明，与对照条件下的OPCs相比，该种群均匀增殖，细胞周期长度大大缩短(Psachoulia等人，2009年)．EdU饱和实验将有助于确定在所有表达ascl1的OPCs中积极参与细胞周期的细胞的生长分数。此外，研究ascl1过表达的OPCs是否最终退出细胞周期并分化为少突胶质细胞将是非常有趣的。如果是这样，ascl1诱导的OPC库的扩张可能是脱髓鞘疾病中少突胶质细胞再生的一种策略。这里观察到的Ascl1诱导的OPC细胞周期活性与先前报道的Ascl1在成人脊髓中调节OPC增殖的生理作用的研究结果一致(Kelenis等人，2018)．

有趣的是，先前在成人海马体中的研究报告表明，在神经干细胞中类似的逆转录病毒Ascl1表达促进了少突胶质细胞的发生，而不是gaba能神经的发生(杰斯伯格等，2008年；Braun等人，2015)．虽然这些数据被解释为Ascl1诱导的成人神经干细胞细胞命运的变化，但我们的数据可能开启了另一种可能性，即Ascl1过表达增强了逆转录病毒靶向OPCs的局部增殖，甚至可能是两种效应的结合。

先前的工作强调了Ascl1的增殖促进作用。虽然Ascl1对腹侧端脑祖细胞的神经元分化至关重要，但Ascl1也调节参与细胞周期调节的基因，Ascl1缺失导致祖细胞增殖减少(卡斯特罗等人，2011年)．此外，Ascl1在胚胎皮层祖细胞中过表达诱导增殖和胶质母细胞标记物Sox9的表达(李等，2014)．同样，Ascl1在成年海马的神经干细胞激活中起着关键作用(安德森等人，2014)，而下调则促使经济恢复平静(Urban等，2016)．此外，Ascl1诱导也参与星形胶质细胞中神经源性程序的重新激活，以响应成人纹状体或皮层中Notch信号的损伤或沉默，这一过程涉及到表达Ascl1的星形胶质细胞的短暂增殖(马格努松等人，2014；北约等人，2015年；Zamboni等人，2020年)．在此背景下，我们发现Ascl1的促增殖作用在P5过表达时仅局限于OPCs，星形胶质细胞未进入细胞周期，这是非常有趣的。一种推测的可能性是，OPCs和星形胶质细胞对Ascl1的不同反应取决于时间表达动态。在我们的实验条件下，Ascl1的表达可能是相对恒定的。相比之下，先前的研究发现，在增殖的神经干细胞(分子上更类似于星形胶质细胞而不是OPCs)中，Ascl1的表达经历了与Notch信号下游振荡效应子相异的振荡(Imayoshi et al.， 2013)．我们的数据提供了由恒定和可能的高水平Ascl1诱导的增殖的第一个例子，并为未来对细胞类型对Ascl1表达动态的特异性敏感性的研究提供了依据。

数据可用性声明

支持本文结论的原始数据可以从伦敦国王学院的研究数据存储库(KORDS)中公开获取doi: 10.5061 / dryad.6gb90．本研究生成的任何试剂将在合理要求下由相应作者共享。所有其他研究数据包括在文章和/或补充材料．

道德声明

这项动物研究得到了莱茵兰-普法尔茨州政府、伦敦国王学院伦理委员会和英国内政部的审查和批准。

作者的贡献

CG, NM, FS, LG, YS和SP:方法论，调查和形式分析。CS:资源。CG、NM、SP:撰写初稿。CS、BB和SP:资金获取、概念化、可视化、写作评审和编辑。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

本研究部分由威康基金会(206410/Z/17/Z)资助。出于开放获取的目的，作者已对本次提交产生的任何作者接受的手稿版本申请了CC BY公共版权许可。这项研究还得到了欧洲研究委员会(ERC)在欧盟地平线2020研究与创新计划(资助协议编号101021560,IMAGINE)下的资助，德国研究基金会(BE 4182/11-1项目编号357058359;CRC1080，项目编号221828878)，莱茵兰-普法尔兹在美因茨约翰内斯·古登堡大学的研究计划(ReALity)到BB，由美因茨约翰内斯·古登堡大学的Inneruniversitäre Forschungsförderung Stufe I到SP，由英国癌症研究中心、医学研究理事会和威康信托基金会(FC001002)提供核心资金给弗朗西斯·克里克研究所。纳米项目得到了人类前沿科学计划(HFSP长期奖学金，LT000646/2015)的资助。雷竞技rebatFS由São保罗研究基金会(FAPESP)资助，项目编号为2021/13515-5。

致谢

我们非常感谢Berninger实验室的成员在本研究过程中提出的有益意见和关键反馈。我们非常感谢B. Rico(伦敦国王学院)对整个项目的支持。我们感谢来自美因茨分子生物学研究所(IMB)显微镜核心设施的支持。本工作中发表的数据部分收录在Johannes Gutenberg-Universität Mainz (2019年兰)和预打印服务器(加兰特等人，2020年；doi: 10.1101 / 2022.04.13.488173)．

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnins.2022.919462/full#supplementary-material

参考文献