协议评估奖励作为学习和记忆的脑刺激调节治疗:比较自主自办experimenter-administration

介绍

激励和强化过程是直接参与操作性条件作用(Bamford et al ., 2018)。然而,数据从许多动物的研究已经证明,刺激区域属于大脑奖赏系统(BRS)也调节学习除了操作性条件作用,作为促进治疗不同的学习和记忆任务(Morgado-Bernal Segura-Torres, 2022)。br的主要地区之一,最常见的目标之一是内侧前脑束外侧下丘脑(地铁消防队)(米尔纳,1991)。动物植入电极刺激火车地铁消防队的用药时,由于强化刺激的性质。这种管理模式被称为颅内意欲(女性),以前所描述的岁和米尔纳(1954)。

内侧前脑bundle-intracranial电气胳肢自己,尤其是当管理岗位培训,能够改善non-declarative(的整合Aldavert-Vera et al ., 2013;Garcia-Brito et al ., 2017)和陈述性记忆(Chamorro-Lopez et al ., 2015;Garcia-Brito et al ., 2020),甚至促进诱导的功能恢复内存赤字(Segura-Torres et al ., 2010;阿提拉·et al ., 2014)。地铁消防队的女性也能激活可塑性过程在不同的电路参与几种类型的内存(Aldavert-Vera et al ., 2013;阿提拉·et al ., 2014;Huguet et al ., 2020;Puig-Parnau et al ., 2020)。尽管有前景的结果在动物模型中,临床试验使用脑深部刺激(DBS)缓解内存赤字在阿尔茨海默病等疾病通常目标离散与内存相关区域(即。、穹窿内嗅皮层、基底核Meynert) (里昂,2011;Aldehri et al ., 2018),而不是地铁消防队或任何其他br的地区。另一方面,地铁消防队正在被用作治疗目标在快感缺乏和抑郁等疾病(Bewernick et al ., 2017;Fenoy et al ., 2018)。一起,这些结果表明,针对地铁消防队的纤维可能是有用的在疾病的治疗呈现多样的症状,包括情绪、动机和内存的改变,这可能是出现在阿尔茨海默病(班纳特和托马斯,2014;魏et al ., 2020)。

虽然女性的一种程序电刺激动物用药,DBS在人类不自觉。因此,为了让动物研究告诉未来的临床研究,重要的是要确定所需的治疗效果可以通过形式的政府。

这个协议的主要目标就是比较自行(女性)和experimenter-administered (EAS)刺激“MFB的有效性的提高空间记忆的巩固。为了做到这一点,动物训练hippocampus-dependent莫里斯水迷宫空间任务(微波加工)(Vorhees和威廉姆斯,2014 b),并接受岗位培训治疗女性或EAS)的每个5微波加工后立即收购会话。地铁消防队的刺激的影响评估每24 h收购会话,并在保留测试72 h后收购会话。此外,不同的大脑区域的神经激活是评估保留90分钟后,使用c-Fos免疫组织化学协议。

这个协议的次要目标是作为一个全面的指南在大鼠建立一致的女性行为,为了使用它作为一个治疗研究它与学习和记忆的关系。我们提供详细的解释的准备自制的电极,电极植入手术,和程序获得自治的行为。此外,我们指定参数的使用两种形式的奖励刺激政府女性和EAS)治疗提高微波加工空间任务的性能。尽管这个协议描述了岗位培训管理治疗,某些方面也可以应用到实验设计,旨在评估地铁消防队的刺激的影响在其他阶段的学习和记忆。学习和记忆的过程和结果的任务在微波加工以及c-Fos表达免疫化学也包含在协议中。

此外,安全有效地建立女性行为的具体步骤也可能感兴趣的研究人员的研究领域中涉及到奖励,如成瘾行为(Baird et al ., 2021)。Carlezon领导和Chartoff (2007)提供一个更详细的描述过程遵循为了评估激励状态,使用女性行为作为因变量。

鉴于基础研究用动物有时可以带来意想不到的甚至有害的后果,它是至关重要的建立良好的协议以获得可靠的结果对动物福利的影响最小。在此基础上,综合列表的最常见问题和故障排除。所有程序进行了符合欧盟指令2010/63 /机构动物保健委员会批准。

材料和设备

刺激电极和地脚螺钉材料

材料所示图1。

通用工具。(钳,文件,统治者、剪刀)

b。手术刀

c。看到

d。烙铁

e。旋转台虎钳

f。绝缘不锈钢焊丝

g。女性连接器

h。螺丝

我。刷子和焊接通量粘贴

j。焊锡丝

k。铜线

l。电源

m。用水培养皿

n。氯化钠

o。勺子

p。销钉

外科手术设备

手术设备所示图2。

一个纸巾。

b。理发工具

c。人工眼药水

d。刷

e。加热垫

f。手术灯与灵活的武器

g。数字显示的坐标

h。抽气器

我。外科器械(手术刀,抹刀,x4弯曲蚊子钳,剪刀,x1直蚊子钳,标准钳)

j。利多卡因

k。碘

l。Meloxicam

m。过氧化氢

n。棉签

o。铅笔

p。0.9%无菌生理盐水

q。手术钻

r。电极(之前准备)

年代。螺丝和螺丝(之前准备)

t。丙烯酸水泥(混合)

u。缝合材料

诉21 g针,缩进

w。Sterile-absorbable止血明胶(Cutanplast^®)

脑电刺激设备

斯金纳箱

对所有实验条件(女性、东亚峰会、或non-stimulated动物),传统的25×20×20厘米的斯金纳箱杆插入墙上之一是使用,如图所示图3。

刺激器

刺激用于这些实验模型CS2-10 Cibertec(以前模型CS20 IM),创造了火车的双相波正弦恒流在50 Hz图4 b)。孤立optoelectronically刺激电路的输出。火车可以调整的持续时间(在本例中,我们使用0.3 ms)。火车的触发可以通过按钮或手动执行响应在斯金纳箱杆。触发信号应用于抗反弹电路,防止不必要的刺激。在到达刺激器之前,触发信号经过脉冲抑制电路,可以适应不同的时间。这个系统的目的是不让另一个信号经过直到预设抑制时间已经过去了。刺激器有两个数字显示,反应,所有的反应明显,增援部队,所有收到的刺激动物显示,如图所示图4一。

行为装置

行为装置用于实验测试的空间学习和记忆是莫里斯水迷宫(微波加工)。微波加工是一个迷宫,主题必须找到一个水下平台中间的四个象限的池。坦克几乎是分为四个象限,定义四个基本方位:北(N)、南(S),东(E)和西(W),观察到图5一个。受试者必须识别和使用池周围的空间线索挂为了找到池中的平台和逃避。在这个实验中使用的线索;东北(NE):沙滩球有不同颜色的条纹,东南部(SE):间接光灯的窗帘、西南(SW):泰迪熊和白色塑料缸水平黑色条纹,和西北(西北):交叉器在一个盒子里面有一盏灯,观察到图5 b, C。

游路径记录使用闭路摄像机(智能视频跟踪系统,2.5版本,Panlab)广角镜头1.75米池的中心。

看到表1所有试剂和资源来源和标识符。

方法

刺激电极和地脚螺钉准备

时间:2 h (2 h / 6电极和6地面螺丝)。

重要的注意事项:总是准备1和3之间的电极前几天手术。这个时期应该考虑以防止氧化的刺激电极。手套可能大部分步骤复杂化这个过程;相反,仔细地开始前和毕业后洗手。

1。提前准备所有材料需要这个过程。打开烙铁。

2。准备2-bases部分使用了。锯切部分后,文件的任何缺陷。注意:仔细检查锯暴露金属角内的任何部分的基础。如果是这样,丢弃并获得一个新的部分。

3所示。旋转台虎钳的基础和安全。7厘米的铜线。离开约4厘米的铁丝将底部和卷起的线角,直到它完全覆盖。离开约1厘米多余的导线两端的角和切丝多余的另一端。用画笔来收集一些焊接通量粘贴和覆盖角。以烙铁,以一滴锡和角(见封面图6 a - c)。警告:通量粘贴和锡应该总是从上到下应用。如果做了相反的方向,铜线可以脱落。

4所示。削减另一个7厘米铜线的长度。地方的中心,它周围的其他角和滚动角一旦创建一个稳定的基础。

5。切1.3厘米绝缘电极线(图6 d)。一旦切断,刮掉的3 - 4毫米的一个极端使用手术刀为了带隔热层。用放大镜检查如果所有的绝缘被正确删除。

6。地方的剥夺了一端电极线由滚线固定在底座上。当电极,以一个极端的线,它在焊丝和角基本3 - 4次的为了确保电极(见角图6 e)。一旦连接,减少多余的铜线两端焊接。重要:电极导线的绝缘端应该最终面对我们,如图所示图6 h-k。

7所示。一旦我们完成了准备刺激电极,它必须检查功能。连接电源连接块底部,如图所示图6 f。首先,把电源的部分基础电极线的位置。介绍焊丝的尖端的解决方案盐水(避免铜线碰水),如图所示图6克。如果通过刺激电极电流运行,您应该能够看到泡沫的尖端电极线和电源应该表明当前水平的增加。重复相同的过程的铜线(地面)。

8。检查剩余的电极线的长度是1厘米。

9。将刺激电极存储在一个密封的盒子,直到使用。

10。准备地脚螺钉,螺杆的旋转台虎钳头朝下滑和安全。

11。7厘米的铜线。留1到2厘米的铜线和使用它滚线的螺丝两次。

12。减少极端。

13。用画笔来收集一些焊接通量粘贴和铜线。

14。带着一滴锡烙铁的帮助和铜线。重要的是检查如果铜线最终完全卡住了。如果铜线仍然可以移动螺杆,重复这个过程,直到完全附着在螺钉。

15。一旦准备好地面螺丝,让他们在一个密封的盒子(见使用图6 l, M最终结果的地脚螺钉)。

暂停点:不超过4天应该通过电极和地脚螺钉之间的准备和使用。

检查德赛et al。(2014)为解决旋转运动的其他方面的问题。

立体定位手术

时间:1天(30分钟/鼠)。

这一步的目的是单方面植入一种慢性电极在内侧前脑束外侧下丘脑。立体定位坐标与前囱:-2.3毫米前后,medial-lateral 2毫米,8.8毫米dorsal-ventral,根据老鼠大脑图集(Paxinos和华生,2007年)。下面是对每个老鼠重复所有实验。为我们的实验中,我们使用3个月大的雄性Wistar鼠从种畜。

1。打开加热垫,并将其在手术区域。封面纸的工作空间。打开灯和数字标记。

2。诱导麻醉将动物和5%异氟烷麻醉诱导室3 - 4分钟。检查呼吸动物完全麻醉时修改确定。之后,把动物从室和刮头皮毛皮机,并将人工滴在眼睛。

3所示。立体定位器将把动物耳道内的酒吧。检查如果头不动,两只耳朵和眼睛之间的对称。把动物的鼻子夹上牙和调整它的鼻子周围的防毒面具。

4所示。异氟烷率降低到2.5%。注意,每个动物可能需要不同的浓度维持麻醉。呼吸频率应该检查在整个过程中为了评估麻醉的充分性。

5。管理利多卡因在头皮上和碘棉签的帮助下。

6。管理2毫克/公斤的止痛剂(Meloxicam)皮下注射。

7所示。把手术刀,前后的切口1.5 - 2厘米。重要的是要避免在切口新的削减。相反,一个清晰的切口应一次完成。

8。用抹刀把颅骨骨膜膜向侧根和公开。

9。使用四个蚊子钳留出头骨和公开的组织,确保侧缝线,前囱和λ是可见的和可访问。

10。清洁表面的头骨与过氧化氢。

11。把电极放在外侧手臂。检查电极是直的,不是弯。

12。地方的尖端电极边缘的一个侧颅缝合线。马克零水平轴(Y)的数字标记。把小费了相反的侧缝线。把获得的数量两和电极的尖端在坐标。

13。前囱上放置电极的尖端和马克零数字标记的所有坐标(X, Y, Z)。

14。背腹侧的坐标找到λ和检查。如果不同之处在于从前囱高于0.3,应调整头的倾向。

15。找到坐标美联社-2.3毫升2和马克在头骨用铅笔。把手臂从电极头的工作区域,以避免弯曲。

16。应用两个盐水滴头骨和钻一个洞在坐标标记。

17所示。让其他两个洞前额缝合线和另外两个洞后缝合线(见前图7)。

18岁。把螺丝头骨。重要!地脚螺钉应附在洞位于侧半球电极和前λ。

19所示。打破的脑膜电极孔使用弯曲的21 g针和介绍了电极在洞里,直到-8.8毫米DV。在大出血的情况下,使用Cutanplast^®按区域,直到出血停止。

20.使用烙铁焊锡丝,焊锡的铜导线电极基础和地脚螺钉。减少多余的线(见图7)。

21。使用固体树脂和液体树脂创建一个honey-like一致性水泥。慢慢地让它滴在头骨,确保所有的螺丝和一半的基础电极。用抹刀水泥干燥时利用产生轻微的金属声音。谨慎!干,水泥应该仔细塑造用抹刀避免锋利边缘的形成可能会损害皮肤。不要把电极植入后就和之前的巩固治疗。

22。执行一个前和一个从电极植入后缝合。如果有一个头骨暴露的一部分,在需要的地方执行更缝合线。电极的基础应该暴露,如所示图7 b。

23。使用棉签清洁伤口与碘。

24。动物撤出的立体定位器,并将其homecage。homecage应该保持在一个加热垫,直到动物苏醒。一些球笼内,以促进在以下时间进食。

暂停点:应该至少7天post-recovery时期。所有的动物都应该监督每日按照动物福利方案。所有的动物,已经成功地从干预可能包括在行为过程。

行为塑造和最优强度搜索(OIS)

•行为塑造

时间:20分钟(性能)的依赖。

这两种类型的管理必须执行这些步骤:自行(女性)和experimenter-administered (EAS)。

1。打开刺激器和选择一个低强度(例如,40μA)。

2。把动物(一块布可以用来抑制)和男性连接器连接到女性连接器植入头骨。

3所示。斯金纳箱内部的主题。动物将开始探索自然。刺激不应该管理在这个初始探索阶段(图8)。

4所示。按下按钮每次刺激动物接近杆所在的墙,如图所示图8 b。

5。强度可以逐渐增加,直到动物表演外围唤醒(通过增加咬嚼证明了噪音,增加立毛,和一般行为激活)。

6。一旦动物可以用药刺激本身一会儿,秒表开始。停止5分钟以后。

7所示。写下增援部队的数量和响应的成型部分。

暂停点:在建立女性行为老鼠必须至少休息30分钟,以返回到基底的激活水平。会话OIS-1可以休息或后24 h后立即完成的行为塑造会话。

•最优搜索强度1 (OIS-1)

时间:15 - 30分钟性能相关的。

1。重新启动计数器的增援和响应。

2。降低强度的最后部分塑造过程中使用了50%。

3所示。秒表开始2分钟,2分钟后,写下的反应表现在强度。

4所示。5μA强度增加。秒表开始2分钟,2分钟后,写出反应的数量。

5。重复这个过程,直到反应的数量减少,至少两个连续的强度。如果一个动物停止响应特定强度为2分钟,10列车的刺激可能会使用这个按钮手动管理。

6。的电流强度主题执行响应的最大数量是其最优强度1 (OI1)。

谨慎!增援部队的数量记录和响应执行的动物的数量通常是不一致的。每一个非连续电流脉冲持续0.2或0.3年代取决于它是如何编程。在这个时间间隔,老鼠可以按杠杆不止一次。反应是用来计算速度/时间单位,决定最优强度应用岗位待遇,而增援部队的数量表示多少刺激(火车)动物已收到。

暂停点:第二个OIS会话后24 h OIS-1建议因为最佳的强度通常减少这两个会议。

•最优搜索强度2 (OIS-2)

时间:15 - 30分钟(性能)的依赖。

1。OIS-1遵循步骤。的电流强度主题执行反应被认为是最佳的强度2的最大数量(OI2)。

2。重要!OI1的意思和OI2被认为是最优强度强度为每个受管理的岗位待遇。

暂停点:最后OIS会话理想情况下应该进行至少72 h微波加工前培训。短时间间隔可以顺行的影响任务的性能,可能屏蔽的影响的岗位女性/ EAS治疗。在这个协议,治疗的日子政府匹配行为训练,但如果女性或东亚峰会是为了调节其他学习阶段,这两个步骤应该搬到时间轴,这可能会导致一个重叠与其他行为过程。

莫里斯水迷宫收购

时间:15 - 25分钟/鼠性能相关的。

在收购会议举行之前,一个习惯化会话执行,以减少动物的情感反应。将动物的习惯由60年代的池没有线索或平台。一旦动物从池中删除,暗示测试执行以检查动物的视力和动力找到平台。暗示测试,平台位于SE象限。一个球与条纹黑白线是连接到平台,最终20厘米以上平台表面。在于将暗示试验动物在游泳池里游泳的最大90年代。如果动物没有方法平台试验过程中,他们应该手动引导,离开那里15 s。习惯化和暗示测试进行收购前3天会议。

连续五天的收购会议由6试验的90年代。在每个试验中,受试者被引入到池从不同的基本方位(E, N W S)。平台总是位于SE象限。主要变量评估是越狱延迟,是指受试者的时间找到平台。作为主要的控制变量,我们测量了时间靠近墙壁,游泳速度和总距离动物游泳。所花费的时间接近墙壁措施趋触性,这是一个焦虑的指标(Treit Fundytus, 1988;黄et al ., 2012)。

暂停点刺激:因为我们执行的岗位培训,没有一个实际的行为训练和治疗管理之间的停顿。唯一的时间延迟是由于老鼠退出微波加工和正确的干燥后用毛巾在继续之前的协议。

颅内电刺激治疗

时间:30 - 60分钟/鼠(性能)的依赖。

重要!所有条件下,斯金纳箱后面的加热垫。尤其是动物刚刚完成了莫里斯水迷宫,水温大约是70 - 74°F(研讨会°C)。

•自治制度

描述了服药治疗图8 c。

1。打开刺激器并选择选择强度(OI)这个话题。

2。动物(一块布可以用来抑制)和连接插头的连接插座电极植入头骨。

3所示。斯金纳箱内部的主题。

4所示。一旦动物面对墙上的杆,按下按钮执行电刺激。

5。主题应立即自己施用治疗了。启动一个秒表,当这一切发生的时候。

6。离开动物用药2500列车的刺激。

7所示。一旦主题达到2500列车(增援部队),关掉刺激器。

8。把动物笼子并返回它的家。

9。写下治疗的总时间和总反应。

•Experimenter-administration

描述了Experimenter-administration治疗图8 d。

1。遵循以上的自治协议步骤1 - 3。

2。总共有2500列车的刺激应该管理,旨在提供每列车0.5 1 s分开。

3所示。把动物笼子并返回它的家。

4所示。写下的总持续时间治疗,以及任何相关的观测。

•Non-stimulated动物

1。斯金纳箱里的动物。

2。在女性塑造和最优强度,斯金纳箱离开动物为20分钟。

3所示。治疗期间的会议,让他们在斯金纳箱45分钟。

4所示。删除homecage的动物,把它。

暂停点:这个暂停点取决于时间和实验的主要目标。在这项研究中,动物进行了保留测试72 h后的岗位待遇。

莫里斯水迷宫保留

时间:3分钟/老鼠。

七十二小时后获取会话,动物保留执行测试,包括从池中删除隐藏的平台,把动物放在池60年代从东方。变量保留测试进行了分析评估的整体试验持续时间(60)和第一一半的试验(30岁),考虑到性能的准确性和水平可能会改变整个保留测试微波加工(布劳克et al ., 2004)。变量分析是:时间的百分比在目标象限上半年的审判(Q30)及其整体(Q60);平均距离目标(DT30和DT60),时间的百分比在目标环(Ann30和Ann60),时间在墙(W30和W60)和Wishaw错误(我们),衡量动物时花在30厘米宽的走廊从东入口点的平台和显示精度轨迹。

暂停点:受试者安乐死90分钟后保留测试。

组织收集和免疫组织化学研究

为包含IHC时间:2天。

这一步的协议旨在评估神经活动组之间的差异后,保留会话。

九十分钟保留测试结束后,接收到的动物戊巴比妥过量(150毫克/公斤,i.p。)和灌注transcardially有0.1米的磷酸缓冲盐溶液(PBS)的溶液pH值7.4,其次是4%多聚甲醛在PBS。大脑被移除和4%多聚甲醛在PBS你找找,然后cryoprotected在15%和30%蔗糖在PBS和储存在-80°C。连续冠状部分(30嗯)获得在低温恒温器(1800年Cryocut 2020荣格切片机)在-20°C和储存在-80°C到疣状。自由浮动的日冕部分与0.3%过氧化氢在孵化Tris-buffered盐水(TBS) 30分钟和1%牛血清白蛋白(BSA)在TBS 0.3% Triton x - 100 (TBS-T) 30分钟。部分孵化在初级抗体鼠标anticFos(圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国;sc - 166940)在1:50 0 0.1% BSA TBS-T一夜之间在4°C。第二天样本孵化与生物素化的山羊anti-mouse-IgG二级抗体(杰克逊Immunoresearch Inc .)、伊利、英国;ref。: 115-065-166)在1:50 0 0.1% BSA TBS-T 60分钟在室温和随后处理Streptavidin-HRP(海水养生物科学,马尔伯勒,妈,美国)在TBS-T 1:2500 120分钟,其次是治疗3、3′-Diaminobenzidine (DAB)解决方案(向量实验室、纽瓦克、新泽西、美国)5分钟。最后,部分被安装到幻灯片,脱水,盖玻片被Pertex安装介质(Medite GmbH, Wollenweberstraße,德国)。消极的控制没有主要的抗体被包括在内。

结果

量化和统计分析

使用SPSS统计分析执行第23节(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。共有21个纯种白化的雄性老鼠(鼠形)与平均年龄在这个实验中使用的113天(SD = 4.00)和平均体重389.57克(SD = 7.00)开始实验。四只动物被排除在实验。三个对象被排除在外,因为他们极端异常行为任务(> 2.0 SD分意味着两收购多会话)。一个主题被排除在外,因为在行为测试问题记录问题。没有动物被排除在外,因为电极遗忘,如图所示图9。行为和分子分析,总样本包括17个项目(女性:n= 6;东亚峰会:n= 6;假:n= 5)。所有对象都保存在一个随意政权的食物和水。

分析性能的微波加工使用3×4混合进行方差分析(集团×会话)收购阶段。一个独立的样品t以及分析用于第一个收购会话(S1)和72 - h保留测试。此外,一个t以及当时用来比较动物在保留在目标象限测试机会水平(25%)。

分析c-Fos定量数据,我们使用一个3×2混合方差分析(×半球组)为每一个大脑区域研究。半球因子不显著时,同侧和对侧的的均值半球进行了分析。故事的特定大脑区域的10×使用BX-41奥林巴斯显微镜物镜与奥林巴斯dp - 70数码相机(日本)。适当的灰度阈值和颗粒大小为每个区域设置和维护所有科目。图像分析软件Image-J 1.43¹采用双边计数的数量c-Fos应用核使用感兴趣的区域(roi)(看到了吗10的数据情况在“结果”一节)。三个组织学部分数和平均为所有地区。为了消除背景噪音,每个图像数字平滑和减去从原始。看到10我的数据免疫组织化学结果为代表。

最优强度女性进化和响应速度

下图描绘代表使用标准的女性获得最佳的强度和反应率参数。关于OI,下降通常观察OI1和OI2会话之间稳定如果更多的会话。在这个实验中,只有OI1和OI2会议进行。然而,OIS会话的数量将取决于研究的目的图11)。

在不同强度响应曲线通常适合一个倒u (图11 b)。诱发反应率最高的强度被称为最优强度。这个数字还显示女性的强度阈值。

学习和记忆的结果

收购

主要变量用于评估性能在微波加工的收购是逃避延迟,或者时间对象试图找到隐藏的平台。组间无显著差异在第一个会话中(S1)被发现(P= 0.199),这表明所有组开始收购阶段类似的性能水平。这些结果让我们排除任何先前的刺激,女性的影响/东亚峰会主题之前收到了微波加工培训。

重复测量方差分析分析(×会话组)被用来研究越狱延迟其他收购会话(S2-S5)。集团(F₂,₁₄= 10.098,P= 0.002)和会话(F₃,₄₂= 29.174,P< 0.001)因素造成重大的,但是他们的交互作用不显著(F₆,₄₂= 1.816,P= 0.119)。它可以观察到图12,表现在会话的演变主要是调整线性函数(F₁,₁₄= 77.229;P< 0.001),其中一些变化(二次函数:F₁,₁₄= 5.431;P= 0.035)可能由于地板效应,通常是观测到的最后一次会议。尽管所有的组织显示改善执行整个会话,接受治疗的两组显示低逃脱延迟与non-stimulated组(相比女性与non-stimulated:P= 0.003;东亚峰会与non-stimulated:P= 0.001)。因此,两种形式的政府同样促进任务的收购。这些影响在第一次治疗后立即开始会话,并保持整个收购阶段。没有观察到不同的控制变量。

保留

相比上半年机会水平(25%)的测试(Q30),两组接受刺激花更多的时间在目标象限(女性:t₅= 3.306,P= 0.021;东亚峰会:t₅= 5.469,P= 0.003),而non-stimulated集团没有(t₄= 1.824,P= 0.142)。然而,当我们看整个测试(Q60),所有的团体目标象限中花更多的时间与机会水平(女性:t₅= 3.785,P= 0.013;东亚峰会:t₅= 5.359,P= 0.003;non-stimulated:t₄= 3.391,P= 0.027),如所示图12 b。关于上半年墙附近的时间保留测试(W30),组织被发现之间的显著差异(F₂,₁₆= 4.175,P= 0.038)。具体来说,两种刺激组花了更少的时间在墙壁与non-stimulated集团(Helmert对比:P= 0.021),如所示图12 c。没有在任何其他变量组间差异分析。

免疫组织化学结果

我们测量c-Fos表达式后保留在72 h来确定初级运动皮层神经元活动(M1),伏隔核的核心(NAcC) centromedial丘脑核(CMT)和海马CA1区。一个混合3×2方差分析(集团×半球)使用。

关于M1 (图10),两国之间的差异观察组(F₂,₁₂= 6.309,P= 0.013)。一个事后(图基HSD)对比显示,女性c-Fos表达明显高于动物组相比没有杠杆式压力机响应(东亚峰会,P= 0.008;non-stimulated,P= 0.012)。类似的双边结果观察CMT(集团:F₂,₁₃= 15.708,P< 0.001)(图10 c),女性群体也表现出更多的cfo +比其他两组神经元(东亚峰会,P= 0.005;non-stimulated,P< 0.0001)。

国家缮食护理协会(中图10 b),组间差异hemisphere-dependent(集团×半球:F₂,₁₂= 3.944,P= 0.048)。侧半球,女性条件造成更大程度的c-Fos比一个无外界影响条件表达式(P= 0.025),而东亚峰会组没有不同于女性或non-stimulated组。immunolabeling由于问题的样本,结果侧半球的CA1区是不可靠的。基于先前的研究显示,女性会导致类似的CA1双边激活(Huguet et al ., 2009),只有身体的同侧的CA1已经包括在分析中。观察组之间没有差异(图10 d)。

优势和局限性

女性的主要优势是相对宽松的实验动物获得这种行为,它允许生理刺激的可以。此外,它被证明不是导致依赖性或上瘾,所以它不涉及耐受现象也不抵抗灭绝。此外,事后组织学控制电极的位置不是必要的,因为本身就是一个成功的女性行为的保证准确的位置。最后,目标区域相对较大,经过足够的训练立体定位手术,对准确植入的百分比误差小于10%。应该注意的是,女性被认为是无害的,可以获得不同的物种,在男性和女性受试者。

一个可能的限制对这个协议是治疗的时间管理。根据实验目的,刺激治疗可能在不同的时间管理与学习任务或其他相关手续。例如,训练的治疗(培训之前)会影响任务的收购,而pre-retention(探针测试之前)会影响记得,和岗位培训(培训后)会影响整合过程。治疗也可以管理non-contingently学习过程,阶段之间的培训。所有这些不同的设计实验测试了女性,和岗位培训管理一直是最有效的(Segura-Torres et al ., 1988;Redolar-Ripoll et al ., 2002;Soriano-Mas et al ., 2007)。因此,本协议描述如何执行的岗位培训管理治疗,无论是女性还是东亚峰会。

最后,另一个限制是,评估c-Fos是时间敏感的神经激活(乔杜里et al ., 2000)。因此,我们只能神经元激活链接到保留的性能测试,因为这是任务的动物进行安乐死和组织提取之前90分钟。

故障排除

问题1:电极植入落下来。

潜在的解决方案:

(1)避免过度操纵的电极。

(2)拧紧螺丝陷入更深的头骨。

(3)申请前的丙烯酸水泥头骨,表面完全干燥。

问题2:动物不会显示女性的行为。

潜在的解决方案:

(1)我们可以将动物从斯金纳箱,检查所有刺激器之间的连接,河鼠电极装置,杠杆。检查所有组件的电路正常工作,你可以用一个电阻。建议有几个可用的备用电缆。

(2)虽然不是很常见,一些动物似乎得到足够的电流强度在塑造行为的第一天。这可能是由于增加组织抵抗,如血凝块。这通常是解决而不需要任何类型的干预,所以建议在以后再次测试动物。

(3)在某些情况下,河鼠从未显示女性的行为。由于这个原因,有必要定期检查立体定位器,和非常小心在精化的电极。在大脑中植入的时刻也很重要。电极丝总是应该阻止被意外弯曲或损坏。例如,一旦执行头骨上的洞,穿过针的脑膜。如果这一步是遗忘,焊丝可以弯曲通过老鼠硬脑膜,这可能影响电极的路径。

问题3:动物显示异常行为,如刻板行为,甚至极端边缘激发癫痫刺激期间,这可能会阻碍其自我的能力。增加立毛,牙齿打颤,梳理和偶尔在男性射精是正常的现象。也是正常的动物偶尔休息期间短期治疗女性。

潜在的解决方案:

(1)降低刺激的强度,如果可能的话。

(2)密切关注动物的行为在女性或东亚峰会和特别注意的时间完成部分会话。如果动物不断退出女性行为或如果异常行为太严重,它不应该被包括在刺激组。

(3)癫痫:抽搐发作的开始可以评估胳肢自己活动的停止和垂涎。在这些情况下,立即停止刺激。等几分钟之前把动物从笼子里。主题的一般参数应该检查在接下来的几天里。如果癫痫发作引起是由于高强度水平,动物可能会继续在这个实验中,使用较低的强度。癫痫不影响性能的学习任务,但是他们影响c-Fos +神经元的数量,尤其是在齿状回,因此,根据分子的目标,这应该被考虑。

问题4:动物的学习行为的任务(任务)在这种情况下,空间速度快于预期,在这种情况下,治疗的效果是不明显的。

潜在的解决方案:

(1)使任务更困难减少试验每个会话的数量(从6 4或2),或者通过减少总会议执行的数量(Chamorro-Lopez et al ., 2015;Garcia-Brito et al ., 2018)。

讨论

摘要股票标准化指南使用奖励“MFB刺激作为治疗改善大鼠的学习和记忆。这个协议中描述的材料和步骤已经被用来评估自我的影响vs。experimenter-administration微波加工性能,以及c-Fos保留测试后的表达。据我们所知,这是第一次相比,女性和东亚峰会在空间记忆任务。

行为数据显示,加强地铁消防队的刺激是一种有效的治疗促进收购大鼠空间学习任务,不管它是否自行或外部管理。形式的政府都是明显的影响在第一次治疗,管理和维护这种效应获取会话。女性的促进作用是微波加工(与之前的结果相一致Ruiz-Medina et al ., 2008;Chamorro-Lopez et al ., 2015),和其他类型的任务,如主动回避条件作用(Segura-Torres et al ., 2010)。它已被证明效力的影响的有关培训,因为non-stimulated动物能够达到更好的性能时接受更多的培训(Redolar-Ripoll et al ., 2002;Ruiz-Medina et al ., 2008;Chamorro-Lopez et al ., 2015)。这可能会减少治疗的行动范围。然而,尽管每个会话使用更多的试验在目前的研究中,女性和EAS-treated受试者表现出改进的性能相比non-stimulated动物。这是同意的结果显示,女性可能比训练本身(更加强大Redolar-Ripoll et al ., 2002)。

相比之下,没有观察到的差异的刺激和non-stimulated动物变量之间在保留测试评估。这是否意味着“MFB刺激没有长期影响?当评估保留水平相比上半年机会在每个组的测试,只有刺激动物花更多的时间在目标象限。这表明他们召回了平台的位置比non-stimulated动物。此外,由于空间微波加工被认为是hippocampus-dependent记忆任务(Vorhees和威廉姆斯,2014)CA1活化进行了的研究。类似c-Fos水平在CA1发现所有组的支持,最终他们都呈现类似的保留的水平,可能由于他们经历的强化训练。事实上,女性能够产生长期的促进效应当动物收到较少的试验在收购(Garcia-Brito et al ., 2020)。有趣的是,刺激动物花更少的时间在保留墙附近测试相比non-stimulated组。这种减少thigmotactic行为可能与一个更好的保留。另一方面,这一结果表明潜在的抗焦虑效果地铁消防队的刺激。

尽管行为结果表明同等的治疗潜力,c-Fos表达式的结果在M1, NAcC, CMT,建议两种政府形式之间的区别。正如预期的那样,女性组显示增加初级运动皮层的激活,也就是解释为持续施压行为需要得到电刺激(Shankaranarayana Rao et al ., 1998)。

令人惊讶的是,尽管女性和东亚峰会组织收到奖励刺激,只有女性组显示更多的激活NAcC相比non-stimulated动物。这是一个关键地区的中脑边缘系统(Baik 2020)。自从c-Fos评估72 h后治疗管理,我们无法知道是否激活这个核相似或不同的两组后立即刺激。然而,女性似乎更持久的影响。两组接受相同数量的刺激;因此,最可能的解释是双重的。

关键资源表

一方面,女性的条件下,实验者可以调整基于女性行为的刺激强度。另一方面,老鼠在这种情况下能够调节自己的动机水平或兴奋通过调整反应率,并且通常表现出明显的外围冲动和行为激活(Nieh et al ., 2016)。高表达的c-Fos arousal-related CMT女性组的核可以支持这一观点。此外,观察效果的ipsilaterality NAcC和两侧对称的CMT同意以前的结果显示更大的侧激活只在地区最直接连接到刺激区域(Arvanitogiannis et al ., 1996)。

总之,两种形式的管理奖励刺激促进hippocampus-dependent学习任务,虽然他们目前关于长期激活水平差异在一些相关脑区兴奋,和运动行为。这些结果表明,地铁消防队是一种很有前途的目标用于DBS人类与内存相关疾病的治疗,即使刺激不是自行。此外,他们支持一种观点,即使用女性在一个动物模型获得的结果指导临床研究是有用的。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

动物研究回顾和批准Departament d 'Agricultura Ramaderia, Pesca我Alimentacio Generalitat de加泰罗尼亚(DARP Ref。7350)。

作者的贡献

LV-S:调查和原创作品。SG-B:调查和writing-review和编辑。LA-V:概念、方法论和writing-review和编辑。艾克:概念、方法writing-review和编辑,资金收购。GH:概念、方法、监督和资金收购。IM-B:概念化。PS-T:概念化,writing-review和编辑,项目管理和资金收购。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作是支持pid2020 - 117101 - rb c21和pid2020 - 117101 - rb - c22赠款Ministerio de Ciencia e Innovacion(西班牙)。

确认

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的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnbeh.2022.1046259/full补充材料

脚注

1. ^http://rsb.info.nih.gov/ij/

引用