内小胶质异质性和补充组件3消除新兴多种感觉的中脑隔间在早期的关键时期
朱丽安·b·卡罗尔
Shaida哈米迪
Mark l . Gabriele- 詹姆斯·麦迪逊大学生物学系,美国弗吉尼亚州州
的外侧皮层下丘(LCIC)是中脑壳地区接收多通道输入目标离散区域的区划的(模矩阵)的框架。这样的安排出现老鼠位围产期(产后一天,P0-P12)感觉和听觉输入隔离到各自的模块和矩阵终端模式。小胶质细胞(mgc)执行各种重要功能在大脑发育的过程中,其中识别领域的活跃的电路组装和选择性地修剪的或未被充分利用的关系。最近的证据在其他大脑结构显示相当大的MGC异质性的寿命,特别是在建立发展的关键时期。摘要本研究以古典的潜在参与补体级联信号(C3-CR3 / CD11b)精炼早期多重网络,并确定几个小胶质在新生LCIC表现出截然不同的分子特征子集。GAD67-green荧光蛋白进行免疫染色(GFP)和CX3CR1-GFP老鼠和之后定义LCIC关键时期。迦得标签凸显了新兴LCIC模块化,而表达fractalkine受体CX3CR1标签描述了德国。C3的表达式非常普遍LCIC神经纤维网,之前明显缺席在P8模块化的区域,和更多的全球关键期关闭后消失。CD11b-expressing小胶质细胞均匀分布在出生时,偏置模块字段在P8 P12然后周围的矩阵。时间和空间的匹配LCIC室(即C3的消失。, modules then matrix) with CD11b-positive MGC occupancy implicates complement signaling in the selective refinement of early LCIC connectivity. Multiple-labeling studies for a variety of established MGC markers (CD11b, CX3CR1, Iba1, TMEM119) indicate significant MGC heterogeneity in the LCIC as its compartments and segregated multisensory maps emerge. Marker colocalization was the exception rather than the rule, suggesting that unique MGC subpopulations exist in the LCIC and perhaps serve distinct developmental roles. Potential mechanisms whereby microglia sculpt early multisensory LCIC maps and how such activity/inactivity may underlie certain neurodevelopmental conditions, including autism spectrum disorder and schizophrenia, are discussed.
介绍
突触修剪是一种神经发育的重要组成部分,包括选择性删除无关的或未充分使用联系人(威尔顿et al ., 2019)。小胶质细胞(mgc)常驻巨噬细胞的神经系统,在这一过程中发挥关键作用的网络优化在关键时期(早期Paolicelli et al ., 2011;香港et al ., 2016;Mosser et al ., 2017;硫化和Garel, 2017,2020年)。德国展览各种激活状态,从高度吞噬时期目标吞没调理的材料,电路后休息或侦查国家建立和functionally-tuned (Jurga et al ., 2020)。畸变MGC修剪行为被认为是某些神经发育条件(詹et al ., 2014;Bordeleau et al ., 2019;浮士德et al ., 2021),包括自闭症谱系障碍(ASD under-pruning)和精神分裂症(over-pruning)。
最近的单细胞RNA序列研究揭示小胶质异构性问题在整个大脑,与最重要的多样性表现出发育关键时期(De Biase et al ., 2017;哈蒙德et al ., 2019;李et al ., 2019;此外et al ., 2019,2020年;谭et al ., 2020)。鉴于德国的微分表达式转录标记观察整个寿命,各种条件和大脑区域,它是合理的,不同的小胶质子集提供及时的角色具有独特的责任。两个规范发展MGC基因集群涉及fractalkine的表达和古典补信号级联组件,每一个都包括一系列特定的标记。
fractalkine通路,通常涉及小胶质招聘和迁移,包括交互的neuronally-expressed fractalkine配体(CX3CL1)和其相应的受体CX3CR1发现只在德国(哈里森et al ., 1998;荣格et al ., 2000;Paolicelli et al ., 2014;Arnoux Audinat, 2015)。CX3CL1可以膜结合,解放时的金属蛋白酶裂解ADAM10 (炮手et al ., 2019)。MGC入住率以及突触修剪/成熟延迟方面的发展中桶字段(路过et al ., 2012)和海马(Paolicelli et al ., 2011;帕加尼et al ., 2015)CX3CR1突变体,这表明德国以及fractalkine信号参与执政早期电路组装的重要特征。
经典的补体级联,特别是补充组件3 (C3)及其受体CR3,同样出现在开发过程中参与MGC-neuronal相声和某些疾病(史蒂文斯et al ., 2007;谢弗et al ., 2012;Stephan et al ., 2012)。C1q启动蛋白质,由德国高度细胞或部分细胞标记他们随后删除。C1q标签最终导致调理素C3的生产。德国开始吞噬作用的选择性标记的碎片通过C3绑定同源受体,补体受体3 (CR3) (Stephan et al ., 2012)。CR3是整合素的异质二聚体αM (CD11b)和β2 (CD18)子单元,CD11b是一个既定的标志CR3-expressing mgc (Bajic et al ., 2013;Vorup-Jensen詹森,2018;拉默斯先生et al ., 2021)。
探索潜在的多种感觉的小胶质影响组装电路,目前的研究集中在一个特定的壳中脑区域下丘(IC)。集成电路由三个细分;为维基百科中央核(),背侧皮层(DCIC)和外侧皮层(LCIC)。尽管经典描述为听觉继电器为维基百科中心由于其证据确凿的,LCIC展品多通道响应属性(Aitkin et al ., 1978,1981年;Jain和海岸,2006;Gruters Groh, 2012),摆脱discretely-mapped、网络配置。在成年小鼠,躯体感觉预测目标的区阳性谷氨酸脱羧酶(GAD),称为模块,而听觉输入终止整个包括矩阵(Lesicko et al ., 2016,2020年)。不连续LCIC模块化领域跨越其中间层(2层,Chernock et al ., 2004)和完全包围calretinin-positive矩阵(1和3层;迪林厄姆et al ., 2017;同性恋et al ., 2018)。这些和其他确定的神经化学和可靠地指导标记标签新兴LCIC区划的结构和仪器在定义一个早期的关于其特点cytoarchitectural组织和关键时期多种感觉的传入连接模式(从出生到产后12天,P12;迪林厄姆et al ., 2017;同性恋et al ., 2018;史汀生et al ., 2021)。的感觉和听觉起源最初表现出相当大的重叠,之前完全隔离成modality-specific隔间(模块化和矩阵,分别;Lamb-Echegaray et al ., 2019;Weakley et al ., 2022)。
最近,我们报道,小胶质殖民LCIC和及时的入住率的新兴模块由CX3CR1-positive mgc是fractalkine signaling-dependent (布雷特et al ., 2022)。本研究探讨了潜在作用互补信号在炼油早期LCIC连接。这里,发育监管变化C3和CD11b表达对新兴LCIC隔间记录在一系列GAD67-green荧光蛋白(GFP)老鼠。此外,我们检查的可能性分子不同的MGC亚种群在新生儿LCIC并发标记数建立MGC标记(CD11b, TMEM119 Iba1) CX3CR1-GFP老鼠。结果显示普遍C3表达式,随后被修剪compartmental-specific进展(即。,modules first, then matrix), and that such refinement appears temporally and spatially linked to the presence of CD11b-expressing MGCs. Examined MGC markers were generally non-overlapping, providing evidence for the likelihood of considerable MGC heterogeneity in the developing LCIC.
材料和方法
动物
一系列发育小鼠跨越老牌LCIC关键时期(P0, P4, P8 P12;n在每个年龄≥3)的两个转基因线[GAD67-GFP (n= 46)和CX3CR1-GFP (n= 47)]被用于实验。在某些情况下,一个额外的发展关键期关闭后的计算是研究(P36)。新兴LCIC GAD67-GFP敲入小鼠启用容易识别模块,从而评估各种MGC标记关系发展中LCIC隔间。先前的努力从我们实验室验证的特异性鼠标线在其他地方发表(同性恋et al ., 2018)。细节关于增强型GFP的目标轨迹的迦得基因育种策略,并以前描述的基因序列(Yanagawa et al ., 1997;Tamamaki et al ., 2003;小野et al ., 2005)。繁殖对这条线最初是由彼得博士Brunjes(弗吉尼亚大学医学院)许可授予博士Yuchio Yanagawa(群马县大学医学院毕业,群马县,日本)。CX3CR1-GFP老鼠(JAX 005582)促进fractalkine-receptor的可视化表达mgc杂合的和纯合子的后代。与野生型相似,CX3CR1+ / GFP老鼠能够fractalkine信号,而这样的功能是CX3CR1妥协绿色荧光蛋白(GFP同窝出生的。在目前的研究中,只有这条线使用了杂合的老鼠,简称为CX3CR1-GFP以后。CX3CR1-GFP老鼠用于评估潜在的MGC异质性和各种其他相对colocalization MGC标记。以前的工作在我们的实验室证实的存在CX3CR1-expressing mgc新生LCIC和迁徙行为特征识别其新兴隔间(布雷特et al ., 2022),暂时与峰形成的多种感觉的传入流(Lamb-Echegaray et al ., 2019;Weakley et al ., 2022)。
两株繁殖C57BL / 6 j背景(JAX 000664)。GAD-GFP育种包括配对杂合的男性与C57BL / 6 j女性。后代与黑暗的读者观察到聚光灯和查看护目镜P4之前确定GFP-expressing幼崽(Dolores,克莱尔化学研究有限公司美国猫# SL10S)1。CX3CR1-GFP基因分型是外包(Transnetyx、科尔多瓦、TN,美国)2使用探针具体这个JAX行从提供的数据库。大约相同数量的男性和女性受试者被用于所有实验,并没有观察到性别差异。实验过程都是按照美国国立卫生研究院的指导方针和已获批准的IACUC詹姆斯麦迪逊大学(20 - 1421)。
灌注和组织切片
在准备中脑切片,老鼠服用了过量的氯胺酮(200毫克/公斤)和甲苯噻嗪(20毫克/公斤)。大脑与生理冲洗灌注transcardially NaNO(0.9%氯化钠和0.5%2在dH2O)其次是4%多聚甲醛,然后4%多聚甲醛溶液和10%蔗糖cryoprotection。大脑从头骨和存储在4°4%多聚甲醛/ 10%蔗糖溶液中C 24 h,然后被允许在同一温度平衡在4%多聚甲醛/ 30%蔗糖溶液。组织块被切断在冠状面50μm使用滑动冷冻切片机和部分在整个rostrocaudal中脑收集的范围在0.1 M磷酸盐(PBS, pH值7.4)。
免疫细胞化学
开始处理感兴趣的各种标记(见表1对所有相关抗体信息),部分在磷酸盐缓冲盐水冲洗三次(PBS)五分钟。组织部分被封锁在5%的正常血清30分钟(正常血清的物种总是与物种的二级抗体生产)。阻塞后立即转移到主要抗体解决方案在确定最佳稀释和部分在4搅拌过夜°C。
表1。抗体信息。
为double-immunolabeling实验,部分被允许平衡至室温第二天在PBS为20分钟,然后洗了八分钟的三倍。组织培养90分钟directly-conjugated二级抗体(Alexa萤石350)。额外的四个PBS冲洗10分钟后,组织被适当的5%正常血清在第二初级抗体在孵化前4°C在一夜之间。
的最后一天处理,组织再次被允许回到室温,然后在PBS冲洗三次。接下来,一个适当的生物素化的二次抗体是申请1 h,其次是三个额外的PBS冲洗。最后,链霉亲和素荧光共轭(DyLight 549链霉亲和素,1∶向量实验室,纽瓦克,美国,sa - 5549,RRID: AB_2336408)申请前2 h三最终PBS冲洗。组织被安装到幻灯片和盖玻片延长钻石anti-fade mountant(美国热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA, P36970)。single-labeling研究上述生物素化的放大是用于代替直接共轭辅助方法。TMEM119处理,组织被阻塞在10%而不是5%正常血清,和所有步骤开始最初的PBS通过生物素化的二次冲洗包括0.5% Triton x - 100(美国微孔σ,伯灵顿,MA TX1568)。
Epifluorescent成像
大视场图像捕获进行Eclipse Ti-2尼康显微镜(尼康,梅尔维尔,纽约)使用单色,滨松ORCA-Flash 4.0 V3 CMOS相机(滨松,布里奇沃特,新泽西)和PlanApo目标(10倍20 x 40 x;NA = 0.30、0.75和1.30,分别)。过滤集(色技术,波纹管,VT)在设计时注意各种荧光团的光谱确定之间不存在渗滤通道。一个扩展景深(EDF)算法用于生成二维图像获得Z-stacks(元素软件;尼康)。尼康元素EDF模块有助于捕获Z-stacks合并成二维图像,只使用每个光学平面的集中地区。独立通道伪彩色,查找表每张图片略有调整,以减少背景噪音和最佳描述标签通过显微镜观察。图像保存为无损如JPEG2000文件之前,随后的定量分析。屏蔽外面观察到的最小工件截面轮廓在一些实例执行(Adobe Photoshop,圣何塞,CA)来提高整体图质量。
LCIC模块化的识别、C3亮度采样,和区域覆盖评估
生如JPEG2000图像打开NIS-Elements和出口未压缩的TIFF文件和导入ImageJ软件(贝塞斯达国立卫生研究院,医学博士RRID: SCR_003070)3为了生成亮度情节概要C3和迦得渠道在P4, P8, P12。Mid-rostrocaudal部分的IC LCIC模块化最为明显。抽样关注这些年龄作为定性C3观察似乎进展从最早的C3消失的迹象(P4),明显不连续C3 (P8)模式,缺乏明显的C3标签(P12)。合并通道首次分离并转换为灰度图,然后一个阈值函数进行促进清晰界定模块化的边界(更多信息见布雷特et al ., 2022)。徒手画的工具(100)厚度行用于样本和完全包含2层GAD-positive ventral-to-dorsal发展模块。一旦采样轮廓集,一个感兴趣的区域(ROI)函数是用来复制并保存使用在其他通道的采样轮廓相同的形象。抽样数据通道亮度荧光标记的剖面模式提供了互相尊重。
C3和CD11b面积覆盖率比较(即在关键阶段。,P4 and P8 for C3, and P8 and P12 for CD11b), extracted GAD and C3 or CD11b channels from 20x digital merges were opened in FIJI (Schindelin et al ., 2012)。五个部分来自三个动物共有15部分分析在每个时代。迦得的频道,模块化的边界被确定(布雷特et al ., 2022)、追踪与徒手画的工具和使用ROI管理器相结合。迦得渠道被关闭,所有后续步骤进行相应C3或CD11b通道。整个LCIC的视野提出了未来并添加到ROI经理。选择GAD-defined模块化和总LCIC roi, XOR(即。,exclusive or operator) function was used to create a ROI for just the encompassing matrix. Additionally, a sufficiently large box was drawn in the region of the C3 or CD11b channel containing no tissue to provide a background level. Modular, matrix, and background medians for each of the ROIs were calculated. The following ratio from those median values was used to assess relative areal C3 or CD11b coverage: (module–background)/(matrix–background). Values above one correlate closely to largely modular expression, those near one indicate comparable or homogeneous compartmental expression, while those diminishing below one indicate expression preference for the surrounding matrix.
结果
C3表达对新兴LCIC隔间
探索潜在的参与补充系统的细化隔离LCIC多种感觉的地图(Weakley et al ., 2022),C3表达是研究发育一系列GAD67-GFP老鼠(图1)。时间点包括四个等距的阶段跨越其建立的关键时期(图1 l),以及一个关闭之后(图1 m-o)。C3表达强出生时,主导整个LCIC神经纤维网(图1 a - c)。许多小裂陷在C3疣状的密集丛被GAD-positive细胞(图1 c)。迦得原始细胞集群的重合与第一提示在P4的最早迹象同样花纹,似乎空间匹配C3损失(图1 e, F)。P8,引人注目的间歇C3-negative补丁现在显而易见在一个包含丛C3-positive矩阵(图1胃肠道)。不连续LCIC补丁缺乏C3表达式可靠与完善GAD-positive模块化区域在这个年龄(图1我)。LCIC C3表达反面的关键时期在P12结束(图1 j-l)一旦multimodal传入完全隔离。没有任何值得注意的C3 P36一直观察,证实其早期产后的瞬态特性表达式(图1 m-o)。
图1所示。补充组件3 (C3)表达式(红色)发展系列(P0,(两者);P4,(D-F);P8,(胃肠道);P12,(J-L);P36,(M-O)的谷氨酸脱羧酶(GAD)绿色荧光蛋白(GFP)(绿色)老鼠。暗示GAD-positive外侧皮层下丘(LCIC)模块出现P4和随着年龄的增长越来越明显(虚线轮廓)。C3的弥漫性神经丛神经纤维网表达式主导LCIC出生时(B, C),它的许多空洞被GAD-positive somata。随着LCIC模块开始组织在P4, C3损失的丝毫迹象是观察到在这些领域(E, F)。由P8, C3表达式是完全缺乏GAD-defined模块化的区域内,但仍然强烈集中在周围的矩阵(H I)。C3表达式从同时LCIC隔间P12重合的关键期关闭(K, L)之后,依然如此[P36;(N, O)]。酒吧= 50μm规模。
在关键LCIC C3量化时间点和区域覆盖
代表亮度情节概要文件生成LCIC 2层抽样P4和P8和P12证实在C3表达对观察到的变化发展中LCIC隔间(图2 f)。在P4 Channel-specific波形(图2 a, BC3)揭示暗示新兴周期信号波动表达式(红色)相对于仍然发展LCIC模块化(绿色)。在P8 (图2 c, D),始终不同相的波形为C3和迦得可靠地观察,C3空隙(即强调事实。,波谷红色信号)精确对齐(即明确GAD-positive模块。山峰在绿色信号)。缺乏值得注意的C3信号或间隙差别P12表明其对这些来自LCIC隔间的关键期关闭(图2 e, F)。中位数LCIC区域强度措施(图2 g)支持这些定性观察。计算区划的C3比率(模块/矩阵)显著减少从P4 P8 (p< 0.001),C3(即模块化空洞越来越明显。由P8, matrix-only表达式)。
图2。量化的补充组件3 (C3)表达模式的新兴外侧皮层下丘(LCIC)分为若干部分的结构。多路感兴趣的区域(ROI)轮廓采样LCIC层2在P4模块化的字段(一),P8(C),P12(E)与相应的谷氨酸脱羧酶(GAD)(绿色)和C3(红色)表达谱(B, D, F)。虽然C3信号波动很明显在P4,他们仍然出现很大程度上无组织的对新兴GAD-positive模块(B)。P8,清晰的周期的研究观察到两个通道的波形一致彼此异相位的(绿色和红色箭头在(D)]。这样的空间偏移确认modular-specific C3损失在这个年纪,有强表达持续整个包括矩阵。由LCIC关键期关闭P12, C3难以觉察的表达式(F)LCIC隔间,暗示其间隙。盒子,须情节比较平均分为若干部分的面积覆盖率在关键时期阶段P4和P8(G)。他们的垂直分离表明这些年龄在模块化C3表达显著差异(*p< 0.001)。注意,不相交的P4和P8框显示,3/4的P4 P8比率的比率高于3/4。P4值集群或略低于1显示在这个年龄从均匀过渡C3 LCIC表达式见过,选择性的开端C3模块范围内消失。显著降低P8值定量指示继续modular-specific C3损失。水平线内框表示中位数;X的内框代表的意思。规模的酒吧(A, C, E)= 100μm。
时空的区划的本地化CD11b-positive德国
类似于上述C3实验、CR3 / CD11b-expressing小胶质细胞检查相对于发展LCIC模矩阵框架(图3)。CD11b表达德国殖民这三个IC细分出生时(图3 a - c)。开始在P4, CD11b变得明显更局限于LCIC为维基百科比邻近的(图3 d-f)。由P8 CD11b-positive小胶质细胞更偏向LCIC最主要集中在第二层,重叠GAD-defined模块化字段(图3胃肠道)。很大程度上互补的模式在P12和MGC位置现在优惠周围的矩阵,这表明补充信号小胶质细胞首先集中在模块化的区域选择性包括矩阵的入住率(之前图3 j-l)。P36,类似于C3表达式,CD11b-positive缺席整个LCIC小胶质细胞(图3 m-o)。高放大成像强调优惠集群模块化P8(范围内图4一P12)转移到周围的矩阵(图4 b)。中位数LCIC CD11b区域强度措施(图4 c在P8)产量比率通常上面(即主要是模块化),显著减少一般不到一P12(主要是矩阵,p< 0.01)。综上所述,compartment-specific C3消失(第一个模块,然后矩阵)遵循同样的时间和CD11b-expressing spatially-matched聚合的小胶质细胞。正如预期的那样,之间没有co-localization CD11b(小胶质)和迦得观察(神经元)标签。
图3。整合素αM (CD11b)表达式(红色)发展系列(P0,(两者);P4,(D-F);P8,(胃肠道);P12,(J-L);P36,(M-O)的谷氨酸脱羧酶(GAD) gfp小鼠(绿色)。CD11b表达式是明显和均匀分布在整个集成电路细分出生时,之前集中更多的对侧皮层下丘(LCIC) P4。在P8, CD11b表达定位尤其是在LCIC GAD-defined模块化的字段。CD11b-expressing小胶质细胞(mgc)转变在P12占领周围的矩阵。P36, LCIC CD11b表达在很大程度上是无法觉察的。酒吧= 100μm规模。
图4。改变compartment-specific整合素αM P12从P8 (CD11b)模式。CD11b表达式(红色)在P8集中在外侧皮质的下丘(LCIC)和大多数集中在谷氨酸脱羧酶(GAD)阳性模块(绿色,(一)]。CD11b表达式在P12是观察到P8的补充,现在主要见于周围的矩阵的标签(B)。CD11b面积覆盖率分析(C)支持定性观察,显示出显著变化CD11b区划的表达式从P8(主要是模块化)到P12(主要是矩阵,*p< 0.01)。规模的酒吧(A, B)= 50μm。
LCIC C3间隙遵循转变CD11b区划的表达式
补充组件3和CD11b检查在迦得- 67 GFP小鼠在P8和P12确认CD11b-positive mgc集中迦得模块中C3表达式开始消失,之前类似的发展中观察到相邻矩阵(图5)。双标记结果GAD-GFP老鼠可靠地显示改变CD11b小胶质模式与同龄区划的C3消失,第一层内2模块(P8,图5模拟接下来)周围的矩阵(P12,图5情况)。
图5。连续补充组件3 (C3)分为若干部分的间隙遵循转变整合素αM (CD11b)表达小胶质细胞(MGC)位置。双标记研究C3(蓝色)和CD11b(红色)在谷氨酸脱羧酶(GAD) gfp在P8(绿色)小鼠(模拟)和P12(情况)。在P8, CD11b-positive小胶质细胞占据GAD-defined模块,C3标签现在弱比周围的矩阵。P12, CD11b-positive mgc优先聚集在C3的矩阵表达式现在也寻常。酒吧= 50μm规模。
的证据LCIC小胶质异构性:CX3CR1 CD11b
fractalkine受体表达mgc的殖民和空间模式(CX3CR1-GFP)新生鼠LCIC最近报道了我们实验室(布雷特et al ., 2022)。观察CX3CR1模式出现不同于这里描述CD11b促使进一步调查,以确定不同的MGC亚种群中存在LCIC在其早期的关键时期。虽然现在整个LCIC出生时,CX3CR1——CD11b-positive mgc显示没有明显的组织和没有co-localization (图6)。P4 P8, CX3CR1-positive小胶质细胞控制矩阵和环模域明显缺乏fractalkine受体表达小胶质细胞,与前面描述的一致(布雷特et al ., 2022)。CX3CR1 CD11b继续标签单独的MGC亚种群,整体空间格局,出现同样的(矩阵与模块化,分别;图6 b, C)。P12, CX3CR1-positive小胶质细胞占据LCIC模块(逾期纯合子小鼠,看到布雷特et al ., 2022),如CD11b-expressing小胶质细胞腾出说区包括矩阵(图6 d)。有趣的是,LCIC模块化走出P4 P12,人口都似乎改变偏好的不同方面发展区划的框架。CX3CR1-positive小胶质细胞似乎聚集在入侵前矩阵模块,反之亦然CD11b (图7 a - c)。不同的亚种群为这两个小胶质标记是最好的赞赏在高放大缺乏任何重叠一直看到(图7 d-f)。
图6。发展数字合并的整合素αM (CD11b)疣状CX3CR1-GFP杂合的老鼠(模拟)。小胶质细胞(mgc)表达fractalkine受体(CX3CR1、绿色)似乎截然不同的亚种群的表达CD11b(红色)的外侧皮质下丘(LCIC)在其早期的关键时期。CX3CR1模式所示符合那些最近报道Brett et al。(2022),即矩阵表达式,主导环模域在P4 / P8,进入之前在P12模块。CD11b这发展对比,首先显示偏好LCIC模块,前后来转向区域周围的矩阵。酒吧= 100μm规模。
图7。高放大倍数的一系列整合素αM (CD11b)表达在P8 fractalkine受体(CX3CR1) gfp组织显示不同的小胶质细胞(MGC)的子集。CX3CR1-expressing小胶质细胞(绿色)在P8环绕模块(虚线轮廓,(两者),更多的看到布雷特et al ., 2022]在补体受体表达(CD11b、红色)是最集中。在每一个与显著的CD11b表达式(即计算进行分析。,not P36), lateral cortex of the inferior colliculus (LCIC) CX3CR1(D)和CD11b(E)表达式是重叠(F),提供证据支持的概念不同的MGC种群具有独特的分子特征。箭头在(D, E)显示独特的小胶质亚种群。规模的酒吧(两者)= 50μm;(D-F)= 20μm。
的进一步证据LCIC小胶质异构性:TMEM119 Iba1
缺乏CX3CR1和CD11b colocalization促使进一步实验利用其他建立小胶质标记:TMEM119 Iba1。TMEM119据报道,是一个非常具体的MGC标记在成年小鼠,虽然目前还没有已知函数的跨膜蛋白(班尼特et al ., 2016)。TMEM119发育一系列CX3CR1-GFP小鼠免疫细胞化学(图8)表明,虽然没有出生时,在IC检测之后,偏向LCIC 2层模块化字段。再一次,没有观察到显著的colocalization在任何阶段,唯一的例外是偶尔在P12 double-labeled细胞遇到。
图8。跨膜蛋白(TMEM119)表达在发展系列(蓝色)(模拟)fractalkine受体(CX3CR1) gfp小鼠(绿色)。侧的皮层下丘(LCIC) TMEM119表达式是在出生时没有(一个),然后主要局部2层后在P4的外观(罪犯)。除了在P12罕见double-labeled细胞(数据没有显示),没有观察到co-localization。酒吧= 100μm规模。
确认的相对空间和细胞型态为各种MGC标记在同一组织,immunolabeling CD11b和TMEM119在P8 CX3CR1-GFP执行组织(图9)。这个计算被选为进一步调查每一个标记展品LCIC compartmental-specific表达式在这个年龄。CX3CR1-positive德国占领矩阵(图9(更多)和环模块看到布雷特et al ., 2022)主要阳性CD11b——TMEM119-expressing小胶质细胞(图9 b, C)。尽管类似的总体偏好CD11b TMEM119-positive细胞在P8模块化区,观察细胞colocalization (图9 d),表明存在多个不同的MGC子集,或许在开发潜在的不同的角色。
图9。Fractalkine受体(CX3CR1) gfp(绿色),整合素αM (CD11b)(红色)和跨膜蛋白(TMEM119)(蓝色)或Iba1在P8(青色)表达式。明显缺乏co-localization建立MGC标记支持相当大的外侧皮层下丘(LCIC)小胶质多样性在其早期的关键时期。CX3CR1-positive小胶质细胞(mgc)占据了矩阵和环绕模块(虚线轮廓,更多的看到布雷特et al ., 2022),而CD11b和TMEM119标签展览一个互补模块化的偏见(模拟)。像CX3CR1 Iba1-positive小胶质细胞环在P8 LCIC模块,并从CD11b染色法是不同的(情况)。而所有Iba1-positive细胞也表达CX3CR1,并非所有fractalkine受体表达细胞积极Iba1。酒吧= 50μm规模。
Iba1(电离分子钙结合适配器1),另一个MGC-specific标记,研究了在P8 CX3CR1-GFP老鼠与CD11b (图9情况)。没有triple-labeled细胞观察,也CD11b和Iba1 double-labeled细胞。然而,所有Iba1-positive小胶质细胞也CX3CR1-positive,有一个独特的人口fractalkine receptor-expressing细胞不表达Iba1。这个发现是符合之前报道(布雷特et al ., 2022)。这些结果进一步证实了这种观点,即广泛MGC LCIC内异质性的存在在其早期产后关键时期。
讨论
本研究结果表明补体级联参与和小胶质异质性LCIC在其建立发展的关键时期。C3和CD11b瞬变表示为LCIC隔间出现(迪林厄姆et al ., 2017;同性恋et al ., 2018;史汀生et al ., 2021)和多通道LCIC传入相应的隔离(Lamb-Echegaray et al ., 2019;Weakley et al ., 2022)。集群的CD11b-positive mgc的模块,然后矩阵,再加上C3的顺序消失区说,暗示C3-CR3 / CD11b信号作为重要的早期修剪LCIC多通道地图。异构的证据MGC亚种群空间模式的改变表明潜在的为每个在个体发生早期不同的角色和职责。这些和其他可能的进一步分类有待确定MGC子集将提供重要的见解机制多种感觉的电路组装,以及如何与某些神经发育异常的网络优化相关条件,如自闭症和精神分裂症。
在发展中LCIC补充信号和区划的修剪
听觉和躯体感觉传入的时间和空间塑造模式关联不仅与新兴LCIC隔间,但也与discretely-organized补充组件蛋白表达报告在这里。C3和CD11b都是暂时性的表达或清除后不久LCIC关键期关闭。CD11b-positive MGC入住率,相似之处消失的C3第一模块中紧随其后的是矩阵(图10),说对补体依赖的可能性LCIC修剪,遵循compartmental-specific进展。类似的C3在CR3KO老鼠进行的实验,这些都需要进一步证实这种说法。如果确实C3-CR3绑定需要选择性LCIC修剪,可以假设C3损失的观察序列就不会看到通过破坏信号突变体。额外的研究,评估相对MGC吞没活动(例如,C3-tagged躯体感觉和/或听觉终端)在不同的突变株在关键发展阶段应该提供进一步的见解关于方面的小胶质细胞扮演特定角色LCIC多种感觉的电路改进。
图10。总结示意图补体级联表达发展中外侧皮层下丘(LCIC)。补充组件3 (C3)表达式(橙色)突出在LCIC隔间最早时间点检查(P0-P4)。整合素αM (CD11b)阳性小胶质细胞(红色)LCIC在这些阶段中(没有显示),虽然不表现出任何区划的偏见。在关键时期峰值(P8), C3表达式从模块化的区域选择性地失去它现在被CD11b-positive小胶质细胞(mgc)。P12, CD11b-expressing小胶质细胞占据包括矩阵,在C3表达不再明显。这个发展序列结合补体级联信号作为一个潜在的关键球员在新兴的LCIC compartmental-specific修剪。
突触消除在其他系统中似乎是介导的部分由其他识别调理素的细化,也可能成为早期LCIC网络。外部化磷脂酰丝氨酸(PS)诱发吞噬MGC活动通过几个同源受体(如TREM2, GPR56;李et al ., 2020;Scott-Hewitt et al ., 2020;夺宝奇兵et al ., 2021),还与上游合作伙伴补充组件,比如C1q指导吞没行为(Paidassi et al ., 2008;马丁et al ., 2012)。PS本地化发展中海马和视觉丘脑是主要突触前和选择性的目标mgc建立时期的峰值修剪。类似于C3 / CR3淘汰赛中(谢弗et al ., 2012),retinogeniculate连接C1q突变体不够修剪和PS展览水平升高和降低吞没PS-labeled材料(Scott-Hewitt et al ., 2020)。PS和/或C1q是否存在在发展中LCIC,以及每个函数是否独立或者可能会影响其他方面的互补信号在这种结构还有待确定。
新生LCIC MGC异质性
多个LCIC小胶质子集以看似独特的分子签名都在本研究中显示了。最近的单细胞RNA-seq研究在其他大脑区域显示不同的MGC转录簇在寿命和损伤/炎症,最显著的多样性发展的早期关键时期(De Biase et al ., 2017;哈蒙德et al ., 2019;李et al ., 2019;此外et al ., 2019,2020年;谭et al ., 2020)。明显缺乏co-localization大部分小胶质标记检查在这里,任何观察到的重叠是例外,而不是常态,支持大量发展中LCIC MGC异质性的概念(图11)。当然,还有许多其他建立MGC标记(例如,P2YR12, SIRPα、CD115等。Jurga et al ., 2020;夺宝奇兵et al ., 2021)没有探索可能的线索LCIC MGC异质性的程度。相关免疫染色结果与未来RNA-sequencing实验集中在新生LCIC应该证明高度信息化的程度不同的MGC亚种群,并可能潜在的责任都有策划了各种发育事件。
图11。示意图突出微分表达式建立了小胶质细胞(MGC)标记的外侧皮层下丘(LCIC)在关键时间点关键时期。
MGC修剪和神经发育条件
除了具体调理素标记为选择性吞噬作用,充分利用人脉和碎片等标签CD47似乎提供一个替代的作用,从潜在的消除(保护连接的必要理et al ., 2018;夺宝奇兵et al ., 2021)。平衡的“吃我”,“不要吃我”的标签是很重要的,以确保MGC介导修剪是充分的,而不是大脑活动中夸大了。这样下——或者over-pruning期间尤其重要的窗口被认为与常见行为表型与某些神经发育条件有关。自闭症谱系障碍通常与under-pruning和增加树突棘密度比正常控制(《好色客》,2010张;浮士德et al ., 2021)。几个ASD-linked基因影响突触修剪在老鼠身上,与报道的减少网络优化和改变社会行为(Voineagu et al ., 2011;De Rubeis et al ., 2014;Bourgeron 2015)。与自闭症,精神分裂症的各种模型始终指向over-pruning缺陷,减少脊柱密度在不同脑区(分et al ., 2014;Presumey et al ., 2017;约翰逊和史蒂文斯,2018年;Yilmaz et al ., 2021)。
建设期间的综合多种感觉的电路和适当的雕刻发展可能实现早期社会交际的关键里程碑。赤字在某些感官任务高度预测后来的发病和严重程度与自闭症相关的认知和行为症状(Brandwein et al ., 2015;罗伯逊和西蒙,2017年)。除了unisensory评估,在多种感觉的知觉障碍绑定(Kwakye et al ., 2011;Collignon et al ., 2013;史蒂文森et al ., 2014 a,b,c,2018年)提供最相关的诊断标准,如自闭症的标志性特征(例如,困难与演讲、沟通和社会交往)本质上是多种感觉的过程。种族隔离的多通道的LCIC afferent-efferent系统可能是进一步感知集成的重要集结地层次结构(Lesicko et al ., 2020)。此外,LCIC数据在处理某些反射性行为(如pre-pulse抑制、PPI、声惊吓反应,ASR),一方面LCIC被显著改变的响应(林et al ., 1974;莱特纳,科恩,1985;Parham Willott, 1990)。PPI LCIC-mediated变化响应行为(ASR)已报告广泛自闭症和精神分裂症(科尔et al ., 2013;Haßet al ., 2017;高桥和Kamio, 2018)。需要进一步调查,建立我们目前发现确定的程度发展等多重结构的修剪程序可能出错LCIC,和行为后果体现在某些神经发育条件。
结束语
本研究其中牵扯到的小胶质细胞和补体级联信号compartmental-specific早期LCIC内连接的修剪。此外,我们的数据显示显著MGC异质性的多种感觉的区域发展中脑。机制控制的精确表达分子标记(如活动依赖性C3 / CD47表达式)和特定的方式MGC LCIC种群在暗示,然而,在很大程度上仍没有解决。小心的映射描述区域变化和异构性问题对未来单细胞RNA序列和空间的转录组研究LCIC胶质人群应该深化我们对复杂的多种感觉的中脑修剪项目和每个可能图如何进入某些神经发育障碍的发病机制。
数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
道德声明
动物研究回顾和批准的詹姆斯·麦迪逊大学动物保健和使用委员会(批准文号:20 - 1421)。
作者的贡献
JC、SH和MG导致了实验。JC和SH执行所有组织处理,关联成像,和数据采样。JC和MG进行量化的数据。MG准备了所有的数据和写的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项工作是由美国国立卫生研究院(1 r15dc018885-01),美国国家科学基金会(dbi - 0619207和dbi - 0619207),和JMU生物学系光学显微镜和成像设备。
确认
我们要感谢托马斯博士Gabriele统计磋商,博士Kristopher Kubow显微镜帮助区域覆盖分析,和斯蒂芬妮·阿特金斯和萨拉基冈的宝贵的援助与繁殖和维护我们的鼠标的殖民地。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
脚注
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收到:2022年10月17日;接受:09年12月2022;
发表:2023年1月04。
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茱莉亚Dallman美国迈阿密大学版权©2023卡罗尔,哈米迪和Gabriele。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
*通信:Mark l . Gabriele✉gabrieml@jmu.edu;orcid.org/0000 - 0003 - 1035 - 4104