原始研究的文章

前面。衰老>。,20 January 2023
秒。帕金森病和体内运动的障碍
卷14 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fnagi.2022.1077738

脑脊液的血脂水平与6-hydroxydopamine-induced损伤大鼠帕金森病模型

Jiewen邱^{1 __},

Guoyou彭^{1 __},

个唐^{1 __},

Shiyin李¹,

Zengfu刘¹,

Jiayun郑¹,

Yunxin王¹,

Hanqun刘¹,

Lijian魏¹,

伊琳苏¹,

Yuwan林¹,

魏戴¹,

Zhiling张¹,

香陈¹,

品鉴叮¹,

北京郭¹,

朱小秦^{2 *},

平邑徐^{1 *}和

Mingshu莫 ^{1、3 *}

¹神经病学、广州医科大学第一附属医院,广州,中国
²生理,基本医疗科学学院,广州医科大学,广州,中国
³于今天夜间到明天上午人民医院惠来到内科,揭阳市中国

背景:帕金森病(PD)是一种进行性神经退行性疾病和病理特征异常,包括多巴胺(DA)神经元的损失,dopamine-depleted纹状体,小胶质激活。脂质积累展品与这些疾病在PD关系密切。

方法:这里,6-hydroxydopamine (6-OHDA)被用来构造一个PD大鼠模型,和血脂模型大鼠脑脊液(CSF)使用lipidomic方法进行了分析。

结果:建立这个PD模型证实了apomorphine-induced旋转行为,DA神经元的损失,消耗在纹状体的多巴胺,和小胶质激活6-OHDA-induced损伤后的一代。无监督和监督的手段都为脂质分析。总共有172种脂质中确定CSF,随后分为18个脂质家庭。脂质家庭,包括二十烷类、甘油三酯(TG)、胆固醇酯(CE)和游离脂肪酸(FFA)和11个脂质物种表现出显著改变配置文件2周后6-OHDA管理、二十烷类和重大变化,TG, CE,汽车,和三个脂质物种被发现后5周6-OHDA管理。期间6-OHDA-induced病变形成,脂质家庭和物种显示浓度波动相关的恢复和黑异常行为。相关分析表明,类花生酸的水平,CE、TG家庭和TG(16:0_20:0_18:1)表现出积极的人际关系与apomorphine-induced旋转行为和消极的关系在中脑酪氨酸羟化酶(TH)表达式。

结论:这些结果显示,非渐进式黑变性引起6-OHDA促进的表达式impairment-related lipidomic CSF签名,和类花生酸的水平,CE、TG家庭和TG(16:0_20:0_18:1)脑脊液可能揭示在中脑病变6-OHDA侮辱。

介绍

帕金森病(PD)的特点是病态的进行性变性涉及巨大损失的黑质多巴胺(DA)神经元(SN) dopamine-depleted纹状体,小胶质激活,积累α-synuclein(α-syn) (巴莱斯特里诺Schapira, 2020)。基因-环境交互作用可能导致帕金森病的发展(巴莱斯特里诺Schapira, 2020)。是一种理想的环境毒素,6-hydroxydopamine (6-OHDA)是用于构造单侧病变SN的老鼠,猫,灵长类动物(Deumens et al ., 2002)。6-OHDA-induced PD模型概括大多数病理异常除了α-syn积累和改变多巴胺的行为,比如apomorphine-induced旋转(Deumens et al ., 2002)。然而,6-OHDA接触代表一个非渐进式的侮辱,以及由此产生的病理和行为异常可以逆转药物,它不同于PD治疗反应观察在诊所(Cicchetti et al ., 2002;Deumens et al ., 2002)。6-OHDA模型已经应用于探索敏感生物标记物黑函数。

脂质和脂蛋白代谢发挥重要作用在神经退行性疾病的发生和发展农民et al ., 2020)。载脂蛋白E,脂蛋白的组件,可能会破坏血脑屏障(BBB)和增加阿尔茨海默病(AD)的风险(富勒顿et al ., 2001;陈et al ., 2021)。一些突变glucosylceramidase-beta (GBA)基因编码溶酶体水解酶葡糖脑苷脂酶(GCase)参与膜脂质成分代表高PD和路易体痴呆的危险因素(的卡et al ., 2016;Gan-Or et al ., 2018)。PD患者GBA突变表现戏剧性的变化在血清脂质浓度,包括增加神经酰胺和鞘磷脂水平和降低磷脂酸水平(古埃德et al ., 2017)。脂质紊乱也6-OHDA-related病理异常密切相关,比如DA神经元的损失(Xicoy et al ., 2019;Elabi et al ., 2021)。在脂质家庭,二十烷类有特殊概要文件在衰老小鼠和AD患者(Valcarcel-Ares et al ., 2019;杜罗et al ., 2022)和胆固醇酯(CE)可以总在髓细胞触发受体表达2(表“发抖”₂KO和AD-variant人类iPSC小胶质细胞(Garcia-Sanz et al ., 2021;镍锰合金et al ., 2021)。特异表达的新陈代谢的甘油三酯(TG)被发现在PD病理(Sharma Taliyan, 2018;花王et al ., 2019;Brekk et al ., 2020;Toscano et al ., 2020)。关于脂质物种,几个阴离子和两性离子脂质结合的调节₂受体在小胶质细胞参与识别异常沉积的蛋白,如Aβα-syn,在神经退行性疾病(王et al ., 2015)。脂质过氧化作用的特色产品,15-hydroperoxy-arachidonoyl-phosphatidylethanolamine可以激活ferroptotic DA神经元的死亡信号在PD (太阳et al ., 2021;王et al ., 2022)。关于多巴胺耗竭,饮食富含饱和脂肪可能会改变多巴胺前体可用性相关的在人类的中脑多巴胺浓度(哈特曼et al ., 2020)。因此,脂质代谢展品与PD病理关系密切,被认为是一个理想的生物标志物的诊断。

在许多临床研究PD,寻找生物标志物血清。由于BBB封锁,生物标志物在脑脊液(CSF)表现出更好的准确性和灵敏度反映黑的病理变化在PD (锅和Nicolazzo, 2018)。因此,本研究旨在探讨脂质代谢与6-OHDA CSF获得大鼠病变和评估CSF和透析相关异常的脂质之间的联系。

材料和方法

动物

成年男性Sprague-Dawley老鼠(4个月大的时候,体重350 - 490×g)购买来自江苏Aniphe Biolaboratory(江苏,中国),维护specific-pathogen-free条件下自由获取食物和水和12 h光/ 12 h暗周期实验动物中心(广州医科大学、广州、中国)。本研究中使用的所有程序依法进行动物保健指导方针。所有实验动物实验伦理委员会批准广州医科大学(2020143、2020年8月21日)。老鼠被随机分配到五组:对照组没有注射,注射的虚假的组车辆,和三个6-OHDA组注射6-OHDA观察乘以2,3和5周,分别。显示在实验过程图1一个。

图1

图1所示。非渐进式黑变性6-OHDA模型。(一)实验过程示意图。(B)SN部分显示TH免疫反应性和黑变性2,3,5周后单方面病变形成的免疫组织化学染色法评估。(C)西方墨点法用于检测中脑中减少在不同的时间点。图形显示的数⁺细胞在SNpc评估体视学的面板(D)和免疫印迹的中脑TH水平面板(E)。(F)apomorphine-induced旋转反应是评估逆时针旋转的数量进行超过30分钟,每分钟和平均数计算。数据被表示为均值±S.E.M.*P< 0.05和控制,^#P< 0.05和2周组。6-OHDA 6-hydroxydopamine;SN,黑质;TH,酪氨酸羟化酶;SNpc,黑质致密部。酒吧规模:50μm。

6-OHDA病变

神经毒性大鼠PD模型是由单方面6-OHDA注入到内侧前脑束(地铁消防队)此前报道(莫et al ., 2018)。使用老鼠的脑图谱Paxinos和华生(2007)作为一个指南,6-OHDA (Sigma-Aldrich、上海、中国)注入到地铁消防队是基于以下坐标:前后,−4.4毫米;medial-lateral−1.2毫米;相对于前囱dorsal-ventral,−7.8毫米。老鼠被放置在一个立体定位装置低于1%戊巴比妥钠麻醉。这里,6-OHDA溶解在每1 2μgμL汽车解决方案,包含0.2%抗坏血酸在同等体积的0.9%氯化钠。在PD大鼠4μL 6-OHDA的解决方案是管理400 nl /分钟的速度使用汉密尔顿注射器配有30-gauge针。针被注入额外的10分钟后撤回1毫米/分钟的速度。相同的坐标被用于大鼠接受虚假的操作,但只有车辆交付。

Apomorphine-induced旋转测试

评估6-OHDA病变的存在,apomorphine-induced转弯率评估根据先前描述的协议(0.5毫克/公斤,ip阿朴吗啡)(莫et al ., 2018)。在2、3和5周6-OHDA注射后,老鼠注射0.5毫克/公斤阿朴吗啡(Sigma-Aldrich、上海、中国)在0.5毫克/毫升溶解在腹腔内注射生理盐水。然后,老鼠分别转移到一个透明的塑料筒,和旋转都记录了30分钟自行建造转子流量计根据之前报道的方法(莫et al ., 2018;Palese et al ., 2019)。完整的360°逆时针旋转的总数统计,平均每分钟数计算和表达的部分“结果”。

免疫组织化学染色

老鼠与水合氯醛麻醉,然后用预冷perfusion-fixed 4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich、上海、中国)0.9%氯化钠紧随其后。大脑被分离开,后缀在4%福尔马林(PFA) 24 h和cryoprotected w / v蔗糖30%磷酸缓冲盐(PBS)脱水。嵌入在10月后介质(美国樱花Finetek Tissue-Tek),大脑在15或20μm分段使用冷冻切片机。大脑部分是孵化主要抗体酪氨酸羟化酶(TH,微孔,MAB318 1:400)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP、细胞信号技术,80788年,1:1,000),过氧化物酶病生物起源因素19 (Pex19, ABclonal A5476, 1:50)和Iba1(10904年Proteintech 1:200)。免疫荧光染色的部分与4’,6-diamidino-2-phenylindole复染色(DAPI)。片被数字病理扫描仪罐头(精确的500 b,尤尼克公司技术公司,北京,中国)后,制造商的指示。使用ImageJ的形态学分析程序(贝塞斯达国立卫生研究院,医学博士,美国)。

TH的数量⁺神经元在黑质致密部(SNpc)是计算使用光学分馏器。每三个部分的每个动物在整个SNpc 9 - 12部分计入×20下病变方面客观的观点。SNpc被定义的解剖标志。TH⁺与最佳可视化核细胞在一个视图中被认为是一个有效的计算。数Iba1的数量⁺细胞免疫荧光染色的基础上,三个不同的部分包含1200μm×1400μm标准化领域SNpc选择随机如前所述(Gramage et al ., 2022)。Iba1的总面积⁺细胞荧光计算整个图像。减去均值背景荧光后,程序ImageJ被用来识别和计数Iba1的数量⁺细胞。Iba1的密度⁺细胞决定基于细胞的数量和面积。三个部分每鼠被量化。

量化的表达在纹状体使用的斐济图像分析系统执行ImageJ如前所述(莫et al ., 2018;Gramage et al ., 2022)。整个纹状体区域在两个半球被确认为感兴趣的区域。在两个半球TH免疫反应性测量。部分进行扫描后,图像被转换为二进制模式。所有老鼠共享相同的阈值。比例被认为是病变的TH强度较对侧的一起在相同的部分。总共4 - 5每鼠纹状体部分进行评估。

免疫印迹

中脑分离,其蛋白质提取之前报道(莫et al ., 2018;Gramage et al ., 2022)。蛋白质浓度估计使用Nanodrop™8000分光光度计(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。蛋白质的提取是运行在一个4 - 12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)凝胶,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜被孵化的主要抗体TH(微孔、MAB318 1:20 00)或β-actin (Bioworld, AP0060 1:5000)。洗Tween-20 Tris-buffered盐水含有0.1%后,膜与HRP-conjugated孵化二级抗体。一个增强化学发光系统(ECL,微孔)用于可视化。这些墨迹评估使用图像实验室软件6.0 (Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国),结果是β-actin强度归一化。

CSF的UPLC-MS / MS分析

用1%的戊巴比妥钠麻醉后(40毫克/公斤,i.p。),老鼠被放置在一个立体定位装置。头的位置在135度角。剃须和消毒后,2厘米纵向沿背部中线切口在枕暴露枕骨大孔生成的。直接使用胰岛素针穿刺硬脑膜cerebellomedullary水箱。然后,CSF是UPLC-MS / MS分析。

脂质提取从脑脊液进行之前报道(格拉et al ., 2019)。50毫升的脑脊液样本与Bligh-Dyer混合提取和内部脂质标准1毫升(补充数据1)。在孵化后超声波水浴40 kHz的频率和功率100 W的5分钟,500μl Milli-Q水是补充道,和示例离心机在12000 r / min 10°C。然后,500年μl上层清液收集和与100 bμl流动相混合,20μl每个样本添加到池的质量控制。检测系统包括Shim-pack UFLC日本岛津公司CBM30A超高效液相色谱仪(UPLC)(日本岛津公司、日本)加上QTRAP5500串联质谱(MS / MS)(美国SCIEX)。色谱分离进行一个热Accucore™C30列(2.1毫米×100毫米、2.6μm)。列温度维持在45°C。移动阶段(60/40乙腈/水)和B(10/90乙腈/水)均包含0.1%醋酸和10 L更易与甲酸铵。注射体积是2.0μL,流速为0.35毫升/分钟。梯度洗脱程序设置如下:20% B开头;30 - 60% B之间2 - 9分钟,85 - 90%的B 9 - 15.5分钟,95% B之间15.5 - -17.5分钟; 20% B for 17.5–20 min. The desolvation temperature was set as 500°C. The MS voltage in positive and negative modes was set to 5,500 V and −4,500 V, respectively. The pressures of the curtain gas, gas II, and ion source gas were 35 psi, 55 psi, and 45 psi, respectively. The ion pairs were detected by optimized collision energy and declustering potential in the triple quadrupole UPLC-MS/MS (补充数据2)。

Lipidomic分析脑脊液

UPLC-MS / MS分析使用了一个基于Metware数据库的广泛目标代谢物方法(Metware生物技术有限公司,武汉、湖北,中国)(刘et al ., 2023)。保留时间、离子对信息和二级光谱数据被用于半定量分析。半定量分析是由多反应监测(MRM)模式的三重四极质谱,和数据分析使用分析师1.6.3软件(美国AB SCIEX弗雷明汉,MA)和MultiQuant(3.0版本,AB SCIEX)。峰面积决定,个别区域相同的代谢物被规范化的综合区域所有的山峰。所有样本提取混合的质量控制(QC),和一个QC样品插入每十样本。各种QC样品的总离子流图被用来评估代谢物提取和检测的可重复性。脂质物种被列为二十烷类,甘油三酯(TGs),磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、游离脂肪酸(远期运费协议),甘油二酯(DG) lysophosphatidylcholine (LPC)、磷脂酰乙醇胺(PE),神经酰胺(Cer),肉碱(汽车),单甘油酯(毫克),胆固醇酯(CE)、磷脂酰丝氨酸(PS), hexosylceramide (HexCer)、鞘磷脂(SPH)丁酸(BA), phosphatidylglycerol (PG)。

无监督和监督方法被用来评估在CSF lipidomic签名是否可以确定使用6-OHDA诱导后的病变。在比较早期6-OHDA治疗和控制后,主成分分析(PCA)结果表明,天池和天泉占16.5%和26.2,分别为(补充数据3)。部分至少squares-discriminant分析(PLS-DA)结果表明,22%的总方差可以解释为1,和12%的总方差可以解释为组件2 (补充数据3 b)。使用正交偏最小二乘歧视分析(OPLS-DA)方法,正交T分数和分数分别为9.3%和22.4,分别为(补充数据3 c)。受到S-plot OPLS-DA数据分析(补充数据三维)。问(Deumens et al ., 2002)截距值排列−0.237的测试(n= 200)建议OPLS-DA模型有统计学上有效质量和鲁棒性补充数据3 e)。前15名的脂质VIP值被确定和VIP得分图所示(补充数据3 f)。

相同的方法选择比较控制晚期6-OHDA病变。主成分分析结果表明,天池和天泉占14.9%和23.8,分别为(补充数据4)。PLS-DA结果显示,15.1%的总方差可以解释组件1和14.2%的总方差可以解释为组件2比较后期的控制(补充数据4 b)。使用OPLS-DA方法,正交T分数,和T分数分别为6%和22.1 (补充数据4摄氏度)。S-plot和排列测试进行,Q (Deumens et al ., 2002)拦截价值观−0.301 (补充资料4 d, E)。前15名变量重要性的脂质投影(VIP)值VIP得分图所示(补充数据4 f)。

评价脂质过氧化作用,丙二醛(MDA)含量从Solarbio CSF是由检测工具(Solarbio科技、北京、中国)后,制造商的指示。

统计分析

并给出了数据意味着±标准错误的意思。比较两组接受了未配对t以及或Mann-Whitney测试后正常测试。在多个组之间比较分析了单向方差分析其次是至少显著差异(LSD)事后测试。数据分析使用统计产品与服务解决方案(SPSS) 16.0(美国IBM)p< 0.05表示一个统计上的显著差异。

lipidomic分析,15 SIMCA版本软件(Umetrics、期刊、瑞典)和MetaboAnalyst软件(版本5.0¹)被用于PCA, PLS-DA, OPLS-DA。火山情节、箱线图和热图使用GraphPad棱镜(GraphPad棱镜^®软件版本8.0.2窗口;拉荷亚、钙、美国)和起源软件(美国2022年版本,OriginLab Inc .)。变量重要性的代谢物投影(VIP),错误发现率(罗斯福)调整p价值,绝对的日志₂褶皱变化(FC)被用于聚类分析与起源软件(2022年版本,OriginLab Inc .)、美国)。使用Hiplot小提琴情节生成。²皮尔逊相关性分析起源软件(2022年版本,OriginLab Inc .)、美国)。在皮尔森相关和线性mixed-effects模型中,每个变量的重要性评估级别为0.05。

结果

非渐进式黑6-OHDA PD模型退化

老鼠与黑6-OHDA引起的退化,作为一个PD动物模型,评估了之前使用阿朴吗啡牺牲。评估的时间点是2、3、5周后6-OHDA管理。在这三个时间点,SN DA神经元的数量大幅减少,在PD大鼠与虚假的组评估包含IHC(褶皱变化:0.31、0.33和0.64,分别)和世界银行(褶皱变化:0.33、0.34和0.38,分别图1中),类似于TH-positive区域的纹状体包含IHC(褶皱变化:0.16、0.16和0.27,分别图2 a, B)和世界银行(褶皱变化:0.21、0.22和0.31,分别补充数据5)和SN星形胶质细胞密度(补充数据6)。TH的数量⁺细胞蓝斑(LC)也显著减少2、3和5周后6-OHDA注入褶皱变化为0.35,0.37,和0.45,分别为(补充数据7)。这些影响是伴随着大幅度增加apomorphine-induced旋转折叠变化为5.52,6.23,3.96 (图1 f)。小胶质细胞的密度在SN在2周增加了4.17倍和3.81倍6-OHDA政府在3周后,通过免疫荧光染色法如图所示(补充数据8)。有趣的是,在损伤诱导5周后,apomorphine-induced旋转,DA神经元的数量,小胶质细胞的密度在SN,和TH⁺信用证所有细胞明显恢复相比指出损伤诱导2周后,纹状体和TH-positive区域也显示经济复苏趋势没有意义。这些数据表明,功能恢复或补偿黑6-OHDA模型中可能发生减值,这非渐进式特征可能有助于探索和评估理想黑损伤的生物标志物。

图2

图2。非渐进式6-OHDA模型纹状体的退化。(一)纹状体部分显示TH免疫反应性和黑变性2,3,5周后单方面病变形成评估免疫组织化学染色。(B)图表显示了中脑TH水平。数据被表示为均值±S.E.M.*P< 0.05和控制。6-OHDA 6-hydroxydopamine;TH,酪氨酸羟化酶。酒吧规模:50μm。

脂质家庭CSF 6-OHDA病变的不同阶段

CSF lipidomic签名可能相当黑退化敏感的生物标志物PD (Hwangbo et al ., 2022)。基于TH表达式和旋转测试的结果,异常表现在早期阶段就被观察到大约2周后6-OHDA病变。在这个时间点,全球lipidomic CSF的差异进行了检测和分析。共有172种脂质和分为18个家庭被发现。脂质家庭包括2类花生酸、9远期运费协议,6 Bas 1 PS 1π,1 SPH 1 HexCer 1 PG, 8车,5 CEs, 2 cer 21 DGs, 4表示,6毫克,29个人电脑,10只,14 SMs, 51 TGs。根据表达式的百分比,DG, MG, TG,和电脑的家庭占51,24日,11日,和对照组的6%,50岁,23日,13日,6-OHDA 2 w集团6%,51岁,24岁,12岁和5% 6-OHDA 5 w集团,分别是(图3一)。脂质提供了家庭的概述层次聚类分析(图3 b)。期间6-OHDA病变形成,六个脂质家庭显示调节趋势,而12脂质家庭呈现下调趋势的早期阶段2周。其中,二十烷类、CE、TG、FFA家庭有显著不同的表达水平。在接下来的3周,汽车水平显著增加。在5周的后期阶段,仍然有一个显著的低水平,二十烷类,TG和汽车展出部分恢复,但水平仍高于对照组没有意义,和FFA几乎恢复到正常水平(图3 c)。类二十烷酸、CE、TG、FFA家庭表现出1。13 - 0。81 - 1。21 - 0.93倍的变化和意义表达6-OHDA 2 w集团和1。11 - 0。87 - 1。14 -,0.95倍的变化6-OHDA 5 w集团与控制相比,分别汽车展出6-OHDA两组之间的变化(1.84倍图4和补充数据9)。

图3

图3。脂质后家庭CSF 6-OHDA-induced病变的形成。检测脂质物种被分为18个家庭。(一)每个脂质家庭的比例控制,6-OHDA 2 w和5 w集团上市基于表达水平。(B)代表整个的热图18脂质家庭通过UPLC-MS /女士。(C)三维彩色图形显示的强度趋势脂质家庭CSF在正常情况下和6-OHDA-induced病变的不同阶段形成。颜色规模反映了分子强度与控制。6-OHDA 6-hydroxydopamine;TG,甘油三酸酯;电脑,磷脂酰胆碱;SM,鞘磷脂;FFA,游离脂肪酸;DG,双甘酯;lysophosphatidylcholine LPC的;PE、磷脂酰乙醇胺; CER, ceramide; CAR, carnitine; MG, Monoglyceride; CE, cholesterol ester; PS, phosphatidylserine; HexCer, hexosylceramide; SPH, sphingomyelin; BA, butyric acid; PG, phosphatidylglycerol.

图4

图4。脂质6-OHDA-induced损伤后脑脊液家庭形成特征。小提琴的情节显示脂质有罗斯福的家庭的表达和分布调整p6-OHDA 2 w的值< 0.05或5 w组与控制。差异是由学生的决定t以及,*p< 0.05和* * *p< 0.001由Mann-Whitney测试。6-OHDA 6-hydroxydopamine;CE、胆固醇酯;车,肉碱;FFA,游离脂肪酸;TG,甘油三酸酯。ns,不重要,0.05概率水平。

脂质物种从CSF 6-OHDA病变的不同阶段

172种脂类的完整概述层次聚类提供的是(图5一个和补充数据10)。在两周的早期阶段,11脂质物种调节。在接下来的3周,10的11个物种浓度几乎恢复正常。只有TG(16:0_20:0_18:1)水平与控制相比,增加了维护和新脂质肉碱C5-OH和肉碱C4:1-2OH显著调节在5周的后期阶段(图5 b, C)。以上13脂质物种还会见了罗斯福的选择标准调整p在2 w值< 0.05或5 w 6-OHDA组与控制相比,和被用来画PD lipidomic签名特征(图5 c)。13个脂质物种表现出不同的变化趋势6-OHDA病变形成期间(图5 d)。其中,TG (16:0_16:0_18:1), TG (16:0_18:0_18:1), TG (17:0_18:0_18:1), TG (18:0_18:0_18:1), TG (16:0_20:0_18:1), TG (16:0_18:1_18:1), TG (16:0_18:0_18:2), TG (16:0_16:1_20:1), TG (18:0_18:1_18:2), TG(18:1_18:1_18:1)和TG(18:0_18:1_18:2)表现出2。22 - 3。38 - 3。40 - 3。64 - 3。00 - 2。83 - 3。19 - 2。73 - 4。 00-, 2. 45-, and 2.79-fold changes with significance in expression in the 6-OHDA 2W group compared with the control, respectively. After a of 3-week period of recovery, the level of 169 lipid species had no significant change except TG(16:0_20:0_18:1), carnitine C5-OH, and carnitine C4:1-2OH with 2. 08-, 3. 02-, and 3.19-fold changes in the 6-OHDA 5W group (图6和表1)。

图5

图5。脂质签名后脑脊液6-OHDA-induced病变的形成。(一)获得的热图代表所有172种脂质UPLC-MS /女士。(B)三维火山情节显示13脂质物种|日志₂FC | > 1和VIP > 1 6-OHDA-induced病变形成的早期阶段表现出不同的变化趋势在接下来的三周时间。(C)13个脂质物种被用来生成lipidomic签名所示的热图。(D)三维彩色图形显示的强度趋势13脂质物种CSF在正常情况下和6-OHDA-induced病变的不同阶段形成。颜色规模反映了分子强度与控制。6-OHDA 6-hydroxydopamine;贵宾,变量重要性的投影;FC,褶皱变化。

图6

图6。CSF 6-OHDA-induced损伤后形成脂质物种特征。小提琴的情节显示脂质物种与罗斯福的表达和分布调整p值< 0.05 6-OHDA 5 w与对照组相比。差由学生决定t以及,*p< 0.05和* *p< 0.01通过Mann-Whitney测试。6-OHDA 6-hydroxydopamine;TG,甘油三酸酯。ns,不重要,0.05概率水平。

表1

表1。脂质物种在CSF 6-OHDA-induced病变的形成。

一些研究表明,6-OHDA-induced脂质过氧化与多巴胺功能障碍(李et al ., 2009;甜美et al ., 2010)。我们研究了脂质过氧化反应在脑脊液和SN发现Pex19的表达。MDA含量均呈增长趋势在2周后6-OHDA损伤无显著差异(补充数据11)。Pex19也没有显著差异表达在SN 6-OHDA病变(2和5周后11 b补充数据)。

脂质代谢在脑脊液遵循黑障碍的恢复

相关分析是用来评估的脂质CSF作为黑变性6-OHDA模型中的生物标志物。阿朴吗啡引起的旋转,一个行为检测,可以帮助在SN估计6-OHDA的病变。类花生酸、CE和TG被他们表达的改变选择在5周后6-OHDA病变。类花生酸的水平和TG与旋转行为有积极的关系P值分别为< 0.001和0.006,(图7)。类花生酸的负相关关系和TG与TH表达式SN也表现出不同程度的意义P值分别为< 0.001和0.005,(图7 b)。CE与TH表达,表现出一个积极的关系P值< 0.001,但与旋转行为有一个清楚的关系P值为0.558。关于脂质物种,肉碱C5-OH、肉碱C4:1-2OH和TG(16:0_20:0_18:1)也选择基于后期表达的变化。所有的脂质物种与旋转行为方面表现出显著的积极的人际关系,包括与一个肉碱C5-OHP值为0.279,肉碱C4:1-2OHP值是0.280,TG (16:0_20:0_18:1)P值为0.011 (图8)。TG(16:0_20:0_18:1)表现出消极的关系表达式在SNP值为0.011。肉碱C5-OH和C4:1-2OH与TH表达式(通常积极的人际关系图8 b)。TG家庭,这些协会建议类花生酸和TG(16:0_20:0_18:1)可能是敏感的生物标志物在PD黑变性。

图7

图7。脂质之间的关系分析家庭在脑脊液和6-OHDA-induced病变。类花生酸之间的相关性,CE, TG与旋转阿朴吗啡引起的脑脊液(一)和TH率(B)皮尔森相关分析。带预测的95%和95%置信区间与光红色和深红色区域,分别。CE、胆固醇酯;TG,甘油三酸酯;TH,酪氨酸羟化酶。

图8

图8。脂质之间的关系分析物种在脑脊液和6-OHDA-induced病变。肉碱C5-OH之间的相关性,肉碱C4:1-2OH, TG(16:0_20:0_18:1)与旋转阿朴吗啡引起的脑脊液(一)和TH率(B)皮尔森相关分析。带预测的95%和95%置信区间都标有红色和深红色光区域,分别。TG,甘油三酸酯;TH,酪氨酸羟化酶。

讨论

临床和临床前诊断为帕金森病仍然是一个重大的挑战。当PD病人表现出运动症状,50 - 70% SN DA神经元的丢失(奥尔特Tabrizi, 2003)。CSF lipidomic失衡被发现在后期PD患者(Fernandez-Irigoyen et al ., 2021)。我们的研究旨在探索PD的生物标志物,有助于实现疾病的早期诊断和干预。这里,我们利用lipidomic方法开发了一个特殊的脂质签名表示6-OHDA-induced PD大鼠,发现脂质家庭的表达变化和物种在随后CSF 6-OHDA病变的进展。我们建议类花生酸、CE、TG和TG(16:0_20:0_18:1),这是有关6-OHDA-induced病理和行为异常,可能代表适合PD的生物标志物。

CSF的脂质家族分为二十烷类、FFA,英航,PS,π,SPH, HexCer, PG,车,CE, CER、DG, LPC, MG,电脑,体育,SM和TG在这项研究。其中,二十烷类、DG和TG显著调节与控制。许多研究研究血清中TG的作用与缺血性脑血管疾病有关,但很少有研究关注的功能TG在神经退行性疾病(、et al ., 2018)。非痴呆衰老的人,在血清中TG水平具有负相关性与执行功能(从事et al ., 2014)。一些研究表明,增加血清TG展品与可怜的认知关系密切(他et al ., 2016年),而其他的研究报告也没有关系(亨德森et al ., 2003)或显示了相反的结论(Lv et al ., 2019)。循环TG能增加奖励的活动在大脑功能电路(Cansell et al ., 2014),可能与小皮质厚度在老年人大脑Aβ负担(Llado-Saz et al ., 2015)。提出了TG穿过BBB和诱发特殊中央受体阻力,包括瘦素和胰岛素,导致功能改变喂养和认知(银行et al ., 2004年,2018年)。TG新陈代谢也会影响DA释放,扮演多个关键角色的奖励系统,联想学习、运动规划和决策(Ramos-Lopez et al ., 2018;Berland et al ., 2019,2020年)。在PD患者中,SN的TG浓度与inflammation-attenuating信号(Brekk et al ., 2020)。TG的饮食可以影响DA神经元的功能调节dopamine-dependent行为,促进小胶质SN极化(Cansell et al ., 2014;Toscano et al ., 2020)。一些研究认为,高脂肪饮食包括神经毒素和加速DA神经元的损失在PD (Sharma Taliyan, 2018;花王et al ., 2019)。对TG在脑脊液中,相对报告PD是罕见的。本研究表明,TG的家人和TG(16:0_20:0_18:1)表现出显著调节水平2周后6-OHDA-induced病变的形成。这些调节水平一定程度上恢复了在随后的三个星期但仍高于指出在控制在5周。6-OHDA模型的病理和行为异常是最严重的2个星期,及其严重程度符合CSF中TG含量的变化。以上证据表明TG水平的家庭成员和TG(16:0_20:0_18:1)脑脊液可能暗示PD的SN病变的存在。

二十烷类和FFA是其他脂质家庭表现出显著改变表达式的CSF 6-OHDA-induced损伤后2周内的形成。二十烷类两亲水脂分子,来自花生四烯酸和多不饱和脂肪酸的氧化(Tapiero et al ., 2002)。其亚科包括前列腺素、白细胞三烯、凝血恶烷resolvin, lipoxins,保护,isoprostanes maresins,内源性大麻素等(Tapiero et al ., 2002)。类花生酸在中枢神经系统调节神经功能,包括记忆和学习、脑血流量、睡眠,神经炎症(Biringer 2019;Regulska et al ., 2021;杜罗et al ., 2022)。在衰老小鼠,改变类二十烷酸概要文件在海马体展览与炎症关系密切,突触功能障碍、认知障碍(Valcarcel-Ares et al ., 2019)。这类二十烷酸lipidome激活AD患者的大脑中,特别是APOE4基因携带者的增加(杜罗et al ., 2022)。关于PD,相关报道缺乏。这PD研究表明显著调节水平2和5周后6-OHDA-induced病变形成类二十烷酸家族不被发现,但在其脂质。类花生酸的变化表达家庭可能包括所有的小其脂质来实现意义的差异。这一发现表明,类二十烷酸的家庭可能更适合比其脂质作为PD的生物标志物。

关于FFA,其大脑中积累一些遗传性神经系统疾病有关,包括Refsum疾病和x连锁罹(Schonfeld赖泽,2016)。在AD患者,降低FFA水平在载脂蛋白E4比非承运人(航空公司杜罗et al ., 2022)。FFA可能防止淀粉样蛋白的组装和τ丝(Kruska赖泽,2011;Barracchia et al ., 2020)。远期运费协议,包括棕榈酸、油酸和硬脂酸,都被证明有低浓度血清的PD患者在临床前阶段(Havelund et al ., 2017;Gonzalez-Riano et al ., 2021),提出了作为后续研究的潜在生物标志物PD (Havelund et al ., 2017;Konjevod et al ., 2022)。亚麻酸,归类为不饱和脂肪酸,可以抑制蠕虫6-OHDA-induced多巴胺能神经退化(Shashikumar et al ., 2015)。然而,角色类花生酸和FFA的黑功能和PD的发病机制尚不清楚。在这项研究中,显著调节FFA水平只说2周后6-OHDA-induced病变形成但不是5周。这个结果暗示,CSF远期运费协议可能发布的DA神经元或其他细胞受损,出现在有限的数量在5周。因此,改变FFA CSF表达可能作为一种有用的生物标志物,有助于识别早期PD病理变化。更多细节关于函数和表达式类花生酸和FFA的PD仍然是需要的。

胆固醇酯称为存储形式的胆固醇,有助于大脑中的胆固醇运输(金et al ., 2019;Gliozzi et al ., 2021)。在神经退行性疾病与异常蛋白质总量,TREM2作为一种lipid-sensor在小胶质细胞,是广告的一个遗传易感性因素(纽金特et al ., 2020)。CE聚合可以在TREM2 KO和AD-variant人类iPSC小胶质细胞,并可能与α-syn存款(Garcia-Sanz et al ., 2021;镍锰合金et al ., 2021)。溶酶体的胆固醇异常积累在孤立的PD患者成纤维细胞被发现携带N370S GBA1突变(Garcia-Sanz et al ., 2017)。24-hydroxycholesterol酯的浓度也降低血清中从PD (Havelund et al ., 2017;Di et al ., 2018)。另一项研究表明,三酰甘油,但不是胆固醇,被选为最主要的血清脂质用来区分PD患者从富亮氨酸重复激酶2体内基因LRRK2()突变携带者(Galper et al ., 2022)。CE和帕金森病风险之间的关系尚不清楚。在这里,我们表明,6-OHDA-induced病变减少CE家庭CSF水平在早期和晚期阶段。这表明,胆固醇障碍可能在PD病理中发挥重要作用。CE功能和机制在PD的更多细节还需要进一步研究。

肉碱C5-OH和肉碱C4:1-2OH表现出一种特殊的表达谱调节水平被发现只在5周后6-OHDA-induced病变的形成。乙醯左旋肉碱一直是研究热点的广告(彭尼斯et al ., 2020)。一些研究表明,乙醯左旋肉碱可以防止炎症过程,恢复会造成的神经退化,在广告(起到预防的作用Bodaghi-Namileh et al ., 2018;Kepka et al ., 2020;彭尼斯et al ., 2020)。在临床研究中,通路富集分析表明,碱航天飞机是一个重要的途径相关药物天真的PD患者(辛克莱et al ., 2021)。12 - 14的长链acylcarnitines早期血清中水平较低的PD具有较高的特异性和中度敏感性疾病诊断saki et al ., 2017)。在6-OHDA-induced老鼠和慢性1-Methyl-4-phenyl-1 2 3, 6-tetrahydropyridine全身的注射(MPTP药物)小鼠模型,乙醯左旋肉碱能保护免疫反应性的TH和DTA nigral-striatal系统,和PD进展缓慢Afshin-Majd et al ., 2017;伯克斯et al ., 2019)。乙醯左旋肉碱在PD的作用仍不清楚。我们发现调节乙醯左旋肉碱表达式6-OHDA-induced病变晚期的形成与提高病理和行为异常大鼠模型。这一发现表明,碱C5-OH和肉碱C4:1-2OH可能与黑病变的恢复。看来不同的脂质被发现6-OHDA-induced病变的不同阶段形成。一个脂质家人或物种不足以描述的完整6-OHDA-induced病变在大脑中形成。不同的表达模式涉及多个脂质家庭和物种表现出更多的敏感性和准确性评估PD进展。

脂质氧化的产品被认为是理想的生物标志物的PD的诊断诊所。作为他们的成员,hydroxyeicosatetraenoic酸和胆固醇氧化产品被发现在PD患者尿液浓度升高(李et al ., 2009)。其他脂质,如F2-isoprostanes和胆固醇氧化产品,均显示同样增加血清中浓度从PD (李et al ., 2009;甜美et al ., 2010)。与F2-isoprostanes相比,isofurans更有利于形成氧张力(Fessel et al ., 2003)。一项研究发现,isofurans,但不是F2 - isoprostane,有调节趋势SN的PD和路易体痴呆患者(下文)(Fessel et al ., 2003)。这表明,脂质氧化的产品可能有特殊的代谢特征在不同的PD患者的体液和组织。在这项研究中,我们发现,脂质氧化CSF和Pex19 SN没有发生戏剧性的变化在2和5周后6-OHDA-induced病变。我们推断,6-OHDA引起的脂质过氧化作用的产品可能是代谢后2周。仍需要进一步的研究来证实这种可能性。

各种神经毒性和遗传动物模型已经应用PD研究。经典的转基因模型难以复制PD在诊所的完整的特性,例如,α-Syn,帕金,DJ-1基因敲除小鼠(贾et al ., 2020)。PD-like单边行为表型的6-OHDA模式优势和可预测的DA神经元的变性(贾et al ., 2020)。在体外,6-OHDA-treated SH-SY5Y细胞模型显示一系列的脂质变化的大脑中发现PD患者和动物模型(Xicoy et al ., 2020)。血清中的胆固醇水平也呈显著降低趋势6-OHDA-treated兔子(Meara et al ., 1992)。6-OHDA建议作为一个很好的促进ferritin-dependent脂质过氧化(蒙泰罗Winterbourn, 1989)。在这里,我们显示一个特殊的血脂的CSF PD大鼠模型。这一发现表明,6-OHDA适用于作为探索神经毒素构造一个PD模型脂质代谢。

我们的研究有一些局限性。我们的数据不够强壮披露之间的直接关系后血脂6-OHDA-induced在PD大鼠损伤和神经退行性变的。需要更多的研究来证实这种关系和披露潜在的机制。

结论

总之,6-OHDA-induced病变引起CSF lipidomic概要文件的变化,而这些变化表现出潜在价值作为一个潜在的PD的诊断工具。描述改变后的脂质代谢概况6-OHDA-induced病变形成,尤其是二十烷类、CE、TG的家庭,和TG(16:0_20:0_18:1),可能会打开一个新窗口黑损害评估PD和帮助开发新的anti-PD药物。

数据可用性声明

最初的贡献在这项研究中都包含在本文展示/补充材料,进一步的调查可以直接到相应的作者。

道德声明

综述了动物研究和动物实验伦理委员会批准广州医科大学(2020143、2020年8月21日)。

作者的贡献

毫米,XZ和PX的构思和设计研究和解释实验。欧美,LW, y,金桥进行研究和准备手稿的初稿。毫米,PX, GP,刘日东监督项目。WD、金桥、YL、SL ZL,生理,YW, WG、ZZ, LD、HL和XC提供了实验样品和数据。所有作者阅读和批准最终的提交。

资金

这项工作得到了国家自然科学基金(81701254,81701254,81701254,82071416,82071444),基础研究和应用基础研究的一般项目广州局科技(2060206)、广州市教育局的杨成学者项目(202032790)、广东省自然科学基金一般项目(2021 a1515011043),和广州关键学科格兰特(2021 - 2023)。

确认

我们谢谢林胡安的优秀的技术援助。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnagi.2022.1077738/full补充材料

脚注

引用

Afshin-Majd, S。Bashiri, K。,Kiasalari, Z., Baluchnejadmojarad, T., Sedaghat, R., and Roghani, M. (2017). Acetyl-L-carnitine protects dopaminergic nigrostriatal pathway in 6-hydroxydopamine-induced model of Parkinson’s disease in the rat.生物医学。Pharmacother。89年,1 - 9。doi: 10.1016 / j.biopha.2017.02.007