阻塞的治疗潜力GAPDH亚硝基化与CGP3466b实验性自身免疫性脑脊髓炎
韦斯利·h·戈弗雷
Soonmyung黄
部分曹1,
Efrat艾布拉姆森
迈克尔Davin科恩伯格- 1约翰霍普金斯大学医学院的神经病学学系巴尔的摩,医学博士,美国
- 2精神病学和行为科学系的,约翰霍普金斯大学医学院的巴尔的摩,医学博士,美国
多发性硬化(MS)是一种神经炎症疾病的中枢神经系统(CNS)。尽管经典视为脱髓鞘疾病,neuroaxonal受伤发生在急性和慢性阶段和代表一个病理衬底的残疾不是当前治疗的目标。中枢神经系统产生的一氧化氮(NO)巨噬细胞和小胶质细胞有助于neuroaxonal伤害在所有阶段的女士,但候选人疗法预防NO-mediated损伤尚未确定。在这里,我们表明,多功能蛋白质glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)强劲nitrosylated实验性自身免疫性脑脊髓炎的中枢神经系统(运算单元)小鼠模型的女士GAPDH亚硝基化作用被阻塞在活的有机体内CGP3466b日常管理,CNS-penetrant化合物在人类建立了安全性。符合已知的角色nitrosylated GAPDH (SNO-GAPDH)的神经细胞死亡,封锁的SNO-GAPDH CGP3466b变弱神经系统残疾和减少独立于轴突损伤实验性自身免疫性脑脊髓炎对免疫系统的影响。我们的研究表明,SNO-GAPDH有助于neuroaxonal神经炎症期间的伤害和识别CGP3466b女士作为候选神经保护治疗。
1。介绍
多发性硬化(MS)是一种自身免疫性疾病的中枢神经系统(CNS)的影响在美国近100万人(1)。女士是经典,其特征是炎症攻击少突胶质细胞,是myelin-producing沿着轴突细胞动作电位的传导效率的关键,导致脱髓鞘。这种疾病是进一步的特点是神经胶质过多症和神经退行性变的(2)。女士的两种主要类型是复发缓和女士(名RRMS),由离散神经“旧病复发”的特征与局部炎症相关攻击中枢神经系统内,由阴险的残疾女士和进步发展没有复发。尽管历史关注髓鞘脱失,neuroaxonal损失发生在所有阶段的女士,是神经系统残疾的主要来源(3),不同的但在名RRMS重叠的免疫机制产生损伤和进步的女士(4- - - - - -8)。目前批准的治疗目标外围免疫系统限制复发,但没有减轻neuroaxonal受伤期间复发相关神经变性或放缓加速进步的女士(9)。因此,存在重大未满足临床需要防止炎症neuroaxonal损伤的神经保护治疗。
在炎症、各种自由基的生成(10)。一个特别有效的自由基,一氧化氮(NO)气体,与炎症损伤相关的高活性分子(11)。没有小胶质细胞在神经炎症的主要来源和CNS-resident巨噬细胞,造成neuroaxonal伤病复发和累进形式的疾病(3,6)。没有由活化的小胶质细胞和巨噬细胞病理学女士(中扮演着重要角色7,8),如发现在高浓度炎性病变(女士12,13)。)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(实验性自身免疫性脑脊髓炎,女士的主要小鼠模型,在本地没有食腐动物防止轴突退化(14),没有捐赠者复制EAE-like轴突病变(15)。但是,没有当前治疗目标NO-mediated中枢神经系统损伤。
没有信号的主要作用方式是蛋白质S-nitrosylation redox-based改性的半胱氨酸残基在目标蛋白(16,17)。糖酵解酶glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)生理nitrosylated Cys150残渣,可灭活酶活性和产生一个信号转导作用由绑定Siah1和核易位(18)。在细胞核,nitrosylated GAPDH (SNO-GAPDH)会导致细胞死亡通过p300 / CBP和p53通路(18,19)和trans-nitrosylates核蛋白质(20.),这些研究表明在神经元损伤中的作用。此外,GAPDH亚硝基化(以前的上下文中报道神经炎症21)。因此,我们想知道是否阻塞GADPH亚硝基化作用可能是神经保护的环境中神经炎症疾病。
CGP3466b (Omigapil)是一个CNS-penetrant化合物具有广泛的抗凋亡特性,在结构上类似于anti-parkinsonian药物L-deprenyl(司立吉林),但不影响单胺氧化酶(22,23)。值得注意的是,CGP3466b块GAPDH亚硝基化作用而不影响GAPDH酶活性,并封锁GAPDH亚硝基化药物的抗凋亡作用是至关重要的(24,25)。CGP3466b显示特殊承诺在临床前诱发神经保护小鼠模型的帕金森病(PD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)但不幸的是未能达到初级端点在临床试验(26,27)。虽然nitrosative压力中扮演了一个重要的角色在这些疾病的临床前动物模型,相应的人类疾病的因素是非常复杂的(28,29日)。相比之下,人类病理学女士在很大程度上是由于炎症,这是没有的主要来源,有强有力的证据没有在轴突损害人类的参与(女士7,8,30.)。因此,有一种强烈的生物原因探索CGP366b女士作为神经保护治疗。
没有动物模型完全捕捉复杂的神经和免疫环境中发现女士(31日)。然而,在本文中,我们模型病理学与MOG女士的关键方面35−55运算单元。这个模型包括免疫C57BL / 6小鼠与髓少突细胞糖蛋白(MOG)衍生肽结合完全弗氏佐剂和百日咳毒素(32),启动炎症免疫反应针对中枢神经系统髓鞘和产生可量化神经赤字开始post-immunization 10天(PID)。除了髓鞘脱失,撤走35−55运算单元与重大neuroaxonal受伤不依赖(14),一个理想的模型来研究炎症退化。重要的是,MOG35−55运算单元被证明是有用的在临床翻译中扮演重要角色的识别和发展几个女士目前批准的疗法(33)。
在这项研究中,我们探索CGP3466b作为小说的潜在治疗我们女士表明GAPDH强劲nitrosylated MOG期间在中枢神经系统内35−55运算单元,这是预防系统性CGP3466b管理。我们进一步证明CGP3466b直接神经在活的有机体内疾病严重程度,改善实验性自身免疫性脑脊髓炎和减少neuroaxonal损伤视神经。最后,我们表明,CGP3466b行为独立于外围的免疫系统,对immunophenotype产生最小的影响在体外和在活的有机体内。我们得出这样的结论:CGP3466b持有承诺作为辅助神经保护治疗。
2。结果
2.1。中枢神经系统内神经炎症导致GAPDH亚硝基化撤走35−55运算单元女士的老鼠模型,由CGP3466b预防治疗
确定SNO-GAPDH可能在神经炎症损伤中发挥作用,我们首先检查是否GAPDH亚硝基化作用发生在中枢神经系统的过程中撤走35−55运算单元。使用很好的描述生物素开关试验检测nitrosylated蛋白(34),我们发现GAPDH亚硝基化大大增加了脊髓)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(主站点的神经炎症的时间进程与中枢神经系统炎症反应(图1一个;补充图1)。SNO-GAPDH水平增加开始出现神经症状10 (PID)和峰值达到最大水平疾病(PID 15),代表的顶峰神经炎症和神经障碍。28 (PID)是解决神经炎症相关与回归的SNO-GAPDH基线水平,如巨噬细胞和小胶质细胞激活(和产生的生产)消退。在一起,这些结果说明GAPDH亚硝基化存在的一个主要后果是女士的小鼠模型。
图1。CGP3466b防止GAPDH亚硝基化作用在中枢神经系统内撤走35−55运算单元的小鼠模型。(一)Nitrosylated GAPDH (SNO-GAPDH)化验由脊髓溶解产物生物素开关控制(CFA)小鼠在15天开始(post-immunization天10),峰值(post-immunization天15),和慢性(post-immunization 28天)的运算单元阶段。总GAPDH组织溶解产物作为加载控制。免疫印迹(左)代表。(正确的)量化SNO-GAPDH峰值运算单元。SNO-GAPDH GAPDH乐队总强度的比率是用来量化和结果规范化CFA单独控制。数据代表的意思是±SEM每组三个老鼠。(B)CGP3466b被日常管理显示剂量腹腔注射post-immunization天0开始,和nitrosylated GAPDH和β-tubulin化验生物素开关post-immunization一家乳制品15。(左免疫印迹)代表。“没有asc”=没有抗坏血酸盐控制。(正确的)量化SNO-GAPDH水平治疗后车辆或CGP3466b 4毫克/公斤。SNO-GAPDH水平量化描述(一)。数据代表的意思是±SEM每组三个老鼠。* *p< 0.01的学生t以及(一)或单向方差分析与图基的多个比较测试(B)。完整的墨迹图所示补充图1。
然后,我们试图确定GAPDH亚硝基化作用可以预防在实验性自身免疫性脑脊髓炎CGP3466b系统性管理,类似于其他实验模型(22,35)。老鼠每天车辆或CGP3466b对待通过腹腔内注射(i.p)开始在PID 0,和GAPDH亚硝基化作用的生物素开关试验测定脊髓溶解产物在PID 15。我们发现CGP3466b治疗预防GAPDH亚硝基化,最大效应4毫克/公斤(图1 b;补充图1 b)。亚硝基化的封锁特定SNO-GAPDH,β-tubulin CGP3466b没有对亚硝基化作用的影响。
2.2。阻塞与CGP3466b SNO-GAPDH神经模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎的多发性硬化症
考虑到已知SNO-GAPDH在神经细胞损伤中的作用18,19,36,37),我们检查是否封锁GAPDH亚硝基化与CGP3466b变弱。神经赤字实验性自身免疫性脑脊髓炎要回答这个问题,我们首先利用预防性治疗范式,日常治疗小鼠随机车辆或CGP3466b MOG那天开始35−55免疫(PID 0)。基于我们之前的发现,我们使用的剂量CGP3466b(4毫克/公斤),最大限度地防止GAPDH亚硝基化作用在这个模型。老鼠在临床上取得了失明的方式通过PID 31。在这种治疗模式,我们发现CGP3466b显著(减毒的严重性实验性自身免疫性脑脊髓炎图2一个)。
图2。阻塞SNO-GAPDH MOG CGP3466b是神经35−55运算单元。(A, B)CGP3466b 4毫克/公斤是由每天腹腔注射开始post-immunization天0(预防范式)。临床评分是由一个失明的观察者。预防性治疗与CGP3466b减弱神经赤字(一)而不影响减肥(B)。数据代表n= 17(车辆)n= 10 (CGP3466b)小鼠每组。(C)CGP3466b 4毫克/公斤是由每天腹腔注射开始post-immunization天10(治疗范式),和临床评分是由一个失明的观察者。数据代表n= 20(车辆)和n= 26 (CGP3466b)小鼠每组。(D)量化轴突损伤,老鼠接受车辆或CGP3466b 4毫克/公斤每天腹腔注射post-immunization天0开始,和SMI-32 +轴突检查球状体通过免疫荧光染色的近端视神经post-immunization 28天。代表图像(左)所示,随着量化执行n= 3老鼠每组(右)。(E)老鼠处理车辆或CGP3466b 4毫克/公斤每天腹腔注射10 post-immunization天,开始和SMI-32 +轴突检查球状体通过免疫荧光染色的近端视神经post-immunization 28天。代表图像显示(左),以及量化执行n= 3老鼠每组(正确的)。*p< 0.05,* *p< 0.01,Mann-Whitney紫外线测试(A, C)还是学生的t以及(D, E)。数据显示为±SEM。
在撤走35−55运算单元,myelin-directed免疫反应在外围的免疫系统开始,与树突细胞呈现MOG-derived肽在周围淋巴结和脾脏CD4细胞。这些外围地激活CD4细胞然后渗透到中枢神经系统,激活当地的巨噬细胞和小胶质细胞产生脱髓鞘和neuroaxonal受伤。这外围的免疫激活决定神经炎症的发病和产生全身减肥,先于神经赤字。在上面描述的预防性治疗模式,治疗CGP3466b没有影响疾病发生的时间或减肥的程度(图2 b),这表明减毒神经赤字与CGP3466b可能观察到由于直接从炎症损伤的神经保护,而不是外围的抗炎作用。进一步探索这种可能性,我们检查的影响CGP3466b PID 10上治疗开始时,一个时间点之后启动外围的免疫反应。这种模式也更接近临床治疗的情况下,在开始治疗后疾病的发作。我们发现每天CGP3466b治疗开始于PID 10同样减毒神经系统残疾PID 28日(图2 c)。
确定的影响与CGP3466b SNO-GAPDH封锁neuroaxonal直接完整性,我们检查了视神经。视神经的主站点神经炎症和炎性轴突损伤,在实验性自身免疫性脑脊髓炎的类比视神经炎发生在人类由于女士(38,39)。轴突损伤很容易量化与视神经在实验性自身免疫性脑脊髓炎SMI-32 immunofluorescent染色为non-phosphorylated神经丝重链,标签受伤的轴突球状体(40)。我们开始每天治疗车或4毫克/公斤CGP3466b PID 0在一个独立的老鼠被撤走35−55运算单元和量化SMI-32 +视神经轴突的球状体近端PID 28。CGP3466b-treated老鼠少SMI-32 +轴突的球状体,表明降低了轴突损伤而CGP3466b治疗(图2 d)。是否可以实现类似的神经保护治疗范式,我们又开始治疗PID 10和量化SMI-32 +视神经轴突的球状体近端PID 28 (图2 e)。类似于预防性治疗方案,CGP3466b-treated小鼠显著减少SMI-32 +球状体。
我们还研究了视神经髓鞘脱失的老鼠被撤走35−55运算单元和处理车辆或CGP3466b PID 0开始,以免疫荧光染色对髓鞘碱性蛋白(MBP) (补充图2,对应于相同的视神经SMI-32染色的分析图2 d)。我们提到与MBP染色CGP3466b治疗趋势增加,表明有趣的可能性,封锁SNO-GAPDH产生神经保护的比例对髓鞘脱失的影响。换句话说,SNO-GAPDH可能发挥更大的作用在轴突与少突细胞/髓鞘损伤。这一发现与之前一致工作证明焦轴突退化产生的活性氧和氮物种甚至在完好无损的轴突髓鞘发生在实验性自身免疫性脑脊髓炎(14)。
2.3。CGP3466b最小直接作用于骨髓和淋巴细胞在体外
尽管上述研究结果表明,CGP3466b变弱通过直接神经保护而不是外围神经系统残疾在实验性自身免疫性脑脊髓炎抗炎效果,我们接下来问CGP3466b是否可量化影响培养免疫细胞的激活。从骨髓中巨噬细胞(桥梁养护管理系统),我们发现CGP3466b没有影响LPS-stimulated il - 6的分泌,IL-1β,或il - 10的剂量范围,以酶联免疫吸附试验(ELISA) (图3一)。然后,我们评估的影响CGP3466b LPS-stimulated激活标记CD86的表达和MHC II在桥梁养护管理系统(图3 b)和骨髓衍生树突状细胞(BMDCs) (图3 c通过流式细胞术)。CGP3466b只在最高剂量的影响最小。
图3。CGP3466b最小直接作用于骨髓和淋巴细胞在体外。(一)骨髓中巨噬细胞(桥梁养护管理系统)处理有限合伙人(100 ng / mL) +车辆或者指定的浓度CGP3466b 24 h。细胞因子浓度媒体ELISA测定。数据代表的意思是±SEMn= 3或n= 4独立实验一式三份。(B)桥梁养护管理系统和(C)骨髓中树突状细胞(BMDCs)处理有限合伙人(100 ng / mL) +车辆或者CGP3466b表示浓度,和表达的活化标记流式细胞术测定。数据是一个代表性的例子n= 3独立实验。(D)CD4 +淋巴细胞刺激了anti-CD3 / CD28抗体(3 ug /毫升)的车辆或CGP3466b浓度表示。CD4 +淋巴细胞百分比表示给定的激活标记流式细胞仪测定。数据代表的意思是三个生物复制的±SEM。
确定CGP3466b直接影响T细胞的激活,我们刺激与anti-CD3 CD4 + T细胞CD28抗体在不同浓度的药物(图3 d)。CGP3466b移行细胞没有影响(IFNγ)生产或激活标记CD44和CD69的表达。
2.4。CGP3466b不会改变中枢神经系统免疫渗透撤走35−55运算单元模型
进一步检查是否提供的神经保护CGP3466b发生独立的外围的抗炎作用,我们量化CGP3466b治疗中枢神经系统炎性浸润的影响。老鼠被撤走35−55运算单元治疗日常车辆或CGP3466b(4毫克/公斤)在预防范式(开始PID 0)和分析PID 18(峰值疾病)和PID 28。使用免疫荧光染色CD45(表达的所有类型的白细胞)在PID 18日,我们发现没有区别浸润免疫细胞的数量在脊髓CGP3466b治疗(图4一)。使用相同的预防性治疗范式,我们检查的数量Iba1 +小胶质细胞/巨噬细胞在视神经PID 28岁,但我们观察到无显著差异(图4 b)尽管神经保护中观察到相同的视神经通过SMI-32染色(图2 d)。我们也检查了CGP3466b对髓系和淋巴细胞表型的影响在中枢神经系统疾病在高峰使用流式细胞仪(图4 c- - - - - -H;补充图3)。CGP3466b治疗没有影响arginase-1 (__arg1)浸润的巨噬细胞(CD11b表达式+CD45+Clec12a+)(图4 c)或小胶质细胞(CD11b+CD45+Clec12a−)(图4 d在大脑和脊髓)。伊诺,经典的炎性巨噬细胞和小胶质细胞表型标记,只是表达(发病的实验性自身免疫性脑脊髓炎41)。因此,我们调查了炎性表型的影响通过检查CGP3466b在巨噬细胞表达MHC II (图4 e)和小胶质细胞(图4 f),没有发现显著的影响。同样地,我们发现在CD4淋巴细胞的比例无显著差异显示的标记辅助T (Th) 1 (CD3+CD4+IFNy+)(图4 g)或Th17 (CD3+CD4+IL-17+)表型(图4 h)。在一起,这些结果表明,CGP3466b MOG最小对免疫反应的影响35−55运算单元的模型。
图4。CGP3466b不会影响中枢神经系统免疫渗透撤走35−55运算单元。(一)CD45 +浸润在腰椎脊髓post-immunization 18天。老鼠接受车辆或4毫克/公斤CGP3466b日常post-immunization天0开始。代表图像显示(左),以及量化执行n= 3老鼠每组(正确的)。(B)Iba1 +浸润在视神经post-immunization 28天。老鼠(同一队列中描述图2 d)治疗与车辆或4毫克/公斤CGP3466b日常post-immunization天0开始。代表图像显示(左),以及量化执行n= 3老鼠每组(正确的)。(C)巨噬细胞浸润和(D)居民在大脑和脊髓小胶质细胞通过流式细胞仪检测post-immunization天18的表达arginase-1总巨噬细胞和小胶质细胞的比例,分别。数据代表的意思是±3老鼠每组的扫描电镜。(E)巨噬细胞浸润和(F)居民小胶质细胞检查通过流式细胞术post-immunization天18表达MHC II,显示为平均荧光强度。数据显示每组3老鼠。(G)Th1细胞和(H)Th17细胞被量化通过流式细胞术post-immunization天18日在大脑和脊髓的总CD4 +细胞的比例。数据代表的意思是±3老鼠每组的扫描电镜。所有统计分析与学生的表现t以及。
3所示。讨论
在这项研究中,我们评估了GAPDH亚硝基化抑制剂CGP3466b小说作为一个潜在的治疗我们发现女士撤走35−55女士的运算单元模型,GAPDH是中枢神经系统内亚硝基化作用的主要目标,即有选择地与CGP3466b被全身治疗。我们进一步表明CGP3466b神经保护存在的背景下,衰减女士的疾病在我们的小鼠模型,减少视神经轴突损伤。最后,我们表明,CGP3466b最小对免疫反应的影响在体外和在活的有机体内,这表明CGP3466b直接神经和行为独立于外围的免疫系统。
适度CGP3466b观察对骨髓细胞功能的影响只在高剂量(200海里)。尽管CGP3466b块GAPDH亚硝基化作用在低摩尔浓度(24),在更高浓度的药物有其他目标,如PCMT1 / MST1信号通路(42)和succinate-dependent H2O2从线粒体释放复杂的我(43)。这些lower-affinity目标可以解释观察到的对骨髓细胞在高剂量的影响。然而,如此高的浓度是不太可能实现在活的有机体内4毫克/公斤的剂量用于我们的研究。
已经有长期兴趣阻塞NO-mediated途径来保护神经元女士小胶质细胞,CNS-resident巨噬细胞,和星形胶质细胞——没有的主要来源——代表复发的常见病理中的链接和进步如前所述,女士没有活跃在复发病变女士和水平增加,导致一些调查没有作为生物标志物(44)。最后,没有直接导致neuro-axonal损伤神经炎症动物模型(14)。尽管如此,在炎症没有有多效性的影响,其中一些需要解决炎症或简单的神经系统的正常功能,这样限制没有完全生产产生了不一致的结果(45)。相比之下,有选择性地针对SNO-GAPDH与CGP3466b块特定NO-mediated信号通路参与neuroaxonal受伤同时保护其他的功能没有。
有趣的是,尽管治疗CGP3466b阻止轴突变性和减轻神经系统残疾在我们的模型中,我们没有观察到显著影响的CGP3466b MBP染色。虽然它是可能的,我们的研究存在不足观察这样一个效果,看起来CGP3466b保护对少突胶质细胞轴突完整性不成比例的影响。这些发现表明,通路产生炎性损伤神经元和少突胶质细胞之间的不同。正如上面提到的,选择性保护的轴突CGP3466b符合以前的工作表明活性氧和氮物种产生独立的髓鞘损伤轴突退化在实验性自身免疫性脑脊髓炎(14)。虽然分析了组织学的动物数量和流量仪研究是温和,这些实验进行独立的群老鼠专门从事这些研究为了避免抽样偏差。此外,所有的组织学分析在相同的视觉神经,让神经保护的直接比较,髓鞘保护,CGP3466b治疗在同一动物的免疫效果。
SNO-GAPDH已被证明trans-nitrosylate几个蛋白质,包括脱去乙酰基酶sirtuin-1 (SIRT1) (20.)。SIRT1是线粒体生物起源的关键调节器(46,47),SNO-GAPDH也已被证明能够trans-nitrosylate几个线粒体酶(48)。因此,有可能阻塞CGP3466b保护在神经元和轴突,因为它可以防止SNO-GAPDH-mediated线粒体功能障碍。未来的研究将检查CGP3466b神经元线粒体健康上的影响,以及其他潜在的神经保护机制。
因为CGP3466b已经在二期临床试验,评估有一个建立临床安全性和低阈值的翻译。尽管CGP3466b没有显著影响人类帕金森病的临床过程,这可能是因为帕金森病病理与更少的依赖复杂的氧化/ nitrosative注射压力比MPTP药物CGP3466b鼠标模型显示的好处。相比之下,女士是一个主要的炎性疾病,巨噬细胞和小胶质细胞和星形胶质细胞病理学的一代没有一个已知的方面在人类疾病小鼠模型和实验性自身免疫性脑脊髓炎。因此,SNO-GAPDH参与人类疾病的基本原理是强大得多的情况。
所有疾病修饰治疗目前批准的法案女士通过针对免疫系统——主要是通过限制周围免疫激活或防止外周免疫细胞浸润中枢神经系统(49)。然而,这些药物限制在复发或中枢神经系统伤害,最重要的是,缓慢的残疾女士权责发生制在稳定的进步,很大程度上是因为进步女士病理学是由区分先天免疫激活的t细胞攻击在复发缓和女士(驱动7,50)。因此,神经保护治疗预防炎症性中枢神经系统损伤代表女士研究的主要目标,不管源或炎症阶段。这种疗法可能被用作辅助治疗结合免疫调节治疗在复发和/或女士first-in-class代理减缓神经退化,因此残疾权责发生制在进步,未来的研究将评估CGP3466b作为辅助治疗的小鼠模型。
总之,我们的数据表明,阻止GAPDH亚硝基化与CGP3466b明显变弱模型小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的残疾女士通过神经保护机制独立于外围的免疫系统。考虑到大量需要神经保护药物辅助治疗复发和进步的女士和由于其安全性,CGP3466b持有承诺女士作为治疗策略,值得进一步研究。
3.1。材料和方法
3.1.1。老鼠
野生型C57BL / 6 j小鼠从杰克逊实验室购买(# 000664)和安置在一个专用的约翰霍普金斯啮齿动物设施监管温度(20 - 22°C),湿度50%,12小时光/ 12小时黑暗周期自由获取水和固体食物。协议是由约翰霍普金斯大学机构批准动物保健和使用委员会(协议MO21M370)。
3.1.2。抗体
抗体的列表包括在报告中使用的实验表1。
表1。抗体。
3.1.3。运算单元归纳和得分
是活跃的实验性自身免疫性脑脊髓炎引起女性C57BL / 6 j小鼠(8-12-week-old)后1周驯化的动物设施。MOG35−55肽溶解在PBS 2毫克/毫升的浓度是1:1混合完全弗氏佐剂(8毫克/毫升结核菌素不完全弗氏佐剂毒素),然后混合10分钟到乳剂。0天,小鼠免疫注射50μl乳液皮下注射到每个侧腹部上的两个网站。此外,0天又2天,小鼠腹腔注射250 ng百日咳毒素。控制动物是用完全弗氏佐剂和治疗百日咳毒素。得分进行盲法的方式根据以下范围:0,没有临床赤字;0.5,尾基调的部分损失;1.0,完成尾瘫痪或两部分损失尾部基调加上尴尬的步态;1.5,完成尾瘫痪和尴尬的步态;2.0、尾巴和后肢瘫痪无力证明用脚块笼盖子一边之间下降;2.5,后肢麻痹与没有负重后肢(拖),但有一些运动可能在腿; 3.0, complete hind limb paralysis with no movement in lower limbs; 3.5, hind limb paralysis with some weakness in forelimbs; 4.0, complete tetraplegia but with some movement of head; 4.5, moribund; and 5.0, dead.
3.1.4。与CGP3466b治疗的老鼠
CGP3466b马来酸(Tocris猫# 2966)原液(50毫米在DMSO)在PBS稀释到4% DMSO作为工作解决方案(最终CGP3466b 20 - 800μg /毫升浓度取决于剂量交付)。老鼠每天腹腔注射药物或治疗同等体积的车辆控制在PBS (4% DMSO)。治疗也开始与MOG当日免疫35−55(PID 0)或PID 10。
3.1.5。生物素开关试验
执行的分析是如前所述用细微的修改(34)。简而言之,从脊柱脊髓是冲静水压力,然后再溶解在里帕/母鸡(母鸡缓冲调整包含1% Triton x - 100, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS)手持组织均质器。阐明了匀浆旋转13000 g 10分钟4°C。浮在表面的收集和储存在−80°C到使用。自由巯基共同被封锁和20毫米mmt(甲基methanethiosulfonate) 20分钟。蛋白质在丙酮沉淀,然后resuspended标签解决方案包含50 mM抗坏血酸钠和0.8毫米biotin-HPDP 1 h。蛋白质在冰冷的丙酮沉淀,resuspended,一夜之间推倒高容量neutravidin琼脂糖珠。珠子被清洗和生物素化的蛋白质被筛选了母鸡/ 10缓冲区(母鸡缓冲稀释在水里1/10)含1% beta-mercaptoethanol(σ)。解决了蛋白质SDS /页面。乐队被转移到PVDF膜止动剂P使用湿转移,阻塞TBS-T中含5%牛奶和探索在一夜之间在4°C主要抗体。屁股被清洗和沾HRP-conjugated二级抗体(杰克逊ImmunoResearch)。免疫印迹是可视化使用SuperSignal西发射极耦合逻辑系统(ThermoFisher)胶片曝光紧随其后。 Bands were quantified with ImageJ software. To correct for differences in sample loading, a ratio of SNO-GAPDH to total GAPDH band intensity was calculated, and values were normalized to the CFA alone control group.
3.1.6。免疫荧光成像
小鼠安乐死的过量异氟烷(调整异氟烷流量5%,直到呼吸停止),然后灌注通过与冰冷的心脏穿刺PBS多聚甲醛灌注。灌注后,视神经和脊髓被切割出来。组织在一夜之间多聚甲醛固定,蔗糖与30%蔗糖,保护和冷冻Cryosections 10月(12μm)从近端视神经与anti-SMI-32孵化,anti-Iba1,一夜之间或anti-MBP抗体,用PBS-T洗净,孵化anti-mouse二级抗体。脊髓部分(12μm)与anti-CD45孵化(APC共轭)抗体在一夜之间在4°C。部分成像在蔡司Axio观察者Z1荧光显微镜和蔡司710共焦显微镜数字化与适当的激发和发射过滤器。SMI-32和Iba-1染色被自动计数量化离散粒子的决心成为一个积极的信号。MBP染色被掩蔽MBP +量化区域的视神经和计算将MBP -区域,然后将收益率% MBP计算。SMI-32染色,Iba1, MBP执行相同的视神经为了比较神经保护与巨噬细胞和小胶质细胞的激活和髓鞘脱失的老鼠。所有与ImageJ量化进行了软件。
3.1.7。隔离、文化、和治疗的小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)和骨髓中巨噬细胞(桥梁养护管理系统)
细胞被孤立的描述(51)。短暂,股骨从6到10-wk-old C57BL / 6 j小鼠,削减两端,骨髓PBS得脸都红了。骨髓细胞在1500 rpm,那么颗粒状红细胞裂解缓冲resuspended, 1分钟后反应就熄了PBS过剩。另一个离心后,细胞resuspended完全RPMI媒体组成的RPMI - 1640与GlutaMAX补充,加上10%的边后卫,penicillin-streptomycin 1%, 50μM beta-mercaptoethanol(σ)。天0 ~ 2×106细胞被播种在10毫升每100毫米板媒体包含20 ng / mL重组小鼠- csf (Peprotech)。3天,额外10毫升新鲜cRPMI媒体包含20 ng / mL - csf是添加到每个盘子。5天,一半的文化从每个盘子被上层清液和离心机,颗粒状细胞在10毫升新鲜cRPMI resuspended 20 ng / mL - csf和添加回盘子。8天,所有non-adherent细胞收集(代表BMDC分数),颗粒状,离心resuspended新鲜cRPMI媒体20 ng / mL gm - csf和镀到96年——好菜。这些BMDCs被治疗在一夜之间有或没有有限合伙人(σ)100 ng / ml +指定剂量的CGP3466b(溶解在DMSO)或车辆(DMSO孤独)。第二天(9天),这些细胞被流式细胞术然后化验。附着巨噬细胞(桥梁养护管理系统)被从培养皿中巨噬细胞分离解决方案(Promocell)和山肩到6孔板和有限合伙人100 ng / mL CGP3466b表示剂量或车辆。这些细胞随后被化验通过流式细胞术或细胞因子ELISA。
3.1.8中。气流组织的准备
小鼠安乐死的过量异氟烷(调整异氟烷流量5%,直到呼吸停止)然后用冰冷的PBS灌注通过心脏穿刺。收集大脑和脊髓,机械分离,然后用胶原酶化学分离(200 U /毫升)和DNase (100 U /毫升)常摇动20分钟。细胞然后经过100年与PBSμM过滤和清洗。髓细胞碎片被resuspending颗粒与废墟清理解决方案(Miltenyi研究),与PBS覆盖,然后旋转3000 g,清除髓碎片层。细胞球然后resuspended在PBS,经过100μM过滤器,沾染了抗体如下所述。
3.1.9。CD4 + t细胞隔离和文化
t细胞被生成单细胞分离悬浮液的脾脏和淋巴结6-10-week-old C57BL / 6小鼠。脾脏中断与注射器的柱塞70 -μm尼龙细胞过滤器(BD猎鹰),然后由离心细胞颗粒状(500 g×5分钟)和resuspended新鲜流式细胞仪缓冲区。CD4 +细胞被孤立的负选择使用魔力从Biolegend CD4 +细胞隔离工具目录(48006)根据制造商的指示。一夜之间,盘子被涂在4°C anti-mouse CD3抗体(3μg /毫升)。T细胞在完成resuspended RPMI (glutamax Pen-strep的边后卫RPMI + 10%, 1%, 1%, 0.1% 2-mercaptoethanol)连同3 ug /毫升anti-mouse CD28抗体。细胞培养96 h和治疗前的最后24小时车辆或CGP3466b与流式细胞术进行染色。
3.1.10。ELISA
隔夜与LPS刺激后100 ng / mL±CGP3466b或车辆,BMM文化收集上层清液和细胞因子生产化验使用ELISA试剂盒IL-1β,il - 6、il - 10从eBioscience购买,根据制造商的指示。板块在450 nm读桌面比色分光光度计。
3.1.11。流式细胞术染色
对于面板包括T细胞,细胞首先resuspended完整解决方案的RPMI brefeldin /莫能菌素和PMA / ionomycin。BMDCs和桥梁养护管理系统接受brefeldin和莫能菌素。这些治疗持续了4小时37°C。
染色是在黑暗中在室温下进行。细胞首先沾僵尸近红外光谱(1:1,000)10分钟连同CD16/32(1:200)溶解在PBS。细胞被清洗和resuspended在PBS溶液+ 2%的边后卫+ 1毫米EDTA和染色与相关抗体。所有表面抗体染色施用稀释。细胞被洗和孵化FoxP3固定/透化作用缓冲按照制造商推荐的方案。细胞内染色进行与共轭抗体(1:200)在透化作用对指定的蛋白质缓冲1 h,洗两次,然后分析细胞用流式细胞分析仪Cytek极光。使用FlowJo执行数据分析软件。
3.1.12。统计分析
所有使用GraphPad棱镜软件进行统计分析。细节可以找到每个实验的统计分析数据和图的传说。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。
道德声明
动物研究是由约翰霍普金斯大学机构进行审核和批准的动物保健和使用委员会。
作者的贡献
WG导致项目和实验设计、数据采集、数据分析和解释,以及起草的手稿和数字。SH、KC、SS、PG和EA导致数据采集。可导致项目和实验设计、数据采集、数据分析和解释,起草/编辑的手稿和数据,并提供了资金支持。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这个工作是由国家卫生研究院/研究所授予K08NS104266和康拉德希尔顿基金会玛丽莲·希尔顿弥合医师科学家奖授予17316年可工作组由NIH MSTP支持格兰特T32 GM136577免疫学家协会(American Association of individual investors)的职业生涯在免疫学奖学金计划。
确认
作者要感谢马修·史密斯,行长保罗,朱迪·李,米歇尔·泰勒,托马斯•加顿Em哈林顿和技术援助。
的利益冲突
可有收到咨询费Idec,基因泰克,詹森制药、诺华、OptumRx, TG疗法主题无关的手稿。
其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fneur.2022.979659/full补充材料
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关键词:一氧化氮,多发性硬化症,GAPDH,亚硝基化作用,神经保护,神经炎症,实验性自身免疫性脑脊髓炎
引用:戈弗雷WH黄年代,曹K, Shanmukha年代,Gharibani P,艾布拉姆森E和科恩伯格博士(2023年)阻塞的治疗潜力GAPDH亚硝基化与CGP3466b实验性自身免疫性脑脊髓炎。前面。神经。13:979659。doi: 10.3389 / fneur.2022.979659
收到:2022年6月27日;接受:2022年12月30日;
发表:2023年1月24日。
编辑:
Ingo Kleiter、Marianne-Strauss-Klinik、德国版权©2023戈弗雷,黄、赵、Shanmukha Gharibani,艾布拉姆森和科恩伯格。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
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