多个小胶质细胞的形态学评估Deafferented脊髓三叉神经核gydF4y2Ba
Nuria Garcia-MagrogydF4y2Ba
1、2gydF4y2Ba
雅斯米娜•b•马丁gydF4y2Ba
3gydF4y2Ba
Alejandra Palomino-AntolingydF4y2Ba4gydF4y2Ba
哈维尔EgeagydF4y2Ba
4gydF4y2Ba
皮拉尔NegredogydF4y2Ba
1gydF4y2Ba
卡洛斯阿根廷gydF4y2Ba
1 *gydF4y2Ba
- 1gydF4y2Ba解剖学、组织学和神经科学,医学院,马德里自治大学、马德里,西班牙gydF4y2Ba
- 2gydF4y2Ba在神经科学博士项目,博士学校,马德里自治大学、马德里,西班牙gydF4y2Ba
- 3gydF4y2Ba医学院解剖学系,弗朗西斯科•德•维多利亚大学、马德里,西班牙gydF4y2Ba
- 4gydF4y2Ba研究单位,医院圣克里斯蒂娜大学研究院Investigacion疗养地医院de La普林塞萨港大学,马德里,西班牙gydF4y2Ba
小胶质细胞(MG)是第一个细胞异常输入信号作出反应,受伤的感觉神经和发挥重要作用的开发和维护神经性疼痛,神经损伤的常见的续集。我们目前的人口数据细胞数量,soma大小和长度的过程的MG尾的脊髓三叉神经核(Sp5C)控制老鼠和峰值的microgliosis(7天)后单侧眼眶下的神经横断(离子)。研究结合几个执行偏差,assumption-free成像和stereological方法与不同immunolabeling程序,客观的解决一些困难的问题,往往阻碍了MG的形态学研究的正确执行。我们的方法可以很容易地应用于低密度MG人口,但也适用,有限的偏见,在领土MG细胞体和过程形成致密的网状组织。控制,和侧deafferented方面,MG胞体大小和形状和分支模式匹配的描述“休息”或“监督者”MG描述其他地方,只有适度的主体间的变化。的表面薄层deafferented方面,然而,MG显示平均形状大somata和显著的多样性。细胞的数量和MG过程每毫米的长度gydF4y2Ba3gydF4y2Ba增加5和2.5倍,分别指示净减少50%的平均长度每细胞过程。通过使用特定的immunolabeling血管巨噬细胞和细胞排序,我们发现只有微不足道的一部分Sp5C这些细胞的控制和deafferented动物之间没有差异,说明血源性单核细胞在microgliosis最多玩一个非常有限的作用发生后感觉神经传入神经阻滞。总之,在这里,我们提供可靠的形态学数据在控制和MG deafferented三叉神经核使用有效的方法,我们建议可能同样适用于任何人口的形态学分析这些细胞在不同的生理或病理条件下。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
y Competitividad Ministerio德隐藏,工业,“西班牙花园gydF4y2Ba
在中枢神经系统中,小胶质细胞(MG)经典分配一个函数作为传感器的损伤和炎症和神经退行性病理事件(gydF4y2BaKreutzberg 1996gydF4y2Ba),尽管最近更多的关键角色在许多生理事件,特别是有关连接的形成特点发展和可塑性gydF4y2BaKettenmann et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba狼et al ., 2017gydF4y2Ba)。适当的刺激,MG细胞迅速增殖和转移他们的表型反应的“休息”或“监督者”各种形式的“激活”状态。这个反应,最初解释与消除细胞碎片和促进神经细胞凋亡和恢复,包括一群细胞数量的变化,形态、基因表达、细胞因子释放,和抗原概要文件演示(gydF4y2Ba阿根廷,1983gydF4y2Ba;gydF4y2BaBruce-Keller 1999gydF4y2Ba;gydF4y2Ba斯特雷特et al ., 1999gydF4y2Ba;gydF4y2BaHanisch Kettenmann, 2007gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
而刺激引发MG激活必须发生在中枢神经系统,其来源可能是其他地方。因此,当一个外周感觉神经受损,一个突出的积累MG处于活性状态,简称“microgliosis”(gydF4y2BaHanisch Kettenmann, 2007gydF4y2Ba),发展初级传入纤维在脊髓和脑干领土分配(gydF4y2Ba吉尔摩和斯金纳,1979年gydF4y2Ba;gydF4y2BaCova et al ., 1988gydF4y2Ba;gydF4y2BaGehrmann et al ., 1991gydF4y2Ba;gydF4y2Ba埃里克森et al ., 1993gydF4y2Ba;gydF4y2Ba丢掉了et al ., 1997gydF4y2Ba)。MG是第一个细胞反应本地信号来自受影响传入轴突和移动目标(gydF4y2BaKettenmann et al ., 2011gydF4y2Ba),开始一连串的事件基本开发和维护的神经性疼痛(gydF4y2Ba津田et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2Ba井上和津田,2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba卡尔沃和班尼特,2012年gydF4y2Ba),神经损伤的常见续集。需要阐明MG的细胞和分子特性是无可争议的,理解他们的不同角色的重要性是推进当前的知识组合成MG签名,使设计更有效的治疗慢性疼痛和其他障碍(gydF4y2Ba津田et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2BaHanisch Kettenmann, 2007gydF4y2Ba;gydF4y2BaEcheverry et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba卓et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaButovsky和维纳,2018年gydF4y2Ba;gydF4y2BaKohno et al ., 2018gydF4y2Ba)。然而,“激活”毫克的描述是一个具有挑战性的任务有几个原因:首先,MG的分子表型和基因表达显示显著的年龄,性别,和全区道异构性问题(gydF4y2Ba宋et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaDe Biase et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaGuneykaya et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba此外et al ., 2019gydF4y2Ba),这使得它不适宜的推断数据从一个环境到另一个未经正当验证。同时,MG应对损坏或病理的特质和上下文相关的礼仪(gydF4y2Ba哈蒙德et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba此外et al ., 2019gydF4y2Ba),通过选择克隆,最终可能是抑制在决议阶段的障碍(gydF4y2Ba泰et al ., 2017gydF4y2Ba)。,对于任何给定的损伤影响特定区域的时间必须考虑由于基因表达可能大幅改变的损伤或功能障碍。例如,脊髓神经横断后导致神经性疼痛,脊椎MG显示显著的变化在他们的基因资料第一postlesion一周,和差异表达基因分析表明微分浓缩的函数或信号通路的起始过程或触诱发痛完全表达时(gydF4y2Ba宋et al ., 2016gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
因为这些复杂性,现在普遍认为,形态本身是不足以区分所有可能的功能状态的MG,更别说当这些细胞病变或病理反应(gydF4y2Ba宋et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaHirbec et al ., 2017gydF4y2Ba)。另一方面,数量的变化、大小、形状和MG“激活”的典型特征是在一般情况下,特别是在所有情况下神经损伤实验模型(gydF4y2Babegg Salter, 2007gydF4y2Ba;gydF4y2Ba卡尔沃和班尼特,2012年gydF4y2Ba)。不出所料,形态测量学继续贡献关键参数评估MG的动力学和获得洞察其功能(gydF4y2BaTremblay et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2BaKettenmann et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaBeynon和沃克,2012年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba莫里森和Filosa, 2013年gydF4y2Ba;gydF4y2BaParada et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaOhgomori et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaLeon-Espinosa et al ., 2018gydF4y2Ba)。然而,一个最优的形态学方法产生的结果与功能意义和日益增长的效率还有待发现。这证明频繁的新方法的建议,或回顾旧的(gydF4y2Ba山田和Jinno, 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba帕洛格et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaTorres-Platas et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaFernandez-Arjona et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba莫里森et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba年轻,莫里森,2018年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba赵et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
在这个工作我们现在人口数据细胞数量,soma大小和长度的过程的MG尾的脊髓三叉神经核(Sp5C)控制老鼠和峰值的microgliosis单侧眼眶下的神经横断后(离子)。研究执行高效的多个成像和stereological方法结合不同immunolabeling程序。除了提供新的数据几乎调查问题(gydF4y2Ba埃里克森et al ., 1993gydF4y2Ba;gydF4y2Ba丢掉了et al ., 1997gydF4y2Ba;gydF4y2Ba朴et al ., 2006gydF4y2Ba),在这里,我们解决一些困难的问题,通常创建MG的测量偏差的形态学研究。此外,我们目前的数据支持,血源性单核细胞最多玩一个非常有限的作用,接下来的microgliosis感觉神经传入神经阻滞。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
实验对象和手术gydF4y2Ba
年轻人(2 - 3个月大)雄性C57BL / 6小鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 19)。所有动物程序提前通过马德里自治大学的伦理委员会依照欧洲共同体的理事会指令2010/63 /问题。适当的操作被送往减少动物的痛苦和继续使用的动物数量最低,预计将提供可靠的结果。十二种动物经历了不可逆转的单边传入神经阻滞三叉神经核设施的单方面的横断面和结扎对离子(离子)。手术在一个ip麻醉与氯胺酮的混合物(0.075毫克/克)甲苯噻嗪(0.02毫克/克)和近端和远端神经的树桩的结扎丝缝合。七动物离开完好无损(C组)。七天后,六deafferented老鼠深麻醉(Dolethal, 50毫克/公斤i.p。),并通过升主动脉灌注0.9%氯化钠(50毫升,2分钟)之后,4%多聚甲醛在0.1磷酸盐缓冲剂(PB;pH值7.4,200毫升,10分钟,10 - 12°C)。脑干是提取的,一块至少含有Sp5C核吻侧三分之二的(包括第一颈椎脊髓段和髓质obex) (gydF4y2BaGarcia-Magro et al ., 2018gydF4y2Ba)被移除,后缀相同的固定剂一夜之间,随后在30%蔗糖在PB cryoprotected 2天。三个并行控制动物被同样对待。gydF4y2Ba
其余10动物(六IoN-transected前一周,和四个控制)同样被麻醉并简要灌注(20 - 30 s)通过用无菌盐水的心。一块包含尾脑干和脊髓上部很快暴露和删除,和背外侧象限,推定地包含我们的目标区域,认真分析了立体显微镜下冷板。双方所有控件的汇集,左边的所有切断老鼠,此外,deafferented(右)以及动物。gydF4y2Ba
组织准备和疣状gydF4y2Ba
块冻,连续削减40μm在冠状平面滑动切片机。第五部分都用于自由浮动的疣状。第一个系列的部分是培养两个晚上在4°C的组合两个主要抗体,兔子anti-Iba1 (1:50 0;Wako),和鼠标anti-NeuN (1:10 0;Abcam)。经过数与生理盐水洗PB (PBS)的部分被孵化2 h在黑暗中在二级抗体的混合物:AlexaFluor 488 donkey-anti-rabbit AlexaFluor 546 donkey-anti-mouse。此外,所有原子核都贴上Bisbenzimide(宏彻)。gydF4y2Ba
第二系列加工使用avidin-biotin-peroxidase (ABC)方法与diaminobenzidine (DAB)作为底物(gydF4y2BaFernandez-Montoya et al ., 2018gydF4y2Ba)。简单地说,在PBS几个洗后,内源性过氧化物酶的失活1% HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2BaPB和预培养在阻止溶液2% Triton x - 100对1 h,部分与兔子anti-Iba-1孵化(1:50 0;Wako)一夜之间在4°C。生物素化的山羊anti-rabbit (1:50 0;Sigma-Aldrich)作为二级抗体。最后,部分在avidin-biotin孵化(ABC精英gydF4y2Ba®gydF4y2Ba装备,向量在0.02实验室)PBS Triton x - 100和2% 0.05%民建联在0.1 PB开发的0.008%氯化钴和0.0064%硫酸镍添加0.001% HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba。部分被安装在玻璃幻灯片,脱水,脱脂,并与DePeX盖玻片。gydF4y2Ba
与离子横断2例第三系列免疫荧光的部分处理如上但用老鼠anti-CD206取代anti-NeuN主要抗体(1:10 0;BioRad)。gydF4y2Ba
三维地貌形态示量分析与伊万里瓷器gydF4y2Ba
共焦三维图像获得使用z-stack函数LSM 700共焦显微镜(蔡司、从、德国)。收集图片,每间隔1μm 40×油浸物镜和分辨率为2048×2048像素。形态分析是进行3 d图像使用伊万里瓷器7.6.4软件(Bitplane、苏黎世、瑞士)。29个毫克细胞的细胞质薄片Sp5C i ii和大约放置在中间深度的组织切片和远离组织边缘选择进行分析。他们的三维重建是使用伊万里瓷器的示踪丝不允许循环执行和现场检测模式来确定开始点和结束点。虽然自动分析软件,我们单独验证,每个进程都起源于一个定义的细胞和手动删除错误的连接。伊万里瓷器提供的各种地貌形态示量参数中,只有两个(数量的主要流程和总流程长度)详细分析了使具有相同参数的比较,通过其他方法(见下文)。gydF4y2Ba
小胶质细胞的定量分析DAB-Reacted应用部分gydF4y2Ba
MG细胞体密度(gydF4y2BaNgydF4y2BaVgydF4y2Ba)和MG流程的长度密度(gydF4y2BalgydF4y2BaVgydF4y2Ba通过光学disector)估计方法(gydF4y2BaSterio 1984gydF4y2Ba)和全球空间抽样程序的各向同性虚拟飞机(gydF4y2Ba拉森et al ., 1998gydF4y2Ba),分别。每毫克细胞过程的平均长度(gydF4y2BalgydF4y2BaNgydF4y2Ba)是通过分裂gydF4y2BalgydF4y2BaVgydF4y2Ba通过gydF4y2BaNgydF4y2BaVgydF4y2Ba。所有测量都是在一个集成stereological设置,包括BX61奥林巴斯显微镜用高精度电动显微镜阶段(Proscan二世之前,前科学公司,大妈妈,美国),0.1μm决议gydF4y2BazgydF4y2Ba设在编码器,奥林巴斯DP71高分辨率摄像机(Olympus-Europa,汉堡,德国)。交互式测试网格和机动的控制试样阶段提供的NewCAST stereological软件包(Visiopharm、Hørsholm、丹麦)。gydF4y2Ba
生成虚拟的飞机,程序系统随机选择一个新的各向同性取向对所有飞机可能会出现在每一个新的视野。一个任意的距离gydF4y2BadgydF4y2Ba飞机是在20μm之间。一个抽样框固定gydF4y2BaxgydF4y2Ba,gydF4y2BaygydF4y2Ba,gydF4y2BazgydF4y2Ba维度定义,确保保护领域仍沿三个轴。通过保持不变gydF4y2BadgydF4y2Ba和盒子体积,保证采样密度是常数。一个各向同性的虚拟平面可视化为各向同性的线的2 d (gydF4y2BaxgydF4y2Ba,gydF4y2BaygydF4y2Ba),“行动”横斜的聚焦在“速度”,根据不同的倾斜平面对聚焦的方向。这个倾斜的贡献各向同性gydF4y2BazgydF4y2Ba设在。gydF4y2Ba
目标区域被定义为薄层i ii Sp5C核的腹侧一半,代表caudalmost领土受C和支配Aδ纤维离子(gydF4y2BaGarcia-Magro et al ., 2018gydF4y2Ba)。提出了该地区在planachromatic 4×干NewCAST的镜头使用绘图工具在200μm间隔五到六部分。抽样框然后系统将覆盖10%的目标地区使用planapochromatic 100×油浸物镜(奥林巴斯UPLSAPO NA = 1.4)。测试线的交点与应用毫克流程计算应用gydF4y2Ba拉森et al。(1998)gydF4y2Ba计数规则及其估计量(Eq。1)估计全球长度密度的过程为:gydF4y2Ba
在ΣgydF4y2Ba问gydF4y2Ba是十字路口的总额计算,ΣgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(飞机)是由抽样总覆盖面积的飞机,gydF4y2BapgydF4y2Ba(箱)是代表抽样框的使用点的数量(在这里,四个顶端的角落),gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(飞机)的面积抽样飞机在每个盒子,和ΣgydF4y2BapgydF4y2Ba(ref)的总额是盒子角落,参考空间。gydF4y2Ba
截面厚度gydF4y2BatgydF4y2Ba测量在每个上下关注第三个采样点。平均ΣgydF4y2Ba问gydF4y2Ba三gydF4y2BatgydF4y2Ba(gydF4y2Ba贝尔梅霍et al ., 2003gydF4y2Ba)的每个部分是用于正确的采样体积收缩的预期变化gydF4y2BazgydF4y2Ba设在。gydF4y2Ba
数值密度(gydF4y2BaNgydF4y2BaVgydF4y2Ba)的MG细胞体在目标区域估计通过使用光学disector探测器(gydF4y2BaSterio 1984gydF4y2Ba)在同一部分用于估计gydF4y2BalgydF4y2BaVgydF4y2Ba和垂直收缩也纠正。因为这些细胞的相对稀缺性(至少在控制的情况下),抽样强度在部分四倍至40%。过程的平均长度每毫克细胞被计算gydF4y2BalgydF4y2BaNgydF4y2Ba=gydF4y2BalgydF4y2BaVgydF4y2Ba/ NgydF4y2BaVgydF4y2Ba。gydF4y2Ba
估计的精度gydF4y2BalgydF4y2BaVgydF4y2Ba和gydF4y2BaNgydF4y2BaVgydF4y2Ba在每种情况下被估计的系数计算误差(CE)作为系统的随机样本的描述(gydF4y2BaCruz-Orive 1999gydF4y2Ba)。通过计算平均197十字路口和63毫克每侧细胞,意思是CEs保持在合理的低水平(分别为13.3%和8.6)。gydF4y2Ba
定量分析Immunofluorescent部分:小胶质细胞的细胞数量gydF4y2Ba
得到了共焦图像在高分辨率像素(2048×2048像素)使用gydF4y2BazgydF4y2Ba徕卡的栈函数SP5共焦显微镜在40×PlanApo油浸的目标。五连环组织学部分选择进行分析,rostralmost是位于obex尾。两张图片得到每侧和部分集中在薄层i ii,通常包括一个小肤浅Sp5C第三板的一部分。意味着组织的深度估计每个部分从顶部和底部之间的分离显示荧光光学部分配置文件。栈测量183×183×10μm由0.5μm-thick共焦部分被从10点两边分开。MG细胞体密度估计应用光学disector标准(gydF4y2BaSterio 1984gydF4y2Ba对这些栈)。gydF4y2Ba
小胶质细胞的定量分析Immunofluorescent部分:流程的长度gydF4y2Ba
Immunofluorescent细长组织组件,如纤维、轴突、树突,毛细血管,并不适合使用长度评估使用虚拟的飞机。准确检测目标结构和测试之间的相交线需要时间,这可能使重要photo-bleaching发生尤其是组织通过大功率epi-illuminated镜头下标准荧光显微镜。据我们所知,各向同性虚拟飞机没有实现共焦显微镜。gydF4y2Ba
另一个过程是在这项研究中,基于应用程序的所谓“总垂直投影”(利用状态,gydF4y2Ba1991年Cruz-Orive和霍华德gydF4y2Ba成堆的共焦图像。这种方法允许估计的总长度有限,三维有界曲线通过计算一组摆线的十字路口在几个平面投影的曲线通过旋转固定(“垂直”)轴平行于投影平面。长度估计量(Eq。1gydF4y2Ba1991年Cruz-Orive和霍华德gydF4y2Ba)是:gydF4y2Ba
在哪里gydF4y2Ba一个/ lgydF4y2Ba是测试网格常数,表示测试网格的面积对应于每个摆线弧长,gydF4y2Ba米gydF4y2Ba是垂直的线性放大的预测,gydF4y2Ba我gydF4y2BajgydF4y2Ba十字路口数的总数吗gydF4y2BajgydF4y2Bath垂直投影gydF4y2BangydF4y2Ba是垂直投影的总数。在目前的研究目标曲线的MG细胞过程中包含相同的堆栈用于细胞计数但限制4μm的深度。gydF4y2Ba
的最大gydF4y2BazgydF4y2Ba投影分析了共焦栈和加工离线使用斐济(NIH,贝塞斯达)。图像叠加和分割使用ImageJ插件为了获得最大强度的预测。五预测每个堆栈是通过旋转固定相等间隔0和180°之间垂直(gydF4y2BaygydF4y2Ba)轴(0,72,108,和144°)。旋转图像保存为TIFF文件之前stereological分析。分析了至少两个点目标地区的immunofluorescent部分相邻的两边那些immunoreacted轻拍。gydF4y2Ba
自估计长度MG细胞过程对应于一个待定的不完全采样细胞,的绝对值gydF4y2BalgydF4y2Ba将是毫无意义的。然而,长度密度(gydF4y2BalgydF4y2BaVgydF4y2Ba)的过程是一个宝贵的一阶参数,可以很容易地获得目标组织的体积估计包含在每个堆栈在0°旋转和纠正后收缩。这些估计是通过点计数(或面积测量与ImageJ组织),乘以4μm,任意固定块的深度。这个深度的小尺寸试图限制线性结构的屏蔽或重叠投影后,利用方法的最重要的限制(gydF4y2Ba1991年Cruz-Orive和霍华德gydF4y2Ba)。虽然一定程度的重叠是不可避免的,但这似乎微不足道的角度小于45和> 135°;堆栈时旋转角度接近gydF4y2BazgydF4y2Ba轴(90°)屏蔽更可观的,特别是当immunofluorescent结构丰富。这种限制可能造成一定程度的低估偏见在最后的估计长度密度,这将在稍后讨论。gydF4y2Ba
总垂直投影进行了处理和分析使用矢量图绘图软件和Photopaint(诉X3, Corel,渥太华,加拿大)。图像处理仅限于调整亮度,对比度,实现最优和伽马荧光结构的歧视。一个适当的摆线测试系统(gydF4y2Ba1991年Cruz-Orive和霍华德gydF4y2Ba;gydF4y2Ba霍华德和里德,2005年gydF4y2Ba)创建Corel Draw叠加随机位置的垂直投影(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。十字路口的摆线与荧光过程时容易识别这是薄和非——或者几乎没有重叠。用粗一点的过程是计算交叉路口中央脊柱明显的过程。在控制条件下流程和MG细胞细胞质之间的区别是不成问题的。在deafferented领土,然而,一些细胞显示宽pseudopodic-like扩展缺乏与细胞质锋利的边界,这并不包括在计数。当两个或三个过程不同gydF4y2BazgydF4y2Ba水平的垂直投影重叠摆线的交叉点,但识别作为单独的结构,支安打数相应增加的数量。gydF4y2Ba
图1所示。gydF4y2Ba摘要视图的垂直投影(利用布局(见“材料和方法”一节了解更多详细信息)。组合点,cycloid-grid铺设了一个Iba1-immunofluorescent地区感兴趣的,因为它出现在共焦4μm-thick堆栈(0°)。点是用来估算点估算区域的面积,它乘以堆栈深度(4μm)收益率估计组织量的研究。摆线曲线的交点与immunofluorescent流程计算估计长度密度。网格同样预计在四个地区的多个视图获得的系统堆栈在任意旋转,但可识别,“垂直”轴。只有两个进一步的图像来说明所示旋转视图,在72和144°。gydF4y2Ba
定量分析Immunofluorescent部分:小胶质细胞的胞体大小和数量的主要过程gydF4y2Ba
用于利用状态的图片也提供了一个方便的材料估计胞体大小和数量的主要流程MG细胞。垂直旋转(gydF4y2Ba詹森和甘德森,1993年gydF4y2Ba使用NewCAST)应用软件个人immunofluorescent毫克细胞体的概要文件所示三个等间距的旋转图像(在0、72和144°)。三个测量的平均值作为测量值为每个细胞。主要流程是单独注册的数量在旋转的应用。gydF4y2Ba
测试的激活巨噬细胞的存在Deafferented Sp5CgydF4y2Ba
共同表达的细胞免疫荧光Iba1和CD206 C或甘露糖受体1型,是搜索调查是否激活M2巨噬细胞招募从循环(gydF4y2BaGensel, 2015张gydF4y2Ba)出席在deafferented地区。gydF4y2Ba
另一个程序使用相同的目标是分别确定MG和浸润的单核细胞/巨噬细胞用流式细胞术。组织被放置在寒冷的汉克平衡盐溶液(hbs)(+钙/镁)介质(Lonza)和机械切割100年μm细胞过滤器。组织悬挂在286×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟在4°C。颗粒在胶原酶酶消化/ liberase TL (2 U /毫升)(罗氏诊断)1 h在37°C。细胞悬液与DNAse 70 -μm过滤器过滤(66 U /毫升)(罗氏诊断)。细胞颗粒在25%的密度梯度和离心机resuspended 521×gydF4y2BaggydF4y2Ba在20分钟18°C。然后,白细胞被清洗和屏蔽鼠标Fc块(eBioscience)染色之前主要antibody-conjugated荧光团:CD45-Pacific蓝色和CD11b-PE。所有抗体都是商业从eBioscience购买。生活/死歧视,可以解决的可行性染料,羧酸succinimidyl酯(CASE-AF350表达载体),稀释在施用0.3毫克/毫升的股票。数据获得在LSRII使用FACSDiva 6.0 (BD生物科学)和分析使用FlowJo (Treestar Inc .)。为每个样本没有< 20000事件记录。居民CD45小胶质细胞被确认gydF4y2BaintgydF4y2Ba/ CD11bgydF4y2Ba+gydF4y2Ba人口,而单核细胞/巨噬细胞被确认为CD45gydF4y2Ba高gydF4y2Ba/ CD11bgydF4y2Ba+gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
描述性统计(手段和SEM)三个参数进行了分析,gydF4y2BalgydF4y2BaVgydF4y2Ba,gydF4y2BaNgydF4y2BaVgydF4y2Ba,gydF4y2BalgydF4y2BaNgydF4y2Ba得到从Excel电子表格用于执行计算(微软办公专业+ 2010为Windows 10)。柱状图和图表生成使用GraphPad棱镜(v . 8.0为Windows),并使用Corel X3最终颜色或重新格式化。相同的统计分析软件。在分析正常和方差的同质性,使用学生的组间比较gydF4y2BatgydF4y2Ba以及主要流程的数量和平均体型和非参数测试剩余的变量。魏克森讯号等级测试申请成对比较和组,和未配对样本与Mann-Whitney相比gydF4y2BaUgydF4y2Ba测试。胞体大小的分布在不同侧面和组相比,两个示例Kolmogorov-SmirnovgydF4y2BaDgydF4y2Ba从所有的动物测试,池值相应的边和组。接下来的分析每一个脑干被认为是抽样单位。是水平的意义gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05,在图表示gydF4y2Ba∗gydF4y2Ba(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05),gydF4y2Ba∗∗gydF4y2Ba(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)gydF4y2Ba∗∗∗gydF4y2Ba(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
小神经胶质细胞明显染色的Iba1免疫细胞化学、免疫荧光小鼠脑干(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。他们分布相当均匀低密度在整个Sp5C,显示小细胞尸体和一些细长的主要分支,向各个方向辐射,除了那些在薄层或外板二世的一部分,这往往是面向与核的背侧表面平行。流程分支不同程度,和每个分支可以经常装修很薄,通常短流程。一周后单方面横断的离子,Iba1的免疫反应性大幅增加,反映两毫克细胞体密度的增加和扩大的密度immunolabeled流程(gydF4y2Ba图2模拟gydF4y2Ba)。microgliosis的面积扩展的吻侧端Sp5C caudalwards突然结束在脊髓水平段CgydF4y2Ba1gydF4y2Ba。毫克的“激活”是最突出的薄层i ii, iii iv,减少薄片和本质上是没有从更深层次的薄片。Medio-laterally,它覆盖了外侧核的4/5,几乎支配超过目标地区的离子传入对相邻码头地区的眼科(腹外侧)和下颌(dorsomedial)三叉神经分支(gydF4y2Ba哈亚希,1982gydF4y2Ba;gydF4y2BaJacquin et al ., 1986gydF4y2Ba;gydF4y2BaPanneton et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaFernandez-Montoya et al ., 2018gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图2。gydF4y2BaIba1 immunolabeling小胶质细胞(MG)在横截面上的降低脑干Sp5C小鼠在不同的放大控制和1星期后单侧眼眶下的神经横断(离子)。串行部分被反应要么diaminobenzidine (DAB)的免疫细胞化学和传统的光学显微镜gydF4y2Ba(A, B, E, F)gydF4y2Ba或免疫荧光共焦显微镜gydF4y2Ba(H C、D、G)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Badeafferented积累immunolabeled毫克(右)Sp5C,最为明显的薄层i ii。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba高功率的细节MG ipsi——(右)和侧一侧的离子横断案例所示面板gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba。右侧显示更高的immunolabeled细胞体密度与异构的大小和形状,更丰富的后果。gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaIba1-NeuN染色40-μm-thick堆栈的控制情况。Iba1-immunolabeled毫克的密度是均匀的薄片。gydF4y2Ba(D)gydF4y2BaImmunofluorescent 4-μm-thick栈MG显示相似的细胞数量和层流分布DAB-reacted毫克gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba在类似的位置。他们显得更加广泛分歧的,然而,这仅是部分的正确(见“讨论”部分)。gydF4y2Ba(E)gydF4y2Ba代表的“休息”MG在薄层(左)和II(中间,右)在高功率。gydF4y2Ba(F)gydF4y2Badeafferented地区“激活”MG采用更奇怪的形状,包括厚原浆扩张,都丰富地,显示更大范围的soma的大小比控制。gydF4y2Ba(G H)gydF4y2Ba共焦显微镜下,典型immunofluorescent毫克像DAB-reacted毫克相同的薄层控制gydF4y2Ba(E, G)gydF4y2Badeafferented一边gydF4y2Ba(F、H)gydF4y2Ba,而出现更丰富的分歧的。酒吧,200gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba,50gydF4y2Ba(罪犯)gydF4y2Ba,20μmgydF4y2Ba(情况)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
可测量的小胶质细胞的细胞体密度和长度的过程可能取决于Immunolabeling过程gydF4y2Ba
不同的免疫染色过程的影响进行了测试stereologically通过比较数据获得non-deafferented Sp5C。平均数值MG细胞体密度显示3%程序之间的区别可以忽略不计。然而,MG的长度密度过程是一个非常重要的大30%(双尾配对gydF4y2BatgydF4y2Ba以及,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)在immunofluorescent DAB-reacted采用免疫治疗并行部分(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。相同的模式观察治疗之间deafferented Sp5C (4%, n和26%,gydF4y2BapgydF4y2Ba分别为< 0.001)。因此,流程每个细胞不同的估计平均总长度(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
表1。gydF4y2Ba长度密度小胶质细胞(MG)过程,数值MG细胞体密度和长度的过程每个细胞(平均±SEM),排序,免疫反应类型(diaminobenzidine (DAB)或免疫荧光),和病例组(控制或眼眶下的神经(离子)切断)。gydF4y2Ba
图3。gydF4y2Ba对测量的影响不同的免疫染色程序测试non-deafferented Sp5C。长度密度小胶质细胞(MG)流程明显更大(双尾配对gydF4y2BatgydF4y2Ba以及,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)在diaminobenzidine immunofluorescent材料(如果)比(DAB)反应采用并行处理部分。相同的部分,小MG细胞体的数值密度之间的差别并不明显。尽管数据是指薄层i ii,偶尔分析第三板产生了类似的结果。gydF4y2Ba
数字三维重建个人小神经胶质细胞作为替代过程的长度估计gydF4y2Ba
MG过程测量的长度在伊万里瓷器的数字图像在两个控制情况下(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)没有显示出双方之间的差异(592±33 vs 599±31μm,左和右)。来自同样immunolabeled材料,然而,尽管这些数据显著低于27%的人口数据估计immunofluorescent部分stereologically分析虚拟飞机(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba;见“讨论”部分)。gydF4y2Ba
图4。gydF4y2Ba的例子3 d重建与伊万里瓷器的代表Iba1-immunostained小胶质细胞(MG)细胞的两个控制情况。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba重建一个适度分歧的细胞(gydF4y2BalgydF4y2BaNgydF4y2Ba= 423μm);视图稍微倾斜对外观的组织切片(插图,箭头)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba的细胞长度的过程(最高的国家之一gydF4y2BalgydF4y2BaNgydF4y2Ba= 736μm)在样本进行了研究。规模的酒吧、10μm。gydF4y2Ba
传入神经阻滞,眼眶下的神经横断引起不和谐的侧增加细胞数量和流程长度gydF4y2Ba
Iba1表达deafferented薄片i ii显示最明显的变化。这些变化的大小不同,然而,对于细胞的身体和流程长度密度。MG细胞体之间增加445 DAB-reacted采用材料)和555% (immunofluorescent材料)。密度immunolabeled过程只是增加了约250%在两种类型的标签(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。之间没有显著差异被发现在参数控制老鼠和边侧的传入神经阻滞IoN-transected动物。这种差异导致显著减少过程每个细胞的平均长度deafferented一面53个或45%,分别在DAB-reacted或immunofluorescent组织(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图5。gydF4y2Ba眼眶下的神经横断(离子)对过程的影响长度(gydF4y2BalgydF4y2BaVgydF4y2Ba),数值密度细胞(gydF4y2BaNgydF4y2BaVgydF4y2Ba),和长度的过程/小胶质细胞(MG)细胞(gydF4y2BalgydF4y2BaNgydF4y2Ba)。值deafferented方面比较集中值non-deafferented侧和控制和表达为整体的平均百分比。紫色的,数据从diaminobenzidine (DAB)反应材料;绿色,immunofluorescent组织的数据。gydF4y2Ba
Deafferentation-Induced Microgliosis需要标记细胞的身体形状和大小的变化gydF4y2Ba
毫克的出现在控制的情况下(和侧到deafferented断掉的情况下)忠实地重现经典的描述“休息”或“监督者”MG在脑干和其他地方(审查gydF4y2BaKettenmann et al ., 2011gydF4y2Ba):从卵圆形、梭形或三角形,小细胞为主的身体出现三到六个主要分支分为二、三阶,不经常到高阶分支。薄,filopodia-like过程通常出现在任何地方的分支机构以及偶尔的球状隆起,可以达到相当大的规模(soma附近gydF4y2Ba图2 e, GgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
deafferented地区“激活”MG展示各种各样的形状,从小型细胞体与几个主要过程(一个小比例)更大的细胞(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba),著名的细胞质扩展和丰富的分支,通常短和没有任何优先定位(gydF4y2Ba图2 f、HgydF4y2Ba)。不包括在计算厚细胞质扩展,主分支的数量超过重复那些控制stereology-based材料(9.0±0.2和4.1±0.1,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)和伊万里瓷器的重构(4.0±0.2)。自由,“变形”类型配置文件很少被发现。gydF4y2Ba
图6。gydF4y2Ba根据胞体分布的小胶质细胞(MG)大小,分为16类,在50到800μmgydF4y2Ba3gydF4y2Ba在50岁μmgydF4y2Ba3gydF4y2Ba增量步。值从MG在三个控件(gydF4y2BangydF4y2Ba从MG = 110)都集中值在三个deafferented Sp5C (gydF4y2BangydF4y2Ba= 283)。MG胞体大小平均deafferented地区大67%(249±118和149±74μmgydF4y2Ba3gydF4y2Ba平均数±标准差)。细胞大小分布不同组间显著(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001,Kolmogorov-SmirnovgydF4y2BaDgydF4y2Ba以及)。gydF4y2Ba
Iba1-Expressing细胞Deafferented Sp5C对应于小胶质细胞,巨噬细胞浸润gydF4y2Ba
有限数量的细胞概要强烈标记deafferented CD206出现在双方的情况。他们中的Iba1和总是位于接近原生abluminal小血管表面,建议他们可以对应的一个子集血管周的巨噬细胞(gydF4y2BaLapenna et al ., 2018gydF4y2Ba)。Iba1越强烈gydF4y2Ba+gydF4y2Ba实质细胞典型的MG CD206形状gydF4y2Ba+gydF4y2Ba无论是deafferented薄片或其他地方(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。一致,我们的流式细胞仪分析显示,只有一小部分的细胞表达CD11b,骨髓细胞谱系的常见标志,也表达了CD45的高水平,这在一起,单核细胞/巨噬细胞细胞类型。这些水平是基本相同的控制和deafferented情况下(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图7。gydF4y2BaCo-localization Iba1(绿色)和CD206(红色)在假定的血管周的巨噬细胞接近原生的abluminal表面小血管(箭头),血管的上面和下面。合并后的图片和右边正交XZ和YZ预测包括bisbenzimide核染色(蓝色)。酒吧、规模20μm。gydF4y2Ba
图8。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba代表控制流仪分析脑干的策略。汗衫在FSC-A封闭gydF4y2Ba与gydF4y2BaFSC-H和活细胞被封闭(上)。CD45gydF4y2BaintgydF4y2Ba(小胶质细胞)和CD45gydF4y2Ba高gydF4y2Ba基于CD45染色的免疫细胞是封闭的gydF4y2Ba与gydF4y2BaCD11b,细胞表面抗体用于识别骨髓细胞(底部)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba阳性细胞百分比(小胶质细胞CD45gydF4y2BaintgydF4y2Ba/ CD11bgydF4y2Ba+gydF4y2Ba和单核细胞/巨噬细胞CD45gydF4y2Ba高gydF4y2Ba/ CD11bgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)控制,deafferented动物。值代表的阳性细胞百分比从池尾脊髓三叉神经核四(控制,两国)和六个动物(ipsi——传入神经阻滞和侧)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在这项研究中我们描述的基本的形态学参数Iba1-immunolabeled MG在三叉神经核的尾部门复杂控制microgliosis诱导的小鼠和鼎盛时期传入神经阻滞由于单边离子横断。由不同的图像分析所有参数估计和stereological方法适合使用的免疫染色过程(DAB-reacted、透射光显微镜或免疫荧光共焦显微镜)和目标结构的类型,旨在(单一细胞MG或人口数据在一个给定的地区)。测量assumption-free有关结构的大小、形状、方向和代表3 d值。总的来说,MG细胞密度的表面薄层deafferented Sp5C MG过程增加了五倍,密度增加2.5倍,揭示净减少50%的平均长度每细胞过程。MG细胞体的大小和形状和初始分支模式显示只有温和的可变性控制和IoN-transection侧。在deafferented方面,然而,MG显示平均形状大somata和显著的多样性。虽然我们不能丢弃一些MG可能激增外,然后迁移到microgliosis的面积,先前的研究显示时间的MG deafferented地区扩散以及相似性MG ipsi——和其他地方的侧方在我们的研究表明,扩散和迁移deafferented区域内大多是当地的现象。我们还提供证据表明,绝大多数Iba1-expressing细胞数毫克似乎因为没有浸润的巨噬细胞中控制或deafferented核,和相对罕见Iba1 CD206-expressing细胞不同形状,附在血管和缺乏流程。gydF4y2Ba
小胶质细胞形态计量的尚未解决的挑战gydF4y2Ba
了解塑料的兴趣和动态MG结构告知在斑驳的角色,这些细胞在健康和病理学并没有停止生长在过去几年。形态学方法不断在发展,因此,试图克服多重困难遇到当试图提取准确的定量数据从这样一个复杂的结构合理的效率(gydF4y2BaBeynon和沃克,2012年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科兹洛夫和魏玛,2012年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba帕洛格et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaTorres-Platas et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba年轻,莫里森,2018年gydF4y2Ba)。最新的方法包括分割(主要集中在阈值)和数字图像的骨架化和手动或半自动跟踪和重建immunolabeled细胞。这些方法的目标,理想情况下,个人和完全染色细胞。为gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba模型,如海马片、包埋视网膜准备,延时提供优秀的量化方法研究单个细胞运动性和过程拉伸/收缩(gydF4y2Ba支顶木材et al ., 2001gydF4y2Ba;gydF4y2Ba李et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2BaDamani et al ., 2011gydF4y2Ba)。体视学设计,到目前为止,一直局限于细胞计数(gydF4y2Babegg Salter, 2007gydF4y2Ba;gydF4y2Ba吴et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba帕金斯et al ., 2018gydF4y2Ba),最近,一直在某些有利条件与数字结合起来细胞跟踪(gydF4y2BaPapageorgiou et al ., 2015gydF4y2Ba)和先进的自动分割算法(gydF4y2BaAhmady Phoulady et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
然而,这些方法能够处理满意所有的困难造成MG形态测量学,即使第一个条件的一致性和可靠性数据,高质量的组织处理,和显微镜。简要概述,单个细胞重建是很难或者不可能获得从密集的MG和风险严重偏见当细胞过程并不完全包含在重建,或者当监督或无监督跟踪错误地分配过程为一个给定的细胞。最常MG过程测量从组织部分薄足以保证完全渗透immunolabeling但不能确保的整个过程中包含的部分。从细胞里大概完全标记毫克很厚(200μm)片,平均相对各向同性的线性跨度细胞达到至少60 - 90在不同的大脑区域μm (gydF4y2BaHayashi et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaDe Biase et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaLeon-Espinosa et al ., 2018gydF4y2Ba)。此外,抽样应该没有偏见,以免最大和最明显的细胞有一个不成比例的高概率抽样。gydF4y2Ba
我们stereological设计方法提供无偏抽样细胞体和流程。单独stereological估计过程的长度密度,没有尝试过,在这里定制DAB-reacted和immunofluorescent材料。谨慎,有些字是为了:(1)即使使用尽可能多的放大,DAB-based光材料分析和虚拟飞机措施流程长度的收益率为30%低于immunofluorescent部分与利用分析,差异可以归因于低灵敏度非常薄轻拍信号的过程和/或更高性能的激光源激发甚至少量的荧光分子。更大的差异(58%)最近报道gydF4y2Ba年轻和莫里森(2018)gydF4y2Ba应用一个ImageJ插件来衡量二进制和场大病共焦图像主要是由于DAB-based值的显著减少。(2)Imaris-based数字重构控制MG相比,利用了长度值高出27%,这可能是由于细胞的不完全性乔木重建伊万里瓷器。(3)的十字路口摆线与标记过程使用利用落在部分旋转> 45°由于重叠,这可能导致一个长度密度的低估。这是一个小问题在控制材料但可以与重microgliosis充实区域。(4)在利用可以很容易地应用不需要特殊设备(除了优质共焦显微镜),虚拟飞机和光学旋转需要stereological设置提供测试网格和软件执行所需的计算相应的估计。(5)有限的实习培训,然而,结果回报:独立分析由两位作者(CA和NG-M)相同的部分在两个案例中,一个控制和一个IoN-transected,取得了优于97%的协议评估细胞数和流程长度密度控制,和协议流程长度密度比89% deafferented Sp5C。结果类似于DAB-based和immunofluorescent材料。gydF4y2Ba
的时空特性Deafferentation-Induced MicrogliosisgydF4y2Ba
周围神经损伤后,microgliosis,所定义的细胞数量的增加,胞体增大,增厚的过程,已经明显deafferented脊髓或脑干区域(gydF4y2Ba埃里克森et al ., 1993gydF4y2Ba;gydF4y2Ba丢掉了et al ., 1997gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科伊尔1998gydF4y2Ba)4天postlesion postlesion 7天达到最大值。脊髓横断后背角的腰椎神经MG进入迅速增殖的破裂,发生在24 - 96小时时间窗,达到48-60 h postlesion (gydF4y2Ba刘et al ., 2000gydF4y2Ba;gydF4y2Ba顾et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaKohno et al ., 2018gydF4y2Ba)。这MG反应并不局限于传入神经阻滞由于外周传入的损失。早期研究显示类似的增殖模式在部分传入神经阻滞后的海马结构损伤的穿甲弹路径或连合预测(gydF4y2Ba阿根廷和考恩,1979年gydF4y2Ba;gydF4y2BaGall et al ., 1979gydF4y2Ba;gydF4y2Ba阿根廷,1983gydF4y2Ba)。此外,在早期增殖MG deafferented以外的地区出现,过去增生性破裂MG直接迁移到集中在deafferented领土和紧密相邻区域(gydF4y2BaGall et al ., 1979gydF4y2Ba;gydF4y2Babegg Salter, 2007gydF4y2Ba;目前的结果)。表面薄层的明显偏好microgliosis i ii可能揭示一个密集分布的累加效应在这些薄片nociception-related薄无髓鞘的传入纤维(gydF4y2BaFernandez-Montoya et al ., 2018gydF4y2Ba),考虑到更大的敏感性小神经节三叉神经节神经元末梢轴索显微外科术(gydF4y2BaLagares et al ., 2007gydF4y2Ba),推定地更大一部分纤维过程中不可逆变性。gydF4y2Ba
血源性单核细胞不会导致神经损伤诱导Microgliosis Sp5CgydF4y2Ba
激活居民毫克的共存和血源性巨噬细胞浸润是一种常见的发现在炎症和大脑和脊柱退行性疾病,和努力都被要求区分这些细胞类型和不同分子和基因表达在不同的稳态和病理条件下(评论,请参阅gydF4y2Ba贝et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba楚et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba大卫et al ., 2018gydF4y2Ba)。如果这样的共存也发生在deafferentation-induced microgliosis,一些作者偏爱的一个视图(gydF4y2BaEcheverry et al ., 2011gydF4y2Ba),它将要求澄清的贡献每个细胞类型的形态学数据收集。然而,最近的数据使用骨髓嵌合小鼠和双转基因小鼠,允许特定的染色的细胞类型,强烈支持缺乏重要的循环单核细胞浸润周围nerve-dependent microgliosis (gydF4y2Ba顾et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaTashima et al ., 2016gydF4y2Ba)。这也是支持我们未能找到Iba1-immunolabeled细胞coexpressing CD206, M2巨噬细胞的良好标记(gydF4y2BaGensel, 2015张gydF4y2Ba),除了血vessels-attached假定的血管周的巨噬细胞以及流式细胞仪获得的结果,我们发现没有CD45的差异gydF4y2Ba高gydF4y2Ba/ CD11bgydF4y2Ba+gydF4y2Ba在控制和deafferented动物细胞。因此,我们可以得出这样的结论:巨噬细胞浸润不会导致当地microgliosis,至少在第一次神经损伤后2周。gydF4y2Ba
这里提出的方法适用于其他地方的小胶质细胞:一种新颖的提议小胶质细胞的形态测量学gydF4y2Ba
毫克的果断介入三叉神经痛的发病机理(gydF4y2Ba津田et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2Ba苏特et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba卡尔沃和班尼特,2012年gydF4y2Ba;gydF4y2BaDaigo et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba顾et al ., 2016gydF4y2Ba)是本研究首先开车。此外,新兴的困难来定量评估MG的形态变化在不同的模型使我们专注的研究模型更严重的去神经的Sp5C microgliosis,引起突出。我们的方法相对容易适用于低密度MG人口还工作,有限的偏见和显著程度的精度和效率,在领土MG细胞体和过程形成致密的网状组织。总而言之,我们相信,这里可以扩展程序划定了任何的形态学人口MG不同生理或病理条件下的分析。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
在这项研究中生成的数据集是可在请求相应的作者。gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
动物研究回顾和批准的马德里自治大学的伦理委员会,依照欧洲共同体的理事会指令2010/63 /问题。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
CA和NG-M最初的生物研究理念和执行体视学和图像分析。NG-M和YM大多数实验过程进行。NG-M负责组织数据采集,和相应的结果分析了NG-M, CA, PN。AP-A和我进行流式细胞仪进行了分析研究。CA、NG-M和PN主要是负责撰写这篇文章。所有作者参与了讨论和批准最后的手稿。gydF4y2Ba
的利益冲突gydF4y2Ba
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
这项工作是支持的西班牙Ministerio de隐藏工业y Competitividad /洋底Europeo de Desarrollo区域Europeo de Desarrollo区域(MINECO /菲德尔),格兰特BFU2015−66941 r。NG-M收到了勃林格殷格翰集团昏聩旅行格兰特教授短期呆在赫尔穆特•Kettenmann Max-Delbruck中心的实验室(柏林)。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢服务共焦显微镜的大学医院的“拉巴斯”(IDIPAZ,马德里)免疫荧光成像。同时,伊万里瓷器重建获得的先进的光学显微镜技术平台Max-Delbruck中心(柏林),康斯坦丁Grohmann的建议是有很大的帮助。gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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关键字gydF4y2Ba:背角microgliosis Iba-1 CD11b、CD45、CD206,体视学,流式细胞术gydF4y2Ba
引用:gydF4y2BaGarcia-Magro N,马丁YB, Palomino-Antolin Egea J, Negredo P和阿根廷C(2020)多个小胶质细胞的形态学评估Deafferented脊髓三叉神经核。gydF4y2Ba前面。Neuroanat。gydF4y2Ba13:103。doi: 10.3389 / fnana.2019.00103gydF4y2Ba
收到:gydF4y2Ba2019年10月18日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2019年12月16日;gydF4y2Ba
发表:gydF4y2Ba2020年1月22日。gydF4y2Ba
编辑:gydF4y2Ba
阿尔贝托·穆尼奥斯gydF4y2Ba西班牙马德里大学,gydF4y2Ba审核:gydF4y2Ba
Jon Storm-MathisengydF4y2Ba挪威奥斯陆大学gydF4y2Ba艾瑞卡StrettoigydF4y2Ba意大利国家研究委员会(CNR),意大利gydF4y2Ba
Luis Miguel Garcia-SeguragydF4y2Ba西班牙,西班牙国家研究委员会(CSIC)gydF4y2Ba
版权gydF4y2Ba©2020 Garcia-Magro,马丁,Palomino-Antolin、Egea Negredo和阿根廷。这是一个开放分布式根据文章gydF4y2Ba知识共享归属许可(CC)gydF4y2Ba。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2Ba卡洛斯阿根廷,gydF4y2Bacarlos.avendano@uam.esgydF4y2Ba