的封锁D-丝氨酸信号和成年海马神经发生在雄性小鼠多次记忆检索后减弱远程情境恐惧记忆

简介

巴甫洛夫恐惧条件反射是研究正常和病理性恐惧神经生物学的有用工具(约翰逊等，2012年；勒杜,2014；鲍尔斯和雷斯勒，2015年)．情境恐惧条件反射是一种能够根据情境创造恐惧记忆的范式，并且假设条件恐惧记忆的检索与创伤后应激障碍(PTSD)的再体验症状具有共同或相似的机制(鲍尔斯和雷斯勒，2015年；Chaaya等人，2018；勋伯格等人，2022)．巩固性恐惧记忆的提取诱发了两个相反的过程:再巩固和消失。短暂的恐惧记忆检索(例如，通过少于5分钟的重新暴露于环境)诱导了再巩固，而延长检索(30分钟重新暴露)在小鼠(铃木等人，2004年)．再巩固维持或增强恐惧记忆，而消失则会削弱检索到的恐惧记忆(铃木等人，2004年)．研究表明，通过重新接触环境来提取记忆可以使记忆恢复到暂时的不稳定状态，这需要一个主动的再稳定过程才能持久(纳德等人，2000年)．重新巩固是一个主动的过程，涉及基因表达和更新现有的记忆，如修改记忆强度，在原始记忆中添加新信息(Nader和Einarsson, 2010)．因此，有假设认为，通过在分子或细胞水平上机械地操纵相关神经生物学因素，预防或阻断再巩固可以削弱甚至破坏原始的恐惧记忆(Careaga等人，2016；重击,2019)．

NMDA受体通过控制Ca，在突触可塑性、突触形成和神经元兴奋中发挥重要作用^２＋离子流入细胞(Cull-Candy等人，2001年)．该受体由异四聚体亚基组合组成，包含两个GluN1亚基，结合甘氨酸或D-丝氨酸和两个GluN2亚基结合谷氨酸(Karakas和Furukawa, 2014；Lee et al.， 2014)．GluN2A和GluN2B是最常见的NMDA受体亚型，定位于成人大脑的皮层和海马区，并被确定为长期记忆形成的关键突触元素，包括恐惧事件的联想学习(Monyer等人，1994年；袁等，2009)．据报道，成年大鼠CA3-CA1突触中含有glun2a的NMDA受体占NMDA受体种群的70-75% (Matsui et al.， 1995)，而沉默这些突触NMDA受体提供了对抗NMDA受体诱导的兴奋性毒性的神经保护(Papouin等人，2012)．在突触后密度上含有GluN2B的NMDA受体的小比例可能是单个突触加强的必要条件，有证据表明，GluN2B亚基可能对可塑性特别重要，并可能使突触双向灵活，用于诱导长期增强(LTP)或长期抑制(LTD) (Matsui et al.， 1995)．关于NMDA受体亚型在情境恐惧条件反射中的作用，含glun2b的NMDA受体对于记忆再巩固是不可或缺的，而破坏含glun2b的NMDA受体可以阻止不稳定诱导(米尔顿等人，2013)．脾后皮层中含有glun2a的NMDA受体对于近期和遥远的恐惧记忆的检索是必需的(科克伦等人，2011年)．突触后神经元中NMDA受体信号通路中的一系列关键分子的激活，包括环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)，是记忆再巩固所必需的(Kida等人，2002年；Wang和Peng, 2016)．因此，NMDA受体信号下调或阻断是抑制恐惧记忆再巩固的一种替代方法。

GluN1亚基是所有功能性NMDA受体中的强制性亚基，因此在所有中枢神经元中广泛表达(汉森等人，2018)．CA3-CA1区域的突触受体，由谷氨酸和D-丝氨酸是LTP诱导所必需的，可被细胞外降解所抑制D丝氨酸通过治疗D-氨基酸氧化酶切片(Papouin等人，2012)．这些报道的发现表明阻塞D-丝氨酸信号通路可下调CA3-CA1区和脾后皮层NMDA受体依赖的突触激活，这对远程恐惧记忆的恢复和维持至关重要。细胞外改变的方式D-丝氨酸水平已被用于调节NMDA受体依赖的突触活性(莫尼耶等人，2017)．在哺乳动物的大脑中，合成D丝氨酸从l-丝氨酸是由丝氨酸消旋酶(SRR)催化的，SRR基因敲除(KO)小鼠表现出90%的降低D海马体和大脑皮层的-丝氨酸含量(Inoue等人，2008)．在先前的SRRKO小鼠模型中，齿状回(DG)突触内侧穿孔通路的LTP强度减弱(Balu等，2013)．因此，我们证明了DSRRKO小鼠的-丝氨酸减少可减轻NMDA受体介导的神经毒性引起的脑损伤(Inoue等人，2008)．进一步证明了的作用D-丝氨酸在情境恐惧记忆检索后消失中的作用(Inoue等人，2018)．因此，可以想象，SRR缺失引起D-丝氨酸减少可能会下调NMDA受体信号，这是记忆重新巩固所必需的。

成人海马神经发生在人类和所有其他哺乳动物DG的亚颗粒区(刘,2022；tereros - roncal等人，2022)．DG中成年出生的神经元在功能上整合到海马回路中，在神经可塑性中发挥作用(《明与宋》，2005；Leuner和Gould, 2010)．越来越多的证据表明，成人出生的海马神经元是获得和表达上下文恐惧记忆所必需的(萨克斯等人，2006年；Winocur等人，2006；德鲁等人，2010年)．细胞类型特异性光遗传或化学遗传操作方法的进展表明，DG中新生成的未成熟颗粒细胞以经验依赖的方式参与DG依赖的上下文和空间辨别行为的编码或检索阶段(Gu等，2012；丹尼尔森等人，2016年；阿纳克尔等人，2018；哈克贝利等，2018)．值得注意的是，在远程记忆重建过程中，学习时不成熟的成人出生的神经元群体的沉默，损害了随后的记忆检索，这表明成人海马神经发生在记忆重建中的贡献(Lods等人，2021年)．这些证据提供了另一种可能的方法来削弱远程恐惧记忆，以提取诱导的再巩固为目标通过神经发生的抑制。

据我们所知，关于NMDA受体或海马神经发生在上下文恐惧记忆(包括恐惧记忆的获取和表达，以及提取和消失)中的作用的研究大多是孤立的，没有报道同时调查这两个因素在记忆提取和远程恐惧记忆(28天记忆)维持中的作用。本研究以削弱原始恐惧记忆为目标，采用情境恐惧条件反射与多重检索干预诱导再巩固，并通过阻断记忆的记忆机制对诱导的再巩固进行定向D-丝氨酸介导的NMDA受体信号通路与海马神经发生的不同途径。目前的发现提供了深入了解的作用D-丝氨酸介导的NMDA受体信号通路和神经发生在记忆检索和远程恐惧记忆维持中的作用，可能有助于开发一种新的策略，以提高暴露疗法在PTSD治疗中的疗效。

材料与方法

老鼠

我们使用2月龄的雄性野生型(WT)和SRRKO小鼠，如先前报道的那样，具有纯C57BL/6N遗传背景(Miya等人，2008年)．D- SRRKO小鼠大脑皮层和海马体中的丝氨酸含量比WT小鼠低约10倍。相比之下，的水平l-丝氨酸、甘氨酸和谷氨酸在SRRKO小鼠大脑皮层和海马体中的含量与WT小鼠相当(Inoue等人，2008)．动物护理和实验方案由富山大学动物实验委员会批准(授权号2018 MED-38)。这些小鼠被关在一个温度和湿度可控的房间里，在12小时的明暗循环下(早上7点亮灯)，并能获得食物和水随意．

情境恐惧条件反射，多重检索，远程恐惧记忆测试

在进行行为实验前，每天对小鼠进行1分钟的处理，持续一周。恐惧条件反射在一个小条件反射室(10 × 10 × 10厘米;透明的墙壁和由14根不锈钢棒制成的地板)，周围是一个减音箱(CL-M3, O 'Hara & Co.， Ltd，东京，日本)。

对于情境恐惧条件反射，小鼠被放置在条件反射室中，并在进入房间59和119秒后分别发出两次电击(0.5 mA, 1秒)，如先前报道的那样(Inoue等人，2018)．在最后一次足电击后一分钟，老鼠被放回它们的笼子。作为多重检索组，小鼠在恐惧条件反射后1、7和14天再次暴露于条件反射室5分钟或30分钟，不接受足电击，并于第28天在条件反射室中进行5分钟的远程恐惧记忆测试。作为未回收组，对小鼠进行如上所述的恐惧条件反射，并在恐惧条件反射28天后在条件反射室中测试远程恐惧记忆5 min。

老鼠的行为由数码相机和Freezeframe软件(Coulbourn Instruments)自动记录。在Macintosh计算机上使用基于NIH Image程序的Image FZC 2.22sr2 (O’hara & Co.， Ltd)软件分析冻结响应。在恐惧条件反射实验、5分钟重曝光的短暂检索和远程恐惧记忆实验中，图像捕获速率设置为2帧/秒。对于重复曝光30 min的扩展检索，图像的捕获速率设置为1帧/秒。

x射线照射

进行x射线照射，如先前报导(Santarelli等人，2003年)，并作了修改。简单地说，用3.6%水合氯醛麻醉8周龄小鼠，放置在立体定向框架中，并使用150kv和5ma操作的x射线照射仪(MBR-1505R, HITACHI)对其头部进行照射。除海马体上方3.2 × 11 mm的治疗区外，用铅罩覆盖小鼠全身。在源-皮肤距离为13 cm时，校正剂量率约为0.35 Gy/min。该过程持续了大约15分钟，总共提供了5戈瑞。

药品监督管理局

替莫唑胺(TMZ, LKT LAB, Toyama, Japan)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，然后在生理盐水(0.9% NaCl)中稀释至5 mg/ml浓度。TMZ的剂量(25 mg/kg体重)和注射时间表的选择是基于以往的行为研究结果(斯通等人，2011；Castilla-Ortega等人，2016)．在第1周和第2周连续3天，在恐惧条件作用后24小时腹腔注射TMZ或生理盐水。在每个注射日对小鼠称重，并计算TMZ或生理盐水注射量。

将1-羟基-3-氨基吡啶-2- 1 (HA-966, RSD，日本京都)溶解在浓度为20 mg/ml的生理盐水中，并在情境恐惧条件反射后14天使用渗透微型泵(1003D模型，Alzet, Cupertino, CA, USA)给药。渗透泵植入时，用异氟醚(2-5%)麻醉小鼠，在动物背部皮下插入渗透泵(泵平行于脊柱，缓流剂向后引导)，然后缝合伤口。泵送速率为0.25 μL/h，泵送时间为14 d。对照组和TMZ组小鼠接受假手术。

Immunofluorescent染色

WT和SRRKO小鼠用戊巴比妥钠(100 mg/kg体重，腹腔注射)深度麻醉，然后经心灌注磷酸盐缓冲生理盐水(PBS, pH 7.4)，然后在0.1 M磷酸盐缓冲液(PB, pH 7.4)中加入4%多聚甲醛(PFA)。取出大脑，用4%的PFA固定过夜，并在含有30% (w/v)蔗糖的0.1 M PB中浸泡36小时，温度为4℃。用冷冻切片机将大脑连续切成25 μm厚的冠状切片。对于每只动物，每隔8个切片(bregma从-1.34到-3.58 mm，每只动物12个切片)进行免疫荧光染色，如下所示。

自由漂浮的脑切片用PBS冲洗，用蛋白阻断血清游离(Dako Cytomation, Carpinteria, CA, USA)在室温下(RT)封闭10分钟。然后将大脑切片与山羊抗双皮质蛋白(DCX)多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1:100)在含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中稀释，在4℃下孵育过夜。PBS洗涤后，切片用Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, 1:500)偶联的驴抗山羊IgG在含1% BSA的PBS中稀释1小时。然后切片在PBS中洗涤，DRAQ5 (Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, UK)在rt中染色30分钟。PBS洗涤后，切片用盖玻片覆盖。

使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS-SP5, Leica Microsystems, Mannheim, Germany)收集荧光图像堆栈。三维图像堆栈(图像大小，1.55 mm × 1.55 mm;每个平面像素尺寸为3.03 μm × 3.03 μm)，步长为2.5 μm。dcx阳性细胞计数采用基因型盲法。DG中dcx阳性细胞数按公式计算:dcx阳性细胞/DG = dcx阳性细胞/切片× 96。

统计分析

采用Excel统计软件(Statcel 2;社会调查研究信息有限公司，日本东京)。采用GraphPad Prism 9.0软件(GraphPad software Inc.， San Diego, CA, USA)进行三向重复测量方差分析。方差分析结果显著事后多重比较Tukey-Kramer检验。所有数值均以平均值±SEM表示。的值p< 0.05为有统计学意义(^＊p< 0.05,^**p< 0.01)。

结果

同时封锁的效果D-丝氨酸信号和神经发生在远程恐惧记忆后多次检索

我们设计了一个诱导再巩固的范例，在恐惧条件反射后的第1、7、14和28天进行了4次5分钟的检索(图1一个)．为了调查D-丝氨酸减少单独和联合神经发生抑制可以影响提取诱导的再巩固和最终远程上下文恐惧记忆，我们在恐惧条件反射前4周对WT和SRRKO小鼠进行海马x射线照射以抑制神经发生(图1一个)．将小鼠分为四组:未接受x射线照射的WT小鼠(WT)、未接受x射线照射的SRRKO小鼠(SRRKO)、接受x射线照射的WT小鼠(WT- x - x)和接受x射线照射的SRRKO小鼠(SRRKO- x - x)。在训练过程中，三向重复测量方差分析显示时间有显著影响[F₍₉₂₎= 165.1,p< 0.001]，而非基因型[F₍₄₆₎= 3.394,p= 0.072]， x射线照射[F₍₄₆₎= 0.219,p= 0.642]，时间×基因型[F₍₉₂₎= 0.197,p= 0.822]和时间× x射线照射[F₍₉₂₎= 0.075,p= 0.928]交互作用(图1 b)．在四次检索过程中，三次重复测量方差分析显示基因型的显著影响[F₍₄₆₎= 17.75,p< 0.001]，检索会话[F₍₃₁₃₈₎= 45.88,p< 0.001]， x射线照射[F₍₄₆₎= 10.49,p= 0.002]，检索次数×基因型互作[F₍₃₁₃₈₎= 11.16,p< 0.001]，但不包括检索会话× x射线照射[F₍₃₁₃₈₎= 1.021,p= 0.386]和基因型× x射线照射[F₍₄₆₎= 2.701,p= 0.107]交互作用(图1 c)．的事后分析显示，srrko - x射线小鼠在第14天和第28天的测试中，与其他三组相比，冻结水平显著降低(图1 c)．在第28天的远程测试中，双向重复测量方差分析显示基因型有显著影响[F₍₄₆₎= 34.95,p< 0.001]， x射线照射[F₍₄₆₎= 7.835,p= 0.007]，基因型× x射线照射相互作用[F₍₄₆₎= 6.838,p= 0.012)。的事后分析表明，与其他三组相比，srrko - x射线小鼠表现出明显的冻结水平降低，而在WT小鼠中，单独多次检索或其与神经发生抑制相结合没有导致远程恐惧记忆的减少(图1 d)．未检索小鼠(No-Ret)被用来研究多次检索(Ret)如何影响远程恐惧记忆的维持。在第28天的远程恐惧记忆测试中，双向重复测量方差分析显示基因型[F₍₃₇₎= 0.068,p= 0.796]和x射线照射[F₍₃₇₎= 0.051,p= 0.823] (图1 e)．这些数据表明，同时D-丝氨酸减少和神经发生抑制导致每次检索后冻结逐渐减少，在第28天对远程上下文恐惧记忆达到显著衰减效果。

为确认x射线照射的有效性，在第28天最终检索试验完成后立即取脑，进行DCX免疫荧光染色。双向重复测量方差分析显示基因型有显著影响[F₍₁₈₎= 11.176,p= 0.004]， x射线照射[F₍₁₈₎= 42.087,p< 0.001]，基因型× x射线照射相互作用[F₍₁₈₎= 4.530,p= 0.047)。的事后分析显示，x射线照射显著降低了WT小鼠dcx阳性细胞数量(减少26.7±3.7%)和SRRKO小鼠dcx阳性细胞数量(减少40.9±6.2%)(图2A、B)．有趣的是，我们发现与WT小鼠相比，SRRKO小鼠的dcx阳性细胞数量显著增加(图2A、B)．

药理阻断作用D-丝氨酸信号和神经发生在远程恐惧记忆后多次检索

基于上述数据，我们进一步尝试使用训练后药理操作进行阻断D-丝氨酸信号通路和抑制神经发生，以靶向抢救诱导的再巩固，旨在验证将现有方法转化为临床应用的可能性。我们使用TMZ，一种抗有丝分裂药物来抑制神经发生(Niibori等人，2012；Egeland等，2017)和HA-966，一种NMDA受体拮抗剂，作用于甘氨酸-和D-丝氨酸结合位点(基斯等人，1989年)，以阻挡D丝氨酸信号。在恐惧条件反射后的第一和第二周，TMZ注射连续三天进行(图3一)．在第14天检索试验结束后立即开始使用渗透小型泵皮下给药HA-966，并持续到第28天第4次检索试验(图3一)．根据实验处理的不同，将小鼠分为4组:对照组(生理盐水注射+假手术)、联合组(TMZ注射+ HA-966给药)、HA-966(生理盐水注射+ HA-966给药)、TMZ组(TMZ注射+假手术)。在恐惧条件反射过程中，三向重复测量方差分析显示时间的显著影响[F₍₆₈₎= 93.86,p< 0.001]而不是TMZ注射[F₍₃₄₎= 0.941,p= 0.339]， HA-966给药[F₍₃₄₎= 0.014,p= 0.905]，时间× TMZ注射[F₍₆₈₎= 0.803,p= 0.452]，时间× HA-966给药[F₍₆₈₎= 0.080,p= 0.923]交互作用(图3 b)．在四个检索会话的过程中，三向重复测量方差分析揭示了检索会话的显著影响[F₍₃₁₀₂₎= 10.12,p< 0.001]和检索会话× HA-966给药交互[F₍₃₁₀₂₎= 7.037,p< 0.001]而不是TMZ注射[F₍₃₄₎= 0.411,p= 0.526]， HA-966给药[F₍₃₄₎= 0.941,p= 0.339]，检索会话× TMZ注入交互[F₍₃₁₀₂₎= 1.011,p= 0.391] (图3 c)．的事后分析表明，与第1天、第7天和第14天的检索测试相比，联合组在第28天的第4次检索测试中冻结水平显著降低。在第28天的远程测试中，双向重复测量方差分析显示HA-966给药效果显著[F₍₃₄₎= 10.578,p= 0.002]而不是TMZ注射[F₍₃₄₎= 1.806,p= 0.188]和TMZ注射× HA-966给药相互作用[F₍₃₄₎= 0.687,p= 0.413] (图3 d)．在无多次检索(no - ret)干预的情况下，双向重复测量方差分析显示HA-966给药无显著影响[F₍₃₄₎= 0.200,p= 0.657]和TMZ注射[F₍₃₄₎= 1.461,p= 0.235]在第28天的远程恐惧记忆测试中(图3 e)．这些结果验证了基于药理学操作的靶向方法在削弱远程恐惧记忆方面的有效性。

为了证实TMZ注射对神经发生的疗效，在第28天完成最后的检索试验后立即取出大脑，并进行DCX免疫荧光染色。双向重复测量方差分析显示HA-966给药效果显著[F₍₁₁₎= 13.628,p= 0.004]和TMZ注射[F₍₁₁₎= 28.763,p< 0.001]但没有TMZ注射× HA-966给药相互作用[F₍₁₁₎= 0.001,p= 0.977] (图4A、B)．TMZ组与对照组相比，DG中dcx阳性细胞减少了约45%。

封锁的效果D-丝氨酸信号和神经发生在远程恐惧记忆后延长或短暂的检索

研究表明，在情境恐惧条件反射模型中，记忆提取启动了两个相反的过程，即再巩固和消失，这两个过程主要受记忆再激活时间和记忆强度的影响(铃木等人，2004年)．短暂的记忆提取(例如，5分钟重新暴露)会诱导再巩固，而延长的记忆提取(30分钟重新暴露)会导致熄灭效应。因此，我们研究了在阻断条件下，短暂检索和扩展检索对远程恐惧记忆的影响是否存在差异D-丝氨酸信号和神经发生。我们首先研究了WT和SRRKO小鼠在恐惧条件作用后注射TMZ后30分钟再暴露的延长回收的灭火效果(图5一个)．在第1天、第7天和第14天的三个消光程序过程中，双向重复测量方差分析显示消光程序的影响显著[第1天，F₍₅₁₀₂₎= 9.90,p< 0.001;7天,F₍₅₁₀₂₎= 4.90,p< 0.001;14天,F₍₅₁₀₂₎= 3.67,p= 0.004]，而不是基因型[第一天，F₍₁₁₀₂₎= 1.74,p= 0.190;7天,F₍₁₁₀₂₎= 0.94,p= 0.334;14天,F₍₁₁₀₂₎= 0.82,p= 0.368]和灭绝程序×基因型相互作用[第1天，F₍₅₁₀₂₎= 0.67,p= 0.643;7天,F₍₅₁₀₂₎= 0.70,p= 0.625;14天,F₍₅₁₀₂₎= 0.71,p= 0.615] (补充图1A-C)．为了进行对比分析，我们使用5分钟的再曝光进行检索，重复相同的实验。在四次检索过程中，双向重复测量方差分析显示基因型的显著影响[F₍₃₆₎= 16.08,p< 0.001]而不是检索会话[F₍₃₆₎= 2.72,p= 0.058]与基因型×检索会话相互作用[F₍₃₆₎= 1.38,p= 0.264] (图5 b)．在第28天的远程测试中，双向重复测量方差分析显示检索时间有显著影响[F₍₂₆₎= 7.884,p= 0.009]和基因型×检索时间相互作用[F₍₂₆₎= 6.002,p= 0.021]，基因型的影响趋势[F₍₂₆₎= 4.11,p= 0.053)。的事后分析显示，接受短暂回收的WT小鼠的冷冻水平明显高于其他三组，即接受短暂回收的SRRKO小鼠、接受延长回收的WT小鼠和接受延长回收的SRRKO小鼠(图5 c)．总的来说，这些数据表明，简短的检索可能会诱导记忆重新巩固，这可能会被同时封锁的大脑D-丝氨酸信号和神经发生。

讨论

在基于多重检索范式的情境恐惧条件反射模型中，我们首先考察了阻塞的影响D-丝氨酸信号通路和海马神经发生分别通过SRR基因缺失和条件反射前海马照射抑制远端情境恐惧记忆。我们发现了两个主要结果:(1)eitherD-丝氨酸减少或神经发生抑制对远程恐惧记忆无显著抑制作用;(2)同时进行上述两种干预可逐步减少每次检索后的冻结，最终减弱远程恐惧记忆。此外，在同一行为实验中，同时进行药物阻断D-丝氨酸信号和调节后的神经发生产生了类似的结果。这些结果提出了一种通过操纵两者来削弱远程情境恐惧记忆的有效方法D-丝氨酸信号转导和神经发生破坏多次回收后假定诱导的再巩固。

迄今为止，针对创伤后应激障碍(PTSD)患者以诱发消失记忆为目标的检索过程已作出了大量努力，以改善暴露治疗干预的效果。记忆消失的主要局限性是原始的恐惧记忆没有被改变，只是被抑制，因此不适应的防御行为会随着时间的推移而恢复(Vervliet et al.， 2013；莫里森和雷斯勒，2014年)．因此，再巩固阻断可能是直接削弱或破坏原始恐惧记忆的潜在替代方法。事实上，在没有接受多次回收干预的SRRKO小鼠(no - ret组)中，局部x射线照射在条件反射后28天的远程情境恐惧记忆测试中未能导致显著损害。这一结果大概是由于减少的方式D-丝氨酸水平对NMDA受体功能有中度下调作用，辐照对WT小鼠和SRRKO小鼠的未成熟神经元分别减少26.7%和40.9%。因此，在强度较高(两次0.5 mA足电击)的恐惧条件反射中，需要采用多次检索的干预策略来弱化远端恐惧记忆。根据先前报道的数据显示，在情境恐惧记忆模型中，短暂的记忆检索(例如，小于5分钟)会诱导再巩固(铃木等人，2004年)，每次检索均选择5 min的再暴露时间，设计了初始恐惧记忆巩固后多次检索的范式，旨在通过操纵诱导目标的再巩固D-丝氨酸信号和神经发生。

近年来的研究进展表明，NMDA受体介导的信号通路在检索上下文恐惧记忆中的关键作用，表现为:(1)在信号通路的上游调节MAPK激活，进而影响CREB磷酸化(Kida等人，2002年；Wang和Peng, 2016(2)阻断含有glun2b的NMDA受体可防止检索引发的原始情境恐惧记忆的不稳定(米尔顿等人，2013(3)在脾后皮层中阻断含有glun2a的NMDA受体，会阻止恢复近期和遥远的情境恐惧记忆(科克伦等人，2011年)．因此，通过下调NMDA受体信号靶向再固结的策略至少需要避免破坏含glun2b的NMDA受体，才能成功诱导失稳/再固结过程。D-丝氨酸，作为一种联合激动剂，以前被用于调节NMDA受体的功能(Inoue等人，2008；莫尼耶等人，2017)通过改变其在细胞外环境中的水平。为了下调NMDA受体信号，我们使用了SRRKO小鼠D-丝氨酸含量在海马体和大脑皮层。我们观察到D-丝氨酸减少单独对多次检索后的远程恐惧记忆衰减没有显著影响，这表明可能存在其他关键因素对支持再巩固起代偿作用，例如海马神经发生。

为了进一步改善针对再巩固过程的策略，我们在恐惧条件反射前4周对海马体进行局部x射线照射，以抑制神经发生，此前研究表明，这种照射会消除4 - 6周大的新生神经元，并导致背景性恐惧记忆障碍(Hernández-Rabaza等，2009；丹尼等人，2012年)．先前的研究资料显示，使用辐射消除或抑制成人神经发生可能导致剂量依赖的炎症反应(Mizumatsu等人，2003年；Hernández-Rabaza等，2009)，照射全脑后2个月，单次照射5或10戈瑞可使小胶质细胞活化增加，但未产生新的星形胶质细胞或少突胶质细胞(Mizumatsu等人，2003年)．虽然我们的工作没有评估新的星形胶质细胞或少突胶质细胞的产生，但我们选择了5 Gy的单次照射，这被认为是临床相关剂量(Mizumatsu等人，2003年)，并较其他研究所使用的值(Hernández-Rabaza等，2009；丹尼等人，2012年)．对海马进行局灶性照射可以避免照射所致的认知障碍。支持我们的假设，其他研究表明，用局灶照射和遗传方法消融神经发生显示了类似的行为效应(萨克斯等人，2006年；丹尼等人，2012年)．

我们评估了单独和联合海马照射的效果D-丝氨酸减少冻结后，每次检索和远程恐惧记忆测试在第28天。有趣的是，辐照后的SRRKO小鼠在每次检索后表现出逐渐减少的冰冻，最后在第28天测试时，冰冻水平有很大程度的降低，但在WT小鼠中没有观察到这种影响，这表明两者D-丝氨酸信号和海马神经发生是再巩固过程所必需的。这一结果引出了一个问题，恐惧记忆的衰减效应是否源于消失。为了解决这个问题，我们使用30分钟再暴露的延长检索作为消除程序，来检验在阻断条件下，短暂检索和延长检索对远程恐惧记忆的影响的差异D-丝氨酸信号和神经发生。我们发现，在单独或同时阻断神经发生的情况下，扩展检索可以消除恐惧记忆D丝氨酸信号。相反，如图所示图1 d，5度在WT小鼠中，单纯短暂检索或联合神经发生抑制对远端恐惧记忆无抑制作用。这些数据表明，5分钟再暴露的短暂检索可能诱导了记忆再巩固，而这只能通过同时封锁大脑皮层来抑制D-丝氨酸信号和神经发生。考虑到减少的缺点D-丝氨酸水平受一般SRRKO影响，涉及全脑，需进一步调查选择性降低D-丝氨酸水平在海马和脾后皮层在同一行为实验，例如，通过区域注射腺相关病毒表达D-氨基酸氧化酶，从而验证其区域特异性作用D-丝氨酸介导的NMDA受体信号通路在远程情境恐惧记忆维持中的作用。

据报道，在不同的时间点，在条件作用之前或之后，神经发生抑制对不同的海马体依赖记忆任务产生不同的影响(Arruda-Carvalho等人，2011；潘等人，2012；哈克贝利等，2018)，而将这种实验室方法转化为临床应用的尝试需要建立一种类似的有效的药物干预措施，适用于患者。因此，我们设计了第二个实验，进行训练后的药物操纵来阻断D-丝氨酸信号和神经发生靶向再巩固，并评估其在减少远程恐惧记忆方面的功效。我们选择TMZ，一种抗有丝分裂药物，用于治疗某些患者的高级胶质瘤，以抑制神经发生(Niibori等人，2012；Egeland等，2017)和HA-966，一种NMDA受体拮抗剂，作用于甘氨酸-和D-丝氨酸结合位点(基斯等人，1989年)，以阻挡D丝氨酸信号。我们观察到，在第28天的测试中，两种药物同时服用的小鼠的远程恐惧记忆显著降低，而单次服用其中任何一种药物的小鼠则没有。此外，在完成远程记忆测试后，TMZ注射导致DG中dcx阳性未成熟神经元数量减少约45%，这表明神经发生受阻可能与假定的提取诱导的再巩固损伤有关。最近,Lods等人(2021)证明成年出生的学习不成熟神经元对于大鼠的空间远程记忆是必要的，通过证明特异性沉默成年出生的学习不成熟神经元会损害训练4周后检索的远程记忆，并在检索后2天进行测试。这一新发现支持了我们的假设，即条件反射前后对成年出生神经元的消融或减少可能会负向调节提取诱导的记忆再巩固过程。

不可忽视的是，在多次记忆检索后，单独的海马照射对远程记忆没有显著影响。我们推测，剩余的未成熟神经元甚至成熟神经元会产生代偿作用，在这种情况下，完整的NMDA受体功能对于支持记忆过程是必要的，这可能是由于它有助于新生神经元的新脊柱形成和增强突触可塑性(Ge等，2007)．

不同于通过封锁来削弱或破坏收复性再巩固的策略D-丝氨酸信号与神经发生，近年来，人们越来越关注通过增加成人海马神经发生来促进检索过程中的记忆更新，从而促进海马依赖性记忆的遗忘(埃克斯等人，2014；石川等人，2016)．美金刚胺是NMDA受体的拮抗剂之一，临床上用于治疗阿尔茨海默病，并已被证明是成人海马神经发生和上下文恐惧记忆遗忘的增强剂(前川等人，2009年；石川等人，2016)．有趣的是，在目前的工作中，与WT小鼠相比，SRRKO小鼠中观察到dcx阳性细胞的数量显著增加。然而，神经发生的增强并没有导致第28天远程恐惧记忆测试中冻结的显著减少。这种不一致可能是由于神经发生水平的增加和恐惧条件反射强度的变化，例如，在相对低强度的背景恐惧条件反射中，通过大剂量美金刚成功地忘记了背景恐惧记忆(石川等人，2016)．这些发现值得进一步研究，以比较两种概念相反的方法在相同强度训练的动物模型中对近期和遥远情境恐惧记忆的影响。

综上所述，我们建立了一种策略，通过同时操作来下调，以四次间隔多次检索后的记忆再巩固过程为目标，逐步削弱原始的上下文恐惧记忆D-丝氨酸介导的NMDA受体信号通路抑制海马神经发生。我们的方法导致在所有检索会话中冻结的单向减少，显示出一个强大的效果来衰减远程上下文恐惧记忆。由于巴甫洛夫恐惧是一种对条件提示和情境的适应性反应，本实验测试的远程情境恐惧记忆应被视为具有正常神经生物学的记忆过程。因此，当前方法在削弱远程恐惧记忆方面的有效性需要在PTSD模型中进一步验证，例如，单一长时间应激模型中的上下文恐惧记忆(山本等人，2008)．虽然目前工作中使用的HA-966不适用于临床应用，但最近报道的一种从药用植物中纯化的madecassoside SRR抑制剂据报道可以在动物实验中穿过血脑屏障并表现出神经保护作用(Rani等人，2020年)．TMZ是一种烷基化剂，具有良好的口服生物利用度，良好的穿透血脑屏障，低毒性。此外，作为一种化学制剂，用于某些患者的高级别胶质瘤的治疗，没有严重的毒性(Brada等人，1999年)．在实验动物中，TMZ治疗成功地抑制了中风诱导的海马神经发生(Cuartero等人，2019年)．我们进一步的研究将旨在验证两种药物(梅卡索苷和TMZ)在减弱情境诱发的恐惧记忆方面的有效性。

数据可用性声明

本研究中提出的原始贡献包含在文章/中补充材料，可向通讯作者查询。

道德声明

本动物研究经富山大学动物实验委员会审核通过。

作者的贡献

RI和XN进行实验并分析数据。所有作者都设计了研究，写了手稿，并批准了提交的版本。

资金

这项工作得到了JSPS KAKENHI 18K06888的支持，并得到了武田科学基金会的资助。

致谢

我们感谢Aki Sugano在统计数据分析方面的帮助。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnins.2022.1030702/full#supplementary-material

补充图1 | .d -丝氨酸信号阻断和海马神经发生对多次延长检索过程中恐惧记忆的影响。(两者)在第一天的三次消光过程中(一)7(B)，和14(C)，两种基因型(WT、n= 11;SRRKO,n= 8)。数据以均值±SEM表示。

参考文献