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前面。>。,20 October 2022
秒。神经发生
卷16 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fnins.2022.1031075

神经发育障碍的研究模型:正确的模型在正确的地方

Eleni Damianidou ^{1 __},

莉迪亚Mouratidou ^1、2中而且

克里斯蒂娜Kyrousi ^{1、2 *}

¹大学精神卫生、神经科学和精确医学研究所" Costas Stefanis "，希腊雅典
²希腊雅典国立和卡波狄安雅典大学Eginition医院医学院精神病学第一科

神经发育障碍(NDDs)是一组影响中枢神经系统发育导致异常脑功能的异质损伤。非传染性疾病影响着全球很大比例的人口，造成了很高的社会和经济负担，因此，近年来对这一领域的兴趣广泛增长。然而，人类大脑发育和功能的复杂性以及人体组织使用的局限性使他们的建模具有挑战性。动物模型在相关分子和细胞机制的研究中发挥着核心作用，但其中许多模型显示出与人类表型有关的关键差异，在许多情况下，它们部分或完全未能概括这些差异。虽然在体外二维(2D)人类特定模型已被广泛用于解决这些局限性，它们缺乏复杂性和异质性等关键特征。在这篇综述中，我们将讨论的优点，局限性和未来的应用在活的有机体内而且在体外今天用来模拟ndd的模型。此外，我们将描述三维大脑(3D)类器官的最新发展，它提供了一种有前途的人类特异性方法在体外模型来解释这些复杂的疾病。

简介

大脑皮层负责人类许多高级认知功能，如感知、决策和语言。调节大脑发育的紧密协调过程的中断会引发所谓的神经发育障碍(NDDs)，其特征是认知缺陷、发育迟缓和智力残疾(ID)。其中最常见的ndd是自闭症谱系障碍(ASD)和注意力缺陷及多动障碍(ADHD) (Doernberg和Hollander, 2016)．由皮层形成缺陷引起的一组疾病，即皮层发育畸形(MCDs)，也属于复杂的nds集合(Desikan和Barkovich, 2016)，这些症状通常同时出现在ASD和ADHD患者身上(Ho等人，2019年)．定义大脑发育障碍的病理生理机制将有助于促进ndd的治疗，同时它将有助于我们对人类大脑发育的有限知识。因此，近年来，科学家们在模拟这种疾病方面付出了巨大的努力。

直到最近，动物模型在ndd的研究中发挥着核心作用，然而，它们不能完全概括人类临床和/或分子和细胞表型(Zhao和Bhattacharyya, 2018)．考虑到由于伦理和实践的限制，对胎儿人脑组织的获取有限，使用可获得且在伦理上合理的替代人类特定模型系统至关重要。在这篇综述中，我们将介绍大脑发育的基本步骤和哺乳动物之间的进化差异。的优点和局限性在活的有机体内而且在体外nds模型也将进行分析。最后，我们将回顾nds和MCDs的主要类别，以及用于研究牵连机制的模型(图1 a, B)．

图1

图1所示。神经发育研究中不同模型系统和方法的应用。(一)使用ndd建模在活的有机体内而且在体外模型系统。(B)人体特异性iPSC模型系统可用于NDD的表征、药物筛选和干细胞治疗，而动物模型和人体特异性COs可用于NDD的表征和药物筛选，旨在提高患者的生活质量。ASD，自闭症谱系障碍;PH值:心室周围异托位;诱导多能干细胞(iPSCs);NPCs，神经前体细胞;NDD，神经发育障碍。

哺乳动物神经发生的进化观点

大脑皮层的发育始于妊娠早期，神经上皮细胞(NEs)，即位于神经管最前端的神经祖细胞群，对称分裂以扩大神经上皮区域(Subramanian et al.， 2017)．形成发育中的大脑皮层的心室区(VZ)的偏振光细胞延伸出两个细长的突起:一个接触发育中的大脑的顶端，另一个接触发育中的大脑的基底(pial) (Villalba等人，2021年)．皮质发生后不久，它们转化为顶端径向胶质细胞(aRGs)。arg对称分裂，扩大祖细胞池，不对称分裂，通过产生其他祖细胞直接或间接产生神经元(Noctor等人，2004年)．在这些祖细胞中，中间祖细胞(IPs)和基底桡神经胶质细胞(bRGs)分别在室下区(SVZ)和室外区(oSVZ)定植(Kalebic和Huttner, 2020年)．新生神经元在生成后呈现多极形态，并在RGs基突的引导下从VZ和SVZ迁移到发育中的皮层板(CP) (Villalba等人，2021年)．神经元的连续生成导致皮层层(L1-L6)由内而外依次形成，其中深层神经元形成L5和L6，上层神经元形成L2、L3和L4 (Franchini 2021)．

尽管神经发生的主要步骤在哺乳动物中很常见(Franchini 2021)时，人类的大脑皮层大大扩张，这被认为是人类独特智力的基础。人类以及其他灵长类动物和gyrencephalic皮质的一个特征是手粒上层的增大，这源于一个独特的祖细胞池，即oSVZ祖细胞(斯马特等人，2002年)．在gyrencephalic种中，brg是SVZ中最丰富的神经祖细胞(NPC)群体。汉森等人，2010年)，在细胞水平上，它们具有高度的异质性:有的brg具有基突而无根尖突，有的brg只有根尖突，有的brg同时具有基突和根尖突(Betizeau等人，2013)．相反，在小鼠等无脑物种中，brg样细胞数量较少(占E12-E18之间NPCs总数的5-10%)，只出现在基底突，位于SVZ的上部(王等，2011)．在gyrencephalic物种中，brg表现出高增殖能力，而在小鼠中，它们主要是神经源性的(斯马特等人，2002年；Betizeau等人，2013)．因此，在gyrencephalic物种中，特别是在人类中，oSVZ较厚，其祖细胞在皮层褶皱的形成中起着重要作用(Borrell和Götz, 2014)．机械力对皮层折叠的出现有很大的贡献，迁移神经元的细胞间粘附是支撑皮层折叠的关键因素(德尔·托罗等人，2017)．此外，影响皮层折叠的主要因素之一是细胞外基质(ECM)，人体ECM成分定义了发育中的皮层的力学特性(Amin和Borrell, 2020年)．通过对小鼠和灵长类动物大脑的转录分析，发现了灵长类动物特异性基因和人类特异性基因，这些基因调节着新皮层的扩张(Boroviak等人，2018)．这种人类特有基因的典型例子是NOTCH2NL这有助于人类大脑皮层的快速进化(Fiddes等人，2018),ARHGAP11B这增加了它的大小和可折叠性(弗洛里奥等人，2015年)．灵长类动物特异性和brg特异性基因在胎儿人脑样本中被发现，如Tmem14b, dag1, kcnk10, hp1bp3（刘等，2017)．还有，古人类特有的基因TBC1D3发现增加了人类brg中的ERK信号，因此，它们的增殖能力(Ju等，2016)．Pinson等人最近的一项研究表明，与尼安德特人相比，人类TKTL1中赖氨酸到精氨酸的单一替代导致brg数量增加和更大的神经发生(Pinson等人，2022)．然而，新发现的人类特异性基因或人类特异性异构体不能解释上述人类进化中观察到的表型和形态差异，因此，非编码序列和调控序列也引起了人们的关注(刘等，2017)．比较基因组学和表观基因组学研究已确定:(a)人类谱系中称为人类加速区(HARs)的区域，(b)富含发育增强子的非编码区变化(伯德等人，2007年)和(c)命名为人类获得增强子(HGEs)的区域(佛蒙特等人，2016年)．这些区域调节关键神经发育基因的基因表达，其中一些与额叶皮层的模式有关，比如TBR1（Won等人，2019年)．除此之外，还有一些基因被认为与额叶皮层的大小有关，比如FGF17而且EMX2（Cholfin和Rubenstein, 2008)．所有这些，最终导致神经元数量的增加，同时伴随着大脑区域大小的非模拟性增加，这反过来又导致皮层旋转。有趣的是，在ndd患者中发现了人类特异性基因的变体，即具有人类特异性表达模式的基因或HARs和HGEs，这表明人类特异性变化不仅对人类大脑的进化很重要，而且对大脑相关疾病也很重要。

模型系统:研究大脑发育和疾病的优势和劣势

在活的有机体内模型

多年来，动物模型已被用于解剖ndd的机制和致病因素(图1 a, B)，与用途有限的人体组织相比，具有巨大的优势。被广泛用于研究大脑发育和脑相关疾病的动物模型包括斑马鱼(鲐鱼类） (Howe等，2013)和果蝇(黑腹果蝇） (盖托和布罗迪，2011年)．它们的生命周期短，与人类的基因组相似性高，这使它们成为快速筛选多个候选基因的理想选择。果蝇含有87%的神经系统相关基因和75%的神经发育功能相关基因。同样，斑马鱼与人类基因有近70%的同源性，其神经发育过程在进化过程中高度保守(Howe等，2013)．鸡胚(背带吊裤带)也是脊椎动物神经发育的重要工具，因其体积大、生长快、易于可视化、实验操作和成本效益高(维加拉和坎托-索莱尔，2012；Zosen等人，2021)．尽管利用这些动物模型对大脑相关疾病的研究已经取得了巨大的突破，但可以肯定的是，它们与人类进化的角度相去甚远。为了弥补这一差距，科学家们已经转向其他模型系统，如啮齿动物，以破译控制ndd的分子和细胞机制。小鼠模型被广泛应用，因为它具有相对快的繁殖时间，有几个后代。此外，它与人类基因组的相似性超过95%，允许对候选基因进行精确的基因组操作。然而，使用小鼠也存在一些局限性，因为它缺乏一些人类特有的特征，例如皮层的旋转(Boroviak等人，2018)．已在啮齿动物中进行行为测试，以模拟ndd个体的人类行为缺陷(Kazdoba等人，2016)．小鼠模型表现出几种与人类ndd相关的行为缺陷，包括认知障碍、学习和记忆缺陷、多动和自闭症样行为，但其他的不能精确地概括，这表明评估无脑大脑中的高级脑功能是具有挑战性的。为了克服这些限制，非人灵长类动物(NHPs)被提出作为潜在的模型。最常用的NHP是猴子(恒河猕猴)，它不但在认知功能上与人脑极为相似，而且在解剖学、结构、分子和细胞特征上也与人脑极为相似(刘等，2020)．由于其繁殖速度较长和寄存的需要，最近才开始用于nds研究(冯等，2020)．的优点在活的有机体内瞬时基因操作——即，在子宫内电穿孔-和CRISPR/Cas9技术精确的核苷酸变化和转基因插入/缺失-它已经成为经济和时间有效的产生基因操纵的NHPs (陈等，2017；左等，2017；Heide等人，2020年)．这些动物模型为研究ndd表现的遗传方面提供了重要的研究工具，具有巨大的转译潜力。

人类在体外模型系统

动物模型和人类在大脑发育方面的显著差异，使人们对从动物研究中获得的信息的价值提出了质疑。考虑到使用人类胚胎或胎儿在道德上受到限制，是人类特有的在体外模型可以作为动物研究的补充方法。一项重大突破是人类胚胎干细胞(hESCs)和人类诱导多能干细胞(hiPSCs)分化为所有不同的细胞系，可能包括神经元细胞系(Ardhanareeswaran等人，2017)．随着不同培养基的使用，在二维(2D)神经元培养中hESCs和hiPSCs已被分化(Park等人，2008年)，即单层细胞培养，包括多巴胺能神经元(Sánchez-Danés等，2012)、gaba能神经元(杨等，2017)、血清素能神经元(Vadodaria等人，2016)、海马齿状颗粒神经元(Yu等，2014)、运动神经元(Park等人，2016)和下丘脑神经元(Merkle等人，2015年)．除神经元培养外，星形胶质细胞(Juopperi等人，2012)、少突胶质细胞和小胶质细胞(Abud等，2017)。这些培养物已被用于研究神经元分化、神经元活性和神经元形态。神经元和胶质细胞的共培养也被用于生成一个更复杂的系统和研究细胞间的通信(图1一个)．考虑到iPSCs能够产生可扩展数量的患者组织，它们有助于通过药物筛选识别治疗靶点(Elitt等人，2018；图1 b)．此外，除了在NDD表征和药物测试方面的贡献外，诱导多能干细胞的潜力还在于它们能够作为患者特异性干细胞基础细胞疗法的初始材料(马德里等，2021年；图1 b)．尽管2D人类培养在研究物种特异性机制方面超越了动物模型，但它们的使用产生了局限性，特别是在它们无法概括细胞稳态和多样性方面。特别是，即使在共培养系统中，不同大脑区域之间也缺乏细胞多样性和细胞互连，这可能会导致对所涉及的细胞和分子机制的低估。

考虑到这些限制，使用三维(3D)细胞培养，即在过去十年中开发的脑类器官，是大脑发育和疾病研究的先驱。脑类器官是干细胞衍生的自组织3D组织，模拟胎儿人脑的细胞结构、细胞组成和基因表达谱。它们的产生原理是基于细胞分选和空间限制的谱系承诺(Benito-Kwiecinski和Lancaster, 2020年)．该模型系统具有高度的细胞多样性，其中不同的npc、新生和成熟神经元以及胶质细胞形成了高度编排和有组织的结构。基因表达和电生理研究表明，大脑类器官精确地类似于人类胎儿大脑的第一和第二三个月(渡边等人，2017年；钱等，2018)．此外，单细胞rna测序数据表明，它们在分子水平上精确地模拟了皮层发育(坎普等，2015年；Amiri等人，2018；坎顿等人，2019年；Velasco等人，2019年)．脑类器官(COs)，第一个脑类器官方案(兰卡斯特等人，2013年；兰卡斯特和诺布利奇，2014年)，由iPSCs根据其固有特性生成神经外胚层。从那时起，该协议一直用于模拟早期人类大脑的发育和进化，以及人类大脑疾病(Kyrousi和Cappello, 2020年)．在这些类器官中发现了具有特定区域特征的区域，如前脑背侧和腹侧、脉络膜丛、海马和视网膜(兰卡斯特等人，2013年)．有趣的是，这些区域可以相互形成连接，使相互连接的建模成为可能。新的协议试图通过使用模式因子(Qian等，2019)．单区域脑类器官的例子包括皮质类器官(Velasco等人，2019年)、下丘脑(Qian等，2016；Huang等，2021)、小脑(Silva等人，2021年)和中脑(Qian等，2016；Galet et al.， 2020)．此外，生成融合模式类器官(或组合)的协议已经开发出来，以概括不同大脑区域的连接(图1一个)．背侧和腹侧模式类器官的融合使得在这两个区域之间和内部模拟抑制性和兴奋性神经元的迁移，以及局部抑制性-兴奋性神经元回路的形成成为可能(巴格利等人，2017年；Birey等人，2017年)．皮质-纹状体组合体的产生(三浦等人，2020年)对前脑皮质纹状体回路的建模也是一项重大成就，因为这一通路的神经回路功能障碍被认为有助于ndd。内侧神经节隆起类器官(MGEOs)和皮质类器官共培养，生成人类融合的mge -皮质类器官(项等，2017)已经建立，以研究特定大脑区域之间的复杂相互作用。根据这种方法，人类丘脑和COs融合建模轴突投影(项等，2019)是为了研究人类复杂活动的分子基础，如感觉-运动处理和注意力。不同的类器官方案被证明比其他模型系统更能概括人类大脑发育的关键方面。总的来说，干细胞技术中的新方法已经扩展了我们对ndd建模的工具箱。选择合适的模型系统取决于调查的重点和需要回答的研究问题(图1 a, B)．

在神经发育障碍建模中使用正确的系统

神经发育障碍包括一组异质的疾病，其特征是有大量的临床表型，如认知障碍、沟通障碍、精神运动技能受损和无法达到发育里程碑(帕伦蒂等人，2020)．ndd包括ASD, ADHD, ID，沟通障碍，神经发育运动，学习和语言障碍。这组疾病的特点是在该诊断组内的几种疾病之间的高发病率共病。例如，患有ASD和ID的个体经常表现出mcd (Garcia-Forn等人，2020年)，这是一种广泛的皮层异常。mcd是根据发育过程的紊乱进行分类的，因此，增殖的改变导致小头畸形和大头畸形，神经元迁移的缺陷导致脑室周围/皮层下带异位和无脑畸形，皮层组织的缺陷导致多小回症(Barkovich等人，2012；塞韦里诺等人，2020)．MCDs的临床表现包括癫痫、自闭症、ID和发育迟缓，并伴有神经精神障碍。例如，Rett综合征患者同时表现出小头畸形和ASD，而Seckel和Angelman综合征患者表现出小头畸形和ID (西索迪亚等人，2014)．威利氏综合症患者(班尼特等人，2015)及提摩太综合症(Bauer等人，2021年)同时患有ID和ASD，而在脆性X综合征中，ASD、ID和ADHD的特征同时存在。有趣的是，虽然单基因原因在mcd中占主导地位(表1)， ndd通常表现为多基因病理生理(李敏等，2018)．然而，到目前为止，这些不同综合征的病因尚不清楚，因此，人们已作出巨大努力，通过使用不同的模型系统来仔细研究它们的因果关系，以下部分将介绍这些模型系统(图1 a, B)．此外，我们将根据观察到的神经病理表型提出MCDs:(i)异位神经元的存在(脑室周围异位和皮层下带异位)，(ii)脑回化指数的变化(无脑畸形和多小回症)，(iii)异常的脑大小(小头畸形和大头畸形)，以及我们如何使用上述模型系统对它们进行建模。

表1

表1。用于ndd研究的动物和人类特异性模型系统。

神经发育障碍

自闭症谱系障碍

自闭症谱系障碍包括社会交流和重复行为的缺陷，它呈现出一种复杂的遗传模式，涉及几条染色体上的遗传位点(Muhle等人，2004年；Marco和Skuse, 2006年；Rylaarsdam和Guemez-Gamboa, 2019年)．ASD的候选基因在神经发育或/和神经传递中起关键作用(Rubenstein和Merzenich, 2003；McDougle等人，2005年)．这些基因编码调控蛋白，如参与神经元突触的转录因子(Zoghbi 2003)和与神经炎症和神经传递相关的网络(Voineagu等人，2011)．ASD仍然是最异质的NDD之一，有800多个相关基因(Yin和Schaaf, 2017)．与人类ASD相关的一些最充分研究的单基因综合征是:脆性X染色体综合征(FXS)(突变FMR1） (西茨曼等人，2018)， Rett综合征(RTT)(突变MECP2） (Meloni等人，2000年)和结节性硬化症(突变TSC1而且TSC2） (Bjornsson等人，1996年)，我们将在下一段分析。

动物模型的使用已经并将继续在理解FXS背后的分子机制方面取得巨大进展。的Fmr1敲除(KO)小鼠模型表现出突触缺陷，异常树突脊柱形态和神经传递缺陷，为评估新药物靶点提供了机会(Kazdoba等人，2014)．尽管FXS小鼠模型的研究显示代谢途径不足(郭等，2016)，其调制导致临床试验不成功。到目前为止，缺乏有效的临床试验可以归因于动物模型和人类之间基本的发育、生化和生理差异。事实上，FXS前脑类器官的转录组分析揭示了大量表达改变的基因，而只有少数基因在FXS小鼠大脑中表达差异(Kang等人，2021)．此外，本分析显示FXS前脑类器官和胎儿脑组织中存在大量差异表达的重叠基因(Kang等人，2021)．FXS前脑类器官中的差异表达基因与神经元迁移、轴突发生、神经发生和神经元分化相关(Kang等人，2021)．此外，FXS前脑类器官发育缺陷的挽救是通过抑制PI3K途径实现的，而不是在FXS小鼠模型中被破坏的代谢途径(郭等，2016)，表明大脑类器官更准确地模拟FXS表型(Kang等人，2021)．尽管PI3K通路失调与FXS发病有关(格罗斯等，2015年)，该通路的调控尚未在临床试验中进行。此外，考虑到药物抑制PI3K通路可以挽救FXS前脑类器官的一些发育缺陷(Kang等人，2021)，在未来的治疗策略中使用PI3K通路作为靶点可能是有前景的。总之，所有这些都表明，人脑类器官可以作为临床前模型，以确定人类特异性的治疗靶点(图1 b)．

为了研究RTT，转基因小鼠模型和死后人体组织被广泛应用。这两个Mecp2 -突变小鼠和人类患者表现出运动异常(斯特恩斯等，2007)、严重的神经症状，包括步态不协调和自发运动减少(盖伊等人，2001年)、学习及记忆障碍(莫雷蒂等人，2006)、代谢紊乱(高芬和周，2012)，氧化应激增加(Janc等人，2016)、癫痫发作、寿命缩短(斯特恩斯等，2007)．然而，小鼠的神经症状不太严重，并没有完全概括人类的表型。二维神经元培养与患者源性iPSCs的分化MeCP2突变表现为成熟受损、突触减少、兴奋性/抑制性(E/I)失衡、体体积变小和放电活动功能缺陷(Marchetto等人，2010年)．最近的创新oF大脑器官oids用于RTT建模，揭示了人类mgeo和皮质类器官的神经发生受损(Xiang等，2020)以及神经发生和神经元分化的缺陷(梅利奥斯等人，2018年)．最后，来自RTT患者来源的iPSCs的背侧(DFOs)和腹侧前脑类器官(VFOs)组装显示了神经元间迁移的缺陷(戈麦斯等人，2020年)，这为理解神经发育早期阶段的RTT提供了一个有价值的模型。

啮齿动物研究表明Tsc1/2结节性硬化症的功能影响不同发育阶段的多个过程，包括神经元形态和迁移、突触可塑性和胶质功能(Tsai和Sahin, 2011)．生殖系的丧失Tsc1在小鼠中导致胚胎死亡，先于大脑发育(Kwiatkowski等人，2002年)，因此，在皮层神经发育的早期阶段进行空间和时间遗传操作是必要的。小鼠胚胎发育期间皮层神经元中Tsc1的缺失导致了几种神经异常、异位扩大的神经元和癫痫活动(米克尔等人，2007年)．然而，尽管条件KO小鼠模型已经并将继续成为强大的研究工具，但这种病理可能是由人类大脑发育独特的细胞和分子方面造成的。而且，虽然有一个突变的等位基因TSC1/2足以引起患者结节性硬化症，杂合子动物模型表现出轻微症状或无症状(古尔登等人，2007年；Ehninger等人，2008年)．在学习，记忆和社会行为方面的缺陷Tsc1^{+ / -}而且Tsc2^{+ / -}小鼠出现无神经病理和癫痫发作(古尔登等人，2007年；Ehninger等人，2008年)，表明动物模型不能忠实地概括人类表型。相比之下，使用人类干细胞能够研究结节性硬化症的早期神经病理学，并确定这种疾病的人类特异性特征(图1 b)．的单倍不足TSC1/2可以参与导致皮质结节形成的病理机制，结节性硬化症的神经病理学标志(Winden等人，2019年)．在2D中，从hESCs分化出来的神经元显示出突触传递的改变，这可以通过抑制mTORC1通路来挽救(科斯塔等人，2016)．此外，从患者特异性iPSCs分化的2D npc显示出更大的尺寸和增强的增殖，与mTORC1信号激活一致(马丁等人，2020年)以及神经元分化紊乱(祖可等人，2018年)．同样，2D患者来源的原始神经干细胞(pNSCs)表现出增加的增殖能力，而分化的神经元表现出躯体增大，神经突生长紊乱和与其他细胞的连接中断(李等，2017b)．有趣的是，尽管患者特异性ipsc衍生TSC2^{+ / -}神经元仅表现为mTORC1过度激活和相关细胞体增加TSC2^{- / -}在皮层块茎中观察到神经元表现出高活性和转录异常(Winden等人，2019年)．结节性硬化症研究的一个突破是患者来源的COs的发展，它概括了脑肿瘤和发育不良的皮质区域的出现(Eichmüller等，2022)．更重要的是，该模型系统揭示了一种新的神经元间祖细胞群的存在，即CLIP细胞，它会导致肿瘤和皮质结节病变(Eichmüller等，2022)，强调在神经发育研究中使用合适的模型系统的重要性。

注意缺陷/多动障碍

注意缺陷/多动障碍是一种行为性NDD，其特征是缺乏注意力、缺乏组织和难以完成任务(Ougrin等人，2010)．虽然它通常出现在儿童，但症状可能会持续到成年。来自动物模型的研究结果表明，ADHD的特征是多巴胺能、去甲肾上腺素能和血清素能系统的缺陷，以及神经传递的更基本缺陷(罗素2011)．病因，虽然大部分未知，包括遗传和环境因素，而证据表明，暴露于内分泌干扰化学物质，特别是邻苯二甲酸酯(Kim等人，2009年)及双酚A (罗切斯特等人，2018年)可能是原因。全基因组关联研究已经确定了几个多动症的候选基因，包括parkin 2 (PARK2) (贾里克等人，2014年)、神经肽Y位点(Lesch等人，2011年)和代谢性谷氨酸受体家族的基因(Elia等，2011)．这种多基因病因加上临床表型的可变性和ADHD的精神根源使得其建模极具挑战性。

一些动物模型被用来模拟多动症，包括遗传，环境和化学诱导模型，如自发性高血压大鼠(SHR) (阿德里安尼等人，2003年)、那不勒斯高兴奋性大鼠(Viggiano等人，2002年)和新生6-羟基多巴胺(6-OHDA)小鼠(布查塔等人，2020年)．由于前脑多巴胺能信号和功能的放松与多动症有关，多巴胺转运体KO啮齿动物(dato -KO)是通过消耗产生的SLC6A3基因来研究多动症。事实上，DAT-KO小鼠表现出多动症、睡眠失调和认知缺陷(Kasahara等人，2013)，而DAT-KO大鼠表现出工作记忆的缺陷和影响奖励处理和决策的行为改变(辛克等人，2018年)．此外，ADHD小鼠模型表明，产前和围产期的环境因素，包括表观遗传修饰、早产和怀孕期间母亲吸烟是ADHD的主要危险因素(Halmøy et al.， 2009；朱等，2014)．

然而，我们对ADHD的发育起源以及相关的分子和细胞机制所拥有的有限知识导致了快速和低成本的人类特异性的发展在体外模型。ADHD患者来源的iPSCs的生成已被报道(Sochacki等人，2016；Jansch等人，2018)，提供了在人类特定环境中弥合ADHD遗传和神经网络关联之间差距的独特潜力。药物和化学物质的筛选是通过开发大脑类器官来实现的，它提供了一种更便宜、更快、更具有生物学相关性的模型(施瓦茨等人，2015年)以了解ADHD的环境易感性(图1 b)．例如，双酚a对啮齿动物神经发育的影响(昆达科维奇等人，2013)，显示前脑类器官系统允许定量调查BPA暴露的后果(Qian等，2016)．此外，在机器人技术的帮助下，产生了大规模人类中脑类器官培养的自动化方法，用于筛选几种化合物的一般和多巴胺能特异性毒性作用(雷纳等人，2020年)．尽管如此，缺乏血脑屏障(许多化学物质从血脑屏障穿过)可能对理解考虑毒性的潜在机制有重要影响。此外，在2D/3D模型系统中缺乏任何行为读数是不可忽视的，应该加以考虑。因此，人们普遍认为，单一的模型无法捕捉复杂大脑疾病的所有特征，需要结合不同的方法来满足这一要求(图1 a, B)．

其他神经发育障碍

虽然近年来人们的注意力集中在ASD和ADHD上，但其他ndd，如ID，运动障碍，学习和语言障碍，都是高度不明确的。我们关于这些ndd的知识主要来自于对人类受试者的比较研究，因为动物模型的研究有限，而且是2D/3D的在体外目前尚未进行相关研究。考虑到分子基因检测结合全基因组关联研究(GWAS)已经确定了这些ndd个体的致病基因(尼米等人，2018；Gialluisi等人，2021；Mountford等人，2021年)，利用两者深入研究其发病机制是非常重要的在活的有机体内而且在体外研究工具(图1 a, B)．

以异位神经元存在为特征的皮层发育畸形

室周的异位

脑室周围异位(PH)患者皮层正常，无明显破坏或改变。然而，在细胞水平上，患者在侧脑室附近表现为层状或结节状的灰质簇。这些灰质区域代表了无法向皮层板迁移的神经元亚群(Watrin等人，2015年)．PH患者患有各种类型的癫痫发作和癫痫，可能是由于形成了异常的局部神经元网络和突触连通性。研究认为PH的主要发病机制可能是基因突变或环境因素，如辐射、损伤及感染(Watrin等人，2015年)．最初，PH被认为仅仅是一种神经元迁移障碍，最近人们开始关注npc的增殖和分化在疾病表现中的重要性。

x连锁的FLNA它稳定了细胞骨架，是第一个通过动物模型与PH值相关的基因之一。的Flna-knockdown (KD)小鼠模型显示径向神经胶质组织和祖细胞功能在神经发生和迁移中的重要性(Carabalona等人，2012年)．同样，PH雪貂模型显示位于皮层的神经元结节和无序的径向胶质纤维(松本等人，2017)．微管和肌动蛋白动力学在PH发病机制中的意义也被证实MAP1B，编码微管相关蛋白1B，是PH值的危险因素(Heinzen等人，2018)．有趣的是，虽然微管相关蛋白EML1的致病突变导致人类皮层下带异位(Shaheen等，2017)(“皮层下带异位”部分)，Eml1的破坏导致小鼠突变体的异位皮层(HeCo) (Kielar等人，2014)．HeCo小鼠表现出远离VZ的arg群体，这描述了扰动的初级纤毛和中断的高尔基体功能(比佐托等人，2017；Uzquiano等人，2019年)．此外，Cappello等人也利用小鼠模型证明了Fat4-Dchs1和Yap是哺乳动物神经发生的关键调节因子，这表明祖细胞数量及其分化能力的改变导致了皮层下的异位神经元(卡佩罗等人，2013年)．值得注意的是，作为Fat4和Dchs1分子调节剂的Hippo信号因子，即Mob2，也与PH的发病机制有关(O 'Neill等人，2018a)．Mob2发育中的小鼠皮层中的KD改变了神经元的分布，并导致迁移神经元中的纤毛数量和位置受损(O 'Neill等人，2018a)．从机制上，也有人提出，囊泡和/或膜运输从跨高尔基网络改变了极化分子运输到径向胶质细胞表面，从而在皮层发育过程中破坏了它们的增殖和迁移(辛,2012)．例如，基因突变ARFGEF2编码囊泡运输布莱菲丁a相关鸟嘌呤交换因子2 (BIG2)的基因，与人类PH的表现有关(辛,2014)．此外，E3泛素连接酶NEDD4L的破坏导致人类的PH值，突变体在小鼠模型中表现出对蛋白酶体降解的敏感性(Broix等人，2016)．突变INTS8也与以PH、严重认知障碍、肢体和面部畸形以及癫痫为特征的严重ndd有关，患者表现出全局转录组紊乱(Oegema等人，2017)．

尽管在过去的几年里已经使用动物模型进行了广泛的研究，但这些系统未能忠实地概括人类表型。最近在2D和3D人类特定模型系统的研究强调了npc的形态和功能在PH表现中的重要性(克劳斯等人，2019年)．具体来说,patient-derivedDCHS1而且FAT4缺乏性COs在脑室位置有大量神经元结节，生发区组织不佳，NPCs形态中断。此外，对照COs中这些基因的KD导致了神经元子集中的异常迁移模式(克劳斯等人，2019年)．有趣的是，单细胞rna测序分析揭示了参与轴突引导、神经元迁移和模式化的基因失调的神经元亚群，阐明了在患者中观察到的表型，其中只有一个神经元亚群无法迁移，产生异位结节(克劳斯等人，2019年)．在患者特异性异位神经元簇的差异表达基因中，GNG5，自然地表达在npc中，是上调最多的(克劳斯等人，2019年)，表明其下调对于正常的神经元迁移是必不可少的。过度的GNG5在对照组中，COs引起过早的npc分层，诱导npc形态的改变，并导致神经元迁移缺陷(Ayo-Martin等人，2020年)．因此，现在认为npc的形态和新生神经元迁移行为的改变之间的交叉对话是PH表现的人类特有的分子和细胞解释(克劳斯等人，2019年；Ayo-Martin等人，2020年)．在一篇描述小说的出版物中，也强调了研究PH值的人类特定模型的重要性新创人类特异性异构体的突变PLEKHG6，它负责改变RhoA下游的祖细胞分化和神经元迁移(O 'Neill等，2018b)再次强调了使用针对人类的模型系统的必要性。此外，通过使用脑类器官，细胞非自主机制也被牵连到PH的病因学中ECE2（布赫斯鲍姆等人，2020)，显示细胞外组织在ph表现中的重要性LGALS3BP编码一种与ECM相互作用的分泌蛋白，与PH值、自闭症和癫痫有关(O 'Neill等，2018b)．LGALS3BP不足导致根尖带厚度增加，防止npc的分层，神经元异位，减少RGs在COs中的睫状体长度，表明其表达影响皮质生成(Kyrousi等人，2021年)．本研究表明，ECM在细胞水平上对人类皮层发育至关重要，LGALS3BP是ECM信号的中介。有趣的是，患有LGALS3BP突变还表现出局部旋转指数的变化，这是其他mcd的特征(“以旋转指数改变为特征的皮层发育畸形”部分)，加强了不同mcd之间的共病性。

皮质下带异位

皮层下带异位(SBH)的特征是在白质的表面和中间部分有一个光滑的灰质带。当新生成的神经元无法迁移到正确的位置并积聚在白质中时，它就会出现。在人类中，SBH与ID、耐药发作和癫痫有关(Sahu等人，2019年)．大多数患者是携带x -连锁突变的女性克莱斯勒基因，显示出弥漫性的异位神经元厚带(Dobyns 2010)．由于x染色体失活的女性具有随机性克莱斯勒突变呈现出两种神经元群体的镶嵌状态:一种表达DCX并正确迁移，另一种缺陷神经元则产生异位带。在患有DCX缺陷的男性中，神经元完全缺乏这种蛋白质，导致更严重的无脑“光滑”皮层(无脑畸形部分)(Matsumoto et al.， 2001)．另一个与SBH相关的基因座包含PAFAH1B1该基因编码LIS1蛋白。LIS1-相关SBH表现为较细或中间的后束，后异位比前异位更严重(Mineyko等人，2010)．此外，基因突变的个体EML1，表现为SBH、巨脑畸形、多小回(“多小回”部分)、胼胝体发育不全(Shaheen等，2017；Oegema等人，2019)．总的来说，mcd是由关键发育基因的单点突变或几个遗传位点的变异引起的，增加了疾病的概率。有趣的是，常见基因的破坏可能导致不同的疾病表型(表1)，遗传变异的不同外显率使整体临床表现更加复杂(Klingler等人，2021)．

尽管KD克莱斯勒对大鼠的SBH致痫性提供了有价值的见解，他们只拥有单侧SBH，不能准确地模仿人类表型(Lapray等人，2010年)．中断的Eml1导致了HeCo突变小鼠，这是一个独特的模型，已被广泛用于破译SBH的分子基础。HeCo小鼠表现出祖细胞异常，一些rg离开VZ并潜入基础位置(Kielar等人，2014)．HeCo小鼠RGs表现出初级纤毛中断和高尔基体机制紊乱，这可能是导致异常RGs分层的原因(比佐托等人，2017；Uzquiano等人，2019年)．初生纤毛在SBH病理生理中的作用并不令人惊讶，因为它们在RG行为的调节中起着重要作用。尽管如此，尽管HeCo小鼠模型表现出异位，但它们并没有表现出在人类中发现的全部病理，如多小脑回症和巨脑畸形，这表明人类和非人类模型的疾病表现存在差异。

尖端干细胞技术的出现在破解SBH的病因方面具有极高的价值。二维皮层祖细胞分化EML1突变的iPSCs表现出初级纤毛形成紊乱和高尔基体功能中断(Uzquiano等人，2019年)．此外,EML1缺陷前脑类器官呈现异位神经莲座聚集于VZ基底侧和异位神经元簇(Jabali等，2022)．突变类器官VZ中的RG表现出纺锤体方向的改变和较短的初级纤毛，这可能直接影响RG的分层。此外，异位祖细胞群体中的单细胞rna测序显示bRGs标记物和人类特异性ECM成分上调(Jabali等，2022)．虽然该模型系统揭示了EML1缺陷的相关病理机制，但类器官的发育阶段不允许我们研究由EML1缺陷引起的MCDs的全部范围EML1障碍。

以旋回指数改变为特征的皮质发育畸形

Lissencephaly

无脑畸形的特点是神经元迁移缺陷，导致脑沟和脑回发育不良，从而导致大脑表面光滑。它包括一系列脑回形成异常的脑畸形，从无回(脑回缺失)到少回(脑回减少)(塞韦里诺等人，2020)．除此之外，宽脑回(pachygyria)和双皮层(SBH)也包括在无脑畸形的谱系中(Kattuoa和Das, 2022年)．根据畸形程度的不同，患者可能会出现发育迟缓和智力障碍。导致无脑畸形的关键机制之一是脑回和脑沟正常发育的中断。它是由遗传和非遗传因素引起的，例如胎儿发育期间大脑缺乏含氧血液或胎儿母亲感染病毒(Leruez-Ville and Ville, 2017)．有趣的是，许多相关基因也是导致SBH表现的原因(“皮层下带异位”部分)，支持了常见基因损伤导致不同临床表现的观点。Miller Dicker综合征(MDS)是一种以无脑畸形为特征的皮质畸形，常伴有小头畸形(“小头畸形”部分)，导致ID和死亡(赫尔曼和西格尔，2008年)．这种综合征是由人类17p13.3基因带缺失引起的，其中包括PAFAH1B1(LIS1蛋白)(赫尔曼和西格尔，2008年)．无脑畸形的遗传原因也涉及克莱斯勒神经元正常迁移所必需的基因(Corbo等人，2002年)．无脑畸形的其他遗传原因包括基因突变ARX在前脑发育中扮演重要角色(Gécz等，2006)，RELN编码蛋白质卷(Hong等人，2000年)和其他基因Kif2a, kif5c, cdk5, vldlr, actb, actg1,TUBG1（Parrini等人，2016)，但到目前为止还没有正确的模型。

Lis1的功能及其相关通路已在无脑畸形小鼠模型中进行了研究(Youn等人，2009年)．在皮层、小脑、海马和嗅球中，Lis1剂量逐渐减少的小鼠是研究MDS的合适模型。这些模型有助于证明运动协调和认知障碍，严重破坏海马细胞和突触生理以及在活的有机体内迁移缺陷(Paylor等人，1999；弗莱克等人，2000年)．此外，与LIS1/动力蛋白复合物相互作用的NDEL1也与无脑畸形的发病机制有关。具体地说,Ndel1无效小鼠的大脑表现出严重的皮层分层缺陷和海马缺陷(Youn等人，2009年)．另一个与经典无脑畸形和SBH相关的遗传原因是克莱斯勒基因。克莱斯勒突变小鼠的海马体层状结构被破坏，导致学习能力下降(Corbo等人，2002年)．然而，小白鼠的大脑又小又平，这使得用精确的方式对广泛的表型进行建模变得困难。例如，尽管海马体被破坏了，克莱斯勒突变小鼠呈现正常皮层，新皮层神经发生和神经元迁移的规律模式(Corbo等人，2002年)．相比之下，小干扰RNA (siRNA)抑制克莱斯勒在大鼠胚胎皮层切片中导致神经元迁移的严重缺陷(Bai et al.， 2003)．这些相反的结果表明，有一个更复杂的作用克莱斯勒，强调了人类特有模型的必要性。

诱导多能干细胞分化为2D神经细胞提供了一个模型系统，可以进一步研究无脑畸形的分子和细胞调节，特别是无脑畸形的功能克莱斯勒在神经发育。DCX蛋白表达缺失或减少的神经干细胞(NCSs)表现为分化延迟、迁移受损和神经突形成，概括了无脑表型(Shahsavani等人，2018)．如前所述，在发育中的人类皮层中，IP细胞和brg所在的oSVZ与其他哺乳动物相比更厚(汉森等人，2010年)．虽然IPs在人和小鼠之间是保守的，但在无脑小鼠发育中的皮层中brg较少。此外，人类brg与人类大脑皮层尺寸的进化增加有关(Nonaka-Kinoshita等人，2013)．所有这些都可以解释为什么Lis1缺陷小鼠与人类杂合患者相比表现出更温和的表型PAFAH1B1突变。脑类器官培养的实施已经证明了MDS无脑畸形突变对不同生物过程和细胞类型的影响。具体而言，该研究以空间和时间分辨率再现了从ne到rg、ip和brg的发育谱系，这是以前的方法无法实现的(Kadoshima等人，2013)．这突出了MDS中网元和人类特异性brg的脆弱性，而arg和ip受影响较小(Bershteyn等人，2017)．mds -前脑类器官体积小，扩张速率降低，RGs分裂平面改变，神经发生增加，皮层生态位结构改变(Iefremova等人，2017)．最后，ECM参与皮质回化，从而参与以回化指数改变为特征的mcd的表现，考虑到患者隐藏LGALS3BPLGALS3BP在小鼠大脑中的过表达促进了皮层折叠，这表明LGALS3BP调节皮层扩张和脑回化(Kyrousi等人，2021年)．尽管bRG似乎对旋回有强大的影响，因此，mcd的出现具有改变的旋回指数，由于小鼠几乎完全不存在bRG，在该模型中研究bRG行为是具有挑战性的。相比之下，在脑类器官中，存在具有匹配特征的brg样细胞在活的有机体内如形态、分子特性和有丝分裂行为。然而，如何在体外来源的bRG细胞概括了原代bRG细胞的功能特性和分子身份尚未确定，使得协同作用在活的有机体内而且在体外基本模型(图1 a, B)．

Polymicrogyria

多小回症(Polymicrogyria, PMG)是一种MCD，其特征是存在多个异常小回，导致皮层表面不规则折叠，回化指数增加。PMG患者表现为认知障碍、癫痫和发育迟缓。它与几个基因的功能障碍有关，包括TUBA1A（坐垫等，2013)，TUBB2B（格雷尼等人，2012)，TUBB3（Poirier等人，2010)，GPR56（Piao等，2004)，WDR62（Yu等，2010)，加工（Baala等人，2007年)，SCN3A（史密斯等人，2018)，以及环境因素。考虑到brg在gyrencephalic物种中负责皮层折叠，PMG可能是brg迁移增加和/或过多的结果(Klingler等人，2021)．这是一种高度异质性的疾病，在地形分布、临床和影像学特征以及严重程度方面，从病灶形式到双侧受累各不相同(Leventer等人，2010)．PMG常与其他mcd同时发生，如无脑畸形、大头畸形和异位(Stutterd等，2020年)，但它可能是最不具特点的常见mcd (Stutterd and Leventer, 2014)，因此必须作出更多努力，以确定涉及的机制。

只有少数在这里提到的含有pmg相关基因突变的动物模型已被报道(表1)．尽管如此，他们未能准确地概括人类的表型。例如,Tubb2 -缺陷小鼠模型表现出皮层变薄和皮层神经元凋亡增加，导致围产期死亡(Stottmann et al.， 2013)．同样，当个人携带EML1突变表现出广泛的损伤范围，包括pmg样皮层，HeCo小鼠模型未能模仿这种表型(Kielar等人，2014)(皮层下带异位部分)。此外，尽管人类缺乏GPR56会导致双侧额顶叶PMG (Piao等，2004)，在小鼠中，由于神经元过度迁移、RG终足结构畸变和脑膜基底膜断裂，导致皮质神经元异位(Li et al.， 2008)．总的来说，Gpr56突变小鼠表现出无序的皮层层叠和鹅卵石样畸形(Li et al.， 2008)．虽然小鼠模型在MCDs研究中一直是一个有价值的工具，但使用复杂的gyrencephalic皮质对破译与pmg相关的病理机制至关重要。有趣的是，与pmg相关GPR56e1m启动子优先驱动普通绒猴发育皮层gaba能神经元的基因表达，这表明e1m启动子可能与GPR56-突变相关癫痫(村山等，2020年)．此外，改变的表达SCN3A它编码大脑富集的电压门控钠通道Na_V1.3，在雪貂动物模型中，破坏皮层脑回的形成并导致皮层灰质异位，突出了离子通道功能在皮层发育早期阶段的必要性(史密斯等人，2018)．

尽管已经采取了初步的步骤来模拟PMG，但动物模型不能正确地模拟人类临床表型，因此，迫切需要针对人类的模型系统。此外，缺少一些pmg相关基因的人类特异性模型，如GPR56，阻碍疾病的表征和建模，因此需要朝着这个方向采取步骤。过度的SCN3A在2D原代人类神经元培养中，突变变异体削弱了神经突分支，支持这一观点SCN3A调节神经元的发育(史密斯等人，2018)．转录组分析EML1-缺陷COs揭示了异位神经莲座丛人群中bRGs标记物和人类特异性ECM成分的上调，支持bRGs参与PMG病理生理(Jabali等，2022)．考虑到ECM基因上调COL1A2, COL3A1,亮度与皮质扩张和折叠有关(朗等，2018)，这很容易让人推测，它们活性的增加在患者的pmg样表型的发展中起着作用EML1突变(Oegema等人，2019)．此外，使用COs对wdr62相关的小头畸形基因(“小头畸形”部分)进行建模，描述了brg的破坏(Zhang等，2019)，表明该模型系统可能是深入研究PMG相关途径的有价值的工具。尽管如此，在脑类器官中缺乏折叠限制了pmg相关表型的建模。人类COs中PTEN的缺失导致NPC数量的增加和大量的表面折叠(Li等，2017c)，这表明我们离设计可用于PMG建模的折叠脑类器官又近了一步。虽然已经对折叠类器官的生成采取了行动，但现有的协议是初步的。与发生在妊娠第30周左右的皮质旋回相反，当胎儿的大脑主要由神经元组成时，折叠的类器官主要包含npc，因此它们模拟了早期的发育阶段(Karzbrun等人，2018)．总的来说，虽然类器官褶皱相当于皮层回旋，但两者之间存在重要的生物学差异，这表明该领域仍在发展中。

以异常脑大小为特征的皮层发育畸形

头小畸型

小头畸形的特征是大脑生长减慢，定义为头围≤- 3 SD。它是由祖细胞产生和细胞死亡之间的不平衡引起的，并导致神经元和神经胶质细胞数量减少(Ashwal等人，2009年；Álamo-Junquera等，2015)．这是研究最多的mcd之一，广泛的研究表明，原发性小头畸形(出生时存在)的一些原因是DNA修复途径受损(Zhou等，2013)、中心体蛋白质基因突变(Guernsey等人，2010年)、双股断线(Yue等，2013)、接触有毒物质(帕伦斯等人，2017)，在子宫内感染(Antoniou等，2020年)和代谢情况(Ashwal等人，2009年；表1)．继发性小头畸形(产后表现)可与迁移缺陷(Juric-Sekhar等人，2011年)，细胞死亡增加(西蒙斯等人，2019年)，以及代谢紊乱(Ashwal等人，2009年)．此外，小头畸形也可能是其他ndd和综合征的临床特征，如RTT (班纳吉等人，2012年)、天使综合症(孙等，2019年)及塞克尔综合症(al - dosari等人，2010)，而母体感染寨卡病毒(ZIKV)可导致先天性寨卡综合征(CZS)，婴儿会出现严重的小头畸形(摩尔等，2017年；Antoniou等，2020年)．

斑马鱼一直是一种有用的动物模型，以破译遗传影响和小头畸形的分子机制。敲除异常纺锤样小头畸形相关基因(该模型)，该基因与常染色体隐性遗传原发性小头畸形症(MCPH)的表现有关，导致斑马鱼的头尺寸减小(Kim et al.， 2011)．斑马鱼Fnacd2突变体也由于p53依赖性凋亡增加而表现出小头畸形(Liu et al.， 2003)．此外，免疫功能低下(AG129, C57BL/6模型)(Shao等，2016；Julander等人，2018；李晨等，2018)和免疫能力[Swiss Jim Lambert (SJL)， ICR, STAT2 KO模型](李等，2016；戈尔曼等人，2018；Szaba等人，2018)小鼠已成为研究ZIKV感染影响的有用工具。此外，小鼠模型已被广泛用于研究mcph相关基因在发育中的大脑中中断的影响(McIntyre等人，2012；Insolera等人，2014；Zhang等，2019)．CPAP是一种对中心粒生物发生至关重要的蛋白质，其缺失诱导了p53依赖的细胞死亡，严重破坏了胚胎小鼠大脑(林等人，2020)．然而，小鼠患者突变导致轻度小头症表型，并没有深入了解细胞和分子机制。此外，没有明确的证据表明小鼠大脑中的致病突变与人类小头畸形相似。有趣的是,该模型与小鼠相比，雪貂具有更大的gyrencephalic皮层和更大的NPC多样性，其KO导致严重的小头畸形，皮质表面积显著减少(约翰逊等人，2018)．为了更准确地概括CZS的发病机制、神经生理学和治疗发展，NHPs也被使用，因为它们在妊娠生物学中与人类有相似之处(Nguyen等人，2017)．具体来说，猕猴通过ZIKV感染再现了人类小头畸形的主要特征(杜德利等人，2019年)．然而，NHS育种和管理的需求以及转基因动物的生成都是具有挑战性的，突出了对不仅在生理学上与人脑相关而且易于操作的模型系统的需求。

针对人类的2D和3D在体外模型有助于解码小头畸形症的复杂性，这在现有的模型中是具有挑战性的在活的有机体内模型。Seckel患者来源的iPSCs在2D中分化，显示增殖减少和纤毛拉长CPAP变异npc (Gabriel等人，2016年)．有趣的是，Seckel NPC表现出延迟的纤毛分解和延迟的G1-S过渡，这导致NPC过早分化(Gabriel等人，2016年)．在同一序列中，hESCs 2D分化为含有小头畸形相关基因突变的npcKNL1，这是纺锤体组装检查点信号必不可少的，显示细胞生长减少，细胞死亡高，过早分化，以NPC增殖为代价(奥默·贾维德等人，2018)．CDK5RAP2该基因编码CDK5调节亚基相关蛋白2，是第一个用于研究脑类器官中小头畸形的基因。患者来源的COs的产生表明，有丝分裂纺锤体方向的改变影响祖细胞的增殖并导致过早的神经元分化(兰卡斯特等人，2013年)．此外,建模该模型基因突变证明人类COs有能力重现小头畸形(李等，2017a)．反过来,CPAP突变的COs显示出较小的尺寸(小头的一个关键特征)和增加的纤毛数量，这影响了祖细胞的分裂模式并导致过早的神经发生(Gabriel等人，2016年)．同样,一个CPAP在MCPH患者中发现的突变在COs中诱导细胞死亡，并导致较小的类器官的生成(An等人，2022年)．此外,CPAP突变引起NPC纺锤体定向错误，导致过早分化(An等人，2022年)．最后,WDR62COs中编码中心体蛋白的缺失显示睫状体长度受损，NPC增殖减少和过早的神经元分化，最终导致突变类器官的大小减少(Zhang等，2019)．在小头畸形的2D/3D模型中，纤毛结构和功能的紊乱突出了初生纤毛在调节包括npc增殖和分化在内的关键发育过程中的必要性。最后但并非最不重要的是，脑类器官已经成功地概括了ZIKV感染在皮层发育中的影响，揭示了一种rg特异性感染，特别是在VZ，导致增殖区减少(Cugola等人，2016)．

巨头

对于特定年龄和性别，头围≥2标准差(Accogli等人，2022)，其原因是祖细胞增殖率较高，以及生长因子信号传导存在缺陷(Sun和Hevner, 2014)．杂合子功能丧失突变PTEN在伴有ASD的头大畸形患者中被发现，同时(巴特勒等人，2005年)．的人PTEN突变表现为脑增大和白质异常(范德弗等人，2014)．尽管如此,PTEN突变在不同的大脑区域不会产生相同的影响。不同大脑区域的异常缩放可能表明连接中断，异位组织的存在，或关键大脑区域的神经支配异常，这可能有助于行为表型。有趣的是，失去PTEN导致PI3K-AKT-mTOR信号的增加，而PI3K-AKT-mTOR信号反过来又被认为在头大畸形中具有重要作用(Yeung等，2017)．例如，与PI3K相互作用的小GTPase RAB39B突变与x -连锁头畸形、ASD和ID相关(Woodbury-Smith等人，2017)．此外,AKT3激活突变与大头颅畸形和多小回症有关(Lee et al.， 2012)．

由于对人类脑组织的接触有限，大头颅畸形的产前神经发育异常很难被理解。因此，转基因动物模型仍然是在分子和行为基础上仔细研究巨头畸形发病机制的必要策略。Rab39bKO小鼠表现出大头畸形和自闭症样行为(Zhang等，2020)．特别是，它们表现出增加的增殖率和减少的npc细胞周期退出，从而导致祖细胞池的扩大(Zhang等，2020)．Pten^{+ / -}小鼠模型表现为局部脑过度生长，与成人脑膨大相似PTEN-ASD患者(Clipperton-Allen等人，2019年)．这种表型可能与由于PI3K通路抑制减少而增加的胶质瘤发生有关(Clipperton-Allen等人，2019年)．此外,Akt3具有显性错义突变的突变小鼠表现出增强的信号活性和增大的脑大小(德田等人，2011年)．

在人类中，大部分上层神经元来自于brg丰富的oSVZ。相反，在啮齿动物中，brg样细胞数量较少。因此，人类iPSCs和ipsc衍生的脑类器官是研究巨头症的一个有价值的平台，因为人类大脑表现出增加的皮质尺寸和复杂性。的确,RAB39b突变COs表现出更严重的表型(Zhang等，2020)与KO小鼠模型相比，突出了大脑类器官在模拟人类早期发育中的宝贵作用。与突变小鼠相比，这些突变的大脑类器官在神经祖细胞池和上层神经元中有更显著的增加，这解释了突变类器官中出现的严重表型(Zhang等，2020)．同样，删除PTEN导致脑类器官增大和折叠。PTEN类器官中的纯合突变增加了PI3K通路信号，促进了npc的细胞周期重新进入，并短暂延迟了神经元分化，导致祖细胞群体的扩大(Li等，2017c)．然而，类器官和突变小鼠之间的发育时间不兼容的事实，表明了在小鼠模型和人脑类器官之间进行并排比较的重要性。

脑类器官作为模拟神经退行性和神经精神疾病的工具

除了脑类器官在ndd研究中的应用外，它们还可用于阐明神经退行性疾病和神经精神疾病的受损过程(Sun等，2021年)．动物模型大脑的生理相关性较差，治疗方法的数量有限，以及神经退行性疾病的治疗效果不佳，这都需要革命性的工具。此外，对患者来源组织的非侵入性分析和有效的药物筛选系统的需求促成了脑类器官培养的出现。尽管脑类器官不能概括衰老的大脑，但它们已被用于模拟几种神经退行性疾病。由于这些疾病与前驱性疾病的长时间相关，其中细胞异常正在积累而没有表现为临床症状，类器官使我们能够研究这些驱动神经退行性变的早期细胞变化(雷,2021)．此外，类器官技术的进步使脑类器官的培养得以延长，从而增加细胞多样性和神经元成熟(Quadrato等人，2017年)．这些成熟的类器官形成了自发活跃的神经元网络，并获得了成熟神经元的特征，这表明，除了建模早期神经发育过程之外，它们有潜力模拟人脑的高阶功能(Quadrato等人，2017年)．类器官已被用于模拟阿尔茨海默病(AD) (冈萨雷斯等人，2018；Ghatak等人，2019年)、帕金森氏症(Kim等人，2019年；Smits等人，2019年)、肌萎缩侧索硬化症(渐冻症)(Osaki等人，2018)、额颞叶痴呆(Seo等人，2017)、亨廷顿氏症(Conforti等人，2018)和脊髓性肌肉萎缩症(Hor等人，2018)．考虑到2D模型系统缺乏复杂的细胞外环境来概括蛋白质聚集，例如错误折叠的淀粉样蛋白β (a β)斑块的细胞外沉积，AD的分子标志，3D培养条件提供了一个强大的工具来研究a β病理(Lee等人，2016；Bubnys和Tsai, 2022年)．此外，人类中脑类器官的出现是帕金森病研究的先驱，其特征是黑质致密部多巴胺能神经元的损失和路易体包涵体的存在(Galet et al.， 2020)．同样，人类大脑在生理、功能和结构方面的复杂性，以及认知能力的增加，都指出了研究神经精神疾病需要人类特有的模型系统。在这个方向上，类器官为精神分裂症的相关病理机制提供了有价值的信息(Kathuria等人，2020年)、双相情感障碍(默滕斯等人，2015)、精神病(Sawada等人，2020年)和抑郁(Vadodaria等人，2019年)．特别是，使用脑类器官对精神分裂症相关基因的影响进行建模，揭示了被破坏的神经莲座结构和被WNT拮抗挽救的npc增殖的改变，表明类器官可以成为药物测试的有价值的工具(图1 b） (斯里坎斯等人，2018)．考虑到ndd患者可能同时表现出神经退行性或神经精神疾病，使用能够忠实地概括它们的模型系统具有很大的潜力。

结论及未来展望

创造一个有功能的大脑皮层需要协调重要的发育过程，如祖细胞的增殖和分化，神经元迁移，最终它们成熟并融入现有的神经元网络。这些复杂而微妙的过程的中断会导致大量的脑损伤，即ndd。他们的临床表现包括发育迟缓、癫痫、ID，以及各种影响皮层大小、厚度和折叠的结构异常。了解ndd的分子病因对患者管理至关重要。尽管如此，它们的多因子和多基因性质使得建模变得困难。虽然啮齿动物和其他动物模型一直是破译ndd中隐含通路的基础，但使用人类特异性模型是必不可少的。朝着这个方向，ipsc衍生的2D和3D在体外培养在模拟人类神经发育病理方面显示出巨大的潜力。在这篇综述中，我们详细阐述了在活的有机体内而且在体外用于研究ndd的模型(图1 a, B)．

尽管干细胞和类器官发育的巨大进展已经破译了复杂的致病途径，但脑类器官作为模型系统仍存在许多局限性(Paşca, 2018年)．特别是，它们没有发育过出生前的大脑阶段，也不能再现皮层板的六层空间组织(兰卡斯特等人，2013年)．然而，最近在大脑类器官模式方面的进展已经导致了延长在体外开发，实现重要的成熟度级别(Quadrato等人，2017年；Velasco等人，2019年)．此外，尽管存在brg，但COs未出现pial表面折叠和旋回(Qian等，2019)．此外，E/I神经元虽然有功能，但与成年神经元相比还不太成熟。因此，类器官中的细胞多样性仍有待进一步丰富，也考虑到它们缺乏非神经元细胞类型，如小胶质细胞(杜塔等人，2017年)，可通过新的模式协议(Ormel等人，2018)或将来与非神经元谱系细胞共培养。血管化的缺乏限制了营养物质和氧气的输送，这是这些培养物长期生存的另一个重大障碍，因为在类器官内建立了坏死的核心(Qian等，2019)．为了解决缺乏血管化的问题，已将人类大脑类器官移植到成年小鼠大脑中(曼苏尔等人，2018)．有趣的是，在这些小鼠中观察到功能性移植物内神经元网络以及移植物与宿主的突触连接。克服这些问题的另一个有前途的工具是芯片上的类器官。最近的一份关于人类肾脏的报告检查了hipsc衍生的肾类器官在血管化和成熟过程中的流体流动。他们在3D打印的腔室中设计了它们，这导致了类器官内内皮祖细胞的扩张，并最终以流动增强的方式形成血管(霍曼等人，2019年)．另一个限制是不同类器官培养的可变性，这取决于创始细胞系的质量(即，iPSCs的系和传代)(Hernández等，2022)．最后，使用脑类器官来建模ndd的一个主要障碍是缺乏任何行为读取在体外文化。总结，围绕六层人体架构，在体外血管化、模式化和组织特征的进一步细化可以为开发更健壮的人类特异性模型系统提供巨大的希望(Chiaradia和Lancaster, 2020年)．然而，类器官在动物大脑中的高级发育和植入构成了一个伦理灰色地带，使伦理学家怀疑这些实验对回答科学问题是否必不可少，或者是否超越了界限(里尔登,2020；鲍威尔,2022)．

作者的贡献

ED和LM撰写了手稿。CK构思、撰写并修改了所呈现的作品。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

资金

这项工作得到了希腊研究与创新基金会(2881)和国际大脑研究组织(IBRO)的支持。

致谢

我们感谢Panagiota Nti Kostantzo对手稿的批判性阅读。由于篇幅所限，一些主要出版物无法被引用，对此我们深表歉意。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

参考文献

阿布德，E. M.，拉米雷斯，R. N.，马丁内斯，E. S.，希利，L. M.，阮，C. H. H.，纽曼，S. A等人(2017)。ipsc衍生的人类小胶质细胞用于研究神经系统疾病。神经元94年,278 - 293. e9。doi: 10.1016 / j.neuron.2017.03.042