与当地屏蔽抑制串扰的多极阵列

介绍

大脑包含大型和小型时空组织,与不同的功能发生在多个空间和时间尺度。了解规则,从根本上提高大脑功能,人们普遍认为网络的神经元需要研究(军部et al ., 1998),而不是孤立的单个神经元。细胞外多极阵列(MEA)是一个适当的设备刺激和记录从大量的神经元(以及其他电致细胞),因为它能够同时记录缓慢的活动与当地领域潜在的变化(一个聚合周围的突触输入)和快速活动相关的多部件附近神经元放电。为了获得一种机械的生物物理因素的描述神经网络过程,需要隔离单机制活动。给定的大小和间距内神经元网络(在1 - 10μm量表(Heathcote萨金特,1987年),这需要一个设备高空间分辨率的能力。而量是可以伪造的密度较高时(10的μm音高(多通道系统,2021;米科利et al ., 2019),实现更高的空间分辨率的限制因素孤立单个神经元的活动在更大的数组(文图拉和Gerkin, 2012)。

由于细胞外电流的扩散到周围的离子中来自动作电位的有效记录频道数量的设备将低于实际数量减少,如果他们的临界间距或更小。电场在多大程度上源自神经元记录由多个电极,而不是/在一个记录网站,可以定义为电气相声(Wilke et al ., 2011)。之际,这种情况下的倒数字段从多个神经元在单个记录网站(然后聚合为一个单一的输入,而不是多个不同的输入)也同样有问题。重叠的电动电位和字段是不良记录和刺激,后者被标识为一个问题,例如,意味着技术用于视觉假体(纳尔逊et al ., 2017)。的程度的一种定义单个像素的电极系主导所有相邻的像素是由Wilke, et al。(2011)由于串扰系数CT=E_{n - 1 (x, y, z)}/E_{N (x, y, z)},|E|_{N (x, y, z)}在点(电场强度x, y, z与数组中的所有电极活性),|E|_{n - 1 (x, y, z)}是这一点的领域选择电极不活跃。这个比例将相同的电位(电压)。CT范围从0到1,最小的低端相声(测量电场由感兴趣的测量电极)和高的上端相声(多个电极导致测量电场)。

如果神经元之间的重叠事件(峰值)相对较少,普遍使用的一种手段神经科学家分离单个神经元在多部件记录峰值的post数据采集过程分类。这包括分组记录峰值成集群基于波形的相似性(雷伊et al ., 2015)(即。,voltage dynamics over time). Spike sorting extracts individual spike waveforms out of a temporal window of collected spikes and is highly dependent on the sampling rate. Each datum point of a spike is a possible “feature” to be used for differentiation from other spikes and therefore the problem starts off being an N-dimensional one, where N is the number of data points per spike. Here, the complexity increases exponentially as a function of recorded events and can quickly becomes computationally intensive (普伦蒂斯et al ., 2011;Hilgen et al ., 2017)。

动作电位的持续时间是在几毫秒,所以典型的40千赫采样率将产生50 - 100分上升。如果采样率太低,风险变得不足,减少数据点可能会导致意外的转变最大值点用于对齐。高采样率对应更多的数据点和代表信号精度高,但需要更多的计算能力。降低这个负担,方法已经发展为了降低了问题的维数。特征提取的一个简单的方法是采取一个波形的基本特征(振幅、持续时间/宽度、上升时间、信号的平方,等等)和使用它们来区分信号。然而,它已经表明,这并不总是可靠的(Lewicki 1998)。另一个简单的方法称为模板匹配峰值形状依赖于选择模板为每个单元(格斯坦和克拉克,1964年)。然后用作形状指标分配和匹配的波形。然而,除了手动干预问题,sparsely-firing神经元可能是错过了使用这种方法(Quiroga et al ., 2007),动作电位在许多类型的神经元表现出内在的可塑性明显双向膜离子电导的变化和相应的动作电位的动态变化(Debanne et al ., 2019)。最常见的特征提取与降维方法是主成分分析(PCA) (哈里斯et al ., 2000;Shoham et al ., 2003)。虽然这种方法的细节超出了本文的范围,这样做是为了找到一个命令组正交基向量,捕捉最大方差数据的方向和代表任何波形的线性组合这些主成分(人,1901年;Quiroga, 2013)。尽管存在这些挑战,高峰排序算法目前仍然是一个标准的过程在神经系统数据的分析和新方法或改进不断地(Ekanadham et al ., 2014;Kadir也et al ., 2014;Swindale斯,2014年)。然而,建立指标评估分类器是一个持续的过程,一些研究显示不存在放之四海而皆准的算法(Buccino et al ., 2020;Magland et al ., 2020;大厅et al ., 2021)。

最具挑战性的问题的排序方法是本文关注的主题:重叠或峰值,如上所述,相声。两个或两个以上的神经元附近发射同步或有足够小的延迟将重叠的细胞外的动作电位。这可能被视为一个信号从一个神经元,而不是从区分神经元。此外,细胞外的波形来自动作电位改变形状,因为它穿越空间。鉴于领域潜力可以旅行数百微米在离子解决方案中,波形在一个位置可以在另一个截然不同,因此错误地解释为两个独特的信号(Einevoll et al ., 2012)。外的分类,各种技术被利用尽量减少串扰的影响通过设计设备限制产生的电场(柴et al ., 2008;黄et al ., 2009;穆贾达姆et al ., 2011;Kaur et al ., 2021)。

在本文中,我们表明,当地电力通过同轴屏蔽结构(诺顿et al ., 2016)大大减少了传统相声相比,光秃秃的,无屏蔽的电极。两个刺激方法,电气和光学,是用来展示当地屏蔽的效用与无防御的情况下,通过电极刺激电压瞬变的录音。在光学刺激实验中,optogenetically-transfected人类胚胎肾细胞(HEK 293 - chr2),作为电致神经元细胞等代理。两种类型的设备是捏造的每个刺激方法:裸露的多极阵列(bMEA)和同轴多极阵列(cMEA)。图1上显示了一个示意图的同轴电极,其组成材料。在图1中间,我们展示的光学图像布局布线电气设备(裸=红色箭头,哄=蓝色箭头),和电子显微镜图像的每种类型的电极。在图1低,我们展示了布线布局的光学设备,和一个实际的芯片的照片。我们指示代表位置明确的洞(红点)否则optically-opaque金属薄膜在玻璃基板上的量(像素=黑点)是捏造的。这些漏洞使局部光学照明和激励通过从下面。在每个cMEA刺激装置,外导体/盾牌唱红脸是常见的,与芯单独electrically-addressed。

结果

模拟

我们还建模/仿真非屏蔽和屏蔽是配置的性能。使用有限元方法(FEM)仿真软件COMSOL多重物理量(RRID: SCR_014767),设备的计算模型是采用现实的材料参数,打算检查重叠的一对电极电势的传感领域作为电极距离的函数。图案电极对七行,每一行有一个特定的分离距离(从1000年5μmμm),放置在一个模拟的电解质溶液(名义上拥有相同的电特性使用的介质电实验,即。、静态介电常数ε∼80直流电导率σ∼1.5 S / m)。虽然相声和检测领域的潜力原位受到各种因素的影响,包括细胞类型,距离电极和电极接触的性质,这个仿真的目的是找到潜在的振幅在记录电极表面生成的源(例如,神经元飙升)分离距离的函数。Green-Lorentz互惠减少这个问题的求解泊松方程的标量势产生的记录电极电压源(洛伦兹,1896)。

模拟进行裸露,无防御的和同轴屏蔽电极的电极直径和高度,以及与外部屏蔽屏蔽的情况下,各种高度相对于核心的电极。所示图2结果20μm-diameter 5μm-tall电极对,盾牌在同轴的情况下60%的高度(即核心。3μm)。后来的实验与裸电极和同轴屏蔽电极有60%。澄清,模拟双进行单独为每个分离距离,与1 mV激发。10到50μm扩大中间面板的分离结果图2。,深红色(蓝色)代表地区一个电极强(弱)感官源信号,显示的颜色范围。很明显的图像无防御的电极(左图像)经验重叠相邻电极的感应区域分离的距离远远大于做屏蔽电极的图像(右)。距离的50 - 100μm和少,传感电极的无屏蔽的区域明显重叠。这有效地呈现两个人电极作为单个电极更大的大小,代表一个像素密度,从而出现损失的相声。相反,即使是在分离距离小到10μm(中间面板的底部图2),屏蔽电极继续显示信号的分离CT *≤0.8。在这里,CT* = |V(d)| |V(0)|。CT是一种有效的串扰系数和|V(d)|是一个特定的信号传感区域距离d从激励源。仿真结果为CT*,从线性穿过邻近电极在50岁μm间距,中心面板的图所示。

重要的是要注意,这些模拟主要是规模不变。也就是说,如果裸电极更小或更大的直径比模拟图2,传感区域重叠,仍然是由相声的分离距离几次电极直径。多个2 d和3 d几何图形模拟,定性是相同的结果。因为这项工作的目标是将高密度阵列发生在感应区域由一个哄,我们做了模拟的几何形状比较单一的同轴结构与传统意味着技术(单一、平面、圆柱垫)。而我们实验阵列特性单个传感器区域内多个同轴结构,模拟代表保守估计领域重叠,因为实验数组有更多的保护面积。相比较而言,在传统意味着架构,场分布可能会更大,因为缺乏当地的屏蔽和更大的表面积覆盖气缸(相对于同轴结构的盖移除)。因此,本次模拟的结果可以给一个允许的最大像素,给定一个电极尺寸,以避免大量的相声。

电气和光学刺激

对电刺激实验,设备的好图1(中间),包含独立bMEA和cMEA地区,充满了电解质使用吸管缓冲溶液。从bMEA分离设备和1毫米行,并逐步转移到5μm分离行,电压脉冲被送到一个左电极(使用Ag / Cl颗粒电解质作为地面缓冲溶液),同时在所有剩余电压信号电极记录。实验重复使用正确的特定行电极作为刺激电极,以确保镜面对称。原始数据的痕迹从激励源的距离d= 10、25、50、100、500、和1000年μm所示图3(上,红色)。cMEA上测试,一个哄位置的盾牌(而不是一个遥远的线)被设置为地面。和上面相同的步骤进行(信号注入在左边,其次是正确的,确认对称)。原始cMEA数据所示痕迹图3(低,黑色),再次d= 10 - 1000μm。five-sweep试验的数据平均,平均值绘制误差显示分散在稳态值。从实验中观察到,信号记录在第一次扫描是最高的,而随后的扫向稳态值。

光刺激,optically-evoked场电位检测与探讨蓝光敏感hek - 293细胞转染脑细胞蛋白质ChR2 (H134R) (Zhang et al ., 2007)。转染数组和文化过程,描述在以前的工作(诺顿et al ., 2016),使用。设备一致的测量仪器放大器(多通道系统mea - 2100)的一个60通道设置为地面。确保人生活、工作在整个数组(即细胞。能够光学驱动),473 nm波长激光上面是一致的数组和照亮了样本。一旦细胞生存能力确认通过捕获变位,激光是搬到背面对齐,定位到以下几个网站数组,顺序和five-sweep试验进行。代表原始数据块电压源(即。,a cell excited at the illuminated coax) and at multiple channel distances from that source are shown in图4为bMEA(上)和cMEA(低)设备。那里可以看到,对于每个light-excitation网站,变位在局部领域仅限于只有少数直接(即。cMEA照亮)传感区域,而不是几乎完整的信号至少180μm bMEA带走。我们注意到的波形optically-induced变位HEK细胞被cMEA从那些被bMEA显得有些不同。裸电极和屏蔽阵列的核心是电容耦合的信号从细胞,但后者的屏蔽显著降低这个耦合。假设相同的液体介质阻抗R两个结构,这可以相应地减少时间常数τ=钢筋混凝土cMEA测量电路。具体来说,数据图4收益率τ∼bMEA和cMEA女士475年和120年,分别。我们已经模拟了电容C这些电路使用电磁有限元建模程序(CST工作室套件),并计算电容的比值C_bMEA/C_cMEA= 5 $\pm$ 2,与测量∼4的比例一致。因此,cMEA结构更好地代表了细胞外真正的反应。

电气和光学刺激,记录电响应仅限于传感领域的刺激位置靠近cMEA设备。另一方面,这种反应持续显著更大距离bMEA设备。在图3电刺激,可以看出响应∼75%抑制距离50μm cMEA从源,但只有∼15%抑制bMEA情况。除此之外,距离,cMEA电极检测没有剩余信号,而几乎一半的刺激信号持续bMEA 1毫米的距离。电气和光学刺激结果反映在保护环境中信道串扰的抑制提供了cMEA。

讨论

为了定量比较两个设备,数据采集和试验平均为每个实验。电极电压在激发点名叫V(0),距离计算电极包围和串扰系数CT*,前面介绍,每个电极的提取。就像CT讨论的介绍,一个大CT*对应于高相声,自传感地区捕获的很大一部分来源。我们在图5电压响应,策划有效的相声CT* =V(d)/V(0),而距离d从激发电子和光学刺激实验,从数据图3,4从其他比如实验(平均数据±标准差如图所示)。红色(蓝色)从无防御的符号数据bMEA(屏蔽cMEA)样品,开放(固体)符号从光(电)实验。虚线代表使用的计算机模拟响应使用相同的形式图2。每种类型的数据集从两个意味着设备显示(因此两个符号类型)。通过结合光学和电刺激数据集,看到一个共同的趋势,在这两个实验,诱导优于裸电极减少串扰。这些研究结果进行了总结图5,一个可以看到有效的屏蔽电极串扰系数明显低于裸电极的所有距离大于几微米从源。这对应于更好的抑制或过滤电场偏离来源记录装置。在裸电极装置,感应区域内100μm信号仍然显示CT*超过0.9,这对应于很大的相声。这种信号重叠可能从真实的角度建立数据成为问题。一个可以量化的地方屏蔽意味着技术的影响图5。即使用相声代表50%计,屏蔽,同轴情况下收益率∼20×改善线性空间分辨率(∼25和500μm无屏蔽的,图5)。这对应于一个20²∼400×区域设备的改进,例如,对一个典型的意思。

本研究的主要局限是选定的细胞培养实验中使用的光学刺激。optogenetic应用技术易于实现转染,高密度,确保电极覆盖,HEK细胞的电特性和高生存能力让他们选择一个合适的概念验证研究。然而,有一个明显的区别HEK细胞和神经元如通常在神经研究引用。一个适当的下一步将是文化转染神经元或海马片。这将进一步发展概念验证两个维度:1)显示细胞减少串扰知名电特性,从而能够真实验证测量,和2)测试的形态学动态cell-coaxial电极界面。从quasi-2D系统中,作为传统意味着技术发现,3 d体系结构有助于防止细胞漂移,同时,促进细胞内电极的吞没,这表明阈下信号和记录的能力,再加上电穿孔,细胞内活动渗透细胞膜。然而,我们并不预期不同的细胞系将产生深远影响的结果。

摘要和结论

本文提供的实验和模拟演示相声的抑制使当地屏蔽通过使用同轴电极结构。他们建议,为了避免在高密度多极阵列信号重叠,同轴或类似locally-shielded架构可以利用。虽然目前最先进的电极阵列(例如,高清量,cmos多路复用的传感器阵列,neuropixels)实现高密度、相声代表一个病原对空间分辨率的影响。相反,目前的同轴结构,除了实现更高的像素密度比这里介绍(在制造过程中没有阻止我们把像素密度到纳米尺度),能够减少电串扰,从而维持高空间分辨率。理论上,屏蔽架构可以提高到热噪声地板成为主导。纳米同轴数组,使用Johnson-Nyquist噪声方程一阶近似,应该还有一个实际的信噪比噪声地板的数万微伏。设备特征可以进一步提高通过改变阻抗增加内部电极表面积(降低盾)或改变电极(inner-outer金属环)的差距。

在互惠的范式中,电极用于通过电刺激唤起细胞行为,我们展示了同轴结构有利于实现本地化细胞接触。这种优势还延伸到孤立的光刺激。而不是通过光束控制实现有针对性的光刺激或scanning-based方法,屏蔽电极便利原位光学集成。未来的工作在设备发展也可以转移到一个完全设备内置光学组件,从而使高速,分别可寻址光电记录和调制。除了减轻负担的先进的光学方法,这种采用能减少依赖排序,精心开发等算法,在分析多单元的录音使用多级/微电极阵列。locally-shielded阵列配置可以找到未来效用connectomic研究神经元和其他电致细胞配置。

材料和方法

光刺激实验设备,10/300 nm Ti /非盟层,厚度足以光学不透明在400 - 700 nm波长范围,是溅射沉积在玻璃基板上,其次是标准光刻和湿蚀刻产量八20μm-diameter开口间距为300μm(金属)。这些职位是必要促进光(从472纳米激光),后来用来唤起HEK细胞离子电流,通过玻璃和传输的核心支柱,然后到指定的区域,而不是macro-illuminating样本(光锥的外径,从而覆盖多个传感区域)。激光测量的光锥直径∼300μm在几何,这样,只有一个地区将照亮。5日Nanoimprint光刻(NIL)然后使用μm-thick SU8光刻胶来创建一个10毫米²区域支柱数组(包含2μm直径、5μm高大的柱子在10μm hcp音高)(黎刹et al ., 2013)在这金属薄膜。后沉积一层10/120 nm Ti /非盟(作为bMEA电极金属或cMEA核心金属电极),直径10 8×8平方数组μm传感领域(包括平均三个支柱电极连接在平行)60μm使用光刻图案,和随后的湿化学腐蚀了60单独解决传感区域(即。(不包括四个角落)。这些传感领域中与上述开口light-confining金属层。原子层沉积(ALD)是用于存款225纳米厚的氧化铝层覆盖整个样本(从而钝化地址线),和光刻加湿蚀刻是用来打开洞在宏观尺度垫(线图)地区。

同轴结构的外层金属层120纳米厚度的Cr进一步沉积(作为诱导保护电极)和光刻+湿蚀刻用于模式Cr。揭露内部诱导金属以及斩首支柱促进光的传输通过2μm传感中的每个支柱的核心区域,从而允许光刺激,两个过程。SU8层剥离出来,烤成机械稳定层。接下来,一种化学机械抛光机是用来斩首支柱和标准湿化学腐蚀被用来降低铬和铝层的高度在哄核心支柱。等离子体蚀刻过程被用来降低SU8填料的高度(厚度)。为了使HEK细胞生长并包含在电极区域,PDMS liquid-confining井(5毫米直径10毫米高度)是附着在基板上,使用PDMS也。

电刺激实验,设备也对玻璃基板制造。零的过程类似于上面所描述的用于创建两个数组SU8支柱区域(10毫米²区域包含类似2μm直径、5μm 10μm距),高大的柱子与区域相隔50 mm。每个地区由一个直径20μm传感区域,含有平均七个人的支柱。传感领域被安排为七双行,每一行有一个不同的分离距离,从1000年到10μm。一个地区包含bMEA,另一个是cMEA。一个金属层(10/110 nm Ti / Au)沉积通过物理气相沉积和光刻+湿蚀刻是用于定义28单独解决传感领域的两个支柱区域总区域(56)。接下来,一个200纳米厚铝氧化层是沉积在整个样本使用“肾上腺脑白质退化症”。洞被蚀刻在氧化铝为了访问非盟层宏观垫(地址来自传感领域终止行)相应的前置放大器董事会销位置。最后,120 nm铬层沉积使用物理气相沉积。光刻用于模式cMEA地区,以便离开Cr覆盖28个传感领域和后续地址线来自每个区域。公开cMEA内心的金属,一个各向异性光刻结合后续湿蚀刻为了降低铬和铝层的高度。由此产生的外部金属内部金属高度比是0.6∼。两个塑料井的使用3 d打印机附加了PDMS含有电解质缓冲溶液(aCSF)和同轴电极区域。

在准备实验,bMEA和cMEA区域的特点是测量直流电阻(在空气中)之间的单个电极之间的裸电极区域和所有终端(内部和外部电极极间)同轴区域。典型抗性GΩ范围,说明电路中没有短裤。同轴电容的样品也是衡量,这些结果与计算值根据同轴电容的方程: $c=2\pi l\epsilon \ln \left(r_{outer}/r_{我nner}\right)$ 。测量值在计算值的10%,差异原因,部分杂散电容的无屏蔽的部分来自唱红脸。此外,设备需要消毒前细胞培养。这是通过将它们放置在一个灭菌包:一个包包含一个支架,让蒸汽通过扩大其在灭菌过程中内在的内容,然后在冷却阶段合同里面免受任何外国污染。包被在一个蒸汽高压灭菌器和一个标准的干燥过程是在100°C运行30分钟30分钟冷却阶段)。热压处理过的设备后,他们被放置在一个无菌罩直到HEK细胞可以镀(放置在设备)。

如前所述,optically-evoked场电位检测使用hek - 293转染和探讨蓝光敏感脑细胞蛋白质ChR2 (H134R) (洛伦兹,1896)。转染和文化过程,描述了在以前的工作(诺顿et al ., 2016),使用。确保细胞坚持裸电极和同轴结构中包含两个单独的PDMS井,两个设备都在一夜之间0.01%的无菌溶液poly-l-lysine孵化37°C公司5%₂。HEK-ChR2细胞从细胞培养菜肴和恢复了离心使胰蛋白酶化在4°C 595 g 6分钟。细胞在DMEM resuspended 10%的边后卫媒体包含250μg /毫升G418的密度∼10⁶细胞/毫升。0.1毫升整除的细胞被添加到一个一夜之间的同轴装置和培养37°C公司5%₂。播种密度的细胞几乎完全覆盖裸电极和同轴结构在24 - 48 h(随后的细胞培养和依从性。介质的颜色是仔细监控以确保细胞的健康。从之前的实验中,我们注意到深黄色意味着媒介需要改变,细胞过度生长。因为我们选择成功转染的细胞,我们希望整个支柱地区覆盖着HEK293-ChR2细胞以确保每个传感区域覆盖,因此是一个潜在的刺激。一次很明显有细胞过度生长(黄颜色的媒介),介质是吸气,取而代之的是新鲜的培养基。立即在这之后,设备覆盖铝箔(为了避免暴露在光刺激)和设备被带到多通道系统放大器测量。473 nm激光离散长(模型bl473 - 100 fc adr - 700 A,上海激光和光学世纪有限公司有限公司)耦合到多模光纤直径200μm (0.39 NA,托尔实验室)的光斑大小∼350μm用于照片刺激。之前将设备放置在放大器系统,激光的特点是使用相同的过程中描述以前的工作(诺顿et al ., 2016)。最大强度被发现20 mW /厘米²这个级别是在整个实验过程中使用。

bMEA发现,放置在放大器系统,和macropads与针保持一致。Ag / Cl小球放入电解液缓冲溶液作为地面,因为没有其他地面出现在该地区。60个频道都同时受到监控,以确保每个传感区域基准电压达到稳定状态。最初,数据采集程序持续运行并为上部照明激光是一致的。激光手动驱动,感动整个传感区域照明区域。这样做是为了确保细胞的积极回应。一旦细胞反应由于光学刺激在外观上得到了证实,激光是调整和附加到背后照明的显微操纵器。数据采集程序改为一个触发器捕获程序使用TTL信号(刺激发生器STG4002,多通道系统),0.5年代的方波脉冲。激光被搬到下面几个网站包含单个传感区域的面积和一个五扫试验平均在每个点(显示在执行图4和峰值平均值±标准差图5)。60个频道都在每个试验和近似激光位置监控之前提到的刺激。在整个实验过程中,可以看到变位照亮工作频道。bMEA地区,Ag / Cl颗粒再次放入电解液缓冲溶液作为地面,因为没有其他地面出现在该地区。脉冲发生器的程序被用来发送100年火车μV,间距为1 s 500 ms方波脉冲。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章。进一步询问可以针对相应的作者。

作者的贡献

MN项目的构想。约,JC, MB, MN设计实验。约和SS捏造的数组。TC和约准备hek - 293细胞。约执行设备模拟。约,合资,JC, MN进行实验。TD和KK电容响应的分析和仿真。所有作者贡献的理论和实验分析结果。约,MB, JC, MN写道。通信和申请材料应该是写给MN(电子邮件:naughton@bc.edu)。

资金

这些研究包括国家卫生研究院的基金资金MH110907 MH109545 JC。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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