评论文章

前面。Neuroanat。,26November 2019
卷13 - 2019 | https://doi.org/10.3389/fnana.2019.00093

腺相关病毒技术和方法有针对性的神经元操纵

莱拉Haery ¹

本杰明·e·Deverman²

凯瑟琳·s . Matho³

阿里Cetin⁴

高管Kenton Woodard⁵

康妮Cepko ^6、7

凯伦。吉林¹

梅根·a·“政府改造” ¹

在人¹

苏珊娜·m·Bachle¹

乔安妮·卡门 ¹

美琳娜迷^{1 *}

¹Addgene,水城,妈,美国
²斯坦利精神病学研究中心,广泛的麻省理工学院和哈佛,剑桥,妈,美国
³冷泉港实验室,冷泉港,纽约,美国
⁴艾伦脑科学研究所、西雅图、佤邦,美国
⁵佩恩向量核心,基因治疗计划,佩雷尔曼医学院宾夕法尼亚大学,费城,宾夕法尼亚州,美国
⁶哈佛医学院遗传学系,霍华德•休斯医学研究所,美国波士顿,MA
⁷哈佛医学院眼科学系,霍华德•休斯医学研究所,美国波士顿,MA

Cell-type-specific表达分子工具和传感器的构建是至关重要的电路图和调查活动和功能的神经元在神经系统。战略目标的操作包括组合经典遗传工具,如Cre / loxP和Flp / FRT,顺式元素的使用,靶向敲入转基因小鼠,基因传递AAV和其他病毒载体。这些复杂的组合技术和精确的神经定位的目标是在实验室里一个挑战。这份报告将讨论相结合的理论和实践方面当前技术和建立最佳实践实现针对特定细胞类型的操作。新颖的应用程序和工具,以及地区发展,将设想和讨论。

介绍

理解神经网络相关的开发、行为和学习是神经科学的一个关键目标。这些问题可以解决,在某种程度上,通过理解特定的神经细胞和大脑区域的作用,以及在这些电路单个分子的影响。这些神经生物学研究的成功执行需要高度通道的方法,高效和精确。在这方面,重组腺相关病毒载体(文中称为AAV)是强大的工具,可以用于目标和操作特定的神经元亚型(定义基于基因表达、位置和连接)和non-neuronal神经系统内的细胞类型。

科学家利用AAV基因转移和/或神经针对关于实验设计必须考虑各种问题,包括:(1)如何最好地提供/管理AAV (图1一个);(2)使用哪个AAV血清型(图1 b);和(3)如何驱动基因表达与基因调控元素(AAV基因组内和宿主动物或细胞系;图1氟)。这些和其他许多因素会影响效率感兴趣的细胞是如何的目标AAV的。进一步的实验参数,如AAV效价和用量会影响AAV效率,而这些细节往往省略了从文献和实验方法可以是昂贵的和及时的来确定每个研究的经验。总的来说,设计一个实验AAV是多方面的和非最优实验设计可以大大降低结果的质量。在这份报告中,我们将讨论使用AAV的实用角度和设计实验的注意事项。

图1

图1。实验设计的几个方面影响神经元定位和操作包括(一)病毒交付方法,(B)病毒衣壳蛋白的组成,(C)启动子和/或增强驾驶转基因表达,(D)忿怒或2 multicistronic表达式的元素加上荧光蛋白(FP)或蛋白质抗原表位,(E)翻译后监管等元素WPRE或3′utr,和(F)重组酶(Flp Cre,克里尔,或隔爆)从转基因司机行(插入的基因表达通过目标或随机集成)和ligand-dependent或recombinase-dependent表达式元素混乱关系或液态氧等网站,分别。缩写:混乱关系,tetracycline-response元素;液态氧,LoxP序列;忿怒,内部核糖体进入位点;2、2 self-cleavage序列;FP,荧光蛋白;WPRE,土拨鼠肝炎病毒转录后的监管元素;3′utr 3′翻译序列。

选择路线的衣壳和管理

AAV取向,由AAV衣壳蛋白,是一个重要因素影响转导效率和跨细胞类型特异性。由于AAV转导机制是通过与细胞表面的交互AAV衣壳蛋白聚糖、蛋白质衣壳的组成(即。AAV血清型)和细胞表面(即。,based on cell type) determine transduction efficiency. Additionally, as the landscape of cell surface molecules varies across species, the efficiency of AAV may subsequently vary considerably across species and strains (Watakabe et al ., 2015;El-Shamayleh et al ., 2016;Hordeaux et al ., 2018;黄et al ., 2019)。因此,血清型和交货路线应该仔细考虑在设计实验(图1 a, B)。概述的主要受体AAV血清型,明白了舒尔茨和张伯伦(2008)。

直接Intraparenchymal交付

当直接注入大脑,许多自然产生的AAV衣壳,同源性,从65%下降到99% (Drouin Agbandje-McKenna, 2013),具有不同的但是明显重叠的取向和分布特征。AAV1、AAV2 AAV5、AAV8 AAV9和工程变体AAV-DJ一般用于目标直接注射后的神经元(表1)。

表1

表1。AAV对神经科学的管理路线。

除了展示当地的转导,好几种血清型展览转导远端注射部位(汉堡et al ., 2004;Cearley和沃尔夫,2006,2007年;克莱恩et al ., 2006,2008年;李et al ., 2006;Reimsnider et al ., 2007;Sondhi et al ., 2007;Taymans et al ., 2007;Cearley et al ., 2008;霍利斯et al ., 2008;Hadaczek et al ., 2009;Masamizu et al ., 2011;Bu et al ., 2012),这些表型的机制是活跃的地区的调查(城堡et al ., 2014)。AAV载体净化方法也已被证明能够影响传导模式(克莱恩et al ., 2008)。

此外,在多大程度上有重要的差异不同的衣壳变异传播注入site-AAV2和AAV-DJ扩散更局限,因此,这些衣壳往往选择需要精确定位的应用程序。而表达AAV2主要是神经元,好几种血清型,包括AAV1 AAV5, AAV8 AAV9,还转导星形胶质细胞和少突胶质细胞。

尽管巨大的工作量serotype-dependent表达模式和机制的复杂性假设和显示驱动这些表型,能够自信地预测表达式模式在一个特定的实验装置仍然需要实证证据。一个简单列表报告的特点提出了好几种血清型(表2),可以用来缩小合适的血清型,虽然每个研究的实证验证的重要性不能被低估。重要的是,基于解剖表中报告的结果可能不同地区,虽然结果没有被总结在这个报告学位。

表2

表2。转导的特点选择AAV血清型。

系统交付

几个自然AAV衣壳穿过血脑屏障(BBB)。相比直接注射,静脉注射AAV可以提供一个中枢神经系统(CNS)采用基因传递。这个活动存在跨多个物种,AAV对新生儿管理时最为明显。新生儿注射AAV9和rh。10 have been used to transduce neurons broadly across the CNS. However, when delivered at later developmental stages including in the adult, transduction is more limited and primarily restricted to endothelial cells and astrocytes, with transduction occurring in 1–2% of neurons in the forebrain (福斯特et al ., 2009;杜福尔et al ., 2014;Deverman et al ., 2016)。在这种背景下,工程AAV衣壳提供了新的和更有效的选择广泛的基因传递到中枢神经系统。第一个向量,AAV-PHP。B,使研究人员能够提供基因超过50%的神经元和星形胶质细胞在许多大脑区域用一个非侵入性的注入(Deverman et al ., 2016)。实现这一效率要求相对较高的病毒剂量(~ 1×10¹⁴向量基因组/公斤),因此需要大量的病毒效价高。一个发展AAV-PHP。B变种,AAV-PHP。eB,解决了这个问题,可以实现> 50%转导的大多数神经元和星形胶质细胞的人口甚至20倍减少剂量(陈et al ., 2017)。虽然PHP衣壳的活动不是普遍观察到在所有物种中,甚至一个特定物种的菌株,PHP的受体参与衣壳在AAV转导已被确认,可以用来预测包容性的细胞或组织类型对这些工程衣壳(Hordeaux et al ., 2019;黄et al ., 2019)。此外,同一组(PHP开发了一个额外的AAV变体。变体),可以有效转导背根神经节神经元和其他外围人群系统性管理后,否则应使研究这些困难目标周围神经元的数量(陈et al ., 2017)。

CSF交付

第三种选择基因传递到中枢神经系统是脑脊髓液注入向量(CSF)。几个接入点可以使用:侧脑室(intracerebroventricular ICV)的小脑延髓池(CM),单纯(Miyanohara et al ., 2016)或鞘内沿着脊髓(IT)空间。当新生儿进行,ICV AAV政府可以提供广泛的基因传递。在成人,ICV和CM注射导致基因传递多个脑区,然而,表达不统一所有脑区和表面结构优先目标。除了神经元,ICV注射也提供室周的细胞群。例如,ICV注射后,AAV4可以用来转换室管膜细胞(刘et al ., 2005),和两个工程AAV衣壳,SCH9 AAV4.18,启用转导subventricular区神经祖细胞(Murlidharan et al ., 2015;Ojala et al ., 2018)。它注射可以用来提供基因脊髓运动神经元和背根神经节(福斯特et al ., 2010;Federici et al ., 2012;舒斯特尔et al ., 2014)。

逆行,顺行运输电路研究

AAV载体常用电路研究的一部分。众多自然AAV血清型展览从他们的吸收在轴突逆行贩运活动终端(见表2)。然而,逆行转导与自然血清型,如AAV1 AAV2 AAV6, AAV9需要高矢量剂量由于这种传导机制的相对低效。最近Tervo et al。(2016)和Davidsson et al。(2018)创建修改衣壳AAV2-Retro AAV MNM008,分别提供有效转导发送的神经元轴突预测注射部位。转导效率的衣壳circuit-dependent所示,因此衣壳应验证电路的兴趣在规划实验。Zingg et al。(2017)报告,AAV1 AAV9展览transsynaptic顺行运输高滴度,具体显示AAV1-directed Cre可以激活Cre-dependent转基因表达在突触后神经元。重要的是,他们指出,逆行传输也可以发生,使得电路只解释清楚,那里是一个单向的连接模式。

AAV在高剂量可引起中毒

虽然AAV不如其他一些炎症病毒,它不是惰性对先天(罗杰斯et al ., 2011)或自适应(Mingozzi和高,2011年免疫系统),也可以扰乱其他细胞活动。几项研究已经发现神经毒性病毒时系统或交付通过直接注射进入中枢神经系统,或到视网膜的sub-retinal空间。狂犬病单突触的跟踪研究,AAV通常是作为一个辅助病毒提供TVA和狂犬病G蛋白。最近的一项研究发现,高剂量的助手并未使狂犬病感染或跟踪,而稀释制剂(拉文et al ., 2019)。虽然未能确定机制,作者建议,高剂量是有毒的。同样,神经毒性被认为在仔猪注射系统(助人者et al ., 2014)。在视网膜,毒性与剂量有关,如果病毒启动子表达支持细胞类型,视网膜色素上皮细胞,但如果病毒启动子活动仅限于感光细胞(熊et al ., 2019)。先天免疫刺激TLR9识别已被证明的结果,一个传感器unmethylated CpG的AAV感染肌肉的研究(朱et al ., 2009)和肝脏(马蒂诺et al ., 2011)。包含一个简短的TLR9识别阻塞在AAV基因组寡核苷酸可以减轻这个问题在某些情况下(陈et al ., 2019)。因此值得仔细考虑这方面的病毒剂量时设置一个实验。

总之,达成共识的意见方面没有达到最好的血清型为每个细胞,大脑区域或应用程序。选择最佳的血清型需要回顾文献最相关的实验计划,进行试点测试新的或至少是具有挑战性的应用程序。新设计的衣壳继续开发具有独特的特性,可用的选项将成为更多和更强大的(Deverman et al ., 2016;Tervo et al ., 2016;陈et al ., 2017;Davidsson et al ., 2018;Ojala et al ., 2018)。

控制基因表达与监管元素

Cre AAV载体中的和隔爆recombinase-dependent表达因素仍是首选系统限制转基因表达基因在生物模型细胞类型定义。然而,很少有Cre或隔爆转基因线开发的其他哺乳动物物种。此外,繁殖多种转基因线生成所需的后代可以耗时又昂贵。因此,开发有浓厚的兴趣的手段实现类似的表达特异性nontransgenic动物使用灵活的基于矢量的方法,将翻译跨物种。

独联体监管元素可用于控制从AAV基因组转基因表达。这些元素包括启动子和增强子(图1 c),以及内含子、微rna识别序列,和内部核糖体进入位点(IRES;图1 d),可用于裁缝RNA加工,稳定,和翻译实验的需要。在这里,我们将讨论如何使用这些监管元素限制AAV-mediated基因表达。

增强剂和促进剂

增强剂和促进剂(以下称为启动子为简单起见)通常可以分为两类:普通/无处不在和细胞特定类型。通常,无处不在的发起人提供高层次、长期表达在大多数细胞类型,尽管一些,如病毒巨细胞病毒启动子,已被证明在特定组织表现出沉默时间(McCown et al ., 1996;克莱恩et al ., 1998;Paterna et al ., 2000;特南鲍姆et al ., 2004;表3)。

表3

表3。无处不在的增强剂和促进剂。

AAV和其他单链DNA病毒进化表现出一些最小的病毒基因组(Campillo-Balderas et al ., 2015),它通常提供了选择压力对较短的启动子序列。相比之下,监管元素控制哺乳动物基因转录通常分布在成千上万成千上万的基地。由于包装容量有限的AAV基因组,识别AAV-compatible推动者一直具有挑战性和发展缩短了启动子是一个活跃的研究领域(内桑森et al ., 2009);de Leeuw et al ., 2016)。细胞特定类型的列表启动子与AAV载体提供了兼容表4。高表达水平并不适合每个应用程序和替代监管元素,比如从哺乳动物MeCP2或PGK基因(表3)可能适合实验高级病毒增强器驱动的表达并不理想。一般建议的总结了各种类型的转基因表达水平表5。

表4

表4。无处不在的增强剂和促进剂。

表5

表5。一般考虑为特定的转基因表达和应用程序。

Multicistronic向量

虽然AAV载体包装容量有限,它可以表达多个短转基因产品从单一向量使用几种方法之一:(1)单独转化单元,其中每个cDNA由单独控制5′和3′监管元素;(2)使用IRES序列插入两个单独的转化成一个单一的单位信使rna;或(3)使用病毒2相同的序列生成单独的蛋白质转化单元(图1 d)。表6强调注意事项2选择使用IRES序列和裂解肽。

表6

表6。Bicistronic表达式选项。

一个重要的考虑因素在评估策略和确定特异性表达是记者检测所需的表达水平可能不匹配是必要的活动视蛋白,DREADD或重组酶。例如,荧光蛋白通常用来评估基因调控和向量设计元素。然而,荧光记者化验可能给特异性的假象,如果看到高水平的表达在靶细胞类型和低级表达未被发现在非目标人群。如果这些监管元素用于驱动DREADDs或Cre,可以调解在低表达水平的影响,然后特异性可能出现减少。如果这是未经检验的,实验结果的解释可能被破坏。此外,尽管他们常用的荧光蛋白不一定是惰性,导致更大的动物免疫反应(萨马兰奇et al ., 2014),表达小鼠的毒性有关。

转录后调控

转基因的表达也可以控制转录通过使用元素影响RNA拼接,核出口,稳定,翻译成蛋白质(图1 e)。包含内含子可以在表达水平有积极的影响。内含子也被创造性地结合与重组酶网站和部分反转基因表达的转基因产品实现区间的控制(Fenno et al ., 2014,2017年)。许多基因组重组AAV还包括一个土拨鼠肝炎病毒转录后的调控元件(WPRE),可显著提高表达式。数的例子包含WPRE如何影响表达式从AAV向量请参阅de Leeuw et al。(2016)。

互补的microrna的目标站点(TS)经常设计成3′未翻译区(3′utr)基因组重组AAV载体来减轻不相干的转基因表达。这些序列是互补的microrna表达非标靶细胞内而不是在目标人群。microrna的绑定到完全互补的microrna的TS导致RNA的降解。包含多个副本的microrna的TS短序列可以显著降低不相干的转基因表达。例如,通过将三份miR-1和mir - 122,具体表现在肌肉和肝脏,分别谢et al。(2011)减少转基因表达从静脉注射AAV9在肌肉,心脏,大脑和肝脏,同时保持表达式。microrna的TS,提高慢病毒介导的基因表达的限制gaba ergic神经元也被确定(谢et al ., 2011;Keaveney et al ., 2018),microrna的TS,导致更多选择性GCaMP6f从强大的无处不在的启动子表达(查理斯et al ., 2019)。鉴于其短长度,microrna的TS可以多路复用在相同的基因组,使他们有吸引力的元素减少表达以外的感兴趣的细胞类型。

条件表达式

哺乳动物中枢神经系统包含极其多样化类型的神经元。这些神经细胞类型可以区分他们的内在基因表达谱,不同在监管的发展。二进制表达式可用于驱动系统的司机和记者在genetically-defined细胞(综述转基因表达黄et al ., 2014)。

有两种通用的策略使用二进制表达式系统访问genetically-defined细胞类型:transactivation-based系统(基于四环素(春节)响应元素,混乱关系)和recombination-based系统(基于lox-site重组,lox)中描述(谷口,2014;图1 f)。基因打靶技术可以用来插入Cre或隔爆特定场地可在小鼠基因组中。这些敲入司机鼠标线表达Cre或隔爆下目标基因的内源性启动子的活性。因此,Flp Cre和司机鼠标线构成基因开关打开recombinase-dependent记者或效应。自定义的细胞表达的重组酶只有目标基因的内源性启动子活动,这个系统允许标签和操纵的神经元所定义的目标基因的表达模式。最近开发的策略可以直接Cre或隔爆活动细胞表达绿色荧光蛋白(唐et al ., 2017)。Nanobodies针对GFP被改造为融合蛋白Cre或隔爆。可只活跃在GFP-expressing细胞。这种方法可用于只有一个重组酶的活动,或者可以交点的使用,例如,交配GFP和Cre鼠标线,感染与GFP-dependent Flp-nanobody融合,然后使用Cre + Flp-dependent读出(见下面的进一步交点的方法)。时间控制,可以使用TET-inducible系统提供快速和可检测表达在给定的时间点(日本日置et al ., 2009;Sadakane et al ., 2015)。春节系统也有放大的优势基因表达(Watakabe et al ., 2012;陈et al ., 2017)。这可能是特别重要的在非人类的灵长类动物的研究因为转导细胞可以保持长期而不影响细胞完整性(Sadakane et al ., 2015)。

记者或效应的表达式是依赖司机的活动在活的有机体内通过交叉司机转基因记者鼠标线,使用病毒载体或electroporating DNA构建进入细胞。Flp广泛使用Cre或司机,有条件的记者表达取决于特定lox的重组或frt网站,分别。在春节的情况下系统,tet-on,反向四环素反式激活因子(rtTA)或tet-off (tTA)司机是配的AAV载体启动子窝藏tet-responsive元素(过夜)。

针对随机和针对特定基因的位点

敲入Cre和隔爆可GFP可以插入到基因组随机或在一个特定的基因位点(图1 f)。传统的转基因和BAC转基因方法导致相对随机插入到基因组。然而,敲入小鼠行针对特定轨迹通过同源重组的优势在于插入基因的表达能够概括表达模式的内源性基因的细胞内。使用有针对性的有几个优势敲入司机鼠标线(表7)。靶向敲入Cre或隔爆或GFP到特定基因的转录/翻译起始位点可能导致表达的内源性轨迹的重演。使用这一策略时,应该注意的是,个人可以展示变量水平的沉默。一般来说,一个最优的“non-silencing”男性应该识别和用于遗传交叉。然而,这个雄性的后代可能表现出沉默,必须重新检验它。

表7

表7。的方法交付Cre程控瞄准,标签,和操纵。

时间控制与他莫昔芬

控制一个记者的表达在神经元的一个子集,独特的和暂时性的表达某种标记在一个特定的时间点,tamoxifen-inducible可(Feil et al ., 2009),所谓的相信或隔爆,可以用作驱动程序。相信司机老鼠,表示Cre重组酶的激活需要管理动物雌激素受体调节剂药物它莫西芬,允许重组的时间控制。

典型的三苯氧胺剂量变化从10到200毫克/公斤,取决于所需的记者等位基因重组的程度。实际上,这个控制稀疏/标签有针对性的神经元的密度人口。时机对他莫昔芬政府依赖于启动子驱动的时态特征认为特定人群有针对性。重要的是,它莫西芬的半衰期(约48 h)必须被考虑。它莫西芬准备详细的出版协议(沃恩et al ., 2015)。

它莫西芬可以管理的三种方式之一,根据所需的发育时间点激活认为司机:口服填喂法胚胎诱导的母亲;皮下注射为早期产后感应后代,后代或腹腔内注射晚期产后和成人感应。

最佳实践归纳认为或隔爆鼠标线

普遍提高结果的可靠性与克里尔或隔爆鼠标线,几个三苯氧胺剂量应评估。如果记者的水平的重组实现与高剂量的三苯氧胺低,管理4-hydroxytamoxifen(它莫西芬的原生形式)可以提高激活克里尔(扬et al ., 2018)。它莫西芬需要在肝脏代谢,达到活跃4-hydroxytamoxifen形式。他莫昔芬是常规应用程序通常优于4-hydroxytamoxifen高活性认为司机行由于低成本和提高溶解度。它莫西芬诱导后,克里尔或隔爆将活跃~ 48小时,期间可能会影响感应发展活跃的时期。4-hydroxytamoxifen是更好的选择严格控制窗口的激活。管理它莫西芬或4-hydroxytamoxifen填喂法对孕妇诱导胚胎的幼崽时间点可能会导致流产或母性差的问题。当管理在胚胎跨度为三苯氧胺,使用瑞士或CD1 C57Bl6小鼠相比,可以通过两种方式改善结果:它们产生更大的窝和女性更好的母亲,总可以提高小狗存活率。

验证一个敲入司机鼠标线

敲入司机鼠标线是用来控制的表达记者调查,在genetically-defined传感器和效应器细胞类型。验证司机是很重要的鼠标线表达位点专一(如Cre,克里尔,隔爆、隔爆)反映了内源性表达模式的基因敲入驱动程序的目标。各种方法可单独或共同验证敲入司机鼠标线:(1)穿越老鼠和一个合适的记者像Rosa26-CAG-LSL-td-tomato (Ai14)或Rosa26-CAG-LSL-h2B-GFP和评估brain-wide表达式;(2)目标区域的疣状;和(3)双重荧光原位记者与探针杂交(双鱼)(例如,RFP或GFP Rosa26-CAG-LSL-td-tomato (Ai14)或Rosa26-CAG-LSL-h2B-GFP,分别)。注意评估Cre线路跨越记者线给出了一个集成视图的Cre活动对动物的生命周期。评估Cre活动在目标细胞群在感兴趣的特定时代,病毒载体与Cre-dependent记者可以使用Cre线。同样,它莫西芬克里尔线路感应应该执行在不同发育评估时间跨度为特异性。

此外,泄漏的鼠标线和病毒都必须评估之前的实验结果的解释依赖于完整的转基因表达的限制。泄漏鼠标线时可以评估验证鼠标线,确保表达位点专一或活化剂(即。Cre克里尔,隔爆、隔爆或tTA)感兴趣的基因在本土是一致的形式。穿越司机记者(如荧光记者)和执行双重荧光原位与探针杂交(双鱼),感兴趣的基因的荧光记者和允许一个人检查司机的内源基因的表达和活动存在于相同的细胞。使用鼠标线敲入司机代替随机插入BAC或质粒司机鼠标线允许目标表达,细胞内高表达的可能性的内源性基因表达兴趣。泄漏的tamoxifen-inducible司机鼠标线可以跨越诱导司机认为评估或隔爆Flp Cre或依赖荧光记者和检查没有管理三苯氧胺荧光蛋白的表达。最后,泄漏的Cre——或者Flp-dependent tTA-activated AAV可以检查注射病毒的老鼠已经越过荧光记者鼠标线司机/激活。如果表达式从病毒和鼠标记者是否相符,这表明AAV是特定于司机/激活。一个给定的病毒的进一步评估准备背景复合(或泄漏)注入到鼠标线不编码同源重组酶。重组AAV质粒的生长中可能发生细菌、病毒准备期间和/或在哺乳动物细胞中,并使用这个测试应该评估。

病毒策略定义的目标人群

各种实验技术相结合可以使感兴趣的特定神经元数量的精确定位。一般使用组合方法的优点是可以提高细胞的特异性针对每个额外的技术。应用已知的特点AAV以及它们所携带的基因编码的转基因,神经元的数量可以根据他们的具体目标和操作位置和连接。这里我们将回顾几个目标策略。

轴突码头

病毒编码的转基因可以针对轴突终端。这样的终端可以在特定领域目标optogenetically只提供光感兴趣的区域窝藏终端(图2一个)。这种技术可以进一步限制,只有特定细胞类型的轴突细胞类型特异的启动子驱动AAV表达目标通过使用(图2 b)。可以通过额外的特异性选择注射部位,AAV血清型,和效价,因此只有所需的细胞类型被感染(Nassi et al ., 2015)。

图2

图2。各种策略针对使用AAV神经元。神经感受器的交付通过AAV标签(绿色)轴突和终端细胞体在注射部位。(一)效应器在一般的启动子表达所有转导神经元细胞体在注射部位。可以光刺激特定区域(红色梁)。(B)效应器在程控启动子表达只在一个细胞类型。(C)效应器交付通过在所有转导神经元轴突逆行AAV表达这个项目到注射部位。细胞体地区感兴趣的可以optogenetically刺激(红色梁)。(D)交付的逆行AAV表达Cre重组酶(逆行Cre)投影网站加上本地交付Cre-dependent效应限制表达神经元在特定电路。

投射神经元的目标

目标投射神经元的细胞体只能重要操纵这些神经元终止在一个特定的网站。针对这些神经元,AAV能够逆行转导(例如,AAV2-Retro)可以送到投影网站和这些神经元的细胞体终止在该地区将有针对性的(Tervo et al ., 2016)。这个方法不会产生途径特异性。然而,如果用于运载optogenetic工具,光只能交付地区窝藏感兴趣的细胞体(图2 c;Nassi et al ., 2015)。

最后,特定的投射神经元的数量可以被耦合局部目标交付Cre-dependent,诱导神经调质(如DREADD或视蛋白)逆行的Cre目标投射神经元产生的地方(图2 d)。使用这种方法,投射神经元的一个子集(图2 d),而不是所有的投射神经元(图2 c),然后表达Cre-dependent神经调质。这样做的优势在于效应器(例如,DREADD配体)可以交付系统,而不是在本地和仍然只操作子集的投射神经元的目标(Nassi et al ., 2015)。

领域的发展

阿森纳的新传感器、致动器、可基因,编辑酶RNA和基地,研究神经系统的其他基因编码工具正在迅速增长。AAV载体仍是最多才多艺的和强大的方法向中枢神经系统提供这些工具。交付的挑战依然存在和正在进行的努力,开发新向量解决几个关键需求包括:(1)提高广泛的中枢神经系统基因转移通过第四,ICV路线;(2)AAV载体能够更高效的trans-synaptic顺行运输;(3)向量解决方案交付转基因太大,以适应在一个AAV病毒;(4)衣壳,专门针对定义神经细胞和神经元亚型;(5)病毒载体,使小胶质细胞的转导。

总体而言,现有的和新开发的一致性和可重复性AAV工具可以提高遵循最佳实践和指导原则。虽然强大的技术正在开发中,每个人都有技术限制,需要考虑在设计实验时,解释结果。为此,提高平台共享信息,包括技术指导原则和最佳实践,将服务于社区的研究支持技术用于他们的最大能力不断在实验室。

作者的贡献

LH,公斤,先生,即某人,JK,曼氏金融计划和主持研讨会,讨论了这种材料。BD,公里,AC、千瓦和CC讨论和建立了基于他们的知识领域的最佳实践。LH、BD和公里写的手稿,当时由AC,编辑千瓦,CC,公斤,先生,即某人,JK, MF。

的利益冲突

LH,公斤,先生,即某人,JK,和MF受雇于Addgene,非营利组织库分配包括质粒和AAV研究材料。

其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

我们感谢延命菊Tervo Sarada Viswanathan,约翰新玩意儿有益的讨论。我们感谢慷慨支持Kavli基金会举行会议,引发了这一报告。我们还要感谢Addgene研究团队和所有其他成员的建议和支持在准备这个手稿。创建数据在这个手稿biorender.com。

引用

Aschauer, d F。、Kreuz年代。,和Rumpel, S. (2013). Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.《公共科学图书馆•综合》8:e76310。doi: 10.1371 / journal.pone.0076310