原始研究的文章

前面。神经影像,2023年2月16日
秒。脑成像的方法
卷2 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fnimg.2023.959601

使用双光子荧光成像线粒体通过骨活老鼠与自适应光学显微镜

天一郑 ¹,

艾德里安·r·Liversage²,

Kayvan f .德黑兰的 ³,

杰罗德·a .电话 ⁴,

彼得·a . kn ¹ ^*和

卢克·j·莫滕森 ^2、5 ^*

¹佐治亚大学电气和计算机工程学院,美国佐治亚州雅典
²学校的化学、材料、生物医学工程、乔治亚大学,美国佐治亚州雅典
³Biophotonics成像实验室,伊利诺伊大学香槟分校的乌尔班纳,美国
⁴佐治亚大学生理学和药理学,雅典,乔治亚州,美国
⁵再生生物科学中心,罗兹中心广告,乔治亚大学,美国佐治亚州雅典

作品简介:线粒体是极其重要的细胞器在骨髓和大脑活动的监管。然而,生活的这些亚细胞的特性与高分辨率成像散射组织如脑或骨已被证明具有挑战性。

方法:在这项研究中,我们开发了一个双光子荧光显微镜与自适应光学(TPFM-AO)高分辨率成像,它使用一个自建Shack-Hartmann (SHWFS)纠正系统畸变波前传感器和无传感器的方法纠正低阶组织畸变。

结果:用AO荧光强度增加的点扩散函数(PSF)和实现快速成像的亚细胞的细胞器通过85年与400纳米分辨率μm高度分散的组织。我们取得了~ 1.55××3.58 ~ ~ 1.77×使用AO强度增加,并减少~ 0.83×PSF宽度,~ 0.74×,在深度为0 ~ 0.9×50μm 85μm住老鼠骨髓分别,让我们描述线粒体功能细胞的健康和生存的视野为67.5×67.5μm。我们也调查初始信号和背景的作用水平样本通过改变激光功率校正质量和相机曝光时间和发展一个灰度标准样品校正。

讨论:这项研究展示了一个有前途的工具,线粒体等细胞器的成像光学扭曲的生物环境中,可以促进各种疾病的研究与线粒体形态和活动范围的生物组织。

1。介绍

线粒体是细胞内的细胞器有0.5到10μ米直径驱动能源生产过程通过呼吸链氧化磷酸化(Siesjo 1978;西格尔et al ., 1981)。他们发挥着基础性的作用在许多生理过程中至关重要的组织内稳态和修复,如细胞分化(Folmes et al ., 2012),细胞凋亡(苗族et al ., 2014),信号转导(徐et al ., 2016)、活性氧生成(墨菲,2009),和维护健康的器官功能(Gropman 2004)。其功能是高度动态的,反映在线粒体网络结构,因此成像技术是必不可少的理解生理线粒体在健康和疾病过程。高能源需求的组织,如大脑和骨髓尤其依赖于线粒体的维护和精心策划的活动。

在过去的几十年,活组织动力学的评估使用活体的成像分辨率手机改变了器官功能的生物学理解在单个细胞水平。在骨,这大大先进的科学认识血管动力学、干细胞生物学和骨内稳态和再生(Lo Celso et al ., 2009;斯宾塞et al ., 2014;Itkin et al ., 2016;Wilk et al ., 2017;Christodoulou et al ., 2020)。在大脑中,活体成像产生了独特的洞察大脑回路和加工、脑肿瘤、脑外伤和退化性疾病(Andermann克林,2010;Shih et al ., 2012;里卡德2014;杨et al ., 2018;Calvo-Rodriguez et al ., 2019;陈et al ., 2019;胡锦涛等人。,2021年)。然而,最严重的障碍之一成像是活体的光学显微镜的可怜的穿透深度。单光子成像和共焦检测是一种常见的方法,它能利用可见光激发荧光(400 - 650海里),光穿透颅骨骨的吸收和散射和组织(施et al ., 2016;王et al ., 2018)。扩展成像深度、高能的近红外线脉冲激发光(760 - 1080 nm)可以紧密关注创建一个非线性双光子吸收过程使用标准荧光团。双光子成像实现成像深度延伸至500年μm−1毫米的脑组织和在高散射骨(~ 150μm德克和斯特里克勒,1990;地狱,1992;徐,1996;愈伤组织,1997;Diaspro et al ., 2006;Sinefeld et al ., 2015)。然而,非齐次通过这些不规则波传播和高度扭曲浑浊的媒体诱发高级波前相位偏差(德黑兰的et al ., 2017 a),大大降低图像分辨率甚至在温和的深度。因此,颅窗和skull-thinning方法通常采用改善光学访问(宋和蔡,2013;杨et al ., 2013;陈et al ., 2021)。然而,手术会增加组织炎症的风险和可能导致压力可能会改变生物功能的目标组织(李和Baran, 2014年)。

克服这一挑战的一个方法是自适应光学(AO)。AO系统通常由一个可变形镜共轭后瞳孔平面的显微镜,和波前传感器或正确评估方法基于图像的无传感器波前畸变和提高分辨率,可以改善在活的有机体内成像在动物模型(艾伯特et al ., 2000;赖特et al ., 2005;Rueckel Mack-Bucher, 2006;Debarre et al ., 2009;道et al ., 2013 a;香港,2015年,b;王et al ., 2015;香港和唐,2016)。波前传感器方法包括Shack-Hartmann波前传感器与auto-fluorescent或近红外线引导明星(道et al ., 2013 a;王et al ., 2015)、相干的波前传感(Rueckel Mack-Bucher, 2006),基于图像的方法,利用获得的图像信息删除波前畸变(马什和烧伤,2003年;Debarre et al ., 2009;香港,2015年,b;香港和唐,2016)。波阵面无传感器方法通常估计初始误差和通过一个迭代计划收敛于一个优化的解决方案基于强度指标(艾伯特et al ., 2000;赖特et al ., 2005;布斯,2006)。最近,非线性导恒星Shack-Hartmann测量波前畸变了精确测量低阶组织畸变被证明是有用的扩展成像深度在生物样品但是需要长时间的整合和有效视场(小Aviles-Espinosa et al ., 2011;道et al ., 2013 b)。在另一个波前无传感器使用快速各向异性畸变校正方法,自适应校正元素共轭浑浊的层而不是重点,目标是增加isoplanatic补丁的大小(公园和太阳,2015)。我们的骨髓成像发生在一个扩展的散射层,所以这种方法是不合适的。

在这项研究中,我们计算和纠正系统像差和样本畸变引起的小鼠颅骨和脑组织改善成像动态线粒体本地化。我们证明了低阶像差校正提供了一个显著的改善成像通过骨进入骨髓。我们首先弥补我们使用传感器显微镜系统的畸变AO算法,然后我们补偿畸变鼠颅骨骨通过使用Zernike-mode-based无传感器AO算法,因为它需要相对较少的信号优化和创建一个改进的波前。我们用双光子荧光显微镜与自适应光学图像线粒体在小鼠颅骨髓和大脑。我们还发现和评估样本灰度校正的阈值和性能。这项工作表明,AO校正后,荧光强度的点扩散函数(PSF)是改善,和显著提高图像的分辨率,成像通过完整的鼠标颅骨骨入骨髓,让我们描述功能细胞的线粒体和动力学在组织。

2。方法

2.1。在凝胶制备的荧光珠堆栈

总共200海里黄绿色荧光珠(ThermoFisher科学F8811)被稀释的比例1:200在2.0%琼脂糖。然后,0.2克的琼脂糖粉(Bio-Rad认证分子生物学琼脂糖1613101)被添加到10毫升的DI(消电离)水的质量浓度2.0%。接下来,琼脂糖溶液在微波炉加热时间间隔45 s。这个过程一直持续到琼脂糖凝胶混合物。1 - 2分钟后通过琼脂糖凝胶的冷却到安全的处理温度、琼脂糖凝胶是准备将珠子固定在合适的位置进行成像分析。总共2.0毫升的珠子被添加到400毫升的琼脂糖实现1:200比率。那时完全干燥后,培养皿放置在舞台上TPFM-AO系统和去离子水添加水浸的成像目标。

2.2。鼠标成像

在小鼠活体成像,我们使用转基因小鼠模型无所不在地表达mitochondrial-targeted Dendra2绿色单体的荧光蛋白(杰克逊实验室,# 018385)如前所述(范教授et al ., 2012;南部et al ., 2019)。鼠标最初使用4%异氟烷麻醉(100毫升/分钟的氧气流)和限制使用3 d打印立体定位支架。持票人是在先前发表的作品类似几组学习时大脑的细胞动力学和头骨(油炸et al ., 2001;Lo Celso et al ., 2009;Leuschner et al ., 2015;Turcotte et al ., 2017;德黑兰的et al ., 2019 b)和服务安全、稳定鼠标头骨同时减少机械耦合与身体躯干,以便减少呼吸运动构件。前5分钟做一个切口,50μl 0.25% bupivacaine本地应用镇痛。在头皮上了一个口子从眼睛向两耳皮瓣。骨膜层被,成像的面积是使用棉签清洗;立即无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)应用于切口的网站。动物置于显微镜物镜和无菌PBS添加填充头骨和物镜之间的差距。异氟烷的速度成像期间被减少到1.4%。血管成像,20μl剂量的70 kDa罗丹明b右旋糖酐(Nanocs)管理通过retro-orbital注射之前做一个切口。活体成像会话后,小鼠安乐死使用有限公司₂和颈椎错位。牺牲后,大脑是提取并安装在培养皿中使用2.0%的琼脂糖线粒体成像。所有动物佐治亚大学机构批准的程序和实验动物保健和使用委员会(IACUC)。

2.3。光学设置

自适应光学双光子荧光显微镜的示意图所示(AO-TPFM)系统图1,基于我们之前发表的工作(德黑兰的et al ., 2017 b,2021年)。光学设置包含变色龙Ti:蓝宝石生产680到1080 nm 137 fs脉冲激光的能量,与权力的来源使用half-waveplate调制和偏振分束器。激光束recollimated,经过泡克耳斯细胞(Conoptics)快速成像过程中强度调制。然后光束扩展使用望远镜的针孔重点创建一个更均匀高斯光束。普克尔斯盒是用来阻止光束扫描逆程期间,以及正确的共振扫描光束强度。变形镜(DM Alpao DM97-15)放置共轭后瞳孔平面连续面板和97年致动器,用于低阶AO波前校正。DM插入两个光学中继系统的光路。波束扫描是通过一个萨特仪器MDR-R框,房子快共振检流计和缓慢检流计为水平和垂直全面扫描,分别。扫描仪都来自剑桥技术和放置非常接近彼此减少散光,散热片。扫描光束传递使用两个消色差doublets-serving扫描和管镜头,分别60×1.00 NA水油浸物镜(尼康,MRD07620)。 The back-propagated emission light from the sample is separated from the excitation light using a dichroic mirror DiM₁(Semrock FF705-Di01)和发送到一个sCMOS相机(和或Zyla科学CMOS)用于看PSF形状或分离二向色镜DiM2 (Semrock FF705-Di01)和发送到光子光电倍增管(PMT)滨松(H10770-40)。DiM3-4 (Semrock FF552-Di02, FF409-Di03-25^*36)和过滤器F2-4 (Semrock 571/72 nm, 509/22 nm, 390/18 nm)被用来单独每个光谱通道来捕获信号双光子荧光(锥度英尺),绿色荧光蛋白(GFP),和二次谐波发生(宋惠乔)的胶原蛋白,分别。土制Shack-Hartmann波前传感器(SHWFS),用一个基于labview的控制和测量软件测量整个系统畸变(红色箭头显示梁方向)物镜前(图2一个)。另一个基于labview的控制和测量软件是用于全AO修正。MATLAB^®基于开源软件,Scanimage (Pologruto和萨巴蒂,2003)是用来控制校正后的显微镜。

图1

图1。与SHWFS修改系统设计。BPP,瞳孔平面;CMOS、科学相机;DG,衍射光栅;昏暗的,二向色镜;DM、可变形镜;F、过滤;IP,屏;L,镜头; OL, Objective lens; PBS, Polarizing beam splitter; PH, pinhole; PMT, photon multiplier tube; SHWFS, Shack, Hartmann wavefront sensor; TL, tube lens.

图2

图2。Shack-Hartmann波前传感器。(一)SHWFS用来测量系统的总畸变(B)Shack-Hartmann斑点SHWFS摄像机的图像。(C)校正波前(μm)。(D)奇异值分解的泽尼克模式。(E, F)PSF前后系统校正。酒吧= 10μm规模。

2.4。传感器系统畸变

在测量和校正畸变的生物样本,我们首先使用一个传感器AO算法补偿系统畸变。小透镜数组创建点在图像的位移和内部参考guidestar允许计算波前畸变(图2 b)。

我们使用Eq。(1)分解计算波前泽尼克模式(赵,2007):

\begin{array}{l} c_{我} = \frac{1}{π} \int_{0}^{1} \int_{0}^{2 π} ψ_{我} (ρ, θ) Z_{我} (ρ, θ) ρ d θ d ρ, & (1) \end{array}

Z是秩序的泽尼克模式在哪里我和c_我的系数模式Z_我。方程(1)产生一个完整的泽尼克系数设置可以应用于DM修正。我们把模式5 37(使用诺尔的排序(诺尔(1976)的泽尼克模式,考虑到订单4]因为这些模式由DM可以纠正。找到修正波阵面形状,我们做一个总结,这样等于建造阶段

\begin{array}{l} ψ_{c} (ρ, θ) = 经验值 (- j \frac{2 π}{λ} \sum_{我} c_{我} Z_{我} (ρ, θ)) & (2) \end{array}

均方根(RMS)波前误差修正的泽尼克模式4 - 37(不包括活塞、提示和倾斜)计算 $σ = {(\sum_{我} c_{我}^{2}]}^{1 / 2}$ 。

我们执行一个DM校正在每个焦平面通过扫描荧光信号,然后优化波前(德黑兰的et al ., 2019 a)。激发光束的波前显示< 2波畸变,波前的泽尼克分解识别最强的贡献从提示(Z2),倾斜(Z3)和散焦(Z4) (图2 c,D)。应用Shack-Hartmann波前校正后,样本的PSF飞机接近衍射极限的高斯形状(应用= 350海里)。

2.5。无传感器样本偏差修正基于总和或最大强度

波前畸变的不同阶段或从理想的光学路径长度(如球形,或平面)的形式尼尔et al。(2000),这可能是由于通过非均匀介质如生物组织光传播。据泽尼克模式方程,不同组合的泽尼克系数的相位分布back-pupil飞机可以改变焦平面上的点扩散函数。如果用来重建波前相位分布与适当的泽尼克模式和系数由DM放置共轭back-pupil飞机,这一原则可以补偿畸变引起的组织。

无传感器AO使用显微镜作为输入的信号获取的算法估计系统中光学畸变。我们的实现无传感器AO的流程图描述了补充图S1。一系列的psf与不同的泽尼克像差模式应用于获得DM共轭后瞳孔平面。确定最优值为每个泽尼克模式,不同的畸变值应用于DM。我们评估10或15的订单泽尼克模式(提示、倾斜和散焦除外),这在我们的初步实验使用10或15模式校正提供了90%的增强时发现包括高阶模式。一个图像质量度量(如最大强度)然后选择为每个图像和评估。然后安装一个抛物线函数测量的点和应用模式系数估计的峰值对应的修正。随后模式修正以类似的方式实现波前的收敛。

2.6。样品校正参数选择

初步畸变校正实验期间,我们观察到增强的程度实现无传感器样品修正初始强度条件的依赖低信号环境。自低起始信号是常见的试图用AO,我们探索的灵敏度校正策略,不同的背景噪声和信号的水平调节物镜前的激光功率(图3一)和相机曝光时间(图3 b)。这些措施都强烈影响PSF的信号背景比示例中使用的图像校正GFP小鼠颅骨。示例中,我们使用两个功率水平的常用的平均功率样本成像50 - 100μm深处组织,和我们实验观察到的最大平均功率不造成明显损害样品在我们的图像采集时间;和一系列集成的时间为每个泽尼克模式测量1 s 10 ms。在每个条件,我们评估PSF质量的若干措施,包括平均强度,最大强度,二次矩,Strehl比率。计算二次矩,k中央的一个数据样本的定义是: $米_{k} = \frac{1}{n} \sum_{我 = 1}^{n} {(x_{我} - - - - - - \bar{x})}^{k}$ ,在那里n的样品和数量吗 $\bar{x}$ 是一个意思。Strehl比率被定义为 $年代 = e^{- - - - - - \frac{4 π^{2} σ^{2}}{λ^{2}}}$ ,其中σ是波前的均方根偏差,λ是波长。在我们的情况下,实验Strehl比率被定义为异常的图像强度峰值的比值从点源相比的最大实现强度使用一个理想光学系统只有有限衍射系统的孔径。

图3

图3。灰度校正样本。两个物镜前的激光功率(一)和相机曝光时间(B)可能会影响样品的结果修正。部分(C)显示了改进百分比计算(全AO-system AO) /系统AO强度。未修正的修正价值之间的百分比变化达到一个常数。

根据图3 b,虽然我们没有得到改进基于平均强度,我们实现改进基于最大价值,第二,和Strehl PSF当曝光时间的比例大于0.5秒,未修正的之间的百分比变化和纠正值后不久到达一个常数(图3 c)。因此,我们发现,通过执行TPFM-AO方法在两个不同的信号水平使用均值或max PSF强度提高的百分比的两个测量几乎是一样的,样品校正已实现了最大改进性能。在未来的工作中,我们将进一步探索交替校正指标(如二次矩)在活的有机体内的情况。

3所示。结果与讨论

3.1。在体外组织模拟与AO亚微米珠校正成像

我们评估实验解决改善组织幻影TPFM-AO显微镜通过测量宽屏的半峰(应用)的强度剖面0.2μm珠子嵌入凝胶使用960 nm激光激发波长(图4)。珠子是嵌入在一个5毫米厚2%琼脂糖凝胶和成像在50μm深度(图4一)来模拟一个扭曲的组织环境。与系统校正成像样品,然后用无传感器的方法来补偿畸变引起的凝胶(图4 b)。完整的AO校正方法显示了相对较高的散光值(Z6)和昏迷(Z7)和收益率所示的波前图4 c,D。AO改进的半宽度检测珠高斯的荧光平均的半最大值宽度10测量半径0.2μm 2-photon兴奋的荧光珠从0.538±0.03μm提高到0.408±0.03μm示例校正(图4 e)。

图4

图4。0.2系统和mean-intensity-based完整AOμm珠子(B)在琼脂糖凝胶在50μm深度(一)。泽尼克模式波前的分解(C)。波阵面后满AO(μm)(D)。光斑大小(E)。红色和绿色框代表每个强度的应用概要文件。67.5×67.5μm视场。数据被表示为每个测量平均值+ / -标准偏差。酒吧= 10μm规模。

3.2。AO校正使得高分辨率成像小鼠大脑线粒体细胞器的形态

然后我们测量和校正畸变Dendra-2小鼠大脑线粒体使用波长780纳米的激光激发波长。牺牲后,老鼠的大脑立即切成2毫米厚的片,然后嵌入在3%琼脂糖,防止运动。成像,大脑是沉浸在磷酸缓冲盐(PBS)。双光子荧光图像获得的海马区域,由一个红色的星号表示在我们的大脑图(图5克)。我们发现组织波前畸变(图5 e)和畸变是由于大脑的形状和高折射率;大多散光(Z5 Z11),三叶草(Z9)和球形(Z11) (图5 f)。AO后,图像在线粒体横向强度和清晰度和改进,特别是轴向通过校正畸变(图5一个,B)。在空间频率空间(图5 c),决议通过改善像差校正导致大幅增加高空间频率分量的大小,这表明一个更清晰的图像和更多的细节。信号配置文件的轴面白线显示改进的强度(图5 d)。

图5

图5。图像的年轻老鼠大脑的海马AO系统(一)和mean-intensity-based AO(B)。大脑的相应的fft算法图像在对数尺度和线配置文件(C)。相应的信号沿着白线资料,轴的强度(D)。波阵面后满AO(μm)(E)。奇异值分解的泽尼克模式(F)样品校正。海马体的年轻老鼠成像在红色的星号(G)。59.32×59.32μm视场。酒吧= 10μm规模。

3.3。AO校正使线粒体成像在小鼠骨髓深处在活的有机体内

我们下一个评估线粒体成像通过外部层的颅骨骨骨髓用Dendra-2鼠标与波长780纳米的激光激发波长。我们评估15的订单泽尼克模式修正畸变的骨髓在活的有机体内因为在初步实验中取得最好的改善PSF强度和形状。我们发现图像强度的改善和解决在活的有机体内锥度英尺的线粒体在骨髓成像深度0,50和85μm (数字6- - - - - -C)。信号沿着红线显示~ 1.55×概要,~ 3.58×,并使用示例AO校正~ 1.77×强度增加深度的0,50和85分别μm (图6 a1- - - - - -C1)。完整的应用AO增强了~ 0.83××0.74 ~ ~ 0.9×深度为0,50和85分别μm (图6 a2- - - - - -C2)。在骨的表面,我们观察到的畸变将骨头的形状和高折射率;主要是散光(Z6),三叶草(Z9)和二级散光(Z13) (图6 a3)。当我们去50μm骨髓深处,初级散光的畸变和三叶草级较低,但二级散光(Z13)是(图6 b3)。当我们到达对面的骨髓的深度85μm畸变主要是昏迷(Z7)和二级散光(Z13)造成骨的弯曲的内表面(图6 c3)。纠正后的波前AO所示图6 a4- - - - - -C4。

图6

图6。GFP-mitochondria老鼠骨髓的动态成像深度0,50和85μm系统袄(左)和mean-intensity-based满袄(右)(两者)。样品后的波前校正(μm)(A4-C4)。相应的信号的红线(A1-C1)和黄线的应用概况(A2-C2)和相应的泽尼克模式(A3-C3)完整的AO。轴的强度信号的概要文件和应用概要文件。图片是在红场0,50和85μm深度(D)。红色和绿色框代表每个强度的应用概要文件。67.5×67.5μm视场。酒吧= 10μm规模。

平均在整幅图像时,信号强度显示~ 2.73×,~ 3.13×,并增加~ 2.18×强度与系统AO TPFM校正(0)50,85μm深度(图7)。平均检测应用改进~ 0.79×(1.0之前和0.79μmμm) ~ 0.78×(0.8之前和0.62μmμm)和~ 0.81×(0.45之前和0.36μmμm)深度为0,50和85分别μm (图7 b)。为了评估AO其他发射波长的影响,证实85年μm深度是通过骨髓和骨头在另一边,我们捕捉到二次谐波发生图片带通滤波器的390/18 (补充图S2),发现FFT频谱包含完整的AO后更多的高频信息。

图7

图7。损失的决议和维护的深度0,85μm AO系统和完整的AO强度(一)和应用(B)。错误栏显示每个测量的标准偏差。

我们也评估另一个多通道动态在活的有机体内骨髓样本使用Dendra2线粒体鼠标和co-labeling血液血管使用罗丹明b右旋糖酐共轭。这个污点需要校正使用840 nm的激发光束激发波长和发射585/40 nm过滤器。我们取得了改善成像与AO 30在三个不同的深度校正,50和70μm,展示AO的实用系统的动态样本在不同激发和发射波长(补充图S3)。

3.4。AO修正线粒体动态评估在小鼠骨髓

评估潜在的AO校正纵向监测线粒体细胞器动力学的骨头,我们组织纠正偏差在一个飞机40μm骨髓深处,然后执行时间流逝成像总共20分钟(补充视频S1)。我们量化时间改变在细胞中线粒体位置(图8),观察到线粒体运动速度和轨迹的差异(图8′/,B / B′)。我们发现最小强度降低成像会话,表明几乎没有光漂白或改变组织畸变超过20分钟(数字8 c,D)。各种细胞和线粒体轨迹明显存在骨髓的相对较小的区域内,这并不奇怪高细胞密度和细胞类型的多样性。

图8

图8。Time-coded伪彩色马克斯的投影时间流逝GFP-mitochondria老鼠骨髓的成像深度40μm mean-intensity-based AO。(A / B / B)概述了线粒体在骨髓中旅行。(C)显示不同的时间点。(D)显示线粒体波动。轴的强度。67.5×67.5μm视场。酒吧= 10μm规模。

4所示。结论

总之,我们计算和修正系统畸变和样本畸变引起的高度散射脑组织和骨骼与传感器的方法使用Shack-Hartmann波前传感器和无传感器AO方法使用PSF强度的指标。我们证明了低阶像差校正提供了一个显著的改善成像时通过骨进入骨髓。我们发现我们的TPFM-AO系统增加PSF的荧光强度,达到快速成像的亚细胞细胞器~ 400纳米的分辨率。我们也取得了接近2倍增加强度和减少PSF宽度用AO住老鼠的骨髓,让我们更好地描述线粒体功能细胞的健康和生存。我们也决定停止迭代的无传感器的标准AO修正,发现一旦改善比例常数,附近的两个测量样本调整达到最佳性能。这有助于我们更迅速和有效地正确的PSF。这种AO的方法可以用于其他细胞器的动力学的研究和适用于广泛的生物组织。在未来,我们将进一步探索交替校正指标(如二次矩)在活的有机体内情况和使用我们的系统研究瞬态功能反应的细胞群在骨髓深处此前无法通过光学显微镜。这可能改变MSC治疗方法,使新基本生物肌肉骨骼和神经领域的理解。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

动物研究一口油井为el瑞罗兹中心进行审核和批准通过动物和乳品科学,雅典,GA。

作者的贡献

TZ卷入概念化设计的光学系统,开发算法和虚拟仪器的代码,数据分析,项目管理,和写作。陆军研究实验室的卷入概念化设计的光学系统和项目管理。KFT参与最初的概念化,光学系统的设计和开发的算法和虚拟仪器的代码。江淮参与调查和写作。PAK和团体参与概念化、调查和写作。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项研究受到了美国国家科学基金会(1706916);美国国立卫生研究院(一下R21开拓者# 1 r21eb027802-01);格兰特再生工程和医学中心的种子;国会指导医学研究项目;和国防医学研究和发展项目(w81xwh - 20 - 1 - 0885)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnimg.2023.959601/full补充材料

引用

艾伯特,O。,年代herman, L., Mourou, G., Norris, T. B. (2000). Smart microscope: an adaptive optics learning system for aberration correction in multiphoton confocal microscopy.选择列托人。25日,52-54。doi: 10.1364 / OL.25.000052