自动化个性化Size-Varying和触摸在猕猴大脑神经细胞显微图像gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

大脑中枢神经系统的主要部分和控制了大部分的身体功能。它是由一个数十亿的神经元网络,范围从5到30μm直径(gydF4y2Ba安徒生et al ., 2016gydF4y2Ba)。信息数量、形态(大小和形状等),和分销(神经元的密度和方向等)在健康和疾病研究大脑发育至关重要。这些研究包括开发、老化(gydF4y2Ba威廉姆斯和Herrup, 1988年gydF4y2Ba;gydF4y2BaPakkenberg甘德森,1997gydF4y2Ba;gydF4y2Ba拉森et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2BaPelvig et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2BaKarlsen Pakkenberg, 2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaWalløe et al ., 2014gydF4y2Ba),cyto-architecture (gydF4y2Ba安德烈et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2Ba安徒生et al ., 2016gydF4y2Ba)和神经退化(gydF4y2Ba星期四et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2BaWaldvogel et al ., 2015gydF4y2Ba)。然而,这些研究是具有挑战性的,因为不同的大小和颜色强度的神经元,高密度在某些地区,大细胞层面图像信息内容。在本文中,我们定义接触联系的神经元,神经元和/或神经元似乎重叠,因为隐式投影的三维(3 d)样本到一个二维(2 - d)的形象。在实践中,体视学(gydF4y2Ba甘德森1986gydF4y2Ba;gydF4y2Ba西方et al ., 1991gydF4y2Ba;gydF4y2BaJelsing et al ., 2006gydF4y2Ba)是神经生物学家所使用的参考方法评估细胞的数量在一个感兴趣的区域(ROI)。当正确地使用这种技术是健壮的和公正的,但依靠冗长而乏味的人工干预。此外,测量的准确性主要取决于三个因素:(1)解剖区域的复杂性(细胞密度和组织),(2)方法的参数(如数量或大小的部分被认为是和抽样的视神经解剖器需要调整),和(3)在体视学操作员的经验。gydF4y2Ba

今天,更先进的技术和更详尽的研究细胞个性化正在开发使用新的自动图像处理方法。相反,体视学,考虑整个样品的厚度,只能处理细胞部分嵌入式领域的观点,只有图像处理方法获得扁平的二维图像。数学形态学(gydF4y2BaNedzved et al ., 2000gydF4y2Ba;gydF4y2Ba蜀et al ., 2013gydF4y2Ba)可以应用于段部分接触细胞使用开放操作或最终残留,但只有努力在低密度区域。方法基于凹度检测(gydF4y2Ba白et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2BaKothari et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba气,2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba里奇奥et al ., 2019gydF4y2Ba)允许凹点的轮廓动人的细胞被发现。接触细胞可以使用椭圆注册或最佳分离距离变换算法,但由于噪声往往存在虚假的凹点。不可能将这种方法应用于高密度凹陷可能不存在的情况。区域增长(gydF4y2BaZucker 1976gydF4y2Ba;gydF4y2Ba亚当斯和女孩,1994年gydF4y2Ba)可以单独接触如果检测到合适的种子细胞。否则,非探测或overdetection种子将导致,分别undersegmentation或oversegmentation。分水岭算法被广泛用于单独接触细胞(gydF4y2BaCousty et al ., 2009gydF4y2Ba),但容易产生oversegmentations和undersegmentations主要是由于噪声的图像。提出了缓解oversegmentation、算法选择合适的初始种子(gydF4y2Ba杨et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba李et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba蜀et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba政府高级官员et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba徐et al ., 2014gydF4y2Ba)。同样的,如果得到适当的初始轮廓,主动轮廓也可以避免oversegmentation (gydF4y2Ba李et al ., 2008gydF4y2Ba)。Graph-cut方法(gydF4y2BaDaněk et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaAl-Kofahi et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2Ba卢et al ., 2012gydF4y2Ba)今天也很受欢迎,因为他们强大的噪音和整合视觉信息和拓扑约束。然而,这些方法不能解决的问题oversegmentation undersegmentation甚至在简单的情况下,只有少数细胞聚合。iCut算法(gydF4y2Ba他et al ., 2015年gydF4y2Ba)提出了个性化接触细胞,但不能单独非常密集的地区(如人口聚集的细胞。亚区、齿状回(DG)的海马体]由于缺乏凹点。此外,这种方法产生的非天然的定期个性化的结果gydF4y2Ba先天的gydF4y2Ba固定细胞的大小。近年来,深度学习技术的出现导致了多个应用程序为分析复杂的细胞组织学部分(gydF4y2BaKainz et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba谢et al ., 2016gydF4y2Ba)。在gydF4y2BaKainz et al。(2015)gydF4y2Ba距离的函数,最中心的细胞是用来识别细胞中心。然而,一个参数对应于对象的平均尺寸需要固定gydF4y2Ba先天的gydF4y2Ba,不能调整,使其适应不良size-varying细胞或非常密集的地区。一个完全卷积回归网络(FCRN,gydF4y2Ba谢et al ., 2016gydF4y2Ba)提出了执行一个回归的一个细胞空间密度地图,提供细胞的数量的估计。然而,高斯模型认为固定模型的每个单元格(的中心gydF4y2BaσgydF4y2Ba= 2)不能适应size-varying细胞。此外,作者报告说他们的方法给了错误的预测的情况下大约圆形细胞集群分布有四个或更多的细胞。然而,像DG包含成千上万的聚合细胞区域。深度学习,另外,需要大量的手工分割训练图像和计算昂贵。到目前为止,数量有限的方法已经被提出了个性化接触细胞由于问题的复杂性和多样性的配置(细胞类型、免疫组织化学染色和数字化系统,等等)。神经元的大量的聚合(例如,DG),这些方法可以产生令人满意的结果。此外,以往的研究一直在进行特定数据呈现稳定的对象大小和密度,使这些方法既不一般也不适应size-varying对象(如神经元。gydF4y2Ba

本文报告一个新的图像处理协议旨在自动个性化size-varying和触摸神经元和提供了一个严格的和广泛的验证。实验进行猕猴大脑部分通过免疫组织化学染色使用神经核(NeuN)抗体。在数字化图像噪声降低了高斯滤波。由于大型神经元大小的不确定性,这应该是自适应去噪步骤。通过一个原始枚举方法,值的高斯滤波器的宽度进行了测试在一个现实的范围,并在本地最佳的一个被选中当稳定的个性化在细胞水平上产生的结果。神经元中心位置和边界信息被min-max增强滤波(gydF4y2Ba你et al ., 2016gydF4y2Ba)。最后,使用contour-based模型神经元进行个性化。个性化这一研究获得的结果是有前途的。的gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数的神经元计数使用我们的方法等于0.816±0.062的roi和可以实现更高的分数在菌丝层0.905±0.001。我们所知,该方法提出了独特的能力来处理大规模接触DG的神经元gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数高于0.85。此外,该方法最终与一种适应体视学技术相比,这是黄金标准技术用于生物学。结果显示高线性相关与体视学(两位专家分别为0.983和0.975),使我们的方法承诺进行进一步的生物研究。gydF4y2Ba

我们的贡献如下。(1)我们提出了一个原始的多尺度协议个性size-varying和无数动人的神经元。(2)我们建立了三个可靠的图像数据集很大,高度变量,代表猕猴大脑的复杂性(解剖区域,神经元密度,神经元大小)从17个主要解剖区域。(3)我们手动生成四个大型参考数据库与地面实况的贡献五生物学和图像处理领域的专家(分割和计数)。(4)该方法与分水岭可视化和定量指标。(5)最初,该方法与体视学。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

生物材料gydF4y2Ba

按照法国规定所有动物实验进行了(2010/63 / EU-French农村行动代码指令R 214 - 87 - 131)。动物设施由兽医检查人员(授权没有授权。D 92-032-02)和人道关怀和使用符合标准的实验动物实验室动物福利办公室(OLAW-no。# A5826-01)。gydF4y2Ba

这项工作进行一个9岁的健康成年雄性猕猴猕猴gydF4y2Ba猕猴属fascicularisgydF4y2Ba。安乐死后,它的大脑从头骨和冻结。大脑被切成40-μm-thick串行日冕部分。八交错系列生产,导致0.32毫米空隙之间一系列的连续两个部分。约133一个系列的大脑部分彩色NeuN使用神经元的标记。这些部分是使用张幻灯片数字化成像明视场扫描仪(Axio扫描。Z1,蔡司)的平面分辨率0.22μm(×20放大)。在当前的工作,三个大脑部分的一个子集,第81,第91和第101节(指出号。81、91和101;gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba),沿着rostro-caudal轴从大脑皮层额极尾结束的选择和加工。他们是最常见的代表神经元分布在整个大脑。它们包含17个主要解剖区域(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba):皮质、海马、丘脑等。每个数字化大脑部分对应于大约140 GB的数据。gydF4y2Ba

数据集gydF4y2Ba

同时作为染色协议进行组织学分析部分,章节之间的染色被认为是类似的处理,染色强度没有偏见。章节号。81年,101年被选为学习分割的神经元染色和部分91号测试个性化的方法。然后,得出了本研究的三个不同的数据集。gydF4y2Ba

学习如何段神经元染色,一百代表图像的分割数据集(512×512像素像素)从章节号。81年,101年被提取(gydF4y2Ba补充数据1 - 3gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba)和手动划分为三个类(神经元染色、non-stained组织和背景)由一个专家。gydF4y2Ba

验证个性化方法,58岁的个性化数据集图像像素(5000×5000像素)提取部分91号(gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充表3gydF4y2Ba)呈现不同的神经元密度和不同的解剖区域被创建。在这些图片中,每个神经元是手动确定由一个专家在其中心,指出质心邻国之间的强度是最黑暗的,提供信息的位置和神经元的数量(约0 - 4000个神经元/图像)。gydF4y2Ba

比较我们与stereological神经元计数的方法,解剖体视学数据集包括八大图片(包括3×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba1.2×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba像素)从解剖六个区域选择提供范围广泛的神经元密度生成(gydF4y2Ba补充图6gydF4y2Ba)。神经元计数方法基于二维图像处理处理平图片(单焦点设置),不允许我们区分整个神经元出现在组织切片和部分神经元产生表面的部分在切割过程中。我们选择了光学解剖器方法作为参考来评估我们的方法,但是我们没有考虑死区能够比较这两种方法。通过这种方式,可以评估个性化过程,但一个小偏差在计算过程中,介绍了可能导致overdetection由于部分嵌入神经元。两个生物学家专家估计,这些图片上的神经元数量在显微镜下直接(徕卡DM6000)软件墨卡托(Explora新星,gydF4y2Ba补充图7gydF4y2Ba使用一种适应体视学技术)。gydF4y2Ba

组织学部分被NeuN染色的表达存在于细胞核和细胞质的神经元。细胞核染色颜色较深,打火机在细胞质中。gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba显示了横向的三个组织学图像像素强度从低到高神经元密度。神经元染色,NeuN被认为是紧凑的在这项研究中(磁盘形状近似)。扭转强度的横向剖面被认为是类似于高斯分布。因此,我们这个空间配置文件通过一个高斯分布建模gydF4y2BaσgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba作为参数,这可以被视为一个像素的概率密度神经元像素。gydF4y2BaσgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba可以评估的直径gydF4y2BadgydF4y2Ba感兴趣的一个神经元(河内)根据西格玛规则(gydF4y2BaPukelsheim 1994gydF4y2Ba):gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaμgydF4y2Ba神经元是期望,解释为重心,gydF4y2BaσgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba空间标准差,相关神经元的大小。gydF4y2BaxgydF4y2Ba从高斯分布的随机变量是一个观察。gydF4y2Ba

考虑到直径最大的神经元是30μm (gydF4y2Ba安徒生et al ., 2016gydF4y2Ba)(约在20×136像素放大),我们计算出的值gydF4y2BaσgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba根据空间分辨率不如23像素用于这项工作。考虑适当的抽样计算测试中,我们研究了整数的值gydF4y2BaσgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba从1到23个像素。gydF4y2Ba

段单个神经元,一般的想法是首先提取神经元类相对应的像素,然后单独接触神经元,可以转换为神经元的质心检测的问题。检测前,先前去噪步骤是由应用高斯滤波器参数化gydF4y2BaσgydF4y2Ba。局部最小值对应于预期重心可以检测到该min-max过滤器,这是健壮的方式能够提高信息的重心以及神经元的轮廓(参见“重心检测基于min-max筛选器”)。参数的选择gydF4y2BaσgydF4y2Ba影响最终的检测结果。一个小的值gydF4y2BaσgydF4y2Ba不能删除所有的噪音导致overdetection min-max质心的过滤器,而一个大的价值gydF4y2BaσgydF4y2Ba将在平滑图像质心的underdetection。我们认为本文的重心可以正确检测到当高斯滤波器的参数是高斯随机过程模型的适应。因此,参数gydF4y2BaσgydF4y2Ba高斯滤波器的定义的gydF4y2BaσgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba估计过程。感人的神经元,估计gydF4y2BaσgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba通过分析计算的所有个性化的结果,相关的所有可能值吗gydF4y2BaσgydF4y2Ba(从1到23像素)。我们假设gydF4y2BaσgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba与当地相关的一个稳定个性化的结果。在实践中,这是通过考虑至少两个连续的gydF4y2BaσgydF4y2Ba稳定,使个性化的结果(参见“最优估计gydF4y2BaσgydF4y2Ba”)。一次最优gydF4y2BaσgydF4y2Ba用于每个神经元估计,我们应用自适应高斯滤波器来减少噪声检测大小不一的质心的神经元,我们执行最后的个性化。通用工作流的方法提出了gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

组织分割gydF4y2Ba

一个随机森林(RF)模型(gydF4y2BaBreiman 2001gydF4y2Ba100年),包括决策树组织分割,生成使用gydF4y2Ba分类数据集gydF4y2Ba分为两个子集,一个学习集和验证集。17岁的特性(R, G, B, H, S, V, X, Y, Z, LgydF4y2Ba^∗gydF4y2Ba,一个gydF4y2Ba^∗gydF4y2BabgydF4y2Ba^∗gydF4y2BaM V, LBP10 LBP40和LBP63)生产射频模型进行了研究。其中,四个主要颜色空间定义为CIE(委员会内部de l 'Eclairage)被认为是。他们是RGB(红、绿、蓝),HSV(色相、饱和度、价值),XYZ (CIE颜色空间,代表感知一致性),和LgydF4y2Ba^∗gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^∗gydF4y2BabgydF4y2Ba^∗gydF4y2Ba(一个典型的CIE颜色空间转换非线性从XYZ) (gydF4y2Ba程et al ., 2001gydF4y2Ba)。M和V分别是灰度强度的平均值和方差计算的十字架10像素。局部二进制模式(LBP)是一个纹理特征(gydF4y2Ba小王和他,1990年gydF4y2Ba;gydF4y2BaOjala et al ., 2002gydF4y2Ba)计算磁盘。这个盘的半径是固定的,40岁,在这项研究中,63个像素对应的半径小,平均和大型神经元。生产射频模型最优特性,同时保持令人满意的分割性能,我们选择了四个特性,LgydF4y2Ba^∗gydF4y2BaM V, LBP40,逐步选择同时保持最佳人选从整个组执行基于连续测试功能。这个选择的功能确认在以往的研究中,旨在客观地确定最优特性,指出,众多组合能够产生申请人分割(gydF4y2BaVandenberghe et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaBouvier et al ., 2018gydF4y2Ba)。这种策略的选择提供相关的,有限的,和可理解的特性与深度学习技术相比,可以吸收黑匣子。以前作品进行组织学部分支持我们的选择以及基于该方法的鲁棒性(gydF4y2BaVandenberghe et al ., 2015gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2018年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba个性化数据集gydF4y2Ba随后基于RF模型划分为三类。在实践中,中值滤波器(7×7像素像素)应用于减少impulsional噪音和调整神经元在二进制图像轮廓。然后,连接组件呈现的表面面积低于三分之一的最小的神经元(估计127像素)被移除。这一步可能删除部分检测到神经元,它们的大小计算是不够的。神经元类的二进制映像被指出gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

选择最优gydF4y2BaσgydF4y2Ba为每一个预期的神经元gydF4y2Ba

执行下列程序在每个连接组件,这是基于计算gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

大脑中的神经元大小是可变的(从5到30μm直径),重要的是要估计最优gydF4y2BaσgydF4y2Ba正确的高斯滤波器应用到检测size-varying神经元的重心在多个脑区使用min-max过滤器。最优的参数gydF4y2BaσgydF4y2Ba高斯滤波器的估计在接下来的三个步骤。gydF4y2Ba

质心检测基于Min-Max过滤器gydF4y2Ba

检测神经元质心进行灰度图像gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba的平均R, G, B通道的原始彩色图像(gydF4y2BaHanbury 2008gydF4y2Ba)。灰度图像与高斯过滤内核(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_{女朋友gydF4y2Ba})和non-neuron像素掩盖了(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_gfmgydF4y2Ba)。这张照片是用作输入到一个原始min-max过滤器(gydF4y2Ba你et al ., 2016gydF4y2Ba)导致一个极值映射(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_egydF4y2Ba)。简单地说,每一个像素gydF4y2BaogydF4y2Ba的gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_gfmgydF4y2Ba,让gydF4y2BaD (r, o)gydF4y2Ba磁盘(不包括gydF4y2BaogydF4y2Ba)的半径gydF4y2BargydF4y2Ba集中在gydF4y2BaogydF4y2Ba,gydF4y2BaN (D)gydF4y2Ba像素的数量gydF4y2BaD (r, o)gydF4y2Ba,gydF4y2Ba马克斯(o)gydF4y2Ba像素的强度值的数量gydF4y2BaD (r, o)gydF4y2Ba较低或等于gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_gfmgydF4y2Ba(o)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba分钟(o)gydF4y2Ba数量的像素强度值优于gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_gfmgydF4y2Ba(o)gydF4y2Ba。计算值是:gydF4y2Ba

因此,像素,其价值是−1被定义为最小值的本地磁盘,而其价值是1被定义为最大值。gydF4y2BargydF4y2Ba固定到10像素对应于预期的最低神经元半径(2.5μm)。两步过程(高斯滤波结合min-max滤波)可以重复迭代gydF4y2BangydF4y2Ba*完善极值映射。人口聚集的神经元,执行这个过程一次不足以区分他们从染色强度太相似,甚至等于提取理想的最小值。此外,在少数情况下,如果一个神经元是完全的强度高于周边神经元,其相应的最小值无法确定。相反,多次迭代会导致过度增强自方程(2)在固定半径的圆盘迭代计算gydF4y2BargydF4y2Ba。因此,需要找到一个妥协。gydF4y2BangydF4y2Ba迭代的数量,设置gydF4y2BangydF4y2Ba= 2(见部分”的迭代次数gydF4y2Ban”gydF4y2Ba)。对于一个给定的值gydF4y2BaσgydF4y2Ba神经元,−1像素的值被选为重心,和每个重心被分配一个唯一的标签(gydF4y2BaidgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

神经元个性化竞争地区增长gydF4y2Ba

神经元个性化进行基于离散contour-based模型的使用。轮廓被初始化为gydF4y2BargydF4y2Ba_0gydF4y2Ba-pixel-radius (1 rgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba< 10)圈子集中在每一个重心,和内所有像素的轮廓被分配重心的标签(gydF4y2BaidgydF4y2Ba)。神经元边界的强度gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_egydF4y2Ba接近它的最大值,我们建议给每个轮廓点不断扩大的速度取决于轮廓曲率和吗gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_egydF4y2Ba的强度。如果轮廓曲率较小的和/或一个点gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_egydF4y2Ba的强度在一个点是深色(远离边界),扩张速度应该更快,反之亦然。让gydF4y2BapgydF4y2Ba是一个轮廓点,gydF4y2Baκ(p)gydF4y2Bacurvature-dependent项,gydF4y2Bah (p)gydF4y2Baintensity-dependent术语,gydF4y2BaogydF4y2Ba神经元质心的位置。下一个位置gydF4y2Bap 'gydF4y2Ba的gydF4y2BapgydF4y2Ba计算为:gydF4y2Ba

让gydF4y2Bak (p)gydF4y2Ba轮廓曲率点gydF4y2BapgydF4y2Ba和gydF4y2BacgydF4y2Ba用户选择一个预定义的曲率。gydF4y2BaKgydF4y2Ba(p)gydF4y2Ba由公式(1)计算,使轮廓曲率小于扩张吗gydF4y2BacgydF4y2Ba(gydF4y2Bak (p) < cgydF4y2Ba)和曲率大于萎缩gydF4y2BacgydF4y2Ba(gydF4y2Bak (p) > cgydF4y2Ba)计算:gydF4y2Ba

intensity-dependent术语的灵感来自于工作gydF4y2BaPerona一起和马利克(1990)gydF4y2Ba。让gydF4y2BatgydF4y2Ba是一个经验系数设置为0.8×max (gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_egydF4y2Ba)。gydF4y2Bah (p)gydF4y2Ba计算为:gydF4y2Ba

每个进程后,轮廓是由一个均值滤波平滑。这是实现为每个轮廓点的平均位置信息通过两个相邻的邻居点。然后,连续两个点之间的距离gydF4y2BapgydF4y2Ba和gydF4y2Ba问gydF4y2Ba检查;如果是优于一个预定义的最大距离gydF4y2BadgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba},新的点插值自动根据:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaNgydF4y2Ba代表新的插入点的数量,gydF4y2BapgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba是gydF4y2Ba我gydF4y2Ba点插入。gydF4y2Ba

每个轮廓像素点gydF4y2BapgydF4y2Ba在gydF4y2BadgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}距离检查。较近的像素重心相比gydF4y2BapgydF4y2Ba和没有标记分配他们的重心gydF4y2BaidgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

所有细胞轮廓连接组件过程中产生神经元类分割同时扩大,和等高线穿过被禁止。可能连接组件上执行个性化可以大规模并行化的过程。在我们的实验中,我们固定扩大的迭代的数量100。这个数字可以任意高,应该选择这样计算时间是足够低,使轮廓达到每个神经元边界。当几个细胞轮廓扩大太近,新扩展位置可能进入另一个细胞。这是被禁止的,扩张停止了。这个过程的最后,标记像素可能存在,他们分配给一个标签根据他们的邻居在一个3×3窗口通过多数投票。gydF4y2Ba

最优估计gydF4y2BaσgydF4y2Ba

这种个性化的方法使用一个gydF4y2BaσgydF4y2Ba整个数据集固定参数导致overindividualization由于不适当的价值和个性化gydF4y2BaσgydF4y2Ba治疗神经元呈现不同的大小。因此多尺度策略集成在这个工作要解决这个大问题。然后我们测试所有可能的值gydF4y2BaσgydF4y2Ba获得相关信息重心、标签和轮廓的神经元,我们估计最优gydF4y2BaσgydF4y2Ba对于每一个预期的神经元在每个连接组件。我们之间的关系进行了分析gydF4y2BaσgydF4y2Ba端依赖轮廓图像和地图上积累的轮廓计算加法gydF4y2BaσgydF4y2Ba端依赖轮廓来估计的最优值gydF4y2BaσgydF4y2Ba对于一个预期的神经元。我们的假设是一致连续的值gydF4y2BaσgydF4y2Ba应该产生相似的或关闭轮廓,将累积在相同的位置。gydF4y2Ba

图4gydF4y2Ba显示了根据个性化的结果gydF4y2BaσgydF4y2Ba值。gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba介绍了原始图像的连接组件包括三个神经元。gydF4y2Ba图4 b-jgydF4y2Ba显示gydF4y2BaσgydF4y2Ba端依赖标签图像重叠与质心探测到。gydF4y2Ba图4 n-vgydF4y2Ba显示gydF4y2BaσgydF4y2Ba端依赖轮廓图像。gydF4y2Ba图4米gydF4y2Ba是积累的地图轮廓,gydF4y2Ba图4 kgydF4y2Ba是最优的地图吗gydF4y2BaσgydF4y2Ba确定。gydF4y2Ba图4 wgydF4y2Ba说明了个性化结果由该方法制造的。在gydF4y2Ba图4我gydF4y2Ba,关闭个性化结果对应于相同数量的神经元检测得到的连续值gydF4y2BaσgydF4y2Ba从8到11。它被定义为一个稳定的状态(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba图4 jgydF4y2Ba提出了另一个稳定状态gydF4y2BaσgydF4y2Ba从12至23日。在这个例子中,当稳定状态存在gydF4y2BaσgydF4y2Ba从8点到11点变化(gydF4y2BaEgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba图4我gydF4y2Ba从12至23日()和gydF4y2BaEgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba图4 jgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

接下来,我们分析了gydF4y2BaσgydF4y2Ba端依赖神经元轮廓。当时的想法是先合成这些信息在地图上积累的轮廓(gydF4y2Ba图4米gydF4y2Ba),它是由加法计算gydF4y2BaσgydF4y2Ba端依赖轮廓的所有可能的值gydF4y2BaσgydF4y2Ba。点的高强度值映射描述神经元之间接触区轮廓的概率更高。因为连接组件包括至少一个或多个神经元和神经元没有先验信息的大小,强度值对应于真实轮廓的地图可能会有所不同。因此,找到最佳的轮廓,我们提出研究中的所有可能遇到的强度水平积累了轮廓的地图使用一个阈值gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba从1到23。这种方法使我们能够检测小和大量的连续值gydF4y2BaσgydF4y2Ba生产稳定的轮廓的神经元。阈值之间的相似准则,每个地图gydF4y2BaσgydF4y2Ba端依赖轮廓计算结果根据骰子的分数:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaNgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba像素的数量吗gydF4y2BaσgydF4y2Ba结果端依赖轮廓,gydF4y2BaNgydF4y2Ba_{作为gydF4y2Ba}像素的数量吗gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba端依赖阈值映射gydF4y2BaNgydF4y2Ba_cgydF4y2Ba是像素的数量都存在于同一空间位置gydF4y2BaσgydF4y2Ba端依赖轮廓结果和gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba端依赖阈值映射。这个计算是在连接组件级别执行。骰子得分变化在0和1之间(完美叠加)。gydF4y2Ba

表1gydF4y2Ba连接组件的列表骰子分数计算中给出的例子gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba。值越接近1,越多gydF4y2BaσgydF4y2Ba端依赖轮廓相似gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba端依赖阈值映射。然后,我们固定一个骰子阈值(gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_{骰子gydF4y2Ba}),它定义了一个足够两个轮廓之间的相似性。这个阈值计算如下:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaEgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba代表一个稳定状态的集合gydF4y2BaEgydF4y2Ba= {gydF4y2BaEgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba,gydF4y2BaEgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba、…gydF4y2BaEgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba}(gydF4y2Ba米gydF4y2Ba理论上≤11日11稳定状态)。gydF4y2Ba卡gydF4y2Ba(gydF4y2Baσ∈EgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)的数量gydF4y2BaσgydF4y2Ba属于国家的gydF4y2BaEgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba。0.8是一个阈值参数定义的经验。gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba,给一个固定的gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba,蓝色的数字比gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_{骰子gydF4y2Ba}局部极大值。这意味着相应的gydF4y2BaσgydF4y2Ba提供本地最个性化的结果。给一个固定的gydF4y2BaσgydF4y2Ba,当gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba增加,overindividualization降低的影响,但相反在个性化的风险增加。如果存在至少两个连续的最大价值的骰子,这个gydF4y2BaσgydF4y2Ba被选中作为一个候选人。的例子gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba,最佳的候选人gydF4y2BaσgydF4y2Ba5、8、9、12(红色gydF4y2BaσgydF4y2Ba列)。gydF4y2Ba

然后生成最优的地图gydF4y2BaσgydF4y2Ba保存的最优值gydF4y2BaσgydF4y2Ba应用时要申请每个神经元自适应高斯滤波。相对应的像素神经元在这张地图上被初始化gydF4y2BaσgydF4y2Ba= 23。最优的研究gydF4y2BaσgydF4y2Ba从执行的最大价值gydF4y2BaσgydF4y2Ba最小的候选人。为每一个gydF4y2BaσgydF4y2Ba研究个性化结果进行了比较gydF4y2BaσgydF4y2Ba+ 1的结果,因为gydF4y2BaσgydF4y2Ba结果可能导致overindividualization−1。如果任何两个过程的个性化gydF4y2BaσgydF4y2Ba和gydF4y2BaσgydF4y2Ba+ 1足够相似的(gydF4y2Ba骰子(随机过程gydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}(σ),陈列gydF4y2Ba_bgydF4y2Ba(σ+ 1))gydF4y2Ba> 0.95,神经元区域再现性,方程(9)],这个值gydF4y2BaσgydF4y2Ba被选为最优的一个个性化的过程和更新地图的最优gydF4y2BaσgydF4y2Ba。如果不是这样,gydF4y2BaσgydF4y2Ba保持它的前一个值。gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba随机过程gydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}(σ)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba随机过程gydF4y2Ba_bgydF4y2Ba(σ+ 1)gydF4y2Ba分别代表一个过程的个性化gydF4y2BaσgydF4y2Ba和gydF4y2BaσgydF4y2Ba+ 1,gydF4y2Ba年代(随机过程gydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}(σ)]gydF4y2Ba和gydF4y2Ba年代(随机过程gydF4y2Ba_bgydF4y2Ba(σ+ 1))gydF4y2Ba分别代表的表面gydF4y2Ba随机过程gydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}个性化的gydF4y2BaσgydF4y2Ba的表面gydF4y2Ba随机过程gydF4y2Ba_bgydF4y2Ba个性化的gydF4y2BaσgydF4y2Ba+ 1,gydF4y2Ba年代(随机过程gydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}(σ),陈列gydF4y2Ba_bgydF4y2Ba(σ+ 1))gydF4y2Ba是像素的数量在同一空间位置存在于两个过程的个性化。0.95定义的经验。gydF4y2Ba

请注意,神经元密度DG在大脑中是最高的。成千上万的神经元聚集,DG形成一个非常大的连接组件。此外,根据染色神经元相似大小在这个地区。检测神经元的DG地区因此非常敏感的参数gydF4y2BaσgydF4y2Ba高斯滤波器。然而,神经元大小DG多样性较低,使其可以应用一个固定值gydF4y2BaσgydF4y2Ba。评估这gydF4y2BaσgydF4y2Ba,我们选择了所有的图像包括个性化的DG数据集(7 58图片)。然后,新生成的二进制图像保持唯一的总干事。这些二进制图像,我们计算了23gydF4y2BaσgydF4y2Ba端依赖个性化结果使用该方法和地面真理(手动计算在同一地区)。使用部分中描述的评价方法”的自动和手动神经元计数比较,“最优gydF4y2BaσgydF4y2Ba决心,细节将提供部分的“最优gydF4y2BaσgydF4y2BaDG的地区。“总干事代表只有很小一部分总额的数据处理和是唯一的地区要求通用协议适用。gydF4y2Ba

使用最优自适应神经元个性化gydF4y2BaσgydF4y2Ba

在这个阶段,我们定义了一个无监督自动确定最优的策略gydF4y2BaσgydF4y2Ba应用到每一个过程的。然后我们应用两步过程(使用地图的最优自适应高斯滤波gydF4y2BaσgydF4y2Ba作为参数和min-max过滤)检测不同大小的最终质心的神经元。两步过程应用两次(优化节”——的迭代次数gydF4y2Ban”gydF4y2Ba),因为根据真实数据实验结果,一个迭代导致underdetection重心,超过两个迭代导致overdetection。质心检测到被选为初始种子区域生长过程基于离散contour-based模型导致最后的个性化的结果。gydF4y2Ba

神经元个性化的评价方法gydF4y2Ba

该方法与分水岭算法(gydF4y2BaCousty et al ., 2009gydF4y2Ba),它定义了分水岭削减基于原理滴水的地形表面。作为分水岭对噪声很敏感,一个预处理步骤是必要的。我们使用高斯滤波器来减少噪音的个性化数据集的照片。的选择gydF4y2BaσgydF4y2Ba是至关重要的,因为我们没有gydF4y2Ba先天的gydF4y2Ba神经元大小的信息。因此,与最优高斯滤波器gydF4y2BaσgydF4y2Ba计算每个陈列的方法应用在使用分水岭算法。gydF4y2Ba

神经元的个性化的质量评价三种评价方法,介绍了在以下部分。gydF4y2Ba

自动和手动的比较神经元计数gydF4y2Ba

相对计数错误gydF4y2BaεgydF4y2Ba被用来验证神经元计数(gydF4y2BaKothari et al ., 2009gydF4y2Ba)。这是定义为自动化之间的绝对差(gydF4y2BaNgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}count()和专家gydF4y2BaNgydF4y2Ba_egydF4y2Ba)除以专家数:gydF4y2Ba

相对计数误差越小,计算的更精确的自动化方法。gydF4y2Ba

此外,补充个性化评分考虑神经元的colocalization个性化使用自动化的方法相对于质心指出专家的定义。如果一个专家重心自动检测神经元区域是重叠的,这被认为是一个真正的积极。否则,它要么是oversegmented(0专家质心)或undersegmented(超过1专家重心)。回忆(R)、精密(P)、和gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数(F)是根据计算:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaNgydF4y2Ba_tgydF4y2Ba是正确的数量自动分段神经元(真阳性),gydF4y2BaNgydF4y2Ba_egydF4y2Ba专家统计,gydF4y2BaNgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}自动计数的神经元。gydF4y2Ba

更大的价值gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数,达到更好的性能的方法。这种验证方法被广泛使用在以前发表的作品(gydF4y2BaAl-Kofahi et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2Ba蜀et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba他et al ., 2015年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba也不会et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaMolnar et al ., 2016gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

这两种验证方法是通用的,但不考虑分段神经元的特定属性(例如,个性化的质量和形状/轮廓精度)。这使我们提出第二个方法。gydF4y2Ba

研究重心的位置和神经元的轮廓gydF4y2Ba

这种方法是考虑当地的利益空间信息在单个神经元水平。专家手动分割单个神经元标记他们的重心和吸引他们的轮廓。耗费时间的,因为这是一个巨大的工作,我们提出了一个折衷的方法生产的初步结果基于某些代表图像和评估质量使用以下指标:轮廓的距离(gydF4y2BaDistance_mean_contourgydF4y2Ba)或质心(gydF4y2BaDistance_centroidgydF4y2Ba),自动和手动个性化结果之间重叠部分神经元之间的自动和手动个性化(gydF4y2Ba骰子gydF4y2Ba_{区域gydF4y2Ba})[方程(12)]。代表基于个性化数据集的子集九图像对应七解剖区域(尾状、屏状核、皮层、海马、核菌丝层,和丘脑)被选中。在每个图像,100个神经元是随机选择和分段由一个专家。gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaNgydF4y2Ba_{手册gydF4y2Ba}在轮廓点的数量的专家,gydF4y2BadgydF4y2Ba_{最小值gydF4y2Ba}对于每个点gydF4y2Ba我(我gydF4y2Ba_xgydF4y2Ba,我gydF4y2Ba_ygydF4y2Ba)gydF4y2Ba轮廓画的专家,距离最小的点gydF4y2Baj (gydF4y2Ba_xgydF4y2BajgydF4y2Ba_ygydF4y2Ba)gydF4y2Ba在等高线自动划定的方法中,gydF4y2BadgydF4y2Ba_{的意思是gydF4y2Ba}是神经元之间的平均距离轮廓分段手动和自动,gydF4y2BaCgydF4y2Ba代表神经元轮廓,gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_{手册gydF4y2Ba}是来自神经元表面轮廓的专家,gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_{汽车gydF4y2Ba}是神经元表面自动分割的方法,然后呢gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_{常见的gydF4y2Ba}是手动和自动分段之间的重叠区域神经元。gydF4y2Ba

这些指标允许不同的自动化个性化方法有效地评估。然而,这项工作是有限的由于所需的重要数量的手动操作。gydF4y2Ba后验gydF4y2Ba上面列出的方法(部分“比较的自动和手动神经元计数”和部分”的研究重心的位置和神经元的轮廓”),分别隐含手动处理大约112000个神经元50图像像素(5000×5000像素)和900个神经元在9个图像数据集的个性化。gydF4y2Ba

黄金标准方法评估细胞的数量在一个解剖区域体视学。这使我们第三评价方法。gydF4y2Ba

比较自动化神经元计数和体视学gydF4y2Ba

生物学家被要求估计神经元的数量与定量体视学数据集(8地区)stereological计算技术基于光学解剖器。古典stereological方法相比,死区区域不被认为有可能比较结果与我们的计算方法。两位专家统计每个解剖样本地区的神经元在显微镜下直接使用软件墨卡托。然后,神经元的数量是根据最优抽样估计分数(两个设置测试),和两个计算结果进行了比较(方法与专家)。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

结果之前,重要的是提到个性化数据集包括58图像,八个图片被丢弃。他们关注四个模糊图像(一个尾状的形象,两个图像的皮层,和一个图像内果皮)的专家不能给地面实况和四个图片没有染色组织(两心室的白质和两幅图像的图像)。gydF4y2Ba

参数优化gydF4y2Ba

的迭代次数,gydF4y2BangydF4y2Ba

神经元与不同数量的迭代检测的例子所示gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba。我们发现专家之间的一致的估计和自动化方法获得两次迭代(10质心检测),因为一个迭代min-max地图计算导致underdetection overdetection神经元和三个迭代。min-max地图的两个迭代计算的设置启用探测小,模糊,以及明亮的神经元。gydF4y2Ba

推广这个说明性的示例中,我们将研究扩展到个性化数据集。相对计数错误gydF4y2BaεgydF4y2Ba(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)和gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)被分组计算图像对应于相同的解剖区域(50图像分成七组:尾状、屏状核、皮层、海马、壳核、菌丝层,和丘脑)。gydF4y2Ba

从gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba,我们观察到所有的解剖区域,计算相对误差的最小平均值(0.105±0.114)获得两个迭代。观察结果区域的区域,我们发现在大脑皮层,相对误差是类似的gydF4y2BangydF4y2Ba= 2,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3,但标准差更小gydF4y2BangydF4y2Ba= 2,它提供了更稳定的个性化的结果。屏状核和壳核,虽然相对计算误差更小gydF4y2BangydF4y2Ba= 3,标准偏差更大。考虑到平均相对计算误差,gydF4y2BangydF4y2Ba= 2是执行结果最优处理。gydF4y2Ba

为gydF4y2BaFgydF4y2Ba得分基于gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba,的值gydF4y2BangydF4y2Ba= 2提供了所有的解剖区域的最佳成绩。gydF4y2Ba

总之,选择最优的迭代次数是2。gydF4y2Ba

最优gydF4y2BaσgydF4y2BaDG的地区gydF4y2Ba

前面提到,总干事是一个特定的情况。gydF4y2BaσgydF4y2Ba= 5的最优值gydF4y2BaσgydF4y2Ba确定使用gydF4y2BaFgydF4y2Ba评分标准(方程(11))。gydF4y2Ba

图7gydF4y2Ba显示了gydF4y2BaFgydF4y2Ba得分为gydF4y2BaσgydF4y2Ba不同图像上从1到23只包括DG的地区。平均最大的值是0.885gydF4y2BaσgydF4y2Ba= 5,gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数为每个图像包括DG优于0.850,这代表一个好质量的计算过程。的值gydF4y2BaσgydF4y2Ba4和6之间提供高gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数,这证明我们的选择的鲁棒性。gydF4y2Ba

DG的需要具体过程是合理的,因为事实上它代表一个特定的情况下大规模聚集的小神经元。左边的大小DG 91号对应于10节gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba像素。在实践中,识别相关的DG是简单的连接组件由于其规模小得多的比其他连接组件。gydF4y2Ba

自动和手动的比较神经元计数gydF4y2Ba

在性能方面个性化的神经元,iCut,流域相比,该方法(size-fixed神经元)gydF4y2Ba你et al ., 2016gydF4y2Ba。结果表明,我们的方法提供了最佳的个性化表现。然而,由于iCut的算法复杂度gydF4y2BaO (ngydF4y2Ba^3gydF4y2Ba)gydF4y2Ba,在那里gydF4y2BangydF4y2Ba是前景图像中像素的数量,我们不能与其他个性化数据集的方法进行比较。此外,个性化的size-varying神经元,iCut不再适应,因为独特的参数对象大小是固定的gydF4y2Ba先天的gydF4y2Ba。因此,我们将该方法与个性化数据集上的分水岭。gydF4y2Ba

图8gydF4y2Ba呈现典型的结果在三个不同的图像呈现不同的神经元密度。图像1说明了图像的丘脑地区几个单个神经元,图2代表中等致密皮层区域的形象在这几个神经元相互接触,和图像3代表密度极高的形象DG许多神经元聚集的地区。gydF4y2Ba图8 a1a3gydF4y2Ba是地面真理(红点质心人工注释)。gydF4y2Ba图8 b1b3gydF4y2Ba代表神经元分类结果不足以段单个神经元,神经元进行聚合。gydF4y2Ba图8 c1-c3gydF4y2Ba目前最优的图像gydF4y2BaσgydF4y2Ba评价该方法(本地值估计神经元水平)。gydF4y2Ba图8 d1-d3gydF4y2Ba现在two-iteration min-max地图中神经元中心出现在黑暗与神经元的轮廓出现在bright-intensity值。gydF4y2Ba图8 e1-e3gydF4y2Ba显示了该方法获得的个性化的最终结果。gydF4y2Ba图8 f1-f3gydF4y2Ba目前个性化使用我们最佳的分水岭算法获得的结果gydF4y2BaσgydF4y2Ba地图。在简单的情况下这两种方法都表现良好。然而,在更加复杂的情况下,流域下结果overindividualization和个性化,使分割轮廓不自然(直边界,发现大神经元)。视觉上,该方法提供了更好的神经元个性化的结果。gydF4y2Ba

图9gydF4y2Ba显示了gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数的方法获得50个性化数据集的图像展示其个性神经元有高的能力gydF4y2BaFgydF4y2Ba成绩,尤其是在尾状,皮质,和菌丝层,平均水平gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数分别是0.874、0.877和0.905。的gydF4y2BaFgydF4y2Ba海马的分数计算变化从0.726到0.898由于这个地区的异质性,它包含不同类型和分布的神经元。特别是条件CA2和CA3的某些神经元中心强度却较轻。这些染色的变化可能是由于不合适的染色标记(gydF4y2Ba马伦et al ., 1992gydF4y2Ba)对应于不同的抗原的表达。作为这种神经元的染色不尊重我们的假设,该方法不适合在这种情况下。尽管如此,该方法提供了一个良好的性能(gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数> 0.726)。gydF4y2Ba

同样的评价实现使用分水岭算法产生的结果。的意思是gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数和标准偏差七解剖区域显示在gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba,这表明该方法系统地提供更高gydF4y2BaFgydF4y2Ba每个解剖区域的得分值。此外,该方法的标准偏差越小,这表明一个好的简单和复杂情况下的鲁棒性。gydF4y2Ba

研究重心的位置和神经元的轮廓gydF4y2Ba

个性化的质量流程和方法之间的分水岭算法使用最优gydF4y2BaσgydF4y2Ba地图比较。gydF4y2Ba

图10gydF4y2Ba提出了一种比较综合的结果补充参数研究。这表明神经元分段的方法添加更好的与神经元分段手动分割和分水岭。的平均值gydF4y2Ba骰子gydF4y2Ba_{区域gydF4y2Ba}该方法是0.77和0.72的分水岭。质心检测和分割轮廓,与流域相比,更接近手动分割的专家。质心之间的距离的平均值(gydF4y2BaDistance_centroidgydF4y2Ba)和轮廓之间的距离(gydF4y2BaDistance_mean_contourgydF4y2Ba分别是1.31和0.98μm方法,和1.45和1.26μm分水岭。再一次,我们观察到神经元的个性化使用我们的方法的质量优越而获得的一个分水岭。这些量化指标的主要兴趣,因为他们的简历和确认的定性评价个性化前面提到的gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba。他们提供额外的量化本地和空间信息有关神经元个性化质量。gydF4y2Ba

比较自动化神经元计数和体视学gydF4y2Ba

我们通过比较我们的结果验证了该方法的应用体视学技术光学解剖器的使用方法,这是黄金标准方法在生物学计算对象。没有考虑死区体视学技术使比较在相同的条件下(没有深度信息的图像处理方法)。这种技术是operator-dependent,两位专家(b1和b2)执行计数通过修改采样两次分数获得稳定的神经元的数量估计,保证计算精度高。在这项研究中,抽样比例变化从1/100到1/4八大图像。获得的结果与体视学使用第二个抽样选择(gydF4y2Ba补充表4gydF4y2Ba)。八张照片的表面是非常不同的,神经元密度而不是神经元数量被认为正常使用该方法获得的结果和应用体视学技术。所示的线性回归分析gydF4y2Ba图11gydF4y2Ba。深灰色的颜色代表了置信区间在实线在深蓝色的颜色。神经元密度之间的相关系数计算方法和应用体视学技术由两位专家(b1和b2)。高度相关的值(0.983对0.975 b1和b2)和低假定值(1.20 e-05 e-05 3.76 b1和b2),该方法是很有前途的估计神经元密度和神经元的数量在不同的解剖区域。gydF4y2Ba

在不同的解剖区域神经元平均半径gydF4y2Ba

图12gydF4y2Ba显示个性化的神经元的平均半径不同的解剖区域的猕猴大脑。6总结统计(最低,第一四分位数,平均中位数,第三四分位数和最大)中列出gydF4y2Ba补充表5gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

我们观察到大部分的神经元,它仍在第一和第三个四分位数的范围,在屏状核(平均半径从2.99到4.52μm)和硬膜(平均半径从3.31到4.73不等μm)小于其他区域的神经元(平均半径从3.34到6.02不等μm)。个性化的神经元的平均半径不同在我们的研究中从1到14.3μm(相应的直径从2到28.6μm,五异常值神经元被排除在外),对应很好研究gydF4y2Ba安徒生et al。(2016)gydF4y2Ba世卫组织估计,神经元不同大小的5至30μm直径。非常小的检测神经元可能是由于生产的部分神经元在切割过程中或在数字化问题(焦平面的扫描不集中在神经元,神经元的位置的深度,受损细胞染色,等等)。gydF4y2Ba

执行时间gydF4y2Ba

c++实现的方法是在64位Linux下计算机工作站(CPU:在2.4 GHz Intel Xeon e5 - 2630 v3,内存:128 GB)。23核心的计算机被用于并行计算58个性化的图像数据集[BrainVISA Soma-Workflow模块(gydF4y2BaLaguitton et al ., 2011gydF4y2Ba),CPU并行化)。最后的个性化结果的平均执行时间为15.6 h,也就是说,16.1分钟/×5000像素5000像素的图像。这个执行时间是非常合理和必要的时间来做体视学相比,它是完全适应处理大型图像,尤其是并行化。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

我们提出了一个新颖的方法的个性化size-varying和大量的神经元在微观猕猴大脑图像。我们首先应用一个射频分类器,一个可靠的分割方法,基于四个特性(LgydF4y2Ba^∗gydF4y2BaM V, LBP40)段染色和non-stained组织。这种组合的特性提出了一个有限数量的颜色和纹理特性,得到令人满意的分割结果。替代方法也可以被认为是和插入我们的协议。特别是,卷积神经网络(CNN)的方法是很有前途的方法。作为一个初步测试,我们应用U-net (gydF4y2BaRonneberger et al ., 2015gydF4y2Ba)分割数据集,我们获得类似的分割结果。个性触摸size-varying神经元,我们单独模型每个神经元(质心和轮廓)处理不同大小和密度。该方法调查所有可能的个性化参数化结果gydF4y2BaσgydF4y2Ba内核,它定义了大小的高斯滤波器,然后确定最优gydF4y2BaσgydF4y2Ba为每个有陈列根据骰子的分数。使用这个自适应高斯滤波器和一个原始min-max过滤器,关键信息,如位置(重心)和边界的预期是增强一个极值的地图。执行的多个研究在目前的工作证实了genericity和兴趣使用min-max过滤器。最后,一个离散contour-based模型应用于实现神经元个性化。这个模型是一个健壮的提出分割方法。而不是检查所有邻近像素的初始种子用于传统区域生长方法,该模型分析几个像素离散轮廓。利用信息像素强度极值图和等高线曲率在像素级别,离散轮廓扩大通过竞争的方式。除此之外,使用离散轮廓减轻噪声对神经元轮廓最后分割和节省了执行时间。考虑由U-net一般满意的结果在其他生物数据,未来的工作将很快开始测试U-net个性化接触细胞的能力,因为它是最近提议(gydF4y2Ba福尔克et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

该方法提供了良好的表演定性和定量。值得一提的是,我们的方法是能够处理最困难的案件大量感人的神经元在总干事,这是海马体的一部分。这个地区的海马体是极其复杂的分析。一个有趣的生物学结果是神经元DG地区的大小根据单一的最优值是稳定的gydF4y2BaσgydF4y2Ba估计(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。海马体包含一个广泛的神经元具有不同大小和不同类型的神经元在几个条件(CA2和CA3),从而导致不同的染色和最优个性化的结果。的gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数的CA2和CA3 0.726和0.788之间变化。然而,的意思是gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数在海马体仍然达到0.816,表示,一些条件(CA1、CA4和DG)海马体是可以治愈的方法。大部分的生物研究旨在计算神经元避免目标这一地区由于其复杂性和支持定量测量的光学密度(gydF4y2BaBrureau et al ., 2017gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

该方法是与流域相比,个性化方法在文献的引用。除了gydF4y2BaFgydF4y2Ba分数上面所描述的那样,三个补充标准本文提出:重心之间的平均距离,轮廓之间的平均距离,骰子叠加。根据这些标准,神经元方法个性化的叠加与手工分割结果优于分水岭方法(0.77比0.72流域)。此外,重心和轮廓分割方法更接近分段的专家紧密(分别为9.98和21.89%)比分水岭。因此,该方法被证明是一种有效的方法来正确识别质心和准确估计神经元轮廓的位置。所有可用数据集产生的这项研究将使公平的基准测试。gydF4y2Ba

为了进一步验证该方法,我们也应用体视学,域中的黄金标准,到一个专用的数据集与两位专家的参与。他们被要求估计各解剖roi神经元的数量,选择符合他们对生物学的兴趣。因此,我们获得了广泛的神经元密度呈现在大脑中神经元(从343年到8167年每毫米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)。神经元密度计算了该方法与估计的高度相关的体视学技术(分别为0.983和0.975,b1和b2专家)。在这部作品中,死区典型用于体视学,排除细胞没有考虑了图像处理的方法,不能处理这种现象(Z-stack可以设想,但将大大增加,处理的数据量)。在这种情况下,获得的结果由专家和我们的方法是一致的。然而,有必要准确地估计偏差引入这一次评估,基于定义的宽容度,是否我们的方法可以替代体视学在生物研究。这一点是主要的体视学相比该方法的局限性。另一方面,我们的方法可以快速分析大量数据,提供第一次筛选在大脑区域层面识别和调查感兴趣的区域。这种策略与体视学几乎是可行的。这项工作是一个主要解剖roi的初步研究在单一组织切片,无疑是值得被扩展到研究整个大脑(一系列组织学部分)和多个动物(gydF4y2BaAmunts et al ., 2013gydF4y2Ba)。未来工作的目标还包括评估染色变化以及主体间效应的影响在我们的协议。这些初步结果表明了该方法的潜在的个性和计算精度高的神经元。据我们所知,这是第一个研究在这一领域用体视学评估一个自动分析方法。gydF4y2Ba

验证工作在本研究中是一个原始的贡献和生产原始加工数据。总共五个专家参与这耗时且乏味的工作。四个参考数据库专家注释来自本研究可以用于未来的研究和发展:(1)100年手动分割神经元染色图像像素(512×512像素)的细分数据集,111971(2)神经元质心手动标记的个性化数据集有关50图像像素(5000×5000像素),900(3)神经元质心和个性化数据集的轮廓由专家9个图片,和(4)37000个神经元数由专家利用体视学技术在体视学的数据集。gydF4y2Ba

能够计算神经元的方法,可以延长神经元计数系列的部分或整个大脑。例如,91条款由大约230000像素×188000像素。我们可以将这部分分成约1730×5000像素5000像素的图像。这些图像可以并行处理方法。神经元的数量在一个部分可以计算和介观定量热图神经元密度派生(gydF4y2BaVandenberghe et al ., 2016gydF4y2Ba)。一台超级计算机的使用可以大大减少计算时间,从而能够显著延长这项研究产生原始制图通过大脑神经元的分布。gydF4y2Ba

初步结果分割的并行代码演示了一个高可伸缩性的方法。这项工作是进行CPU-based架构,但将来可能会扩展到GPU的体系结构,特别是关于深度学习的实现方法。gydF4y2Ba

第一个应用程序旨在计算神经元进行个性化数据集大小。尽管神经元有各种形状,可以减少组织切片的根据他们的位置,我们仍然可以估计神经元平均半径与统计工具,由于大量的神经元处理。这个信息可以用来大致估计神经元大小或进行比较研究考虑到类似的偏见介绍了各种测量。统计结果表明,该方法所计算的神经元大小(直径2 - 28.6μm)与阅读文献的大小(直径5 - 30μm)。重要的是要记住,形态学测量仍在二维估计,有必要获得卷获得更精确的测量。在这种背景下,我们的方法的第一力量是新的提取信息丰富当前知识可用的数据。例如,提出个性化方法提供了有趣的描述性信息(位置、大小、强度、形状、和网络组织)神经元对每个地区的人口。在解剖区域,这些信息可以用来更好的描述大脑发育,衰老,疾病,甚至评价疗法在细胞水平上通过生产分析。第二强度的方法是这些技术的可伸缩性(整个部分,大脑和组)所有职能执行连接组件级别,这使得并行化方案非常有效。它将支持生物研究有趣的视角针对细胞结构分析。gydF4y2Ba

如今,神经元个性化仍然是一个重要和富有挑战性的研究领域的神经科学的主题。在2014年,gydF4y2Ba施密茨et al。(2014)gydF4y2Ba可用的细胞分割方法相比,显示个性化的细胞是一个复杂的问题,并强调了在这一领域需要开发新的方法。虽然做了工作在过去的几年中,大多数的提出基于数学形态学方法,检测的凹陷,分水岭算法,和graph-cut算法。深度学习是一种很有前途的方法在未来但需要仔细调查评估其强劲的能力解决这个问题。大多数这些方法都集中在相对简单的或非常特殊的情况下。当我们处理复杂的情况下,如DG,成千上万的神经元聚集,这些方法不能正确个性神经元。事实上,现有的图像处理方法的原因是他们会表现不好进行二维图像,用一个扫描聚焦平面,从而增加的难度有个性的动人的神经元。有可能获得一些飞机相关部分的深度扫描时使用Z-stack技术,重建pseudo-3-D体积和应用该方法的一个改进版本。然而,不可避免地会出现新问题,特别是增加容量分析的数据处理。gydF4y2Ba

然而,这项工作是有前途的。该工具可以帮助解决生物面临的主要挑战,如改善我们对大脑发育的理解或老化,破译病理机制,或在神经退行性疾病评估新的治疗方法。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

提出了一种健壮和高效的方法有个性size-varying和触摸猕猴大脑的神经元在显微图像部分。获得的结果是有前途的。该方法的准确性接近0.816在海马区,这是一个非常复杂的解剖研究地区和其他地区优于0.841(尾状、屏状核、皮层,硬膜、菌丝层和丘脑)。此外,该方法的精度和性能明显高于分水岭算法相比,定性、定量解剖地区测试。与一种适应体视学技术相比,我们发现计算结果与我们的方法是高度相关(0.983对0.975 b1和b2),可以被认为是一个可靠的选择。补充研究基于扩展数据集(部分和动物)应该设想来证实这一点。神经元平均半径估计的方法是一致的与文学的承认的发现。数以百万计的神经元的自动检测在整个大脑仍然是具有挑战性的。视角的工作将扩展该方法的应用到整个大脑。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

在这项研究中生成的数据集将不会公开。数据稍后将提供一篇文章和一个访问的形式,因为它对应于大量的信息。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

动物研究回顾和批准的拉西'ethique同意par le MESR不新上的菜l 'EU: CETEA深潜器-拉西n°44。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

ZY, CJ, A-SH和TD创建数据集。ZY, YB, CB, NS, TD开发图像处理软件和执行。A-SH和TD组织进行分类。ZY TD质心位于神经元和神经元的轮廓。PG和CJ估计神经元数量与stereological技术。ZY A-SH, TD执行统计分析。A-SH PG, CJ、PH值和TD计划组织学和成像实验。ZY和TD写的手稿。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作是支持的部分法国国家基金(PIA2”程序)根据合同号码p112331 - 3422142 (3 d NeuroSecure项目)和西安理工大学博士启动基金,112/256081811。这项工作被授予访问高性能计算资源分配下的TGCC 2019 - (A0040310374)由GENCI。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnana.2019.00098/full补充材料gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba