分区域密度的神经元,海马神经原纤维缠结和淀粉样斑块的阿尔茨海默氏症患者
戴安娜Furcila
玛尔塔Dominguez-Alvaro
哈维尔DeFelipe
莉迪亚Alonso-Nanclares- 1卡哈尔皮质电路实验室,生物医学技术中心(施),大学为马德里,马德里,西班牙
- 2网络生物医学研究中心的神经退行性疾病(CIBERNED),马德里,西班牙
- 3卡哈尔研究所(CSIC),马德里,西班牙
已报告各种各样的解剖改变海马结构的阿尔茨海默病(AD)患者和这些改变与认知在疾病的早期症状。广告的主要特点是成对存在的螺旋细丝τ蛋白(公积金τ神经元内),也称为神经原纤维缠结(非功能性测试),和骨料amyloid-β蛋白质(Aβ)在细胞外空间形成斑块。然而,斑块的密度和非功能性测试与细胞丧失和认知能力衰退的严重程度还不清楚。本研究的目的是进一步检查Aβ斑块和非功能性测试的可能关系在几个海马神经元损失字段(DG、CA3、CA1和菌丝层)的11个疯狂的广告。为此,使用stereological技术,我们比较神经元密度(NeuN Nissl-stained,免疫反应性的神经元):(i)的神经元应用数字两种亚型的公积金τ(公积金Tau-AT8和公积金Tau-pS396);和(2)Aβ斑块的数量。我们发现CA1显示非功能性测试和Aβ斑块的数量最多,而DG和CA3显示这些标记的最低数量。此外,AD患者显示变量在CA1神经损失由于tangle-related细胞死亡,这似乎与细胞外缠结的存在。
介绍
阿尔茨海默病(AD)的主要特点是成对存在的螺旋细丝τ蛋白(公积金τ神经元内),也称为神经原纤维缠结(非功能性测试),和骨料amyloid-β蛋白质(Aβ)形成斑块在细胞外空间(Grundke-Iqbal et al ., 1986;Goedert et al ., 1988;阿维拉,2004;海曼et al ., 2012;高桥et al ., 2017)。正如前面讨论的加西亚•马林et al。(2009),斑块和非功能性测试主要发现在大脑皮层(内嗅皮层,皮层和海马结构),他们的数量和大脑皮层影响逐渐增加的比例随着疾病进展(Braak Braak, 1991;迪克森,1997;需要et al ., 2002)。这些病理变化也被发现在皮层下结构如杏仁核、下橄榄核,丘脑,蓝斑,和中缝核,尤其是在后期的广告(例如,Esiri et al ., 1997)。因此,多个神经元电路和神经递质系统在AD患者的大脑可能会改变。
它被描述这两个蛋白质(Aβ和公积金τ)共同行动甚至互相提高(狄维士et al ., 2017;墨西哥城et al ., 2017;Furcila et al ., 2018触发),但它仍然是未知的蛋白质变性。他们在大脑皮层开始积累在不同地区;在初始阶段的广告,公积金τ在内侧颞叶(MTL);Braak Braak, 1991),Aβ蛋白质开始形成聚集在皮层区域,特别是在时间和额叶(需要et al ., 2002;Sepulcre et al ., 2013)。主要的争议仍是否Aβ,公积金τ或者他们的交互与疾病进展相关的广告(纳尔逊et al ., 2012;布鲁姆2014)。在初始阶段的疾病,很多改变,如神经损失和锥体细胞形态学的变化,其中,在AD患者海马区域(已报告海曼et al ., 1990;西方et al ., 2004;Merino-Serrais et al ., 2011;Andrade-Moraes et al ., 2013;Llorens-Martin et al ., 2014)。广告认知症状在早期阶段的损失情况下,定向障碍和自传记忆障碍(杜布瓦et al ., 2007;彼得森et al ., 2009)。MTL,特别是邻近皮层和海马结构支持这些功能(海曼et al ., 1986;阿马拉尔和Lavenex, 2007年)。众所周知,各种各样的变化发生在AD患者的海马区域,如减少神经元的数量,以及神经元变化(例如;树突分枝的形态学变化和刺);神经纤维网的线程和Aβ斑块;和微血管的变化(例如,海曼et al ., 1990;西方et al ., 2004;冯Gunten et al ., 2006;布拉绸et al ., 2006;Giannakopoulos et al ., 2003;Andrade-Moraes et al ., 2013;Llorens-Martin et al ., 2014)。它提出了公积金的存在τ骨料和Aβ-ir斑块与广告相关的海马神经元可能代表一种有毒的环境(Ittner Gotz, 2011)。然而,它已经表明,CA1神经显示异构公积金的表达模式τ蛋白质。例如,在一项研究中执行我们在CA1关于公积金的co-expression实验室Tau-pS396和公积金Tau-AT8,我们发现,大多数(64%)的标记神经元只表达了公积金Tau-pS396,而只显示公积金标记显示28%和8%Tau-AT8-ir(Furcila et al ., 2018)。
本研究的目的是进一步研究蛋白质在广告和之间的关系可能在不同的海马区神经元的损失。为此,我们决定可能的地区差异,标记和情况下,通过比较神经元密度(Nissl-stained NeuN-ir,公积金Tau-AT8-ir和公积金Tau-pS396-ir神经元)和Aβ-ir斑块。
将公积金Tau-ir神经元,我们选择了抗体的表彰Tau-AT8因为它是常用的分类神经纤维变性分为几个阶段称为Braak阶段(Braak et al ., 2006),抗体的表彰Tau-pS396因为磷酸化在网站S396晚期通常相关的广告(Regalado-Reyes et al ., 2019),它主要是发现在非功能性测试(木村et al ., 1996)。为了这个目的,我们使用stereological技术神经元,公积金τ和Aβ斑块染色(尼氏小;NeuN;Aβ;公积金Tau-AT8;公积金Tau-pS396)研究了DG, CA3,海马的CA1和菌丝层11精神错乱AD患者。
材料和方法
组织准备
人类大脑组织的样本来自11例AD患者获得(事后两点之间的延迟和5:30 h;年龄在69年和89年在死亡;表1)根据神经病理检查确诊为广告如上所述Braak和Braak (1991)和CERAD (Mirra et al ., 1991;Fillenbaum et al ., 2008)。这些样品来自两个来源:德银Teixits神经从医院Universitari诊所de巴塞罗那(西班牙)和银行(Banco de Tejidos Fundacion CIEN(马德里,西班牙),遵守赫尔辛基宣言的指导和当地伦理委员会批准。允许发布关于年龄和其他人口统计数据从患者获得的信息或其亲属的知情同意使用捐赠者的生物样品的研究,在生物银行按照国家规定。我们使用的日冕部分人类海马在海马体内的水平(梅et al ., 2016)。这些组织样本之前用于我们的实验室(Furcila et al ., 2018;Regalado-Reyes et al ., 2019;例代码Az1-10对应BCN1-10, Az11 VK26)。包含海马结构组织块固定在4%多聚甲醛溶液在4°C(24小时),cryoprotected(30%蔗糖溶液至少24 h)和冰冻(−80°C)。块包含海马体被削减在40°C(−滑动切片机热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国MICROM, HM450;冻结单位,KS34,麻萨诸塞州,美国),在连续冠状部分(50μm厚),收集到0.1 PB进行进一步处理。
表1。总结的临床和病理资料。
免疫组织化学
海马结构的部分选择标准采用的处理技术(图1)。简单地说,第一次治疗的部分消除内源性过氧化物酶(1% H2O2)。那些部分选择染色anti-Aβ首次接受88%甲酸(Sigma-Aldrich没有。251364年,圣路易斯,密苏里州,美国)。部分被对待PB 0.1 Triton-X 0.25%, 3%马血清(NHS,向量实验室Inc .,伯林盖姆,CA,美国)和孵化一夜之间在4°C与特定主要抗体。第二天,部分被清洗和加工与生物素化的二次抗体(马anti-mouse或山羊anti-rabbit免疫球蛋白g, 1∶向量实验室,伯林盖姆,CA,美国),然后与Avidin-Biotin复杂(Vectastain ABC工具包,向量实验室Inc .,伯林盖姆,CA,美国)。染色与发色体可视化3 3′-diaminobenzidine(轻拍:西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)。所有部分都孵化,直到他们变成浅棕色,用同样的孵化时间为所有幻灯片;疣是通过光学显微镜检查之前停止反应在所有幻灯片。然后,部分被孵化OsO4 0.02% PB在室温下15 s。最后,部分安装,脱水,清除和Xilol covered-slipped (DePeX;德国默克公司100579、64271、)。 The following primary antibodies were used: mouse anti-NeuN monoclonal antibody (1:2,000; Chemicon; MAB377, Temecula, CA, USA); mouse anti-PHFTau-AT8单克隆抗体(MN1020下,热科学、沃尔瑟姆,妈,美国);兔子anti-PHFTau-pS396多克隆抗体(下,表达载体,44752 g、钙、美国);和鼠标anti-Aβ单克隆抗体(克隆6 f / 3 d, 1:50, Dako M0872,斯特鲁普,丹麦)。相邻的部分与甲苯胺蓝Nissl-stained (图1)。
图1。彩色海马结构部分病人从一个广告。左栏,低功耗显示NeuN海马结构的故事红外(一),Nissl-staining(C),公积金Tau-AT8-ir(E),公积金Tau-pS396-ir(G)和Aβ红外(我)部分。右列(B、D、F、H、J),更高的CA1区放大说明应用计算框架(绿色线对应边界包含边界和红线排除)用于stereological过程。规模栏所示(J),表明1000μm(A, C, E, G,我);37μm(B, D);90年μm(F、H、J)。DG:齿状回;CA1-CA3:角ammonis字段;子:菌丝层。
生成数据,捕捉图像数码相机(奥林巴斯DP70)连接到一个奥林巴斯BX51光学显微镜(奥林巴斯、Ballerup、丹麦)和Adobe Photoshop CS4扩展11.0.2软件(美国加利福尼亚州圣何塞Adobe系统)是用于生产图板块。
神经元密度估计
标记神经元的密度估计使用stereological方法称为光学解剖器(图1;西方和甘德森,1990年)的帮助下立体调查员软件(11.0立体声调查员,MicroBright Inc .,威利斯顿,VT,美国),利用其光学分馏器工具。神经元密度,表示为每卷标记神经元的数量,估计在CA3、CA1,菌丝层,使用Nissl-stained部分和NeuN——,公积金Tau-AT8 -和公积金Tau-pS396-immunostained部分。Nissl-stained和NeuN-immunostained部分被用来识别海马内的边界。
随机选择一个起点后,六个部分选择在等距的间隔。光学解剖器是用一种油浸×100目标NeuN-immunostained和Nissl-stained部分,平均2050μm的表面2。光学的深度解剖器是10μm,呈现研究20500μm的体积3每一个光学解剖器。一个×40目的是用于住房公积金τ14450μm -immunostained部分,在一个表面上2。光学的深度解剖器在这种情况下也10μm,呈现研究144500μm的体积3。Stereological参数为每个样本和神经元标记被选择。因为大多数神经元位于锥体细胞层,在这一层神经元密度估计CA分支领域和菌丝层。Nissl-stained部分中,神经元只有数如果核仁是明确确定在光学平面沿垂直z轴(图1)。
估计的淀粉样斑块密度和体积
Aβ的数量红外斑块每卷也是估计的光学分馏器工具(立体调查员)DG, CA3, CA1和菌丝层(图1)。至少六个部分被选为每一个病人,以同样的时间间隔与一个×40 22500μm的目标在一个表面上2析像10μm深度,呈现研究225000μm的体积3每一个光学解剖器。
估计Aβ-ir斑块体积,斑块的边缘被划定与成核剂工具借助立体调查员软件(甘德森1988)。该工具提供每个Aβ-ir斑块的体积分析,以及相对体积被他们在每个检测海马子域(图1)提供组织的百分比(%)被Aβ-ir斑块。
组织收缩估计
组织收缩由于染色协议估计测量截面面积和厚度处理之前和之后使用立体声调查员软件正确的最终值。处理后部分的面积除以面积测量值在加工之前,获得任何区域的收缩因素测量。厚度测量10点估计的随机点沿着z轴(即收缩。,部分压缩)。因此,脑组织萎缩30%的估计,当处理轻拍和Nissl-staining: DAB-immunostaining,清白的部分的平均厚度为50.2μm,免疫染色处理后,它是16.49μm NeuN,公积金τ-和Aβ-immunostained部分;在Nissl-stained部分,处理后的平均厚度为17.4μm。因此,所有的最终值stereological估计是纠正获得预处理的估算值。
统计分析
确定可能的地区差异、标记和情况下,统计比较神经元密度(Nissl-stained NeuN-ir,公积金Tau-AT8-ir,PHFTau-pS396-ir神经元)和Aβ红外块数据。当数据参数(正常和方差齐性标准得到满足),我们进行了t——学生检验和方差分析检验,其次是Bonferroni成对比较的测试。正常和方差齐性分析Shapiro-Wilk和列文测试,分别。当常态和方差齐性没有见面的时候,我们使用未配对Mann-Whitney (MW)非参数U以及和克鲁斯卡尔-沃利斯检验(千瓦),其次是Mann-Whitney测试(MW)成对比较。相关分析是用来寻找可能的变量之间的关系。统计程序和图表进行GraphPad棱镜7统计软件包(棱镜、圣地亚哥、钙、美国)和SPSS程序(IBM SPSS统计25节,IBM公司,促进城市、钙、美国)。
结果
在这项研究中,海马领域的分歧的基础上划定之前的描述(Insausti阿马拉尔,2012年),为每个地区以前用于命名法Alonso-Nanclares et al。(2011)。当前工作的目的,我们将使用术语:DG,海马体适当的(分为CA1、CA2和CA3字段)和菌丝层(图1)。
神经元密度估计
整个神经元密度估计Nissl-stained和NeuN-immunostained部分在CA3锥体层,CA1和菌丝层(补充表S1;图2一个)。其他海马区域没有用于神经元计数由于技术上的困难,如致密堆积颗粒细胞游离钙的DG和缩小体积,产生高误差系数,获得准确的估计是不能接受的。没有观察到神经元的数量差异每卷当比较两个标记跨区域(T以及:p在CA3 = 0.13;p在CA1和= 0.73p在菌丝层= 0.41)。AD患者神经元密度显示广泛的所有分析区域的值(图2一个)。此外,估计在NeuN执行红外部分显示高可变性比密度获得Nissl-stained部分(补充表S1)。除非另有说明,我们将参考数据获得的尼氏小神经元密度估计。
图2。(一)图显示了海马神经元密度地区,估计在Nissl-stained部分。密度代表对应标记神经元的数量每卷(毫米3每个案例分析)。白色象征对应广告商品患者。(B)图显示神经元密度/公积金的体积Tau-AT8-ir和公积金Tau-pS396-ir海马神经元领域分析,在AD患者。密度代表对应标记神经元的数量每卷(毫米3每个案例分析)。(C)公积金的比例的图形表示形式Tau-AT8-ir和公积金Tau-pS396-ir神经元,考虑Nissl-stained神经元作为神经总人口。数据对应于每个地区的平均百分比。注意,公积金的比例Tau-pS396-ir元素超过神经元的总人口,这可能是由于细胞外贴上非功能性测试或“鬼缠结”(参见文本详情)。海关,海马硬化;DG,齿状回;CA1-CA3,角ammonis字段;子,菌丝层。
估计CA1神经密度是8852±4368(平均数±标准差;补充表S1)。在六个病人的广告,我们发现很低数量的神经元在CA1,兼容海马硬化(HS),病理发现(图3与广告相关的),通常是(迪克森et al ., 1994;Velez-Pardo et al ., 2004;Attems定形,2006;Amador-Ortiz et al ., 2007)。从这些广告中的神经元密度CA1 HS患者5492±2029神经元/毫米3AD患者(平均±标准差),而没有HS 12884±2304 (图2一个)。后者价值观相似值被发现在CA1控制情况(12040±1746;见“讨论”部分)。无统计差异观察神经元的数量每卷(毫米3)字段(CA1, CA3,菌丝层),而对方(一维方差分析;p= 0.6041;F= 0.5132)。
图3。故事从Nissl-stained海马结构部分的一个广告病人(Az9)海马硬化的影响(一)。高放大倍数的盒装地区显示了严重的神经损失和在CA1神经胶质过多症(B)。DG:齿状回;CA1-CA3:角ammonis字段;子:菌丝层。比例尺(在B)表明2.25毫米(一),1000毫米(B)。
公积金Tau-ir研究
检查中存在过度磷酸化τ蛋白AD患者的海马结构,并探讨可能的相关性的表彰τ和广告阶段(Augustinack et al ., 2002),两种亚型的公积金τ量化:公积金Tau-AT8和公积金Tau-pS396。
在所有的海马区域分析,我们看到一个更高密度的公积金Tau-pS396-ir比公积金每卷(神经元)Tau-AT8-ir如前所观察到的在CA1区广告尤其是在晚期病人的疾病(苏et al ., 1994,1996年;木村et al ., 1996;Blazquez-Llorca et al ., 2010;Furcila et al ., 2018);补充表S1;图2 b)。公积金的神经元密度最高Tau-pS396-ir和公积金Tau-AT8-ir观察在CA1,其次是菌丝层,而CA3和DG呈现较低的值(补充表S1;图2 b)。此外,公积金Tau-pS396-ir神经元密度比公积金更多变量之间的病人Tau-AT8-ir神经元密度,特别是在CA1区。此外,公积金的密度Tau-pS396-ir在CA1非常接近估计整体神经元密度(估计在Nissl-stained和NeuN红外部分),这表明大部分的神经元在CA1 AD病人包含公积金Tau-pS396。公积金的数量之间的比率Tau-ir神经元和神经元总估计Nissl-staining计算在CA3、CA1和菌丝层。这些比率表明,CA3,公积金Tau-AT8-ir神经元代表神经元约占总数的8%,10%在菌丝层,而公积金Tau-pS396,出现在CA3神经元的13%,和32%的subicular神经元。在CA1,公积金Tau-AT8-ir神经元代表大约31%的神经元,而这个数字达到146%的公积金Tau-pS396,也就是说,在CA1公积金的数量Tau-pS396-ir神经元总数超过了总Nissl-stained神经元的46% (图2 c;补充表S2),它可以解释为细胞外非功能性测试的标签或“鬼缠结”(见“讨论”部分)。
公积金的相对比例的相关分析Tau-pS396神经元和神经元总人口(由Nissl-staining估计)显示显著负相关(P= 0.0037;r=−0.791;斯皮尔曼)。
分析Aβ红外斑块
估计Aβ的数量红外每个卷显示斑块CA1提出价值最高,其次是菌丝层、DG和CA3 (补充表S1;图4一)。此外,CA1和菌丝层不仅提出了斑块密度最高的每卷(p< 0.0001;千瓦:22.33),但它们也显示更高比例的组织体积被斑块(p= 0.0002;千瓦:19.21;补充表S1;图4 b)。相比之下,我们发现Aβ的平均体积红外斑块(补充表S1;图4 c)明显高于(p= 0.0198;千瓦:9.86)总干事(52350μm3)。
图4。情节来说明估计的Aβ特性红外斑块的检测海马字段。Aβ数量红外每卷斑块(一),体积被Aβ占领红外斑块(B),Aβ估计红外血小板平均体积(C)。DG,齿状回;CA1-CA3,角ammonis字段;子,菌丝层。
总之,DG和CA3显示每个卷的斑块数量最低,尽管斑块在这些地区更大,他们占领了这些地区的相对体积是低。相比之下,CA1和菌丝层提出了更高Aβ的数量红外每卷斑块,还显示更高比例的组织被斑块,尽管斑块大小相对较小。
讨论
在当前的研究中,我们使用的日冕部分人类海马水平患者海马体内的广告来估计神经元的密度,非功能性测试和淀粉样斑块每毫米3在不同的海马字段。目前的研究是基于分析相对较少的部分从这些患者海马;因此,估计不能外推到整个海马。我们发现,海马CA1字段是该地区最受众多公积金的存在Tau-ir元素和Aβ-ir斑块,而其他海马字段相同的病人。公积金的菌丝层显示适度的水平Tau-ir神经元和Aβ-ir斑块,DG和CA3的影响并非这些病态的元素的存在。
神经元密度
神经元密度无显著差异被发现之间的CA1, CA3,菌丝层在给定这些海马字段之间的病人或从不同的患者,患者除了广告商品。神经元密度很低在CA1 HS患者被发现,相比显著降低CA3的密度和菌丝层相同的病人以及相对于CA1、CA3及菌丝层没有海关的病人。我们检查了公元11例(年龄范围:69 - 89岁)和CA1神经密度从2475到8458个神经元/毫米不等3与海关在这些情况下,从8430年到15187年神经元/毫米3其他的广告。虽然年龄组比较广告的情况下显然是理想,应该注意的是,广告的神经元密度范围患者没有HS是类似于对照组中描述一项研究在我们实验室进行量化的使用相同的方法,尽管年龄差异(Andrioli et al ., 2007)。在这个Andrioli et al。(2007)控制研究中,三个尸检病例检查和神经元密度从10744到14024个神经元/毫米不等3(年龄范围:49 - 69岁)。此外,CA3,菌丝层AD患者显示神经元密度(8936年CA3;9503年菌丝层),类似发现在这些控制情况下(9852±978在CA3;在菌丝层10186±2672)。此外,在相同的研究Andrioli et al。(2007),控制CA1区神经元密度从活检获得来自癫痫患者(年龄:21 - 65岁)估计,从11057年到13194年神经元/毫米3。因此,虽然我们以前的研究是基于一个相对较少的情况下,他们确实表明,神经元的密度控制CA1相似的患者年龄在21岁到69岁。实际上,变化很小(10%)皮层神经元的数量被发现年龄的函数Pakkenberg和甘德森(1997)在研究了年龄从20到90岁。然而,由于广告显示脑萎缩的患者(例如,van de波尔et al ., 2006;虽然我们没有测量海马的总量),很明显,有一个绝对数量的减少神经元在AD患者尽管神经元的数量每毫米3类似于在先前发表的结果发现在健康个体。
的脆弱性CA1神经退化已被广泛研究(综述Duvernoy 2005),据报道,这个特定区域很容易代谢变化了巴奇和伍尔夫,2015)。观察神经元密度最大的减少在这些广告情况下也显示商品(表1,补充表S1;图2一个),而non-sclerotic AD患者显示在CA1区神经元密度更高,与价值观类似于控制情况下(见“结果”部分)。因为大多数神经元在CA1锥体细胞和严重的神经损失被发现在CA1广告商品患者,它遵循他们的投影从CA1网站缺乏正常的输入。然而,如何以及何时神经元相关广告progression-impacts海马连接和功能还有待阐明。
值得注意的是,在CA1,我们发现公积金的密度Tau-pS396-ir神经元达到NeuN的总人口红外神经元,甚至超过Nissl-stained部分神经元密度估计。从广告,几乎所有的CA1神经病人anti-PHF标记Tau-pS396抗体。因此,一些住房公积金Tau-pS396-ir元素超过神经元总人口可能对应于细胞外的非功能性测试的标签。在Nissl-stained估计执行部分,神经元是量化只有原子核是可见的;神经元失去细胞核或细胞完整性没有统计。据报道,在AD患者病理贬低的公积金Tau-ir神经元,这导致神经元完整性的丧失,导致一个细胞外NFT-the所谓“鬼魂纠缠”(Braak et al ., 1994)。这些鬼缠结在后期的广告和磷酸化,主要在Ser396 (木村et al ., 1996)。在目前的研究中,我们发现,较低的情况下神经元密度呈现出更多的公积金Tau-pS396细胞外缠结,这表明神经损失发生在很大程度上由于AD-related纠结病理学。这一发现可能提供一个形态关联广告,严重的细胞损失被称为海马硬化的文献(迪克森et al ., 1994;Velez-Pardo et al ., 2004;Attems定形,2006;Amador-Ortiz et al ., 2007)。
从AD患者,因此,在CA1部分神经元可能失去完整性,功能和正常连接。事实上,树突棘的丧失和锥体神经元树突萎缩包含成熟的非功能性测试被描述在AD患者(Merino-Serrais et al ., 2013)。所以,进步的住房公积金的变化Tau-pS396-ir神经元可能发展成形态和功能改变,最后,导致一个神经元的变性导致细胞外非功能性测试。此外,它已经表明,CA1神经显示异构公积金的表达模式τ蛋白质。例如,在一项研究中执行我们在CA1关于公积金的co-expression实验室Tau-pS396和公积金Tau-AT8在同一病人在目前的工作,我们发现64%的标记神经元只表达了公积金Tau-pS396,28%显示标记和8%显示只有公积金TauAT8-ir(Furcila et al ., 2018)。一些研究提出公积金Tau-AT8早期是一个特殊的标记,而公积金Tau-pS396出现在晚期(苏et al ., 1994,1996年;Regalado-Reyes et al ., 2019)。然而,其他作者表明,公积金Tau-pS396发生在早期阶段,动态的表达模式在整个病程,而公积金Tau-AT8出现在高级阶段(Mondragon-Rodriguez et al ., 2014)。我们的结果符合后者的研究中,因为我们发现更高密度的公积金Tau-pS396-ir神经元比公积金Tau-AT8-ir神经元在所有检测AD患者(对应于IV-V阶段Braak规模)。细胞内的公积金的作用τ是一个开放的辩论;有人建议,它的存在并不一定表明严重的和不可逆转的损伤(龚和伊克巴尔,2008;阿维拉et al ., 2012;Merino-Serrais et al ., 2013;墨西哥城et al ., 2017)和细胞内的公积金τ据报道在CA1神经非痴呆老年人(费雷尔,2012)。然而,由于公积金τ可能损害另一种蛋白质或蛋白质的表达,并可能影响疾病的过程中,很难建立一个hyperphosphorylation stage-dependent模式。
Aβ斑块密度
CA1也显示Aβ密度最高的值红外斑块。先前的研究在我们的实验室在AD患者的CA1表明Aβ的存在红外斑块导致当地的改变,包括锥体细胞形态学和神经支配的变化(例如,加西亚•马林et al ., 2009;Blazquez-Llorca et al ., 2010;Merino-Serrais et al ., 2013;Anton-Fernandez et al ., 2017)。此外,我们之前研究Aβ红外斑块分布CA1-revealed大多数斑主要是位于地层地层radiatum pyramidale紧随其后,这表明基底和顶树突分枝位于这些广告(CA1层可能会受到严重影响Furcila et al ., 2018)。
Aβ红外提出了斑块触发神经胶质激活(D 'Andrea et al ., 2001;荣格et al ., 2015;审查看到2018年春和李),这样也被提出是炎症过程的一部分与公积金的存在有关τ在广告和Aβ(Parbo et al ., 2017)。小胶质集群Aβ附近的报道红外从广告患者斑块在皮层组织(Serrano-Pozo et al ., 2013)。特别是,活化的小胶质细胞可能内化Aβ,有助于稳定斑块的大小(Rajendran et al ., 2006;Serrano-Pozo et al ., 2013;Asai et al ., 2015),但是在晚期毒性病理蛋白质形式的广告可能会引起小胶质功能改变。如果小胶质细胞清除可溶性Aβ失败,他们可能会再次转储到细胞外空间,使更多Aβ的形成红外斑块。在目前的研究中,我们发现更多的Aβ的地区红外斑块每卷(CA1和菌丝层)提出了小斑块比地区少Aβ斑块(DG和CA3)。
个体差异
我们的数据来自广告精神错乱的患者(相对较少n= 11),从而排除结果的外推到整个人口患者的广告。虽然检查患者临床上相当均匀(表1),几个特征应该考虑关于我们当前的结果。我们目前的数据显示在神经元密度显著变化广告样本。中执行的神经元密度估计Nissl-stained和NeuN-immunostained部分没有显示区域差异的分析。然而,来自NeuN-immunostained部分数据显示更大的可变性,地区之间和病人。据报道,延误后期人类大脑组织通常会导致固定工件,如膜连续性的中断和细胞外空间的体积的增加,在其他几何扭曲(例如,唐et al ., 2001)。这些特性是一个重要的限制在执行stereological计数,因为保护组织体积获得可靠的估计是至关重要的。事实上,最近的一项研究显示,老鼠大脑组织经历了显著的代谢变化,强调后期时间较长的,表明这种影响某些抗体的可视化,包括anti-NeuN (Gonzalez-Riano et al ., 2017)。定量研究神经元密度表现在人类大脑组织大型后期延迟(24小时)可能提供的数据与我们的结果不同(西米奇et al ., 1997;Andrade-Moraes et al ., 2013)。而人类脑组织的保护大后期延迟可能会接受某些定性的观察(例如,西米奇et al ., 1997;Wittner et al ., 2006;Andrade-Moraes et al ., 2013),它可能不适合在不同的实验室进行比较研究。此外,脑组织修复技术也可能改变stereological估计,研究揭示了免疫反应性的减少使用福尔马林(Lyck et al ., 2009)。
变异的来源也可以归因于个人认知储备。认知储备已被建议作为一种补偿机制,是防止神经元变性,允许变量数量的公积金Tau-ir神经元和Aβ红外斑块呈现(塔克和斯特恩,2011年;Lazarczyk et al ., 2012;史蒂芬和斯特恩,2012;斯特恩,2012;阿维拉et al ., 2015;洪尼格et al ., 2017)。
最后,Aβ红外斑块是大脑中观察到非痴呆病例的样本,和广告的临床试验治疗集中在淀粉样蛋白未能把AD-associated认知障碍;因此,淀粉样病变可能不是单独负责认知衰退中观察到的广告了安德森et al ., 2017;莫里斯et al ., 2018)。此外,在广告中,改变不仅是由公积金τ和Aβ蛋白质,但也可能存在的其他proteinopathies (Spires-Jones et al ., 2017;罗宾逊et al ., 2018)。改变蛋白质的相互作用,而不是他们单独行动,可以修改广告的发展。因此,我们的研究是符合广告不是一个独特的实体,但从一个病人到另一个不同的因素包括但不限制年龄,性别,co-pathologies和医学治疗。
在总结中,我们发现,在AD患者CA1显示非功能性测试和Aβ斑块的数量最多,而DG和CA3显示非功能性测试的最低数量和Aβ斑块。此外,AD患者有一个变量在CA1神经损失由于tangle-related细胞死亡,这似乎与细胞外缠结的存在。
数据可用性声明
在这项研究中生成的数据集是可在请求相应的作者。
道德声明
涉及人类受试者的研究回顾和批准德银Teixits神经从医院Universitari诊所de巴塞罗那(西班牙)和银行(Banco de Tejidos Fundacion CIEN(马德里,西班牙)。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。
作者的贡献
JD LA-N监督和设计项目。DF组织处理。DF和MD-A执行数据采集和初步分析;他们准备数据。LA-N监督数据分析。DF和LA-N起草最初手稿。所有作者修改,导致最后版本的手稿。
资金
这项工作是支持由以下实体:西班牙“Ministerio de Ciencia Innovacion y大学”(批准pgc2018 - 094307 b - i00);Centro de Investigacion en红色尤其心血管Neurodegenerativas (CIBERNED、CB06/05/0066、西班牙);Fundacion为什么联合国明天罪(Leon,西班牙)和老年痴呆症;阿尔茨海默病协会(禅- 15 - 321663)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
确认
我们要感谢曾巴尔德斯,卡门·阿尔瓦雷斯和米里亚姆马林技术援助和g . Leon-Espinosa p Merino-Serrais处理组织的帮助。作者还要感谢德银Teixits神经从医院Universitari诊所de巴塞罗那(即博士费雷尔,Servicio de解剖学Patologica, IBIDELL-Hospital de bellvige大学巴塞罗那,西班牙)和银行(Banco de Tejidos Fundacion CIEN (a . Rabano博士区域de Neuropatologia Centro老年痴呆症,Fundacion雷纳索非亚,马德里,西班牙)提供人类大脑组织。我们也想感谢尼克·格思里有用的评论和优秀的编辑援助。
缩写
ABC, avidin-biotin复杂;Aβamyloid-β;广告,阿尔茨海默病;钙、角ammonis字段;DG,齿状回;海关,海马硬化;红外、免疫反应性的;MTL、内侧颞叶;非功能性测试,神经原纤维缠结;公积金τ成对螺旋细丝τ蛋白;SD,标准差。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnana.2019.00099/full补充材料。
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关键词:amyloid-β蛋白质、痴呆、海马结构神经元密度、斑块密度、神经退化,体视学
引用:Furcila D, Dominguez-Alvaro M, DeFelipe J和Alonso-Nanclares L(2019)分区域密度的神经元,海马神经原纤维缠结和淀粉样斑块的阿尔茨海默氏症患者。前面。Neuroanat 13:99。doi: 10.3389 / fnana.2019.00099
收到:2019年6月10日;接受:2019年11月28日;
发表:2019年12月19日。
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*通信:莉迪亚Alonso-Nanclares,aidil@cajal.csic.es