原始研究的文章

前面。Neuroanat。,20 December 2019
卷13 - 2019 | https://doi.org/10.3389/fnana.2019.00100

谷氨酸和GABA受体的发展变化在Wistar鼠密度

塞布丽娜Behuet ^{1 *}

詹妮弗·克莱莫 ¹

马库斯·克莱莫 ¹

尼古拉Palomero-Gallagher ^1、2

卡尔齐勒 ¹

凯特琳Amunts ^1、2

¹神经科学和医学研究所(INM-1), j研究中心,德国j
²塞西尔和奥斯卡·沃格特大脑研究学院,医学院,海因里希·海涅大学,德国的杜塞尔多夫

神经递质及其受体信号转导和主题的关键分子和产后期间各种变化发展。先前的研究解决个体发生的神经递质和神经递质受体亚单位的表达。然而,发展变化的受体密度这一天不是很好理解。在这里,我们分析了发展变化谷氨酸兴奋性和抑制性γ-aminobutyric酸(GABA)受体在老鼠大脑的相邻部分的定量在体外受体放射自显影法。受体的密度ionotropic glutamatergicα-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic酸受体(AMPA) kainate和n -甲基- d (NMDA)以及ionotropic GABA的_一个和metabotropic GABA_B使用特异配体受体进行调查。对于每个受体结合位点,重要的密度差异在感兴趣的调查地区[嗅球、纹状体、海马和小脑]和发育阶段(产后一天(P) 0、10、20、30和90]。特别是,我们表明,glutamatergic和gaba ergic受体密度之间已经存在P0, P10感兴趣的所有地区,这可能表明相关性这些受体的早期大脑发育。瞬态增加glutamatergic受体密度在海马体被发现,表明其可能参与突触可塑性。我们演示了下降的纹状体和海马NMDA受体密度P30 P90,这可能是由于突触消灭,一个重新定义的过程神经元网络在产后的大脑。此外,增加GABA最高_一个受体密度从P10 P20正值发育由兴奋转向抑制GABA传播。此外,从P10增加GABA P20_一个受体密度在小脑对应于一个时间点功能gaba ergic突触形成。综上所述,目前的数据显示微分谷氨酸和GABA受体密度的变化在产后老鼠大脑的发展过程中,这可能导致他们的特定功能在个体发育过程中,从而提供一个深入了解大脑的个体发育和受体功能。

介绍

大脑发育的特点是各种各样的分子、细胞、结构以及功能改变底层的运动和认知能力在个体发育与环境和日益复杂的交互。神经递质及其受体信号转导的关键分子。神经递质谷氨酸和γ-aminobutyric酸(GABA)特别感兴趣的是在这种背景下,由于他们是兴奋和抑制之间的平衡的关键成分,都扮演了很重要的角色在不同的流程与大脑发育有关。例如,谷氨酸受体参与神经元迁移和突触发生(Lujan et al ., 2005)以及突触可塑性,因此在记忆和学习过程的调制(格兰杰et al ., 2013;格兰杰,Nicoll 2014)。GABA受体参与控制成年神经发生(Giachino et al ., 2014),神经元迁移(Lopez-Bendito et al ., 2004;Gaiarsa宝卓,2013)以及学习和记忆(希尼和Kinney, 2016)。除了个人角色的谷氨酸和GABA受体,它们是硝唑在许多大脑区域(Lujan et al ., 2005)及其平衡的互动是一个正常的大脑发展关键因素(留在台上,Represa 2007;Luhmann et al ., 2015)。失衡在谷氨酸和GABA损害大脑功能,可能导致大脑病理学,例如癫痫(奈勒,2010)和创伤后压力心理障碍症(高et al ., 2014)。因此,神经递质系统的分析通过一组全面的不同的受体类型必须得到一个了解他们在哺乳动物的大脑复杂的相互作用。

根据他们的药物受体激动剂,有三种类型的ionotropic谷氨酸受体:α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic酸(AMPA) kainate和n -甲基- d (NMDA)。AMPA受体cation-selective ionotropic受体调节的大多数哺乳动物大脑中快速兴奋性神经传递和参与突触可塑性(胡格尼尔教授和Nicoll, 2013年;周et al ., 2018),例如,在小脑运动学习过程(卡诺和加藤,1987)。此外,他们在兴奋性突触的形成起到至关重要的作用,稳定和神经回路的形成由于AMPA受体的数量和性质的变化亨利和威尔金森,2016)。AMPA受体位于整个大脑的神经元和神经胶质膜,例如,少突胶质细胞和星形胶质细胞(Petralia Wenthold, 1992;马丁et al ., 1993)。

Kainate受体参与海马苔藓纤维可塑性(短期和长期承包商et al ., 2001)和迅速变化的交易可能会改变突触传递在突触可塑性和神经发展(简et al ., 2009)。除了他们的参与突触后传输,导致神经元兴奋性突触传递的调制和(简et al ., 2009;承包商et al ., 2011)。

门冬氨酸受体有很高的Ca^{2 +}磁导率,这对突触可塑性的调节(很重要刘et al ., 2009)。更准确地说,长期势差现象的归纳(LTP)海马的CA1神经突触(穆勒et al ., 1988;Zakharenko et al ., 2001),或嗅觉学习(林肯et al ., 1988)是依赖于NMDA受体激活。此外,他们参与双向变化,包括认知、神经细胞分化和发育中的大脑突触整合(麦当劳和约翰斯顿,1990年;Planells-Cases et al ., 2006)。有趣的是,NMDA受体密度和亚基表达水平变化的发展(劳里et al ., 1997;文策尔et al ., 1997),从而使它们的相关目标个体发育的研究。

神经递质的GABA和激活GABA受体结合。伽马氨基丁酸_一个GABA受体调节快反应,主要是渗透Cl⁻,参与突触可塑性改变跨膜Cl⁻梯度,从而影响突触强度(Raimondo et al ., 2012;黄et al ., 2013)。在早期大脑发育,伽马氨基丁酸_一个第一次作为兴奋性神经递质由于细胞内高于细胞外Cl⁻浓度,随后改变行动,抑制由于减少细胞内Cl⁻水平第一次产后一周后(Cherubini et al ., 1991;里维拉et al ., 1999)。有趣的是,第一个突触形成和胚胎中枢神经系统中激活gaba ergic (Khazipov et al ., 2001)。此外,GABA的参与_一个受体在记忆形成或巩固(等认知过程莫赫勒,2009),焦虑和记忆之间的联系(Kalueff和纳特,1996年GABA之间),以及_一个受体亚基表达和水迷宫性能作为空间学习的任务(歌et al ., 2002)表示。因此,关于改变GABA的知识_一个受体密度在大脑发育可能有助于更好的理解其具体在个体发育中的作用。伽马氨基丁酸_B受体调节Ca^{2 +}和/或K⁺膜通道电导和释放神经传递素,从而可以抑制神经活动(乌尔里希,把你,2007年)。他们的抑制作用是缓慢和持久与GABA相比_一个抑制(西蒙尼et al ., 2003),发现在预处理和海马的突触后网站(Lopez-Bendito et al ., 2004)。它们参与大脑发育通过控制成年神经发生(Giachino et al ., 2014)和神经元迁移(Lopez-Bendito et al ., 2004;Gaiarsa宝卓,2013)。此外,伽马氨基丁酸_B受体也一直在与学习和记忆过程,审核希尼和Kinney (2016)。例如,伽马氨基丁酸_B1a和GABA_B1b受体淘汰赛中受损在工作记忆任务的性能,表明伽马氨基丁酸_B1为正确的任务绩效(受体亚型是必不可少的雅各布森et al ., 2007;希尼和Kinney, 2016)。神经递质水平的分析,一般来说,表明谷氨酸和GABA丰富和广泛的前和产后的大脑(Miranda-Contreras et al ., 1999;Miranda-Contreras et al ., 2000)。

然而,尽管先前的研究集中在个体发育的改变受体功能,单元星座和绑定属性,我们的理解仍然是不完整的,例如,对区域密度差异和时间间隔的不同表达水平(Insel et al ., 1990;Pellegrini-Giampietro et al ., 1991;Miranda-Contreras et al ., 2000)。增加纹状体AMPA受体密度在从P1 caudate-putamen P7透露,其次是略有增加,达到峰值P28 (Insel et al ., 1990)。此外,微分海马条件的变化显示,随着密度在P28 CA1和DG达到顶峰,而密度在好CA3达到顶峰,随后的减少,直到P60 (Insel et al ., 1990)。此外,LTP与AMPA受体密度增加几个观察皮质和海马条件在老鼠表现出LTP接收高频θ破灭后刺激穿甲弹通路(Tocco et al ., 1992)。夏和哈达德(1992)证明了GABA_一个受体密度在小脑和吻侧大脑皮层等脑区,丘脑,和齿状回随着年龄的增加,尤其是P10之间和P21,而没有发现显著增加纹状体和海马CA1区(夏和哈达德说,1992)。伽马氨基丁酸_B受体密度的纹状体和海马在P7达到顶峰,显著降低P28成年人。总的来说,这些发现表明在个体发生复杂的区域性特定的变化模式。

因此,本研究个体发生的地址改变不同的谷氨酸受体类型和GABA使用定量在体外受体放射自显影法”来形容他们的详细地区发展模式的变化。为此,邻近部分相同的老鼠的大脑被用来分析谷氨酸和GABA受体,从而使直接比较而消除inter-subject和首次系统的差异。与个体发育的早期研究主要用于非特异性或低亲和力(³H)配体,目前的研究集中在特定的(³H)与高亲和力配体各自的神经递质受体。我们研究他们感兴趣的密度在以下区域(roi):嗅球(OB)纹状体(caudate-putamen、CPu),海马(臀部)和小脑(Cb)在多个发展阶段(产后一天(P) 0、10、20、30和90年)。彩色图像结合的光密度分析放射自显影图启用特定解剖映射的受体密度变化在不同的大脑区域。

材料和方法

动物

根据德国的所有实验动物福利法案,批准的政府机构负责,LANUV北威州(地方政府对自然、环境和消费者保护北威州,德国)。所有的动物都在标准实验室条件下提供食物和水随意。

在目前的研究中,我们使用共有25 Wistar鼠(查尔斯河、德国),有5个动物被分配给每个年龄组:产后一天0 (P0;体重的10±1 g), P10 (24±2 g体重),P20 (50±3 g体重),e(105±6克体重)和P90 (250±10 g体重)。P0, P10老鼠斩首没有镇静,根据德国动物福利法案。P20 P30和P90老鼠镇静的二氧化碳(有限公司₂)吸入和随后斩首。P0头立即冰冻在−50°C异戊烷,并存储在−80°C。P10, P20 P30和P90的大脑立即从头骨,半球分离,冰冻在−50°C异戊烷,并存储在−80°C。只有左半球是用于本研究。

表1

表1。受体结合协议glutamatergic和gaba ergic [³H)配体,包括置换剂(标有*)和孵化条件。

组织处理

组织连续切片(20μm截面厚度)在冠状面−13°C使用低温恒温器切片机(德国徕卡)。对于每个动物和ROI,我们准备六个部分autoradiographic实验(五部分的总绑定和一段不具体的绑定,见下文)组织学染色和五个部分。每个部分是安装在pre-cooled,使硅烷化载玻片和干在37°C加热板30分钟。部分被保存在真空包装塑料袋在−冰箱80°C,直到他们用于组织学甲酚紫染色或量化在体外受体放射自显影法(齐勒et al ., 2002;Palomero-Gallagher et al ., 2003;Palomero-Gallagher和齐勒,2018年)。

定量在体外受体放射自显影法

受体结合位点的glutamatergic AMPA, kainate GABA ergic GABA和门冬氨酸受体_一个和GABA_B受体被贴上使用先前描述的协议(齐勒et al ., 2002,2004年;Palomero-Gallagher和齐勒,2018年)。各自的氚标记的配体(³H] AMPA, [³H]红藻氨酸(³H] mk - 801(+)和(³H] SR 95531买来PerkinElmer(德国)、和(³54626 H)本金保证产品从Biotrend获得(德国)。

受体autoradiographic方法包括三个步骤。在pre-incubation,部分患者和内源性配体被冲毁。在主孵化,两个不同的协议是用于确定特定的绑定:一个用于绑定,其中部分被称为只与氚化受体配体时,和一个非特定的绑定,一个特定的标记置换剂还补充说。最后,部分接受缓冲区的清洗步骤停止绑定过程通过消除多余的氚标记的配体。门冬氨酸的可视化,伽马氨基丁酸_一个和GABA_B受体,这一步之后,在蒸馏水冲洗冲洗缓冲盐。的AMPA受体kainate,缓冲的清洗步骤之后,2.5%戊二醛/丙酮固定。总结了具有约束力的协议的细节表1。

以下选择感兴趣的区域由于各自的角色在学习和记忆过程:嗅球、纹状体、海马和小脑。先前的研究显示出嗅球之间的联系,记忆和情感(Jaako-Movits Zharkovsky, 2005)。在别人,纹状体是重要的身体运动和援助的潜在参与工作记忆(帕卡德和诺尔顿,2002年)。海马体中扮演一个重要的角色在短期和长期记忆的形成以及空间导航(亨特et al ., 1999),而小脑参与控制运动功能和运动学习,也称为隐式学习(Timmann et al ., 2010)。

组织学

为了定位和分析感兴趣的区域通过光学显微镜以及放射能照像,尼氏小染色与甲苯基紫罗兰。冷冻后老鼠大脑部分是适应于室温,他们在4%中性缓冲福尔马林固定30分钟。随后,部分在蒸馏水洗15分钟,然后孵化0.1%甲酚紫染色溶液至少5分钟。在蒸馏水冲洗后几秒钟,他们分化70%异丙醇。随后被脱水的部分增加异丙醇浓度(80%,90%,96%,100%),每1分钟。最后,部分被放置10分钟的媒介XEM二甲苯(代理),然后用DPX盖玻片(Distrene、增塑剂、二甲苯)。尼氏小彩色部分是数字化与高分辨率图像的彩色摄像机(~ 5μm),用一个敏感的ccd传感器(德国卡尔蔡司显微镜GmbH)。

图像采集和数据分析

氚标记的部分与微尺度co-exposed已知的放射性浓度对成像板(富士胶片公司(日本)h。72年博览会之后,成像板与BAS 5000能分析仪系统进行扫描(富士胶片公司、日本)。

AIDA图像分析仪v.4.13软件(德国Elysia-raytest GmbH)是用于随后的放射自显影图光密度分析。灰色的背景值成像板和微尺度(浓度按升序)在AIDA图像分析仪测量v.4.13软件计算线性回归曲线。这些是必要的转换强度单位面积(PSL /像素)在每个ROI成相应浓度的放射性最后受体密度(fmol /毫克蛋白)。受体密度加以平均每五部分动物,受体类型和ROI,平均值也因此获得了每个受体亚型。

roi分析,我们将原来的放射自显影图与彩色图像,邻近的尼氏小染色部分和Paxinos沃森老鼠大脑图集(Paxinos和华生,2005年),以确保我们尊敬的边界相邻的脑区(图1)。嗅球、海马和小脑分析完全没有考虑条件或层,因为他们的边界不容易辨认的由于分辨率的成像板有限,尤其是在P0, P10动物的大脑。因此,定量分析可能是容易出错,即使似乎在观察到视觉上的差异。举一个例子:GABA的彩色放射自显影图_一个老鼠大脑受体密度在P20透露,齿状回分子层有一个受体密度高于的锥体层CA1和CA2/3区域(图1)。然而,它是不可能认识到这些边界P0, P10大脑这些地区只占领了几个像素。

图1

图1。的部分从P20老鼠大脑的海马水平(一)autoradiographic图像的³GABA H] SR 95531绑定_一个受体,(B)autoradiographic形象相同,各自的彩色图像(C)一个相邻的尼氏小染色部分。Paxinos和沃森老鼠大脑图集(Paxinos和华生,2005年)是用于验证感兴趣的区域。

产后阶段之间的显著差异分析每个受体类型分别使用方差分析(方差分析)和随机区组设计作为一个综合测试的发展阶段是作为分析因素和大脑区域之间的一个内部因素。的一个重要结果,分析了roi单独为每个受体类型。的一个重要结果,第二个方差分析(没有定义因素)紧随其后事后t测试来识别区域显示显著的发展变化。阈值被设定为p< 0.05,方差分析测试的结果Bonferroni纠正。

为了说明受体密度的地区差异在不同的发展阶段,放射自显影图是使用MATLAB增强对比度,颜色^®软件(MathWorks,德国)。一个颜色条,分为11个等距的密度范围,编码受体密度fmol /毫克的蛋白质。

结果

受体放射自显影法和随后的光密度分析显示密度的变化对谷氨酸和GABA受体在出生后大脑发育。几乎所有的roi,显著的变化被发现每个受体类型分析。大多数受体的密度30产后第一天内达到高峰,GABA除外_一个在P90受体密度,达到最高的值。的柱状图图2显示受体密度(平均值和标准偏差在fmol /毫克蛋白;每个年龄段的代表n= 5)glutamatergic AMPA, kainate和NMDA受体,以及GABA ergic GABA的_一个和GABA_B受体。相邻年龄组之间的显著差异(例如,比较P0 P10,然后P10 P20,等等)和P0和P90之间。的颜色代表rostrocaudal水平为每个地区的放射能照像和受体类型进行描述图3。

图2

图2。条形图描绘的意思(标准差)glutamatergic和gaba ergic受体密度fmol /毫克蛋白在不同发展阶段(产后的一天:P0, P10, P20, e和P90;每个年龄段的代表n= 5)和大脑不同区域(嗅球、纹状体、海马和小脑)。显著差异由星号(*表示p< 0.05或* *p< 0.01)。

图3

图3。典型截面代表rostrocaudal水平检查大脑区域(嗅球(OB)纹状体(caudate-putamen、CPu),海马(臀部)和小脑(Cb)]描绘彩色autoradiographic glutamatergic和gaba ergic受体密度的图像以及图像的甲苯基紫染色在不同发展阶段(产后的一天:P0, P10, P20, e和P90)。规模酒吧代码受体密度fmol /毫克的蛋白质。

(AMPA受体密度显著高于p< 0.01)在P90老鼠相比,P0所有大脑区域调查(嗅球:262%;纹状体:311%;海马:321%和小脑:471%)。尽管年龄组之间的变化相当在所有的研究领域,峰值大脑不同区域的不同(图2,3)。P0 - P10,显著增加被发现在嗅球(139%,p< 0.05),纹状体(179%,p< 0.05)和海马体(184%,p< 0.05),但不是在小脑。重大变化被发现P10和P20之间只有在小脑(增加110%,p< 0.01)和P20和e在纹状体(44%,p< 0.05)和小脑(44%,p< 0.01;图2,3)。最后,e和P90之间,AMPA受体在纹状体密度降低,海马和小脑,虽然没有达到的水平变化的意义。

Kainate受体密度明显高于在P90的老鼠相比,P0在所有大脑区域调查(嗅球:164%,p< 0.01;纹状体:51%,p< 0.01;海马:22%,p< 0.05;小脑:47%,p< 0.01)。所描述的AMPA受体,年龄组之间的变化是比较在所有的研究领域,但峰值变化不同的大脑区域(图2,3)。P0 - P10,嗅球的密度显著增加(148%,p< 0.01)、纹状体(21%,p< 0.01)和海马(41%,p< 0.01)。此外,P10和P20之间,显著增加被发现只有在纹状体(36%,p< 0.01)和小脑(63%,p< 0.01),而没有发现显著变化P20和e之间。P30和P90之间,有趣的是,有一个受体密度减少,尽管它只在纹状体(−10%,达到意义p< 0.05;图2,3)。

NMDA受体密度低于检出限P0老鼠的大脑和小脑在所有年龄段。有趣的是,time-courses纹状体和海马的变化不同于那些在嗅球中发现(图2,3)。在嗅球,NMDA受体密度在P90高于P10,而相反的适用于纹状体和海马。然而,只有纹状体的变化达到意义(−23%,p< 0.01)。P10和P20之间,在海马NMDA受体密度显著增加(32%,p< 0.01)。没有发现显著变化P20和e之间。P30和P90之间,明显降低被发现在纹状体(−30%,p< 0.01)和海马(−25%,p< 0.01;图2,3)。

伽马氨基丁酸_一个受体密度低于检出限的纹状体和小脑P0老鼠。,但不是高峰期,年龄组之间的变化,在各领域的研究(图2,3)。伽马氨基丁酸_一个受体密度明显高于在P90的老鼠相比,P0嗅球(208%,p< 0.01)和海马体(263%,p< 0.01)。P0之间没有发现显著变化,P10 P20和e之间,或e和P90之间。最后,P10和P20之间,嗅球中发现显著增加(108%,p< 0.05),海马(121%,p< 0.01)和小脑(907%,p< 0.01;图2,3)。

伽马氨基丁酸_B受体的变化呈现不同的time-courses和山峰检查区域(图2,3)。GABA在嗅球和纹状体_B受体密度显著降低在P90的老鼠相比,P0(嗅球:−32%,p< 0.01;纹状体:−31%,p< 0.01),而相反的对海马体(25%,p< 0.01)。有趣的是,P0 - P10,伽马氨基丁酸_B在嗅球受体密度显著下降(−50%,p< 0.01),但显著增加纹状体(26%,p< 0.01)和海马(46%,p< 0.01)。P10和P20之间,伽马氨基丁酸_B在纹状体受体密度显著下降(−35%,p< 0.01)。没有发现显著变化P20和e之间。P30和P90之间,GABA的显著增加_B受体密度在嗅球(74%,p< 0.01;图2,3)。

讨论

5本研究研究个体发生的改变受体类型的两个主要的神经递质系统,谷氨酸和GABA,利用定量纯种老鼠大脑的不同区域在体外受体放射自显影法。第一次,个体发育的密度的变化不同的受体类型这两个主要的神经递质在相邻的部分进行了全面分析使用特异氚化配体,允许同时分析,而有条理和inter-subject改变是可以避免的。结果显示不同的发展模式和区域差异与许多重大改变受体密度调查受体。

AMPA受体密度在新生儿成年老鼠相比显著降低。这是按照早前的一项研究的结果,尽管作者贴上低亲和力AMPA受体的结合位点(Insel et al ., 1990),而目前的研究调查了高亲和性结合位点。海马发育增加受体密度可以解释为高水平的高亲和力[³H] AMPA主要结合位点位于海马细胞层,反映相对数量的结合位点的变化,而非发展性质的变化AMPA受体的亲和力(史坦利et al ., 1995)。

先前的研究调查了AMPA受体亚基的发展变化,表明他们的表情是监管和发展取决于大脑区域(Pellegrini-Giampietro et al ., 1991;马丁et al ., 1998;皮卡德et al ., 2000;Ritter et al ., 2002)。例如,增加海马基因表达式GluA1和GluA2 P21在好和GluA3 (Pellegrini-Giampietro et al ., 1991),以及受体密度的改变我们在目前的研究发现与已知的可塑性(Pellegrini-Giampietro et al ., 1991)。突触可塑性的开头,NMDA受体是通过突触后膜的去极化激活介导的AMPA受体,然后触发Ca^{2 +}端依赖的信号通路,导致AMPA受体的突触后膜表面的变化(饶和芬克贝涅2007)。因此,AMPA受体的突触后表面改性导致改变LTP和长期抑郁(有限公司),因此在突触强度(饶和芬克贝涅2007)。无数的AMPA受体不成熟的大脑渗透Ca^{2 +}由于他们缺乏GluA2亚基(Pellegrini-Giampietro et al ., 1992)。此外,P10-P12小鼠表现出显著降低GluA2表达式与成年人相比,大脑皮层和海马(桑切斯et al ., 2001)和第二产后一周后,有一个交换GluA2缺乏AMPA受体与GluA2包含(Ca^{2 +}不透水)受体(Pellegrini-Giampietro et al ., 1992)。因此,这个开关可能表明AMPA受体的重要性在产后早期大脑发育,尤其是在突触发生等过程(杜兰祖金评述,1993;西蒙尼et al ., 2004)和突触可塑性的调节(Planells-Cases et al ., 2006)。突触发生是一个复杂的过程,新的突触形成,主要在前和产后早期大脑发育,但也可以发生在成熟的大脑,是很重要的学习,记忆和认知(威茨et al ., 2005)。结合本研究的结果,这种发育开关可能与显著增加受体密度P0 - P10,尤其是在纹状体和海马。

小脑的发育变化AMPA受体密度在当前研究中发现符合基因的表达水平以来GluA1-3亚基编码在两种情况下发生连续增加P0 - e,紧随其后的是一个轻微但非重大减少到成人的水平(杜兰祖金评述,1993)。众所周知,小脑等过程中起着举足轻重的作用控制运动功能,运动学习和运动Matsumura et al ., 2004;Timmann et al ., 2010)。我们假设与年龄相关的AMPA受体密度增加小脑可能与这些函数由于其在小脑可塑性已知的作用,特别是通过其参与运动学习(卡诺和加藤,1987;Hirano 2013)。

kainate受体密度变化的模式在海马和纹状体相当,显示逐渐增加直到达到最大值P20和e,分别,其次是减少在成年期,虽然只是从e显著减少P90的纹状体。这些发现与个体发育的研究,发现了类似的模式在海马和纹状体P21的高峰,可能是与cytoarchitectural重组发生在这些地区,随后下降,直到成年期(米勒et al ., 1990)。此外,与kainate受体密度增加时间模式从P0 P10突触发生和P20对应时期(Fiala et al ., 1998),也增强了P15老鼠的海马LTP (沃森et al ., 2016)。有趣的是,kainate受体密度的显著增加这里描述的嗅球,类似时间进程的突触密度的变化在肾小球(Moriizumi et al ., 1995)。

个体发生的变化kainate基因的表达模式(GluK1-5)和kainate受体密度研究了过去(铁路et al ., 1994)。对于后者,我们的结果显示一个类似的时间进程在海马体在早期达到高峰,然后下降直至达到成人水平。瞬态kainate结合位点的表达水平的变化表明kainate在神经发展的重要性,和可能表明参与产后可塑性(法令et al ., 2014)。Kainate受体能够调节突触抑制通过控制表达式的K⁺cl⁻转运蛋白KCC2 (里维拉et al ., 1999在海马苔藓纤维)和调解LTP突触(Bortolotto et al ., 1999)。与AMPA和NMDA受体相比,kainate受体更深入研究,许多问题仍未得到解答。本研究可能表明他们在大脑发育和重要性,因此,为未来的研究提供参考数据。

重大的变化在纹状体和海马NMDA受体密度提出了作为受体的改变数字(Insel et al ., 1990;Colwell et al ., 1998),发育中的变化相似的可能性表示为离解常数被排除在外Tremblay et al ., 1988)。非特异性谷氨酸和门冬氨酸配体L - (³H]谷氨酸早些时候经常用于个体发育的研究关于NMDA受体。但是,通过使用高度receptor-subtype特定配体(³H] mk - 801(+),非竞争性拮抗剂,结合苯环己哌啶NMDA受体离子通道内的结合位点,排除假阳性结果。此外,NMDA受体是惟一的,它们不是激活除非co-agonists谷氨酸和甘氨酸结合识别网站(曲,1995;Danysz和帕森斯,1998年)。早些时候与个体发育的研究中,我们因此包括co-agonists以及增强剂亚精胺在我们绑定协议(曲,1995)。Baudry et al。(1981)建议在海马NMDA受体结合位点低P4老鼠,直到P10迅速增加,然后在接下来的2 - 3周内增加得更慢。这是符合我们的研究结果显示NMDA受体水平低于检出限在所有在P0 roi。电生理研究加强这一假设由于没有响应的大多数细胞在大鼠纹状体突触刺激P10 (赫斯特et al ., 2001)。此外,Maragos et al。(1988)调查两种不同的门冬氨酸受体配体的区域分布,表明小脑的唯一地区门冬氨酸结合位点不一致。通过使用非特异性配体L - (³H)谷氨酸NMDA绑定网站以小脑颗粒细胞层,而只有少数结合位点测定与(³H] TCP、结合的配体苯环己哌啶NMDA受体的结合位点(Maragos et al ., 1988)。另一项研究表明,通过使用5 nM NMDA特定配体(³H] mk - 801(+),这是与3.3 nM在目前的研究中,小脑颗粒细胞层的缺席(樱井et al ., 1991)。然而,通过增加配体浓度20海里,他们观察标记小脑颗粒细胞层,表明低亲和力结合位点的小脑,因此不同受体亚型构成比其他大脑区域(樱井et al ., 1991)。事实上,正是表明,除了较低的NR2A表达,小脑表达主要NR1-NR2C子单元,但是,仅仅表现在大脑(劳里et al ., 1997;Paoletti et al ., 2013)。此外,它表明NMDA受体通道阻滞剂(³H] mk - 801(+)展品高亲和力重组heteromeric NR1-NR2A和NR1-NR2B受体主要表达于大脑和对NR1-NR2C 25倍低亲和力受体主要表达在小脑。这些结果表明NMDA受体的异质性对不同配体亲和性在大脑不同区域(罗力和Seeburg, 1994年)。门冬氨酸受体的微分单元组成在不同的大脑区域在大脑发育可能会在将来的研究中得到解决,例如,通过使用原位杂交和免疫组织化学。总之,我们假设NMDA受体密度低于检出限产后和成年大鼠小脑的主要原因有两个。首先,这一事实非常具体的NMDA受体配体(³使用H] mk - 801(+)的非特异性配体L - (³H]谷氨酸为了避免假阳性结果。第二,可能由于不同的亚基组成及产生的不同亲和力的小脑相比其他大脑区域分析。

信使rna表达水平的分析NMDA受体亚基透露NR2B表达主要在第一个产后一周,在接下来的几周和NR2A表达(文策尔et al ., 1997;Ritter et al ., 2002;Gambrill和巴里亚,2011年)。这个单元开关被认为发挥发展作用NMDA神经毒性(Haberny et al ., 2002),表明新生儿神经传递的重要性由NMDA受体(文策尔et al ., 1997)。NR2A和NR2B亚基表达高峰在产后2周(Ritter et al ., 2002),这可能与海马突触可塑性的时间在增加(哈里斯和Teyler, 1984年)。支持这一观点的研究NR2A基因敲除小鼠,显示减少海马LTP和空间学习(Sakimura et al ., 1995)。当老鼠开始探索周围环境之间P15 P28,海马的突触密度显著增加,由于NMDA受体激活(管家和福尔克,1991年)。这些发展变化与突触发生(Gambrill和巴里亚,2011年),也可以反映在受体密度的增加,我们发现在目前的P10及P30之间的研究。突触发生、突触消除是另一个关键的过程在正常大脑发育,见一项研究解决大脑突触的数量(威茨et al ., 2005)。在突触发生,增加突触的数量直到P28后达到顶峰,但是在成熟的数字然后慢慢下降,这一过程称为突触消除(管家和福尔克,1991年;罗曼·凯塞尔,2014)。因此,受体密度的下降在纹状体和海马从e P90可能是由于突触消除重新定义或者调整神经网络。此外,NMDA受体激活结果插入的AMPA受体和改变树突棘的形态,这是重要的稳定和成熟的突触(威茨et al ., 2005)。

我们发现GABA最显著增加_一个受体密度发生P10和P20之间。通过使用海马体的例子,众所周知,第一次产后两周期间,突触数量稳步增加(管家和福尔克,1991年;Fiala et al ., 1998)。有趣的是,这也伴随着时期,这种受体的激活变化从兴奋性抑制,表明这种转变在大脑发育中起着重要的作用Cherubini et al ., 1991;Ganguly et al ., 2001)。这种转变的确切分子机制仍具有挑战性,然而,两个cation-chloride转运蛋白KCC2和NKCC1发现Cl监管发挥着至关重要的作用⁻分别流出和流入(Delpire 2000)。早期大脑发育期间,表达NKCC1占据着主导地位,导致了细胞内积累Cl⁻由于缺乏KCC2未成熟神经元(肯纳卡人et al ., 2001;王et al ., 2002)。KCC2表达的增加在第一次产后一周,将会提升Cl的流出⁻并导致GABA成为抑制(阿基里斯et al ., 2007;Valeeva et al ., 2013)。GABA的描述功能的转变_一个受体在出生后大脑发育可能参与之间的巨大受体密度增加我们发现P10和P20嗅球(198%)、海马体(121%)和小脑(907%)。此外,GABA是第一个不成熟的大脑和GABA活跃的神经递质_一个第一个被激活受体(Sernagor et al ., 2010)。

门冬氨酸受体也存在与GABA中的_一个在相同的突触后但最初被毫克^{2 +}(Cserep et al ., 2012)。GABA兴奋性行为导致膜去极化,如果足够强大,删除毫克^{2 +}堵塞和激活NMDA受体(Cserep et al ., 2012)。因此,打开压敏电阻器Ca NMDA受体的激活^{2 +}渠道,导致细胞内钙的增加^{2 +}浓度和NMDA受体的激活在邻近的突触,导致自发的同步活动(Cserep et al ., 2012)。这个事件是至关重要的DNA合成的调制,神经元增殖,分化,成熟,以及形成,稳定和加强突触连接(科恩et al ., 2008;Cherubini et al ., 2011;Cserep et al ., 2012)。我们假设这一连串事件可能发挥作用在受体密度的表示改变P10 P20。此外,增加发生在一个时间段,老鼠开始与环境互动的结果令人瞠目结舌的发病和听力(罗曼·凯塞尔,2014)。因为自发活动取决于gaba ergic传输,可以引发突触可塑性,我们假设这些development-regulated变化产生高影响强烈的受体密度增加在我们的研究中,通过比较发现产后和成人受体密度。

GABA的显著增加_一个P10之间受体密度和P20在嗅球和海马体伴随着时间的研究个体发育的gaba ergic神经元(Coyle和Enna, 1976)。结果表明,出生时,GABA绑定是大约50%的成人水平,在P8,大约有25%的成人水平,后者与我们的研究结果在嗅球和海马体(Coyle和Enna, 1976)。作者表明,增加后P8相关与谷氨酸脱羧酶的活性,增加突触前标记所知GABA催化谷氨酸进行脱羧反应的酶。

小脑GABA线性增加_一个受体密度是依照gaba ergic神经元的个体发育和识别网站(Coyle和Enna, 1976;Aldinio et al ., 1980)。此外,时间进程对应功能gaba ergic突触的形成小脑颗粒细胞层(奥特曼,1972;Shimono et al ., 1976)。GABA的增加_一个受体密度我们发现在嗅球是按照增加GABA水平在产后大脑发育(Miranda-Contreras et al ., 2000)。的增加,密度和GABA受体的水平,可能是由于神经发生嗅球中间神经原的数量,尤其是颗粒细胞,改变产后和年轻人之间的生活(其余的et al ., 1982;拜耳1983)。未来的个体发生的原位或免疫组织化学研究可能提供一个洞察改变受体亚型的个人的嗅球层、海马、小脑,也为其他大脑区域发生发展变化如丘脑核、视觉和听觉皮层。

早期的GABA的峰值_B受体密度P0 - P10与GABA的晚高峰_一个受体在成年阶段,可以解释的事实metabotropic受体在大脑发育早期表达,发挥更多的调节作用在成人大脑(Herlenius Lagercrantz, 2001)。然而,原因是没有完全理解并为未来的研究将是一个有趣的目标。此外,伽马氨基丁酸_一个主要是突触后受体,而伽马氨基丁酸_B受体主要突触前。因此,未来的研究可以关注变化的微分分析预处理和突触后GABA受体在开发期间,例如,通过电生理学方法。

调查的拼接GABA变体_B1a和GABA_B1b显示GABA_B1a出生时水平高,达到P5然后下降直到成年,这部分的同时,降低受体密度在嗅球P0 e,但并不能解释增加密度从e P90 (Fritschy et al ., 1999)。相比之下,伽马氨基丁酸_B1bP5水平低出生时,增加后,在P10达到顶峰,随后在成熟有所下降,而这两种类型达到成人的水平在产后第三周(Fritschy et al ., 1999)。这个峰值是依照我们的发现在海马和纹状体,与受体密度增加从P0 P10,当他们达到最大值,然后下降但直到P90呆在大约相同的水平。鲟鳇鱼和阿尔宾(1994)显示一个类似的GABA的发展模式_B结合位点在两种roi (鲟鳇鱼阿尔宾,1994)。此外,增加P0 - P10对应于突触发生的时间进程和峰值,这被认为是由脑源性神经营养因子的分泌,激活原肌凝蛋白受体激酶途径(Gaiarsa宝卓,2013)。

尽管他们参与神经发展,GABA的具体作用_B受体在个体发育还不充分理解。结果表明,伽马氨基丁酸_B在大脑发育的高峰水平最高(鲟鳇鱼阿尔宾,1994),在某种程度上,我们可以用目前的研究证实了这一点。然而,这些发展模式的原因仍然是一个谜。进一步的实验可以帮助获得新的有价值的知识,例如,GABA的表达模式_B通过基因在大脑发展原位杂化。

目前研究显示一个类似模式的受体密度变化glutamatergic AMPA, kainate受体。一般来说,各自的密度增加从出生在生命的头几个星期和略微下降直到成年,即使不显著。相反,GABA受体的调查揭示了微分模式密度变化,根据各自不同的受体类型和ROI。最高的差异对percental密度变化从一个时代到另一个AMPA和GABA被发现_一个受体。

结论

本研究描述发展改变glutamatergic和gaba ergic受体密度在老鼠大脑P0 P90。所有调查受体出席P0或者P10,根据感兴趣的区域,这表明每个受体在出生后大脑发育中扮演不同的角色。海马glutamatergic受体密度的增加,峰值在P20或e,意味着可能这些受体参与突触可塑性,而下降的纹状体和海马NMDA受体密度从e P90可以消除引起的突触。综上所述,目前的数据展示了特定区域和时间微分谷氨酸和GABA受体密度的变化在嗅球,纹状体、海马、小脑的老鼠,从而更好地理解老鼠大脑的发展个体发育。

数据可用性声明

在这项研究中生成的数据集是可在请求相应的作者。

道德声明

根据德国的所有实验动物福利法案,批准的政府机构负责,LANUV北威州(地方政府对自然、环境和消费者保护北威州,德国)。

作者的贡献

某人,JC, MC和KZ设计概念和实验。某人做了实验,收集数据。NP-G执行统计分析。所有作者分析和讨论了数据。某人,JC, NP-G和KA写的手稿。

资金

这个项目已经收到了欧盟的资助下地平线2020研究和创新计划资助785907号协议(HBP SGA2)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

我们感谢c . Radermacher的技术支持。

缩写

(³氚H);AMPA,α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic酸;方差分析,方差分析;GABA,γ-aminobutyric酸;n -甲基- d -门冬氨酸;P,产后;ROI,感兴趣的地区。

引用

阿基里斯,K。冈,。池田,M。,Shimizu-Okabe, C., Yamada, J., Fukuda, A., et al. (2007). Kinetic properties of Cl uptake mediated by Na+-dependent K+-2Cl cotransport in immature rat neocortical neurons.j . >。27日,8616 - 8627。doi: 10.1523 / jneurosci.5041 - 06.2007