β淀粉样蛋白积累和增强神经元分化的脑瀑样Dutch-type脑淀粉样血管病患者gydF4y2Ba
埃琳娜DaoutsaligydF4y2Ba
1gydF4y2Ba
*gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
巴里·a·佩珀gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
达沃StamatakisgydF4y2Ba
1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
琳达·m·范德格拉夫gydF4y2Ba
1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba吉塞拉·m·吉塞拉gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2BaDavid a .帕菲特gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
罗纳德·a . m . BuijsengydF4y2Ba
1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba
Willeke m . c . van Roon-MomgydF4y2Ba
1gydF4y2Ba
*gydF4y2Ba
- 1gydF4y2Ba人类遗传学、莱顿、荷兰莱顿大学医学中心gydF4y2Ba
- 2gydF4y2Ba神经病学、莱顿、荷兰莱顿大学医学中心gydF4y2Ba
作品简介:gydF4y2BaADutch-type脑淀粉样血管病(D-CAA)是一种遗传性大脑紊乱引起的淀粉样前体蛋白(APP)的点突变基因。突变位于内β淀粉样蛋白(Aβ)应用领域并导致Aβ肽积聚在大脑血管。缺乏疾病模型研究的细胞和分子病理机制D-CAA一起没有过度的疾病表型体外细胞模型,以及有限的可用性D-CAA动物模型表明需要D-CAA patient-derived模型。gydF4y2Ba
方法:gydF4y2Ba我们生成脑瀑样从四个D-CAA病人和四个控制,培养他们110天,执行immunofluorescent和有针对性的基因表达分析在两个时间点(D52和D110)。gydF4y2Ba
结果:gydF4y2BaD-CAA脑瀑样展出Aβ积累,增强神经元和星形基因表达和TGFβ途径放松管制。gydF4y2Ba
结论:gydF4y2Ba这些结果说明大脑的潜在瀑样D-CAA体外疾病模型,可用于理解疾病机制D-CAA和可以作为治疗干预平台各种Aβ-related紊乱。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
Dutch-type脑淀粉样血管病(D-CAA)是一种罕见的遗传性大脑疾病引起的点突变在淀粉样前体蛋白(gydF4y2Ba应用程序gydF4y2Ba)基因[NM_000484.3(应用):c.2077G > C]。它主要发生在家庭两个沿海村庄在荷兰(gydF4y2BaBornebroek et al ., 1996gydF4y2Ba;gydF4y2Ba坎普et al ., 2014gydF4y2Ba澳大利亚(西南部)以及家庭gydF4y2BaPanegyres et al ., 2005gydF4y2Ba)。突变导致谷氨酸谷氨酰氨基酸替换(NP_000475.1: p.Glu693Gln)在β淀粉样蛋白(Aβ)应用领域。Αβ肽不同长度的来自微分amyloidogenic蛋白水解处理的应用β-andγ-secretases。在D-CAA主要有毒Aβ肽长40个氨基酸(Aβ40)。氨基酸替换从带电残留(Glu)卸货残渣(Gln)导致加速寡聚化和fibrillization Aβ以及受损Aβ运输和整个大脑血管间隙导致其积累在脑leptomeningeal动脉和大脑皮层小动脉引起血管平滑肌细胞的退化。这将最终导致脑出血(我)年龄在40 - 65(的gydF4y2BaBornebroek et al ., 1997gydF4y2Ba;gydF4y2BaBaumketner et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba金姆和赫克特,2008年gydF4y2Ba;gydF4y2BaGhiso et al ., 2014gydF4y2Ba)。临床上,D-CAA特点是出血性中风,梗塞、血管性认知损害和痴呆(gydF4y2BaBornebroek et al ., 1997gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
世袭的脑部疾病与一个已知的基因原因有助于设计和生成细胞和动物模型,将导致进步在理解基本疾病机制的中枢神经系统疾病和疗法的发展将作为平台(gydF4y2BaChesselet卡迈克尔,2012gydF4y2Ba)。然而,目前有一个低成功率的翻译小说疾病修饰治疗方法为CAA诊所。这可能部分解释为缺乏疾病病因的疾病模型,人类和动物模型作为生物体之间的差异,以及缺乏适当的patient-derived模型。D-CAA有两种可用的转基因动物模型;小鼠模型overexpressing人类Dutch-APP (E693Q)开发一个Aβ表型在20 - 22个月大的时候(gydF4y2Ba赫齐格et al ., 2004gydF4y2Ba)和一只老鼠模型携带人类应用包含瑞典、荷兰和爱荷华州应用突变显示脑微血管Aβ纤维和行为的早期积累赤字在3个月大的时候(gydF4y2Ba戴维斯et al ., 2018gydF4y2Ba)。能够重新编程patient-derived人类体细胞诱导多能干细胞(万能)使得疾病建模的新方法gydF4y2Ba高桥et al ., 2007gydF4y2Ba)。最近我们生成并完全从D-CAA hiPSCs病人特征(gydF4y2BaDaoutsali et al ., 2019gydF4y2Ba)。人类可以分化的细胞则对大脑特定的细胞类型,如神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞(gydF4y2Ba施et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaSpeicher et al ., 2019gydF4y2Ba)。然而,大脑是一个三维的复杂的器官,在多个细胞相互作用形成不同的大脑区域。gydF4y2Ba兰开斯特et al。(2013)gydF4y2Ba首次介绍了大脑瀑样模型的生成和使用大脑紊乱。脑瀑样已经被用来模拟多个大脑神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆(FTD),家族和零星的帕金森病以及精神疾病如精神分裂症和双相情感障碍(gydF4y2Ba儿子et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba金正日et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba中村et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaPapaspyropoulos et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2Ba泽田师傅et al ., 2020gydF4y2Ba)。最近它也表明,瀑样有可能被用作药物筛选平台(gydF4y2Ba拉贾et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaGroveman et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2Ba公园et al ., 2021gydF4y2Ba)。然而,这些3 d模型也有限制建模时神经退行性或神经与血管的疾病。iPSC-induced脑瀑样比成人大脑和大脑与产前缺乏血管化会导致大脑生理学的一个重要组成部分,血脑屏障,这是重要的病理D-CAA (gydF4y2BaDi Lullo和克里斯坦,2017年gydF4y2Ba;gydF4y2BaHuch et al ., 2017gydF4y2Ba)。因此,人类大脑瀑样模型是一个额外的模型,除了动物模型,可以用来识别这个大脑血管疾病的分子机制和治疗干预措施可以作为一个平台。gydF4y2Ba
在这项研究中,我们想要检查是否有变化D-CAA脑瀑样引起的突变体的应用蛋白的表达。在先前的研究中,我们的团队表明,没有更高的生产Aβ40和Aβ42肽D-CAA神经元分化万能(gydF4y2BaDaoutsali et al ., 2021gydF4y2Ba)。这是与细胞和瀑样模型的广告相比,在早衰素上应用突变,而像伦敦和瑞典,以及唐氏综合症21号染色体三染色体细胞(3份应用)导致Aβ肽的表达增加(gydF4y2Ba崔et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba冈萨雷斯et al ., 2018gydF4y2Ba)。因此,我们目前的假设是,在D-CAA Aβ正常生产,但是Dutch-mutation创建一个Aβ肽更容易聚合。我们表明,疾病相关的变化可以确定D-CAA瀑样。首先,我们比较两种不同的脑瀑样协议和最有效的用于生成瀑样相同的大小和形态生长脑瀑样从四个控制和四个D-CAA细胞系,包括一对同基因的创建与CRISPR / Cas9技术。D-CAA瀑样展出Aβ积累只有52天后在文化、和显示高表达的神经元和astrocyte-specific基因控制。此外,我们注意到TGFβ受体1 upregulation 52和110天。所以脑瀑样是一个重要的除了现有D-CAA模型,可用于进一步D-CAA病理学知识,疾病机制和新的治疗的发展。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
重组iPSC行gydF4y2Ba
LUMC批准的这项研究是医学伦理委员会(MEC)和患者知情同意(NL45478.058.13 / P13.080)。在这项研究中四个D-CAA和四个控制线路。重组的D-CAA 3和控制1细胞系以前发表的我们组(gydF4y2BaDaoutsali et al ., 2019gydF4y2Ba)。重组的三行控制和质量控制也由我们组(数据没有显示)。皮肤活检得到来自两个D-CAA病人。解剖后,成纤维细胞培养在最低基本培养基(MEM)补充15%的边后卫,2毫米penicillin-streptomycin GlutaMAX和1%(所有Thermofisher)在37°C和5%的公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。成纤维细胞扩展通道5,在液态氮冷冻,以供将来使用。成纤维细胞重编程的ReproRNA™-OKSGM工具包(干细胞技术)是根据制造商的指示使用。5周后hiPSC殖民地形成被手动和山肩基底膜基质(康宁)涂层板mTeSR1(干细胞技术)中。hiPSC殖民地通过大约每周和质量控制测试后进行10个章节。hiPSCs首次检查多能性标记物的表达gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba免疫荧光。细胞被固定在4%多聚甲醛在室温下(PFA) 10分钟(RT),与0.1% Triton-X permeabilized PBS和探测主要抗体,对Oct3/4 SSEA-4和Nanog immunobuffer含有1%山羊血清和PBS Triton x - 100 0.1%。检查多能性基因表达水平,RNA是隔绝的hiPSCs ReliaPrep Miniprep系统(Promega)根据制造商的指示。500 ng的RNA作为输入与Transcriptor互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA合成装备(罗氏)。存在运行LightCycler 480实时PCR系统(罗氏)SensiMix SYBR Hi-ROX工具包(Bioline)使用以下程序:变性在95°C 10分钟,45个周期95°C的变性10年代,退火30年代和60°C扩展20年代在72°C。使用ΔΔCT-method CT-values被规范化。引物序列中列出gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。全球筛选数组(GSA;Illumina公司)是根据标准协议,紧随其后的是一个标准的分析GenomeStudio软件(Illumina公司)GSA manifest文件。GenomeStudio Finalreports被用来分析和可视化在Nexus发现(BioDiscovery El Segundo的)。使用报告解决~ 50 kb为染色体畸变分析数据。比较患者成纤维细胞生成的数组hiPSCs最终报告被选为R脚本作为输入。根据文件转换为小表SNP ID。使用统计我们确定等位基因是否调用匹配,不匹配或失败。荷兰突变被Sanger测序证实。最后,我们测试了他们自发分化能力的细胞系3胚芽层,内胚层、中胚层和外胚层。细胞在DMEM / F12 20%的边后卫培养3周与媒体改变了每隔一天。 HiPSCs were fixated with 4% PFA and immunostained with antibodies against SOX17 (endoderm), SMA (mesoderm) and PAX6 (ectoderm).
表1gydF4y2Ba。引物序列。gydF4y2Ba
CRISPR / Cas9编辑APP基因创造D-CAA同基因的iPSC线gydF4y2Ba
在线设计工具gydF4y2Bahttp://crispr.mit.edu/gydF4y2Ba(张实验室、麻省理工学院)被用来设计single-guide rna (sgRNAs)与高特异性接近预期的应用目标序列突变网站最少的预测非目标(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。nucleofection之前,控制hiPSCs使用mTeSR1中补充了1 x切割(干细胞技术)至少1 h。0.5 1×10之间gydF4y2Ba6gydF4y2Ba使用人类干细胞细胞nucleofected Nucleofector装备2 (Lonza)和Amaxa Nucleofector 2 b设备(方案b - 016),根据制造商的指示。核糖核蛋白(RNP)形成的复合物结合11.5μg Cas9酿脓链球菌;集成DNA技术(IDT))和3μg sgRNA (IDT)。电穿孔前,75 pmol ssDNA HDR捐赠模板和75 pmol Cas9电穿孔增强剂(IDT)添加到Cas9 RNP解决方案。的细胞转移到井Matrigel-coated 24-well板和500年培养μl mTeSR1包含1 x切割。媒介是每天改变,取决于细胞存活率,切割24 - 72 h后中被省略了。hiPSCs汇合的80 - 90%时,这些细胞被洗与PBS和释放accutase (Thermofisher)。分离细胞的一半用于基因组DNA提取,另外一半被冻结在HyClone胎牛血清(热科学)与10% DMSO(σ)为未来sib-selection−80°C。gydF4y2Ba
表2gydF4y2Ba。ddPCR探针和sgRNA序列的生成D-CAAiso hiPSC线。gydF4y2Ba
基因组DNA提取的细胞则使用ReliaPrep gDNA组织Miniprep系统(Promega)。DNA定量分析来确定的单碱基替换CRISPR编辑是由液滴数字PCR (ddPCR)使用ddPCR Supermix为探针(没有dUTP;Bio-Rad)和特定的引物(18μM)和dual-labeled (FAM /十六进制)水解探针(5μM)表示gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba。使用50 - 150 ng基因组DNA进行解决方案ddPCR QX200滴数字PCR系统和T100热循环(Bio-Rad)使用下列条件:变性在95°C 10分钟,40个周期94°C的变性30年代,60年代退火在61°C,扩展20年代在98°C。gydF4y2Ba
获得一个纯杂合的D-CAA突变克隆从sib-selection屏幕,hiPSCs显示最高CRISPR修改被解冻,生长在mTeSR1包含1 x切割。细胞分散的低密度1500 - 2000细胞/到Matrigel-coated 10厘米菜肴和生长在mTeSR1包含1 x切割。大约7 - 10天之后,大殖民地了,转移到Matrigel-coated 48-well板和扩展。桑格测序结果证实隔离D-CAA突变的杂合的克隆。后扩张D-CAAiso线受到hiPSC质量控制上一节中提到的。gydF4y2Ba
脑瀑样文化gydF4y2Ba
两个协议被用于脑瀑样的一代;STEMdiff脑瀑样工具包(干细胞技术)是基于出版gydF4y2Ba兰开斯特et al。(2013)gydF4y2Ba和描述的协议gydF4y2Ba加布里埃尔和葛(2017)gydF4y2Ba兰开斯特相比,一些小的修改协议。两个协议,脑瀑样生成根据制造商的或作者的指示,分别。总之,大脑瀑样文化开始通过电镀单个细胞悬液hiPSCs 96 -孔板产生拟胚体(EBs)。EBs / neurospheres嵌入人工基底膜滴支持神经上皮的扩张和转移到成熟的轨道振动介质保持旋转条件下(65 rpm 6-well板轨道瓶)。媒介和时间点,每个媒介所示gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba。比较的两个协议脑瀑样收集固定在天52和110,并评估使用immunofluorescent分析如下所述。最后,STEMdiff脑瀑样装备选择和使用根据制造商的指示从控制和生成脑瀑样D-CAA线。测量瀑样的大小,brightfield图像的六种不同的瀑样细胞系和时间点的面积在ImageJ进口每个瀑样在μm报道gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
表3gydF4y2Ba。脑瀑样协议时间点和媒体。gydF4y2Ba
Immunofluorescent分析和成像的脑瀑样gydF4y2Ba
三个脑瀑样收集每个细胞株的天52和110年immunofluorescent分析。瀑样是用PBS和固定在4% PFA解30分钟在房间沿固定后,瀑样是用PBS孵化前一夜之间在4°C cryoprotection 30%的蔗糖溶液。除去30%的蔗糖溶液后,瀑样是嵌入在最佳切削温度复合,Tissue-Tek超频美国T(樱花Finetek) Peel-A-Way嵌入模具。三瀑样每细胞系被放置在每个嵌入模具。模具是在乙醇snap-frozen干冰和存储在- 80 oc直到进一步使用。immunofluorescent分析cryoprotected冻脑瀑样分组低温恒温器,在16个μm-thick PLL-coated玻璃cryoslides收集部分。immunofluorescent染色cryoslides获准的风干第一次30分钟rt,幻灯片和PBS洗一次,然后用200毫米的两倍甘氨酸在PBS淬火PFA-induced自体荧光。瀑样部分为非特异性抗体绑定被封锁屏蔽解决方案包含5%羊或马血清,0.1% Triton x - 100在PBS 30分钟在rt,初级抗体稀释immunobuffer溶液中含有1%羊或马血清和PBS Triton x - 100 0.1%。一夜之间,部分被孵化与初级抗体在4°C。主要抗体探测幻灯片后洗了三次二次抗体和DAPI之前与PBS稀释在immunobuffer被添加的部分为2 h rt,后二次抗体探测幻灯片和PBS洗了三次。 Without letting the sections dry, any excess liquid was wiped carefully off the slide and one drop of Prolong Diamond antifade mounting medium (Invitrogen) was added on top of the organoid sections together with a coverslip. The slides were left overnight at RT and were later stored at 4°C in the dark until confocal microscopy. For the immunofluorescent analysis for every cell line 3 organoids and 12 organoid sections were stained with indicated antibodies. For the overview images of the cerebral organoid sections the slide scanner Axio Scan.Z1 (Zeiss) microscope was used. For the high magnification images the confocal TCS SP8 (Leica) was used. The antibodies and dilutions used are listed in表4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
表4gydF4y2Ba。抗体immunofluorescent染色。gydF4y2Ba
RNA分析gydF4y2Ba
对于RNA分析,三天瀑样每收集细胞系52和110年。瀑样用PBS和冷冻at-20oC洗净。细胞RNA隔离ReliaPrep RNA miniprep系统(Promega)是根据制造商的指示修改用于细胞裂解的一步。细胞裂解,裂解缓冲被添加到每个管包含瀑样和磨碎驱散细胞颗粒/瀑样。细胞溶解产物被转移到麦格纳溶解管(罗氏)在子弹搅拌机均化强度8 3分钟(或3×1分钟)。均化后的溶解产物是离心机在10.000×3分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba和上层清液转移到一个新的管继续协议根据制造商的指示。RNA浓度是衡量量子位荧光计(表达载体)和RNA样本存储在- 80摄氏度。互补脱氧核糖核酸合成100 ng的总RNA从Transcriptor每个瀑样作为模板合成第一链cDNA装备用随机六聚物引物(罗氏)。我们验证引物组使用LightCycler RT-qPCR 480实时PCR系统(罗氏)SsoFast EvaGreen Supermix较低的火箭(BioRad)。的循环参数qPCR包括初始变性在95°C 10年代,退火60°C 30年代,20年代在72°C和扩展。CT-values GAPDH使用ΔΔCT-method规范化。gydF4y2Ba
Fluidigm RT-qPCRgydF4y2Ba
Fluidigm平台(Fluidigm公司)1.25μl每个cDNA样本preamplified使用1μl混合前置放大器主(Fluidigm PN 100 - 5580)和0.5μl底漆的池。前置放大包括变性步骤在95°C 2分钟,其次是15 95°C的周期15年代和60°C 4分钟。preamplified反应与核酸外切酶清除失活后,我(ExoI公司)和ExoI preamplified样本稀释5倍的DNA暂停缓冲(TEKnova PN T0221)。目标基因表达分析与Fluidigm 2.5μl preamplified样本混合2.25μl 2 x SsoFast EvaGreen Supermix较低的火箭(BioRad)和0.25μl 20 x的DNA结合染料总量的5μl加载到96.96动态数组的每个样品进口芯片(Fluidigm公司)。到每个分析进口5μl从分析混合包含2.5μl 2 x加载试验试剂,2.25μl 1 x DNA暂停缓冲和100μM正向和反向引物被加载。96.96芯片放在NanoFlexTM 4-IFC加载和混合控制器。加载后芯片放在BioMarkTM实时PCR系统使用循环程序95°C的10分钟,其次是40 95°C的周期15秒,60°C 30 s, 72gydF4y2BaogydF4y2Bac 30年代。原始Cq值进行了分析,并获得使用BioMark基因表达数据分析软件。样品与Cq值6 - 22被用于进一步分析。四个参考基因用于纠正输入RNA的差异:gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba,gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba,gydF4y2BahRLP22gydF4y2Ba,gydF4y2BahHBMSgydF4y2Ba。据Cq值,gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba和gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba高度表达,而gydF4y2BahHRLP22gydF4y2Ba和gydF4y2BahHBMSgydF4y2Ba是低表达。规范化的高表达基因(Cq值≤13)的几何平均数gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba和gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba,而基因低表达(Cq值≥14)规范化的几何平均数gydF4y2BahHRLP22gydF4y2Ba和gydF4y2BahHBMSgydF4y2Ba。96.96阵列芯片满足42个样品在两个不同的稀释和42个基因复制(重复的值是平均)。列出使用的引物序列gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
使用GraphPad棱镜8.1.1进行了统计分析。Fluidigm分析两个条件控制和D-CAA比较。然后为每个条件随时间的变化进行评估。比较我们使用多个t事后测试(Bonferroni)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
代的两个小说D-CAA iPSC线gydF4y2Ba
皮肤活检得到来自两个D-CAA E693Q突变患者。解剖后,成纤维细胞培养,重组在低段如前所述数量(gydF4y2BaDaoutsali et al ., 2019gydF4y2Ba)。两行hiPSC名为D-CAA 1和D-CAA 2 (gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。D-CAA 1和D-CAA 2则显示典型的细胞形态学与小和紧密,高核胞浆比例和定义良好的核仁(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。D-CAA iPSC OCT3/4线表示多能性标记,Nanog和SSEA-4 immunofluorescent分析(gydF4y2Ba补充图1 bgydF4y2Ba)。有一个调节多能性基因的表达gydF4y2BaOCT4gydF4y2Ba,gydF4y2BaNANOGgydF4y2Ba,gydF4y2BaSOX2通过gydF4y2BaqPCR相比,成纤维细胞(gydF4y2Ba补充图1 cgydF4y2Ba)。检查拷贝数变异(CNV)或等位基因的变化,比较成纤维细胞的身份和派生hiPSCs全球常规筛选数组(GSA)执行,解决~ 50 kb没有观察到染色体畸变(gydF4y2Ba补充图1 dgydF4y2Ba)。荷兰突变被Sanger测序证实两种细胞系(gydF4y2Ba补充图1 egydF4y2Ba)。最后,两个细胞系显示自发分化成三个胚芽层内胚层、中胚层和外胚层通过与SOX17 immunofluorescent染色,分别SMA和PAX6抗体(gydF4y2Ba补充图1 fgydF4y2Ba)。hiPSC线在测试支原体阴性。gydF4y2Ba
代的一个同基因的D-CAA线gydF4y2Ba
使用CRISPR / Cas9技术控制细胞系(以下提到control-iso),我们生成一个同基因的D-CAA线(D-CAAiso;应用c。2077G > C, p.E693Q). The control line had already passed successfully all quality control tests; Oct3/4, Nanog and SSEA-4 immunofluorescent stainings,OCT4gydF4y2Ba,gydF4y2BaNANOGgydF4y2Ba,gydF4y2BaSOX2gydF4y2Ba基因表达存在,trilineage分化与GSA数组染色体畸变与作者(数据没有显示但可用)。的同基因的D-CAA行显示正常iPSC形态(gydF4y2Ba补充图2ΑgydF4y2Ba)和一个额外的GSA筛选表明,没有染色体易位。证实了G C颠换ddPCR以及Sanger测序(gydF4y2Ba补充图2ΒgydF4y2Ba)。此外,D-CAAiso hiPSC线成功分化的三个胚芽层(gydF4y2Ba补充图2 cgydF4y2Ba)。hiPSC质量控制结果表明,D-CAAiso细胞系类似于其同基因的控制。gydF4y2Ba
比较两个前脑瀑样协议gydF4y2Ba
为了最小化前脑瀑样的规模和形态的变化,我们比较两种不同的前脑瀑样文化协议。瀑样形态似乎是不同的在10天当脑瀑样通常表现出神经上皮的芽的形成;瀑样从加布里埃尔等人协议相比,缺少神经上皮的芽形成干细胞技术装备(SCT)瀑样(gydF4y2Ba补充图3gydF4y2Ba)。瀑样大小和形状整个文化时期表明瀑样生成与显示的协议从加布里埃尔等人更大尺寸的变化相比,瀑样用SCT工具包(gydF4y2Ba补充图3 bgydF4y2Ba)。Immunofluorescent与抗体染色PAX6 (NPC-specific基因参与的规范前脑神经元身份标记神经元前体细胞)和βTUBBIII(神经元)显示出类似的皮质板结构在两种方法在52天。在所有实验中我们使用了干细胞技术装备脑瀑样的文化。gydF4y2Ba
表征hiPSC-derived脑瀑样gydF4y2Ba
前脑瀑样代四个主要步骤:身体胚状体形成、诱导、扩张和成熟(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。Brightfield瀑样被在每一步的图像形态学观察和尺寸测量是使用ImageJ软件完成的。在瀑样没有区别之间的大小和形态D-CAA和控制整个文化时期(瀑样gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba,gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。为我们的下游分析我们使用2时间点;52天,110天。选择的时间点是基于先前的文学,它表明天52瀑样显示小胶质细胞和其他细胞类型的表达(gydF4y2BaOrmel et al ., 2018gydF4y2Ba)和Aβ积累被发现在文化(90和110天之后gydF4y2Ba拉贾et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba冈萨雷斯et al ., 2018gydF4y2Ba)。接下来,我们评估了52天瀑样与immunofluorescent分析。我们进行前脑标记FOXG1染色(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)显示典型的脑皮质的形态。大脑的皮质板瀑样展出紧密连接结构,类似于一个心室,顶端的本地化特征标记ZO-1 (gydF4y2Ba图1 egydF4y2Ba)。先前的研究的一代脑瀑样已经显示出适当的质量检查皮质板的特征(gydF4y2BaKadoshima et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba兰开斯特et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaKrefft et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba亚库2019gydF4y2Ba)。我们相应的分析这些大脑皮层区域的组织染色标记的放射状胶质细胞(该公司)使用PAX6抗体,深层神经元CTIP2抗体(gydF4y2Ba兰开斯特et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaBallout et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaRosebrock et al ., 2022gydF4y2Ba)和神经元βTUBBIII抗体。有一个不同的表达模式的神经祖细胞(NPC)标记PAX6内层,中间的深皮质层标记CTIP2和神经元标记βTUBBIII外层皮质板(gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba)。尽管皮质区域的标记出现在所有瀑样,我们注意到控制瀑样并不总是显示不同的皮质板形成52天(gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba)。这种差异可以解释变异的皮质板定位在瀑样;自从瀑样部分,很有可能,有瀑样地区皮质板不存在。第110天D-CAA和控制瀑样也评估上述标记。即使有PAX6积极信号,CTIP2βTUBBIII,所有行失去了典型的皮质板组织,是常见的老年瀑样(gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba)。同基因的控制和D-CAA脑瀑样天52和110的检测径向神经胶质和星形标记GFAP的表达。两行展出GFAP表达在两个时间点。52天GFAP +细胞出现在补丁在瀑样类似径向神经胶质,而110 GFAP +细胞主要出现在天瀑样的外缘(gydF4y2Ba图1 ggydF4y2Ba)。除了neuroectodermal谱系标记,我们染色控制和D-CAA瀑样小胶质细胞使用IBA1天52和110天。尽管兰开斯特和他的同事们发表在他们的出版协议,更多的移行细胞类型分散的瀑样人工基底膜嵌入后,gydF4y2BaQuadrato et al。(2017)gydF4y2Ba表明小胶质细胞在脑瀑样可以开发。此外gydF4y2BaOrmel et al。(2018)gydF4y2Ba显示的协议由兰开斯特和他的同事,还有一个修改版,小胶质细胞天生发达的大脑瀑样。在我们的研究中,小胶质细胞,在所有的细胞系检查,大约一半的部分(gydF4y2Ba图1 hgydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图5gydF4y2Ba)。总的来说,控制和D-CAA瀑样显示典型的皮质区域特点和表达人大,深层神经元和成熟的特异性神经元标记(gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba。人类大脑瀑样的形态特征。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba脑的示意图表示瀑样协议(创建gydF4y2BaBioRender.comgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaBrightfield D-CAA和控制线路的图像。图像描述的四个重要步骤脑瀑样协议;(继续)图1(继续)EB(第五天),形成EB感应(7天)、神经元玫瑰扩张(第十天),和大脑瀑样成熟(20天)。gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba大小量化控制,D-CAA瀑样前110天的文化。对于每一个时间点2 - 6图片每瀑样。gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba代表共焦图像immunofluorescent染色的抗体FOXG1显示前脑神经元52天瀑样的控制。gydF4y2Ba(E)gydF4y2Ba代表共焦图像immunofluorescent染色的紧密连接抗体ZO-1(绿色)52天控制瀑样。核与DAPI标记(蓝色)。gydF4y2Ba(F)gydF4y2Ba代表共焦图像显示皮质层形成使用抗体PAX6神经元前体细胞,CTIP2 V层神经元和βTUBIII新生神经元在110年52和天瀑样的控制。gydF4y2Ba(G)gydF4y2Ba代表的形象GFAP-positive星形胶质细胞在110年52,每天控制脑瀑样。图像是用幻灯片扫描仪Axio Scan.Z1。gydF4y2Ba(H)gydF4y2Ba代表共焦图像IBA1积极的小胶质细胞在D52控制脑瀑样。gydF4y2Ba
有针对性的特异性基因的基因表达分析gydF4y2Ba
进一步检查特定的细胞类型更敏感和定量的方式,特定细胞类型的基因的表达在整个D-CAA和控制脑瀑样从52天,一天110年调查。我们评估使用Fluidigm神经元和神经胶质的基因的表达中存在基因表达分析平台。gydF4y2Ba
探讨神经脑瀑样的身份,我们看着NPC-specific基因,基因和前脑神经元特异性神经元基因(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。gydF4y2BaSOX1gydF4y2Ba作为最早的标志神经干细胞命运决定,也表达了在成人npcgydF4y2BaSOX2gydF4y2Ba表示在干细胞和成人nsc subventricular区(SVZ)和nsc增殖和分化的关键(gydF4y2Ba谢长廷,2012gydF4y2Ba)。gydF4y2BaBCL11BgydF4y2Ba(也称为CTIP2)是一个转录因子控制sub-cerebral预测从第五层神经元(gydF4y2Bacanova et al ., 2015gydF4y2Ba)。表达水平的gydF4y2BaSOX1gydF4y2Ba,gydF4y2BaSOX2gydF4y2Ba,gydF4y2BaBCL11BgydF4y2Ba在天显著高于52 D-CAA瀑样控制相比,而在一天110这种差异已经不再重要。此外,gydF4y2BaSOX1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSOX2gydF4y2Ba水平D-CAA线路大大减少从52天到110天。类似的gydF4y2BaPAX6gydF4y2Ba表达显著升高D-CAA脑瀑样相比,控制在52天。这不再是重要的在110天将减少gydF4y2BaPAX6gydF4y2BaD-CAA线条的表达水平。符合更高的表达gydF4y2BaPAX6gydF4y2Ba在D-CAA瀑样,前脑特异性神经元基因gydF4y2BaBF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaFOXG1gydF4y2Ba也显示出显著增加D-CAA脑瀑样两天52和110。gydF4y2Ba巢蛋白gydF4y2Ba是一个人大标志,但也是一个标记的神经干细胞(NSC)生存和自我更新。gydF4y2Ba巢蛋白gydF4y2BaD-CAA之间显示出类似的表达水平和控制瀑样在两个时间点。gydF4y2BaβTUBBIIIgydF4y2Ba是一种微管蛋白特别是参与分化的npc,因此被认为是神经标记。gydF4y2BaβTUBBIIIgydF4y2Ba显示高表达D-CAA线在两个时间点,但只达到意义110天。以类似的方式dendrite-specific基因gydF4y2BaMAP2gydF4y2Ba显示显著高表达D-CAA瀑样,在两个时间点,表明增加神经元的数量。在目前的研究中我们没有执行任何电生理学实验来评估神经功能,然而我们看基因表达水平的基因被认为是成熟的标记神经元。我们测试的瀑样水泡谷氨酸转运蛋白的表达gydF4y2BavGLUT1gydF4y2Ba和gydF4y2BavGLUT2gydF4y2Ba,以及水泡gaba ergic运输车gydF4y2BavGATgydF4y2Ba。gydF4y2BavGLUT1gydF4y2Ba和gydF4y2BavGLUT2gydF4y2Ba都集中在突触囊泡;gydF4y2BavGLUT1gydF4y2Ba标识在大脑和小脑皮质和海马而gydF4y2BavGLUT2gydF4y2Ba主要是在中脑和后脑神经元(gydF4y2Ba亚库和Sadek, 2018gydF4y2Ba)。只有gydF4y2BavGLUT1gydF4y2Ba表达显著增加D-CAA瀑样相比,控制在52到110天,而另一个成熟标记之间的相似组(gydF4y2Ba补充图6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba。有针对性的特异性基因的基因表达分析。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba增强神经元分化和成熟D-CAA脑瀑样。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba小胶质细胞和评估gydF4y2Ba(C)gydF4y2Baastrocyte-specific基因。对于每一个基因4控制和4 D-CAA线路测试。同基因的控制gydF4y2BaDgydF4y2Bacaa线条描绘与开放的圆圈和三角形,分别。三瀑样/细胞系为每个基因技术测试和重复测量(±标准差(SD);*gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.05,* * * *gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.0001,双向方差分析与Bonferroni多个对比测试)。彩色符号代表个人细胞系的复制。gydF4y2Ba
接下来,我们评估神经胶质细胞基因表达(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图6gydF4y2Ba)。星形胶质细胞相关基因的表达水平gydF4y2BaGFAPgydF4y2Ba显示显著增加110天D-CAA瀑样相比,控制以及随着时间的推移。除了gydF4y2BaGFAPgydF4y2Ba我们检查了就是另一个星形胶质细胞相关基因的表达gydF4y2BaS100βgydF4y2Ba。在研究中通过gydF4y2BaRaponi et al。(2007)gydF4y2Ba,这是显示gydF4y2BaS100βgydF4y2Ba表情特征的关键时期gydF4y2BaGFAPgydF4y2Ba表达细胞得到一个更加成熟的发展阶段和失去神经干细胞的潜力。gydF4y2BaS100βgydF4y2Ba表现出显著减少D52 D-CAA瀑样,恢复到类似的水平控制在110天瀑样。gydF4y2BaS100βgydF4y2Ba也被认为是是一个受伤的星形标记(gydF4y2BaRaponi et al ., 2007gydF4y2Ba)。这表明在D-CAA瀑样星形胶质细胞成熟晚于控制瀑样。gydF4y2BaOLIG2gydF4y2Ba是一个oligodendrocyte-specific基因控制和显示无显著差异D-CAA瀑样(gydF4y2Ba补充图6gydF4y2Ba)。研究几种小胶质基因表达水平的变化我们的表达分析gydF4y2BabrachyurygydF4y2Ba,gydF4y2BaAIF1 (IBA1)gydF4y2Ba,gydF4y2BaP2RY12gydF4y2Ba和gydF4y2BaTMEM119gydF4y2Ba。gydF4y2BaAIF1gydF4y2Ba有显著提高表达水平在一天52 D-CAA瀑样相比,控制不再是重要的110天。gydF4y2BaBrachyurygydF4y2Ba,gydF4y2BaP2RY12gydF4y2Ba,gydF4y2BaTMEM119gydF4y2Ba显示出类似的表达水平之间的两个条件和时间点(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
除了比较控制和D-CAA脑瀑样在一个时间点,我们也看着条件在时间内的变化。总体我们的目标基因表达结果显示增加神经元分化和成熟的潜力,增强前脑神经元发展,以及基因表达增加病患和小胶质D-CAA瀑样相比,控制。gydF4y2Ba
有针对性的基因表达分析D-CAA瀑样反映管制D-CAA脑组织中发现的基因gydF4y2Ba
接下来,我们研究基因表达变化与D-CAA有关。具体地说,先前的研究在人类D-CAA事后我们组脑组织透露TGFβ通路的upregulation D-CAA以及upregulation几个热休克蛋白(热休克;gydF4y2Ba大Moursel et al ., 2018 agydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba)。转化生长因子1 (TGFβ1)在血管纤维化中发挥着关键作用诱导细胞外基质(ECM)的蛋白质。几个gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究表明,TGFβ1推广应用和Aβ表达式在星形胶质细胞(gydF4y2BaAmara et al ., 1999gydF4y2Ba;gydF4y2Ba伯顿et al ., 2002gydF4y2Ba)。的SMAD-dependent TGFβ通路被激活在绑定TGFB1或TGFB2 TGFB受体2 (TGFBR2),其次是磷酸化SMAD2和3 TGFB受体1 (TGFBR1)。在事后D-CAA患者的脑组织,TGFB1 TGFBR2基因控制相比显著增加。规范SMAD通路的信号基因(SMAD2, SMAD3 SMAD4和SMAD7)也评估基因表达变化但没有发现显著差异(gydF4y2Ba大Moursel et al ., 2018 agydF4y2Ba)。的基因表达水平在D-CAA瀑样TGFβ1,TGFβ2和TGFBR2控制相比,没有任何明显的差异而TGFBR1显示显著增加110年52和天D-CAA瀑样(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba。针对D-CAA相关基因的基因表达分析。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaTGFB通路和基因分析gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba热休克蛋白和水通道蛋白4的表达分析。对于每一个基因4控制和4 D-CAA线路测试。控制和同基因的D-CAA线条描绘与开放的圆圈和三角形,分别。三瀑样/细胞系为每个基因技术测试和重复测量(±标准差;* p≤0.05, * * * * p≤0.0001,双向方差分析与Bonferroni多个对比测试)。彩色符号代表个人细胞系的复制。gydF4y2Ba
我们之前大脑的转录组研究脑组织D-CAA事后还显示在其他途径,upregulation几种热休克蛋白家族基因。热休克处理和分解的分子伴侣’重要错误折叠的蛋白质。我们评估的表达水平gydF4y2BaHSPA1AgydF4y2Ba,gydF4y2BaHSPA6gydF4y2Ba和gydF4y2BaDNAJB1gydF4y2Ba在脑瀑样(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。gydF4y2BaHSPA1AgydF4y2Ba表达水平明显增加了52天D-CAA瀑样,但这种差异不再是重要的110天。gydF4y2BaHSPA6gydF4y2Ba和gydF4y2BaDNAJB1gydF4y2Ba表达水平两者之间的相似条件和时间点。接下来,我们检查了水通道蛋白4 (gydF4y2BaAQP4gydF4y2Ba),哺乳动物大脑的主要一起在星形胶质细胞表达。最近在人类大脑sCAA事后免疫细胞化学研究表明,AQP4在中度显著增加创新艺人经纪公司相比,非痴呆老年人口显著下降严重的创新艺人经纪公司(gydF4y2BaOwasil et al ., 2020gydF4y2Ba)。在D-CAA瀑样,显著增加gydF4y2BaAQP4gydF4y2Ba表达水平在110天(注意到gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。gydF4y2BaAQP4gydF4y2Ba随着时间增加是增加类似于前面提到的GFAP的表达水平。我们的发现从目标基因表达分析证实,即使大脑瀑样更好地反映胚胎的大脑,基因表达变化相关的疾病病理发现在人类死后的脑组织。gydF4y2Ba
D-CAA脑瀑样展示Aβ积累gydF4y2Ba
总共有188前脑D-CAA(107节)和控制(81节)从天瀑样部分52和110年immunofluorescently沾抗体Aβ八国集团(4)和完整应用程序(Y188)。D-CAA细胞系,Aβ积累每瀑样通常出现在多个部分(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图7gydF4y2Ba)。量化的4 g8-specific Aβ积累所有D-CAA和控制线路显示Aβ积累的数量明显高于D-CAA瀑样相比,控制在两个时间点(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。确认这些积累确实Aβ我们使用第二个Aβ-specific抗体(6 e10)承认同一Aβ积累(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)。评估是否有邻近的神经元的形态学变化Aβ积累,在D-CAAiso瀑样的52天,一天110人沾anti-Aβ抗体4八国集团和神经元抗体MAP2。我们发现没有证据表明神经形态学的变化在近距离Aβ积累相比,神经元的积累(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。接下来,我们评估了小胶质细胞和星形胶质细胞在靠近Aβ积累D-CAAiso线。我们没有找到任何IBA1阳性细胞在靠近Aβ积累。然而,GFAP阳性细胞出现在每个Aβ积累,两天52和110 (gydF4y2Ba补充图8gydF4y2Ba)。在两个时间点,GFAP阳性细胞形态学的变化过程,在某些情况下,扩展到Αβ积累(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图9gydF4y2Ba)。在控制D52和D110瀑样,以及在D-CAA D52和D110瀑样但远离Aβ积累,GFAP阳性细胞显示mono和双相形态(gydF4y2Ba补充图9gydF4y2Ba)。Αβ聚合已经证明在脑瀑样携带突变早衰素上/或应用基因或overexpressing应用。而由于这些模型研究AD-related突变,还有τ病理学(gydF4y2Ba村上et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2Ba拉贾et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaPapaspyropoulos et al ., 2020gydF4y2Ba)。最后,我们还研究了在D-CAAiso p-Tau表达式和控制瀑样部分。我们没有发现显著差异在p-Tau之间的免疫反应性控制和D-CAA瀑样,结果也符合D-CAA人类脑组织没有τ病理学(gydF4y2Ba图4 fgydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图8 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba。Aβ病理学在D-CAA脑瀑样。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba代表immunofluorescent的图像同基因的控制和D-CAA脑瀑样线使用4天52和110显示Aβ积累g8抗体Aβ(红色)和Y188抗体全身应用(绿色)。白色的箭头指向Aβ积累放大共焦图像向右显示Aβ积累放大更高。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba量化Aβ积累。对于每个细胞株3瀑样(生物一式三份)和4节/瀑样检查了淀粉积累的存在。gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba验证4八国集团积极Aβ积累与第二个anti-Aβ抗体,6 e10(红色)。gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba一天共焦图像52和110天D-CAA脑瀑样部分显示一个Aβ积累(4 g8-red)和MAP2阳性神经元(绿色)。gydF4y2Ba(E)gydF4y2Ba共焦图像一天52和110天D-CAA脑瀑样部分显示Aβ积累(4 g8-red)和GFAP阳性星形胶质细胞(绿色),显示星形胶质细胞形态学改变是改变110年天瀑样(白色箭头)。gydF4y2Ba(F)gydF4y2Ba110年共焦图像的控制和D-CAA同基因的一对脑瀑样显示4 g8 Aβ阳性细胞(绿色)和磷酸化τ阳性细胞(AT8-red)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在本研究中我们提出一个gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba脑瀑样模型,成功地概括D-CAA病理学的神经发育方面。D-CAA脑瀑样展出Aβ积累,显示增强的神经元和星形基因表达,以及TGFβR1 upregulation目标基因表达的分析,而控制。gydF4y2Ba
脑瀑样从四个控制和生成四D-CAA hiPSC线都是定性和定量评估特异性标记物的表达。hiPSC行集,一个同基因的D-CAA线生成与CRISPR / Cas9使用模板控制线是包括在内。创建一个iPSC同基因的一对使评估结果的分子和细胞表型研究从荷兰突变,没有任何两个细胞系的遗传背景差异。在定性研究Aβ病理学D-CAA等基因系是类似于其他D-CAA线和不同的控制。在定量研究中,情况并不总是如此。的D-CAA等基因系显示之间的变异生物一式三份,然而相同的其他瀑样细胞系。这种差异可以归因于organoid-to-organoid可变性和显示这些实验所需更多的同基因的线。gydF4y2Ba
有一些注意事项需要考虑当使用脑瀑样gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba细胞模型,如良好的再现性的脑瀑样协议和低organoid-to-organoid可变性。到目前为止,许多研究表明成功的一代脑瀑样表达多种细胞类型;然而瀑样之间的变化,关于大小或形态不常显示(gydF4y2Ba兰开斯特et al ., 2013gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2017年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba钱et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba加布里埃尔和Gopalakrishnan) 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaQuadrato et al ., 2017gydF4y2Ba)。最近的一项研究self-patterned和dorsally-patterned脑瀑样协议相比,使用不同的细胞系和独立批次。他们表明,self-patterned瀑样高度变量在外形和外部形态相比,背图案瀑样。当比较单细胞RNA序列9 dorsally-patterned瀑样从两个细胞系与以前公布的数据集self-patterned脑瀑样和人类胎儿大脑皮层,他们表明,转录组签名从瀑样协议与人类细胞高度相关,然而self-patterned脑瀑样显示更多organoid-to-organoid可变性(gydF4y2BaVelasco et al ., 2019gydF4y2Ba)。在我们的研究中我们比较两个不同self-patterned脑瀑样协议,以确定哪些协议最低变化有关的大小和形态。选择协议,八细胞株用于生成脑瀑样。我们表明,所有的细胞系显示相同的形态的最重要阶段脑瀑样协议和整个文化时保持类似的大小。此外,immunofluorescent具有特异性标记的分析表明,这些标记表达类似的染色模式在所有的细胞系。目标基因表达分析,我们进行细胞类型特定的标记也证实,不同的控制和D-CAA线条表现出类似的基因表达水平在每个测试条件。神经元基因表达透露,尽管控制和D-CAA脑瀑样也有类似的神经干细胞的潜力和增殖,后者有高分化的特性,导致更多的前脑神经元。在天52 D-CAA瀑样,神经前体基因gydF4y2BaSOX1gydF4y2Ba,gydF4y2BaSOX2gydF4y2Ba和gydF4y2BaPAX6gydF4y2Ba相比,在D-CAA显著增加控制。符合神经元前体细胞,前脑神经元基因gydF4y2BaFOXG1gydF4y2Ba和gydF4y2BaBF1gydF4y2Ba,以及gydF4y2BaMAP2gydF4y2Ba和成熟的神经元标记gydF4y2BaVGLUT1gydF4y2Ba也显著增加。这些结果表明,在早期大脑发育可能有变化,即使疾病发生在中年。这些结果补充的差异被immunofluorescent分析皮质板标记表达式在控制瀑样少组织皮质板可视化在52天相比D-CAA瀑样。这种早期的变化也提出了其他成人发病神经退行性疾病,如亨廷顿病(HD),它是显示有早期神经发育缺陷导致过早神经元分化(gydF4y2BaZhang et al ., 2018gydF4y2Ba)。关于D-CAA,应用程序本身可以影响增强神经元分化和成熟,因为它已被多项研究显示神经发生有影响,神经细胞增殖和分裂,因为它是高表达在大脑发育(gydF4y2BaLoffler胡贝尔,1992gydF4y2Ba;gydF4y2BaHayashi et al ., 1994gydF4y2Ba;gydF4y2Ba沢et al ., 1999gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2014gydF4y2Ba)。研究hiPSC神经元和大脑瀑样带瑞典突变(导致家族性广告)显示增强神经元成熟和异常电活动相比,同基因的控制(gydF4y2BaGhatak et al ., 2019gydF4y2Ba)。另一个D-CAA签名揭示了RT-qPCR D-CAA的定量研究和控制事后脑组织的upregulation TGFβ信号通路,随后也证实了一个RNA-sequencing调节通路的研究(gydF4y2Ba大Moursel et al ., 2018 agydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba)。转录组研究还显示上调的基因从热休克蛋白(HSP)家族(gydF4y2Ba大Moursel et al ., 2018 bgydF4y2Ba)。我们只看到upregulationgydF4y2BaTGFBR1gydF4y2Ba而其余的TGFβ通路基因保持不变。人类胎儿大脑的基因表达分析表明,gydF4y2BaTGB1gydF4y2Ba,gydF4y2BaTGFBR1gydF4y2Ba,gydF4y2BaTGFBR2gydF4y2Ba早期表达,post-conception星期4,相似的表达模式gydF4y2BaPAX6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba巢蛋白gydF4y2Ba随着时间的推移,减少(gydF4y2BaIzsak et al ., 2020gydF4y2Ba)。人类iPSC-NSC文化研究表明,TGFβ基因表达及其配体在这些细胞群,TGFβ1充当一个积极的监管机构,促进神经元分化NSC的文化,以及促进未成熟的外观GFAP +细胞在早期NSC文化。使用3 d文化他们注意到TGFβ1治疗导致神经元数量的增加有增加,但不是重要功能的倾向。他们得出的结论是,TGFβ1不是唯一的信号提示(gydF4y2BaIzsak et al ., 2020gydF4y2Ba)。在目前的研究中,gydF4y2BaTGFBR1gydF4y2Ba增加表达D-CAA瀑样之前,增加全国人大标记的表达模式gydF4y2BaSOX1、SOX2 PAX6gydF4y2Ba。此外,gydF4y2BaTGFBR1gydF4y2Ba已经发现大量表达在老鼠大脑皮层的神经细胞(gydF4y2Ba但在et al ., 1996gydF4y2Ba;gydF4y2Ba朋友et al ., 2014gydF4y2Ba),而且也适用于D-CAA脑瀑样,展览同时增加皮质神经元基因的表达gydF4y2BaFOXG1gydF4y2Ba和gydF4y2BaBF1gydF4y2Ba。D-CAA病理学观察到的差异之间的事后脑组织和脑瀑样可以归因于这样一个事实:脑瀑样代表产前大脑和考虑upregulation作为早期疾病事件。此外,在52天HSPA1A表达显著增加表明D-CAA瀑样可以应对Aβ积累肽。gydF4y2Ba
荷兰突变研究广泛的聚合属性,在那里发现了E22氨基酸改变的时候确实创造了一个更容易形成聚合物的肽(gydF4y2BaMelchor et al ., 2000gydF4y2Ba;gydF4y2BaVan Nostrand et al ., 2001gydF4y2Ba;gydF4y2Ba村上et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2BaBaumketner et al ., 2008gydF4y2Ba)。主要病理发现D-CAA患者的大脑中积累主要是血管周围的Aβ40肽,但是这背后的机制血管周的聚合仍知之甚少。一起Aβ从大脑的低效率的间隙,有更高浓度的Aβ周围血管,有利于Aβ聚合。在这里,我们显示,脑瀑样Aβ积累内生APP / Aβ表达具有一致的Aβ积累显著增加瀑样D-CAA患者相比,控制在两天52和110天时间点。这可能是由于紧密的瀑样细胞扩散的蛋白质和肽降低,导致局部浓度更高,有利于聚合。gydF4y2Ba
D-CAA患者没有τ病理学,这是符合我们的发现在D-CAA脑瀑样。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba广告研究表明,存在形态差异在不同的细胞类型Aβ斑块等周围神经损失Aβ聚集和激活星形胶质细胞和小胶质细胞(gydF4y2BaGonzalez-Reyes et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba纳瓦罗et al ., 2018gydF4y2Ba)。在D-CAA瀑样,没有形态变化在神经元和胶质细胞接近Aβ积累而远离的积累,这表明这些Aβ积累代表一个非常早期的和不成熟的疾病特征。然而我们注意到90%的Aβ积累星形胶质细胞包围了积累和显示长扩展突出Aβ积累。病患参与D-CAA也明显的靶向基因表达分析显示显著增加星形标记在110天D-CAA瀑样相比,控制和跨时间大幅增加。除了gydF4y2BaGFAPgydF4y2Ba,gydF4y2BaAQP4gydF4y2Ba星形胶质细胞表达的主要一起和CAA病理学的一个标志是显著增加,确认一个星形病理学D-CAA瀑样。额外的星形标记,gydF4y2BaS100βgydF4y2Ba出现在各种各样的研究,表明其在脑瀑样的表情也是评估(gydF4y2Ba亚库2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba洛根et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2Ba好几个et al ., 2020gydF4y2Ba)和显示下降趋势的一天52 D-CAA瀑样。小鼠研究显示,S100B表达在后期发展阶段之后,GFAP-expressing细胞失去NSC潜力和获得一个星形表型。(gydF4y2BaRaponi et al ., 2007gydF4y2Ba)。根据这些证据我们因此假设星形胶质细胞在脑瀑样D-CAA成熟晚于控制,因此可以归因于Aβ病理学在这些瀑样。缺乏血管脑瀑样和低吞吐量一般限制大脑瀑样这D-CAA瀑样模型。最近一个研究小组已经成功创建了生物工程血管研究进展和分子机制,导致脑血管淀粉样血管病后添加β淀粉样蛋白纤维血管(gydF4y2BaShin et al ., 2019gydF4y2Ba)。一个gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaBBB模型也由广告iPSC-derived血管细胞(gydF4y2Ba布兰查德et al ., 2020gydF4y2Ba)。然而,这些模型缺乏大脑神经的一部分。更复杂的模型,包括所有不同的大脑细胞实体需要达到更高的与人类大脑的兼容性。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba
在这项研究中,增强神经元分化,Aβ积累和TGFβ途径放松管制是瀑样D-CAA病人中发现的。脑瀑样蕴含着巨大的潜力gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba疾病建模和彻底的描述他们将能够作为平台适合解开各种疾病的分子机制以及治疗测试,如反义寡核苷酸(AON)疗法。治疗脑瀑样D-CAA怡安将下一步发现如果这些化合物能够逆转病理发现在当前D-CAA瀑样模型。尽管当前D-CAA瀑样模型受限于缺乏脉管系统和大脑发育的早期阶段显示了更多的相似之处,我们的结果表明这一点gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba模型提供了一个有前途的工具,可以帮助治疗发展D-CAA和其他Aβ积累的障碍。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba,进一步的调查可以直接到相应的作者。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
ED研究构思,进行了实验,并分析,写了手稿。英国石油公司执行CRISPR / Cas9实验。学生进行实验的一部分。LG提供技术知识和支持。GT提供病人皮肤活检。DP和RB提供监督的方法。WR-M构思和监督。所有作者的文章和批准提交的版本。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
作者声明,这项研究获得资助Amylon疗法容积资助者没有参与研究设计、收集、分析、解释数据,本文的写作或决定提交出版。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者要感谢Nadine Pelzer从事METC协议和艾玛·科曼,帮助皮肤活检。我们也想感谢Amylon疗法资助这个项目。gydF4y2Ba
的利益冲突gydF4y2Ba
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnagi.2022.1048584/full补充材料gydF4y2Ba
补充图S1 |gydF4y2Ba质量控制D-CAA iPSC的线,gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaBrightfield D-CAA iPSC殖民地的形象揭示iPSC与紧密细胞形态,gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaD-CAA万能干细胞的多能性测试immunofluorescent使用SSEA-4抗体染色,Nanog Oct3/4,gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba多能性基因表达分析NANOG OCT4、SOX2基因,gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba全球筛选数组(GSA)显示,没有证据的拷贝数变异或等位基因的变化2 D-CAA线,gydF4y2Ba(E)gydF4y2Ba桑格测序确认荷兰突变(G > C),gydF4y2Ba(F)gydF4y2BaImmunofluorescent分析D-CAA iPSC自发分化与抗体所示的三个胚芽层SOX17(内胚层),SMA(中胚层)和PAX6(外胚层)。gydF4y2Ba
补充图S2 |gydF4y2Ba代的一个同基因的D-CAA符合CRISPR / Cas9技术(D-CAAiso)。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaBrightfield图片2 D-CAA iPSC殖民地揭示iPSC与紧密细胞形态,gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba桑格测序确认荷兰突变(G > C),gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaImmunofluorescent分析D-CAAiso自发分化与抗体所示的三个胚芽层SOX17(内胚层),SMA(中胚层)和PAX6(外胚层)。gydF4y2Ba
补充图S3 |gydF4y2Ba比较两个脑瀑样协议;脑瀑样分化干细胞的技术装备和协议由协议所描述的加布里埃尔et al . 2017 [30]。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaBrightfield图像控制1和D-CAA 3细胞系。脑的图像描述以下步骤瀑样协议;EB(第五天)形成,神经元玫瑰扩张(第十天),和大脑瀑样成熟(20天)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba大小量化控制1和D-CAA 3瀑样第一36天文化。对于每一个时间点2 - 6为每个瀑样图片,gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaImmunofluorescent D52分析和D110控制瀑样部分与抗体PAX6(绿色)和βTUBBIII(红色)。核与DAPI染色。gydF4y2Ba
补充图S4 |gydF4y2Ba皮质板形成D-CAA和控制瀑样。Immunofluorescent分析皮质板从D52 D110控制和D-CAA瀑样使用抗体PAX6(绿色),CTIP2(黄色)和βTUBBIII(红色)。核与DAPI染色。gydF4y2Ba
补充图S5 |gydF4y2Ba小胶质细胞是存在于所有控制和D-CAA瀑样。Immunofluorescent D52控制和分析D-CAA瀑样的抗体IBA1(红色)。核与DAPI染色。gydF4y2Ba
补充图S6 |gydF4y2Ba目标基因表达分析神经元、星形和microglia-specific基因。gydF4y2Ba
补充图S7 |gydF4y2BaAβ积累D52和D110控制和D-CAA脑瀑样。Immunofluorescent分析抗体Aβ(4 g8-red)和fl-APP (Y188-green)。白色箭头指示Aβ积累。gydF4y2Ba
补充图S8 |gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba星形胶质细胞是周围Aβ积累。Immunofluorescent分析D52和D110 D-CAA瀑样部分用一个反Aβ抗体(4 g8-red)和一个anti-GFAP抗体标记星形胶质细胞,gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba量化的pTau五控制和D-CAA节免疫反应性。pTau对MAP2免疫反应性是标准化或控制。gydF4y2Ba
补充图S9 |gydF4y2Ba星形胶质细胞形态学Aβ积累。Immunofluorescent D52 D110控制和分析D-CAA瀑样部分与抗体Aβ(4 g8-red)和GFAP(绿色)。核与DAPI染色。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaGFAP +星形胶质细胞控制D52和D110瀑样;白色圆圈显示选定的星形胶质细胞,显示单音或bi -极形态,gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaGFAP +星形胶质细胞或接近Aβ积累;白色圆圈显示选定瀑样,分别显示单极/双相或多个进程。gydF4y2Ba
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关键词:gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba疾病3 d建模、脑瀑样Dutch-type脑淀粉样血管病,Aβ积累,星形胶质细胞gydF4y2Ba
引用:gydF4y2BaDaoutsali E,佩珀BA, Stamatakis年代,范德格拉夫LM,吉塞拉通用,帕菲特哒,Buijsen RAM和van Roon-Mom WMC(2023)淀粉样β蛋白积累和增强神经元分化Dutch-type脑淀粉样血管病患者的脑瀑样。gydF4y2Ba前面。老化>gydF4y2Ba。14:1048584。doi: 10.3389 / fnagi.2022.1048584gydF4y2Ba
编辑:gydF4y2Ba
Jorge BuscigliogydF4y2Ba美国加州大学欧文分校gydF4y2Ba版权gydF4y2Ba©2023 Daoutsali,胡椒,Stamatakis范德格拉夫,吉塞拉,帕菲特,Buijsen和van Roon-Mom。这是一个开放分布式根据文章gydF4y2Ba知识共享归属许可(CC)gydF4y2Ba。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2BaWilleke m . c . van Roon-MomgydF4y2Ba
w.m.c.van_roon@lumc.nlgydF4y2Ba;Elena DaoutsaligydF4y2Bae.daoutsali@lumc.nlgydF4y2Ba