增强收缩张力和调节毒蕈碱的受体2/3 Colorectum 6-Hydroxydopamine-Induced帕金森病大鼠造成便秘
小李张
肖惠张1、2
Jin-Xia朱- 1生理和病理生理学,基本医疗科学学院,首都医科大学,北京,中国
- 2人工肝治疗中心、北京佑安医院,首都医科大学,北京,中国
经常便秘和defecatory功能障碍症状的帕金森病(PD)患者。路易小体的病理结肠和直肠表明胆碱能神经元胆碱能通路参与了PD的结肠直肠的蠕动障碍。然而,这种现象的潜在机制仍不清楚。本研究的目的是检查大鼠中枢多巴胺能神经支配的作用,为两国substania注射诱导6-hydroxydopamine黑质(6-OHDA老鼠),在结直肠收缩活动,乙酰胆碱的含量(ACh)——血管活性肠肽(VIP)和神经一氧化氮合酶的表达(nNOS)和毒蕈碱的受体(MR)。应变计力传感器结合电场刺激(EFS),肠道转运时间,免疫组织化学,ELISA、免疫印迹和ultraperformance液相色谱串联质谱法被用于这项研究。6-OHDA老鼠表现出出口梗阻便秘的特点是长时间的渡越时间,增强收缩张力和粪便colorectum保留。预处理和河豚毒素明显增加了大肠癌的能动性。EFS-induced胆碱能收缩在colorectum减弱。氯化氨甲酰甲胆碱促进结直肠运动性剂量依赖性的方式,和更强的反应性氯化氨甲酰甲胆碱在6-OHDA老鼠。nNOS的ACh、VIP和蛋白表达减少,但M2R和米3R在结直肠肌层明显调节外。此外,胆碱能神经元的数量减少骶副交感核(SPN) 6-OHDA老鼠。总之,中央黑多巴胺能神经支配与减少胆碱能神经元在SPN,减少,VIP内容,nNOS表达和调节2R和米3在colorectum R,导致结肠直肠的蠕动障碍,导致出口梗阻便秘。便秘的研究提供了新的见解机制和潜在的治疗靶点的PD患者的便秘。
介绍
胃肠(GI)症状,尤其是便秘和defecatory障碍,是非常普遍的在帕金森病(PD)的临床前阶段(克努森et al ., 2017;陈et al ., 2020)。临床诊断PD通常依赖于基本运动症状(Tolosa et al ., 2021),这发生在当多巴胺神经元的损失达到大约80%的纹状体和40 - 50%或更多的黑质(SN) (Fearnley和李,1991年;Johnson et al ., 2018)。越来越多的证据表明,PD开始在肠道,逆行错误折叠α-突触核蛋白的传播扩散与肠神经系统(ENS)更高的大脑中心沿迷走神经传入纤维(Braak et al ., 2003;Holmqvist et al ., 2014)。这些证据可能表明便秘ENS. PD源于功能障碍的另一方面,便秘与黑非常密切相关的多巴胺能神经支配在早期PD患者和相关SN神经元密度低的独立存在的路易小体(Petrovitch et al ., 2009;亨克尔et al ., 2018)。事实上,有直接的证据表明,nigral病理可能加重胃肠道功能障碍。我们有报道说,老鼠6-hydroxydopamine microinjected双边SN (6-OHDA老鼠)展览推迟胃排空(郑et al ., 2011,2014年)、十二指肠粘液分泌受损(燕et al ., 2021)和出口梗阻便秘(Zhang et al ., 2015)。此外,多巴胺能神经元的SN可以激活多巴胺D1在迷走神经背运动核受体(DMV)在大鼠神经元调节胃蠕动(Anselmi et al ., 2017)。然而,SN的多巴胺能神经元变性的发病机理导致便秘仍不清楚。
便秘可能发生由于长期结肠运输和/或肛门直肠的PD患者的功能障碍(Stocchi托提,2017)。降低胃肠道蠕动是由骶副交感核(SPN)和ENS.与便秘和defecatory相关的改变存在的障碍进行了调查和SPN的PD患者和PD动物模型。几项研究显示神经变性的存在与α-突触核蛋白沉积SPN和PD患者存在(布洛赫et al ., 2006;黄金et al ., 2013)。此外,成像研究显示减少的表达在早期PD患者肠道乙酰胆碱酯酶(Gjerloff et al ., 2015;Fedorova et al ., 2017)。但是,一些研究报道,胆碱乙酰转移酶(聊天)表达在老鼠的近端结肠黑去神经6-OHDA没有改变(科鲁奇et al ., 2012)。值得注意的是,路易小体的病理观察结肠和直肠的胆碱能神经元,这表明胆碱能通路参与了PD的结肠直肠的蠕动障碍(Sharrad et al ., 2013)。我们先前的研究已经表明,胆碱能神经元减少,降低了D1和增加维2在车管所受体表达,减少胃疼水平参与6-OHDA老鼠(胃排空延迟郑et al ., 2011,2014年;Cai et al ., 2013;王et al ., 2016)。然而,SN的影响破坏结直肠能动性和胆碱能神经元的SPN尚未确定。
本研究的目的是检查中枢多巴胺能神经支配的影响为两国SN 6-OHDA注射在大鼠结肠直肠胆碱能收缩活动。在活的有机体内整个胃肠道钡餐和结直肠交通进行评判,分析和珠驱逐测试。电场刺激(EFS)诱导和氯化氨甲酰甲胆碱诱导胆碱能收缩被记录了下来在体外结直肠纵肌的准备。ACh水平、聊天蛋白质的表达和毒蕈碱的受体(MR)的colorectum评估超-液相chromatography-tandem质谱(UPLC-MS / MS),分别免疫组织化学和免疫印迹。此外,——血管活性肠肽(VIP)的内容和表达神经一氧化氮合酶(nNOS) colorectum也检测到放射免疫检定法和免疫印迹,分别。本研究将揭示便秘的发病机制,并提供证据关于潜在的药物目标在PD便秘。
材料和方法
动物
男性Sprague-Dawley老鼠(200 - 230 g)购买实验动物服务中心的首都医科大学,北京,中国。所有的动物都被安置在12 h / 12 h光暗周期22±1°C,免费获取食物和水。所有实验都是依照规定执行由美国国立卫生研究院的建立和被批准的动物保健和使用委员会首都医科大学,北京,中国。
6-Hydroxydopamine老鼠
程序准备6-OHDA老鼠前面描述的(田et al ., 2008;郑et al ., 2014;Zhang et al ., 2015)。老鼠麻醉与甲苯噻嗪和氯胺酮的混合物(分别为13和87毫克/公斤体重;腹腔内),放在科夫立体定位工具。6-OHDA解决方案(4μg 2μL 0.9%盐水含有0.05%抗坏血酸)是双边注入SN在下列坐标(毫米):前后的,-5.6;中间外侧的,±2.0;背腹侧的,-7.5。控制老鼠接受虚假的立体定位手术和注射0.2%抗坏血酸/生理盐水。后续实验在6周后6-OHDA管理。
整个胃肠道转运时间和结直肠交通时间
钡餐(1.5毫升,硫酸钡)或酚红(1.5毫升,5% w / v悬浮在0.5%甲基纤维素)被施用于每一个大鼠体内后18-h快洗胃。whole-GI交通之间的间隔时间计算填喂法和时间的第一个纪念白色粪便(钡餐)或红色粪便(酚红)。
结直肠渡越时间测量使用珠驱逐测试根据我们之前的研究(刘et al ., 2018)。老鼠与异氟烷麻醉,然后6毫米玻璃珠是插入到colorectum (4 ?厘米近端肛门)使用塑料巴斯德吸管轻轻润滑润滑果冻。直到珠驱逐测量的时间。类似于老鼠的colorectum rectosigmoid在人类和位于远端结肠和直肠之间。colorectum(约1 - 2厘米长)邻近的淋巴结,从肛门(通常位于1 - 2厘米Zhang et al ., 2008,2010年)。
粪便含水量
我们之前描述的方法研究(Zhang et al ., 2015)。粪便含水量计算根据方程:粪便含水量= 100%×(湿重)干重/湿重。
运动性记录
在活的有机体内记录
在这项研究中使用的方法前面描述的(郑et al ., 2014;刘et al ., 2018)。老鼠麻醉与甲苯噻嗪和氯胺酮的混合物(分别为13和87毫克/公斤体重;腹腔内)。体温监测直肠探头和维持在37±1°C下用恒温的垫放置动物。中线切口是在皮肤和肌肉层的小腹暴露结肠。接下来,应变计传感器(WS100,鑫兴你们科技有限公司,北京,中国)植入在浆膜colorectum记录纵向和圆形肌肉收缩,分别。然后,前置放大器和实验室图软件(PowerLab ADInstruments,悉尼,澳大利亚)被用来记录结肠运动。曲线下的面积的8分钟被送往计算收缩的张力(毫克∗年代)。
在体外记录
根据我们之前的方法研究(Zhang et al ., 2012,2015年;刘et al ., 2018),从colorectum纵行肌条沉浸在一个器官浴Krebs-Henseleit 5毫升的解决方案(k - h),然后安装垂直下1 g的初张力。k - h(作文mM:氯化钠,117;氯化钾,4.7;NaHCO324.8;KH2阿宝41.2;MgCl2⋅6小时2啊,1.2;CaCl2⋅2 h2啊,2.5;和葡萄糖,11.1;pH值7.4)是维持在37°C O和含氧95%2和5%的公司2。他们将平衡至少1 h。收缩达到一个稳定水平和维护一个稳定的高原前30分钟的应用药物或EFS刺激。EFS(2毫秒,50 V, 5赫兹)应用的电刺激器(bl - 420 f,成都Techman软件有限公司,成都,中国)(刘et al ., 2018)。张力记录的等距测力传感器(MLT0201 / RAD、ADInstruments、西班牙)和数字化的桥放大器(ML228;ADInstruments,悉尼,澳大利亚)。曲线下的面积的8分钟被送往计算收缩的张力(毫克∗年代)。
组织准备
colorectum肠系膜边境开放和固定平SYLGARD-lined皮氏培养皿中冰冷的含氧k - h的解决方案。肌肉层的colorectum小心microdissected精细解剖显微镜下钳。组织在液氮立即snap-frozen蛋白质提取和量化。
乙酰胆碱和血管活性肠肽作用的测量
乙酰胆碱的方法部分描述了在我们先前的研究(郑et al ., 2014)。乙酰胆碱水平衡量超液相chromatography-tandem质谱(UPLC-MS / MS)。每个样本(30毫克)在300年被均质水甲酸μL 12%。1.5毫升的匀浆是超声分离调整溶剂(乙腈:甲醇:甲酸,750:250:2)2分钟和离心机在4°C 12000 rpm 15分钟。上层清液的蒸发干燥,与300μL调整溶剂重新溶解,在3000转离心5分钟在4°C。上层清液立即用于UPLC-MS / MS(放射性药物重点实验室,教育部,化学学院北京师范大学)。
VIP含量测定与商业等工具(KIPL 0300年,hy - 091;北京中英生物技术研究所、北京、中国)。
免疫印迹分析
冷冻肌肉组织或脊髓(L6-S1)组织在冰冷的均质裂解缓冲(Applygen技术有限公司、北京)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(瑞士罗氏公司)。等量(50μg)提取10% sds - page分离和转移到聚偏二氟乙烯膜(微孔、美国)在4°C。非特异性结合位点被封锁在TBS 10%脱脂牛奶(20毫米Tris-Cl, pH值7.5,包含2.7毫米0.15 M氯化钠和氯化钾)在室温下1 h。膜是孵化与主抗体中列出表1一夜之间在4°C。与TBST洗后,细胞膜是适当的二次抗体孵育山羊anti-rabbit免疫球蛋白(1:10,000,611-132-122,大美国)或羊anti-mouse免疫球蛋白(1:10,000,610-632-002,大美国)在室温下2小时。膜清洗在TBST和可视化奥德赛红外成像仪(LI-COR、NE、美国)。分析了乐队的整体强度与奥德赛软件(版本1.2)。
表1。主要抗体。
免疫组织化学
免疫组织化学,老鼠与10%水合氯醛麻醉(4毫升/公斤,腹腔内),并与200毫升生理盐水灌注通过左心室,然后用4%多聚甲醛溶液200毫升0.01磷酸盐(PBS;pH值7.4)。大脑和脊髓被立即删除,在4%的多聚甲醛浸泡24小时在4°C。与15 - 30%的蔗糖脱水后0.01 PBS,连续冠状冻SN和脊髓的部分在一个20μm厚度与低温恒温器切片机(瑞士徕卡CM1850,圣加伦)。在室温下一夜之间,组织部分被风干。如我们之前所述研究(郑et al ., 2011),大脑部分和脊髓部分沉浸在柠檬酸缓冲(0.01 M, pH值6.0)抗原检索,然后被处理3% H2O2一夜孵化后10分钟。在4°C主要抗体(表1),部分被孵化用鼠标生物素化的抗体IgG抗体或一只兔子生物素化的抗体IgG抗体(ZSGB-BIO,北京)10分钟。接下来,反应产品使用diaminobenzidine开发发色体(ZSGB-BIO,北京)。反应后,部分在酒精脱水,清除在二甲苯和盖玻片覆盖。
收集L6-S1脊髓段聊天SPN地区免疫组织化学(Vizzard et al ., 2000;借鉴et al ., 2016)。亮场immunolabeled细胞显微图像是由两个独立的调查人员手工计算。每3编码的部分之一是收集聊天免疫组织化学。细胞计数都是location-matched之间的控制和6-OHDA老鼠(每组5动物)。项ChAT-immunoreactive (IR)细胞表现为细胞的平均数量每节(均值±SEM)。
免疫荧光
免疫荧光染色,协议是相同的如前所述(Zhang et al ., 2015;刘et al ., 2018)。冒号清洗了PBS、冷冻和嵌入在最佳切削温度介质(麦考密克,圣路易斯,密苏里州)。组织部分在7μM在冰冷的丙酮固定15分钟。与PBS 3 * 5分钟,洗后的部分是孵化驴5%血清30分钟。然后,孵化了部分主要抗体(中列出表1在4°C)在一夜之间,其次是2 h的孵化二级抗体驴anti-mouse免疫球蛋白(1:1,000 A11055,英杰公司,美国)在室温下。消极的控制是由省略主要抗体。
统计分析
结果表示为±SEM手段,用“n”指的是组织收集的许多不同的动物。所有统计分析使用单向方差分析其次是Newman-Keuls测试学生的配对或未配对t6.0测试(GraphPad棱镜,圣地亚哥,美国)。P值小于0.05被认为是重要的。
结果
出口梗阻便秘6-Hydroxydopamine老鼠
类似于我们之前的研究中,SN和纹状体DA含量大大减少6-OHDA老鼠(补充图1 a - c)。没有显著差异在日常食物或水摄入量之间的两组(补充图1 d, E)。然而,减少日常粪粒消除和粪便含水量在6-OHDA观察大鼠(补充图1 f, G)。
整个胃肠道渡越时间的酚红和钡餐是增加了49.6%(422±24和282±20分钟,图1一个,n= 8,P< 0.01)和40.9%(403±28和286±26分钟,图1 b,n= 11,P< 0.001)相比,6-OHDA老鼠控制大鼠,分别。粪便滞留在观察结直肠6-OHDA老鼠(图1 c)。此外,结直肠过境时间显著延长6-OHDA老鼠(控制,352±29年代;6-OHDA 228±26年代,图1 d,n= 11,P< 0.01)。在活的有机体内运动性记录显示,两纵肌的收缩张力和圆形肌肉明显增强的colorectum 6-OHDA老鼠(图1 e, F,n= 8,P< 0.001)。这些结果表明,6-OHDA老鼠表现出出口梗阻便秘。
图1所示。出口梗阻便秘6-OHDA老鼠。(一)整个胃肠道酚红的渡越时间(n= 8)。(B)整个胃肠道钡餐的渡越时间(n= 11)。(C)粪便保留6-OHDA colorectum的老鼠。(D)结直肠渡越时间使用珠驱逐测试(n= 11)。(E)代表轮廓的结直肠自发收缩控制,6-OHDA老鼠。(F)条形图显示colorectum收缩张力(n= 8)。* *P< 0.01,* * *P< 0.001。
电场刺激对大肠癌的影响在6-Hydroxydopamine大鼠运动性
探索增强结肠直肠收缩的机制6-OHDA老鼠,纵行肌条被孤立记录自发收缩活动在体外。孤立的结直肠条轮廓显示显著增加的收缩6-OHDA老鼠(图2 a, B,n= 7,P< 0.01)。区分神经和肌肉机制,肌肉条使用河豚毒素(TTX;1μM),神经细胞钠离子通道阻滞剂,防止神经肌肉活动的监管。预处理和TTX显著增加了colorectum控制老鼠的收缩(40%,从188.5±16.24毫克∗年代264.4±5.87毫克∗年代,P< 0.05)。然而,TTX-induced收缩只增长了20% 6-OHDA老鼠(从306.1±16.2毫克∗年代365.7±30.29毫克∗年代,图2 a, B,n= 7)。这一结果表明,肠神经元参与6-OHDA大鼠的结肠直肠的蠕动障碍。EFS被用来进一步探索肠神经机制在6-OHDA大鼠结肠直肠的蠕动障碍。EFS induced-contraction colorectum是控制增加了59%(从181.8±15.23,289.3±16.87毫克∗年代,P< 0.005)和30% 6-OHDA老鼠(从255.2±11.57,332.2±16.26毫克∗年代,P< 0.005)(图2 c, D,n= 9)。EFS的含量增加,诱发收缩少6-OHDA老鼠比控制。,EFS被阿托品的作用,一个先生的对手(图2 d)。因此,胆碱能传播参与EFS-induced结直肠收缩,减少在6-OHDA老鼠。
图2。河豚毒素(TTX)的影响和电场刺激(EFS) colorectum的收缩。(一)代表的轮廓在体外结直肠收缩和TTX预处理时(1μM)。(B)条形图显示结肠直肠的收缩(n= 7)。(C)代表轮廓EFS-invoked结直肠收缩。(D)条形图显示的收缩colorectum回应EFS单独或结合毒蕈碱的受体拮抗剂阿托品(1μM) (n= 9)。*P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。
氯化氨甲酰甲胆碱对肠癌6-Hydroxydopamine老鼠的能动性
先生选择性氯化氨甲酰甲胆碱受体激动剂,剂量依赖性增加结直肠收缩(图3一)。预处理和TTX并不影响氯化氨甲酰甲胆碱的量效曲线,表明肠神经元兴奋效应(没有参与chloride-induced氨甲酰甲胆碱图3 b)。氯化氨甲酰甲胆碱的量效曲线在6-OHDA老鼠转向左。欧共体50是8.859×1076-OHDA老鼠相比2.379 mol / L×106在控制mol / L (图3 c,n= 6,P< 0.005)反射增强,反应性的colorectum 6-OHDA老鼠。氯化氨甲酰甲胆碱在野生型小鼠结肠直肠收缩增加最多140%的基线值浓度的方式,但未能在M增加结直肠收缩2R和米3R敲除小鼠(KO) (图3 d,n= 5,P< 0.005),表明M2R和米3R主要介导氯化氨甲酰甲胆碱的影响。
图3。氯化氨甲酰甲胆碱对结直肠收缩的影响。(一)代表录音表明氯化氨甲酰甲胆碱的影响从控制和结直肠肌条6-OHDA老鼠。(B)氯化氨甲酰甲胆碱的浓度响应曲线仅在存在TTX(1μM)控制大鼠(n= 6)。(C)氯化氨甲酰甲胆碱的剂量反应曲线控制和6-OHDA老鼠colorectum (n= 6)。(D)氯化氨甲酰甲胆碱的量效曲线M2R和米3R敲除小鼠(KO) (n= 5)。(罪犯)2条/老鼠。* * *P< 0.001。
乙酰胆碱和——血管活性肠肽含量、蛋白质的胆碱乙酰转移酶的表达,神经一氧化氮合酶,在Colorectum毒蕈碱的受体
米的分布1R,米2R,米3R colorectum的老鼠被免疫荧光测量。所示图4一,米2红外和M3红外肌层中大量表达,但M1红外光谱主要在肌间神经丛,而不是肌肉层。负控制没有免疫荧光检测。此外,一个明显的增加2R和米3R蛋白表达在结直肠肌层外发现6-OHDA老鼠,而M1R没有改变(图4 b, C,n= 7)。
图4。(一)M的分布1R,米2R,米3R的colorectum控制老鼠。箭头表示肌肉层;开放箭头表示肌间神经丛。负控制没有主要的抗体。(B, C)代表免疫印迹和条形图显示的水平1R,米2R,米3R,聊天colorectum蛋白质的控制(C)和6-OHDA老鼠(M) (n= 7)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为内部控制。(D)上述内容在结直肠肌层外(n= 7)。(E, F)免疫印迹和直方图显示的水平代表nNOS colorectum蛋白(n= 6)。(G)VIP含量远端结肠和结直肠肌层外(n= 7)。*P< 0.05,* *P< 0.01。
聊天的蛋白质水平(减少了32%,P< 0.01)和nNOS(减少了40%,P< 0.01)显著降低6-OHDA结直肠肌层外的大鼠(图4 b, C, E, F)。同样,ACh和VIP含量显著下降(图4 d、G,P< 0.01)。
骶副交感核胆碱乙酰转移酶的表达
所示图5、免疫印迹显示聊天L6-S1蛋白质水平脊髓段减少从0.95±0.04,0.70±0.06 6-OHDA老鼠(图5 a, B,n= 7,P< 0.05)。此外,ChAT-IR神经元被发现在SPN。ChAT-IR细胞的数量减少了大约18.5%的SPN地区6-OHDA老鼠相比,控制大鼠(图5 c, D,n= 5,P< 0.05)。
图5。胆碱乙酰转移酶的表达(聊天)骶副交感核(SPN)。(A, B)代表免疫印迹和条形图显示聊天的水平蛋白质L6-S1脊髓段组织(n= 7)。GAPDH是作为内部控制。(C)聊天的表达在SPN地区(黑框)。μm酒吧,规模500人。(D)ChAT-IR数量(SPN)地区n= 5)。* *P< 0.01。
讨论
PD患者表现出显著减缓交通rectosigmoid段和整个结肠,和肛门直肠功能障碍(神et al ., 2003;De Pablo-Fernandez et al ., 2019;谭et al ., 2021)。出口梗阻和慢传输型便秘,单独或组合,曾被观察到在PD患者(神et al ., 2003;Borghammer et al ., 2016)。然而,潜在的机制尚不清楚。我们的数据表明,6-OHDA老鼠表现出出口梗阻便秘的特点是增加了大肠癌渡越时间和增强结肠直肠收缩张力,这在一定程度上类似于临床研究的现象。目前的研究表明,中央黑多巴胺能神经支配(PD)的主要病理特征之一,与胆碱能神经元的减少SPN,减少,贵宾和nNOS,但调节M2R和米3R colorectum,导致结肠直肠的蠕动障碍,导致出口梗阻便秘(图6)。
图6。图解模型6-OHDA老鼠的便秘的发病机制。胆碱能神经元的数量和胆碱乙酰转移酶的表达(聊天)蛋白在骶副交感核(SPN)是减少与中央黑大鼠多巴胺能神经支配。减少表达nNOS和VIP colorectum可能主要负责结直肠收缩张力和增加出口梗阻便秘。同时,M2 / M3的胆碱能传输和upregulation受损也可能部分涉及结肠直肠的蠕动障碍。
球推进colorectum是神经肌肉协调过程中由神经递质在ENS.这过程包括口腔由兴奋性收缩发射器如空调采暖和P物质(SP)和近尾部放松由抑制性神经递质如——血管活性肠肽(VIP)、垂体腺苷酸cyclase-associated肽(PACAP)和一氧化氮(主梁et al ., 1998)。在目前的研究中,持续增强收缩的colorectum 6-OHDA老鼠可能导致粪便推进困难。阻止肠神经活动和TTX结直肠的蠕动增加,表明存在抑制作用的结直肠收缩发生在生理条件。类似的结果也被观察到猫肠,小鼠小肠和大鼠远端结肠(木头,1980;李et al ., 2006;Zhang et al ., 2012)。然而,存在的影响是减少6-OHDA colorectum的老鼠。来验证是否增强在活的有机体内结直肠收缩可能取决于潜在改变肠神经传递,我们集中在结直肠神经递质。我们的研究结果表明,EFS-induced胆碱能收缩减弱6-OHDA colorectum的老鼠。在可能的情况下改变肠道胆碱能通路被认为在PD,可用的证据不一致。系统性的多巴胺能神经元的选择性注射多巴胺能神经毒素MPTP药物诱发损失在SN和小鼠的结肠和非人类的灵长类动物(田et al ., 2008)。注射的MPTP药物动物没有胆碱能的差异或贵宾在实体(安德森et al ., 2007;Chaumette et al ., 2009)。功能,MPTP-treated老鼠显示瞬时增加结肠蠕动,但没有明显的变化在凳子上频率(安德森et al ., 2007)。另一个PD动物模型与6-OHDA-induced内侧前脑束(地铁消防队)病变可以表现出显著增加VIP和减少nNOS表达式没有改变表达式的回肠末端和近端结肠(聊天科鲁奇et al ., 2012),而EFS evoked-ACh释放显著降低在冒号(Fornai et al ., 2016)。值得注意的是,PD患者显示一个重大损失的乙酰胆碱酯酶信号在小肠(Gjerloff et al ., 2015;Fedorova et al ., 2017)和减少VIP-IR神经元在结肠粘膜下神经丛(实施电击et al ., 2017)。符合这些发现,我们先前的研究显示大幅减少聊天蛋白表达和乙酰胆碱含量的胃语料库和十二指肠粘膜6-OHDA老鼠(郑et al ., 2014;燕et al ., 2021)。我们假设,胆碱能神经传递的障碍可能会导致减少的作用EFS 6-OHDA colorectum的老鼠。此外,我们还发现,蛋白质的表达在colorectum nNOS和VIP含量减少。结合colorectum TTX-increased萎缩的削弱6-OHDA老鼠,这表明减少抑制(nNOS下降和VIP),可能主要负责结直肠收缩张力增加。
此外,我们还观察到一个增强的自发收缩张力和氨甲酰甲胆碱chloride-induced 6-OHDA colorectum的大鼠肌原性的反应。在目前的研究中,TTX并不影响氯化氨甲酰甲胆碱的剂量反应曲线,表明先生在肌层由氯化氨甲酰甲胆碱直接激活。三种亚型的分布在整个消化道先生(哈林顿et al ., 2010)。米2R和米3R是主要的亚型调节胆碱能收缩(Eglen 2001;近藤et al ., 2011)。同样,我们的结果表明,氯化氨甲酰甲胆碱无法促进结肠收缩的M2R和米3R KO小鼠。因此,我们研究了M的表达2R和米3R在结直肠肌层。两米2R和米3R的确是调节6-OHDA colorectum的老鼠,发生代偿反应受损的胆碱能神经传递,这可以部分参与结肠直肠的蠕动障碍。Fornai et al。(2016)报道了调节M2R和米3R单方面地铁消防队的结肠损伤模型。但是,他们没有调查自发性收缩。在目前的研究中,增强,而不是减弱,结直肠收缩tenison导致粪便推进的困难。总的来说,可想而知,6-OHDA老鼠取决于出口梗阻便秘,至少部分在colorectum受损的胆碱能神经传递。
colorectum受副交感神经支配盆腔神经(借鉴et al ., 2016从SPN),出现(Vizzard et al ., 2000)。此外,实体也由节前神经终端SPN。在PD患者(SPN)病理也被报道布洛赫et al ., 2006)。激活胆碱能神经元在大鼠(SPN)促进结直肠推进收缩借鉴et al ., 2016)。因此,减少胆碱能神经元和SPN的聊天蛋白表达降低可能减少释放神经传递素,在实体和减缓粪便推进6-OHDA老鼠。我们先前的研究显示多巴胺黑质纹状体预测的存在对下丘脑室旁核(PVN)和蓝斑(LC) (王et al ., 2014)。报道,PVN参与网络通过预测桥的核,如巴林顿核,单突触的连接与骶副交感神经中心(裸体和Nadelhaft, 1998;华伦天奴et al ., 2000;Vizzard et al ., 2000)。因此,神经元变性的SN可能间接影响到SPN的胆碱能神经元。然而,监管机制需要进一步阐明。
总的来说,增强,而不是减弱,结直肠收缩tenison一直在6-OHDA老鼠展出。总之,中央黑多巴胺能神经支配与减少胆碱能神经元在SPN, colorectum nNOS和VIP表达降低,这可能是主要负责增加结直肠收缩张力和出口梗阻便秘。同时,M2 / M3的胆碱能传输和upregulation受损也可能部分涉及结肠直肠的蠕动障碍。目前发病机制的研究提供了更多的线索和证据的潜在药物的目标在PD便秘。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到通讯作者/ s。
道德声明
动物研究是审查和批准的动物保健和使用委员会首都医科大学,北京,中国。
作者的贡献
J-XZ设计研究项目。X-LZ和X-HZ进行研究和分析数据。XY, L-FZ X-YF、C-ZL Z-SQ, YZ提供技术支持。X-LZ和J-XZ写的手稿。所有作者批判性的回顾和修订后的手稿。
资金
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81700462,81700462,32171121)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
确认
我们感激针灸研究所,中国中医科学院提供的M2R和米3R KO小鼠。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnagi.2021.770841/full补充材料
补充图1 |6-OHDA老鼠的表征。(一)TH-immunoreactive (IR)黑质神经元(SN)。(c)低放大率的SN视图。(b, d)是SN的帧内的放大视图(a, c)。μm酒吧,规模100人。(B, C)多巴胺(DA)含量SN (B,n= 7)和纹状体(C,n= 9)。(C, D)食物和水的消耗控制和6-OHDA老鼠n= 9)。(E, F)每日大便生产和粪便含水量之间的控制和6-OHDA老鼠n= 11)。∗∗P< 0.01,∗∗∗P< 0.001。
补充资料表1 |原始数据支持本文的结论。
缩写
6-OHDA 6-hydroxydopamine;TH,酪氨酸羟化酶;锡、Substania黑质;帕金森病,帕金森病;聊天、胆碱乙酰转移酶;乙酰胆碱,乙酰胆碱;哒,多巴胺;不,去甲肾上腺素;先生,毒蕈碱的受体;nNOS神经一氧化氮合酶; VIP, Vasoactive intestinal peptide; SPN, sacral parasympathetic nuclei; ENS, enteric nervous system.
引用
安德森,G。,Noorian, A. R., Taylor, G., Anitha, M., Bernhard, D., Srinivasan, S., et al. (2007). Loss of enteric dopaminergic neurons and associated changes in colon motility in an MPTP mouse model of Parkinson’s disease.经验,神经。207年,4 - 12。doi: 10.1016 / j.expneurol.2007.05.010
Anselmi, L。Toti, L。Bove C。,Hampton, J., and Travagli, R. A. (2017). A Nigro-Vagal Pathway Controls Gastric Motility and Is Affected in a Rat Model of Parkinsonism.胃肠病学153年,1581 - 1593。doi: 10.1053 / j.gastro.2017.08.069
布洛赫,。,Probst, A., Bissig, H., Adams, H., and Tolnay, M. (2006). Alpha-synuclein pathology of the spinal and peripheral autonomic nervous system in neurologically unimpaired elderly subjects.Neuropathol。达成。一般人。32岁,284 - 295。doi: 10.1111 / j.1365-2990.2006.00727.x
Borghammer, P。克努森,K。,and Brooks, D. J. (2016). Imaging Systemic Dysfunction in Parkinson’s Disease.咕咕叫。神经。>。代表。16:51。doi: 10.1007 / s11910 - 016 - 0655 - 4
Braak, H。擦,U。,Gai, W. P., and Del, T. K. (2003). Idiopathic Parkinson’s disease: possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen.j .神经Transm。110年,517 - 536。doi: 10.1007 / s00702 - 002 - 0808 - 2
Cai,问:问。,郑,l F。、风扇,r F。丽安,H。周,L。,Song, H. Y., et al. (2013). Distribution of dopamine receptors D1- and D2-immunoreactive neurons in the dorsal motor nucleus of vagus in rats.Auton。>。176年,48-53。doi: 10.1016 / j.autneu.2013.01.007
Chaumette, T。,Lebouvier, T., Aubert, P., Lardeux, B., Qin, C., Li, Q., et al. (2009). Neurochemical plasticity in the enteric nervous system of a primate animal model of experimental Parkinsonism.Neurogastroenterol。Motil。21日,215 - 222。doi: 10.1111 / j.1365-2982.2008.01226.x
陈,Z。李,G。,and Liu, J. (2020). Autonomic dysfunction in Parkinson’s disease: Implications for pathophysiology, diagnosis, and treatment.一般人。说。134:104700。doi: 10.1016 / j.nbd.2019.104700
科鲁奇,M。,Cervio, M., Faniglione, M., De Angelis, S., Pajoro, M., Levandis, G., et al. (2012). Intestinal dysmotility and enteric neurochemical changes in a Parkinson’s disease rat model.Auton。>。169年,77 - 86。doi: 10.1016 / j.autneu.2012.04.005
De Pablo-Fernandez E。Passananti, V。,Zarate-Lopez, N., Emmanuel, A., and Warner, T. (2019). Colonic transit, high-resolution anorectal manometry and MRI defecography study of constipation in Parkinson’s disease.-帕金斯。遗传代数。Disord。66年,195 - 201。doi: 10.1016 / j.parkreldis.2019.08.016
Fearnley, j . M。,and Lees, A. J. (1991). Ageing and Parkinson’s disease: substantia nigra regional selectivity.大脑114 (Pt 5), 2283 - 2301。大脑/ 114.5.2283 doi: 10.1093 /
Fedorova, t D。,Seidelin, L. B., Knudsen, K., Schacht, A. C., Geday, J., Pavese, N., et al. (2017). Decreased intestinal acetylcholinesterase in early Parkinson disease: An (11)C-donepezil PET study.神经学88年,775 - 781。doi: 10.1212 / WNL.0000000000003633
Fornai, M。,Pellegrini, C., Antonioli, L., Segnani, C., Ippolito, C., Barocelli, E., et al. (2016). Enteric Dysfunctions in Experimental Parkinson’s Disease: Alterations of Excitatory Cholinergic Neurotransmission Regulating Colonic Motility in Rats.j .杂志。其他实验。356年,434 - 444。doi: 10.1124 / jpet.115.228510
实施电击,F。,Torresan, F., Repossi, R., Bianco, F., Latorre, R., Ioannou, A., et al. (2017). Downregulation of neuronal vasoactive intestinal polypeptide in Parkinson’s disease and chronic constipation.Neurogastroenterol。Motil。29:12995。doi: 10.1111 / nmo.12995
Gjerloff, T。,Fedorova, T., Knudsen, K., Munk, O. L., Nahimi, A., Jacobsen, S., et al. (2015). Imaging acetylcholinesterase density in peripheral organs in Parkinson’s disease with 11C-donepezil PET.大脑138 (Pt 3), 653 - 663。大脑/ awu369 doi: 10.1093 /
金,一个。,Turkalp, Z. T., and Munoz, D. G. (2013). Enteric alpha-synuclein expression is increased in Parkinson’s disease but not Alzheimer’s disease.Mov。Disord。28日,237 - 240。doi: 10.1002 / mds.25298
主梁,j . R。,Foxx-Orenstein, A. E., and Jin, J. G. (1998). 5-Hydroxytryptamine4 receptor agonists initiate the peristaltic reflex in human, rat, and guinea pig intestine.胃肠病学115年,370 - 380。
哈林顿,a . M。派克,c . J。刘,L。,Burcher, E., Hutson, J. M., and Southwell, B. R. (2010). Localization of muscarinic receptors M1R, M2R and M3R in the human colon.Neurogastroenterol。Motil。22日,e262-e263。doi: 10.1111 / j.1365-2982.2009.01456.x
亨克尔,j . T。,Perepezko, K., Mills, K. A., Mari, Z., Butala, A., Dawson, T. M., et al. (2018). Dopamine transporter availability reflects gastrointestinal dysautonomia in early Parkinson disease.-帕金斯。遗传代数。Disord。55岁,8 - 14。doi: 10.1016 / j.parkreldis.2018.08.010
Holmqvist, S。Chutna, O。,Bousset, L., Aldrin-Kirk, P., Li, W., Bjorklund, T., et al. (2014). Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats.Acta Neuropathol。128年,805 - 820。doi: 10.1007 / s00401 - 014 - 1343 - 6
约翰逊,m E。,Salvatore, M. F., Maiolo, S. A., and Bobrovskaya, L. (2018). Tyrosine hydroxylase as a sentinel for central and peripheral tissue responses in Parkinson’s progression: Evidence from clinical studies and neurotoxin models.掠夺。一般人。165 - 167,1 - 25。doi: 10.1016 / j.pneurobio.2018.01.002
克努森,K。克罗,K。,Ostergaard, K., and Borghammer, P. (2017). Constipation in parkinson’s disease: Subjective symptoms, objective markers, and new perspectives.Mov。Disord。32岁,94 - 105。doi: 10.1002 / mds.26866
近藤,T。,Nakajima, M., Teraoka, H., Unno, T., Komori, S., Yamada, M., et al. (2011). Muscarinic receptor subtypes involved in regulation of colonic motility in mice: functional studies using muscarinic receptor-deficient mice.欧元。j .杂志。670年,236 - 243。doi: 10.1016 / j.ejphar.2011.08.034
李,z S。,Schmauss, C., Cuenca, A., Ratcliffe, E., and Gershon, M. D. (2006). Physiological modulation of intestinal motility by enteric dopaminergic neurons and the D2 receptor: analysis of dopamine receptor expression, location, development, and function in wild-type and knock-out mice.j . >。26日,2798 - 2807。doi: 10.1523 / jneurosci.4720 - 05.2006
刘,c . Z。,张X。L., Zhou, L., Wang, T., Quan, Z. S., Zhang, Y., et al. (2018). Rasagiline, an inhibitor of MAO-B, decreases colonic motility through elevating colonic dopamine content.Neurogastroenterol。Motil。30:e13390。doi: 10.1111 / nmo.13390
借鉴,K。,Nakamori, H., Shiina, T., Ikeda, A., Nozue, Y., Sano, Y., et al. (2016). Stimulation of dopamine D2-like receptors in the lumbosacral defaecation centre causes propulsive colorectal contractions in rats.j .杂志。594年,4339 - 4350。doi: 10.1113 / JP272073
裸体,s . C。,and Nadelhaft, I. (1998). Bilateral projections of the pontine micturition center to the sacral parasympathetic nucleus in the rat.大脑Res。785年,185 - 194。doi: 10.1016 / s0006 - 8993 (97) 01347 - 4
Petrovitch, H。,Abbott, R. D., Ross, G. W., Nelson, J., Masaki, K. H., Tanner, C. M., et al. (2009). Bowel movement frequency in late-life and substantia nigra neuron density at death.Mov。Disord。24岁,371 - 376。doi: 10.1002 / mds.22360
神,R。小高,T。,Uchiyama, T., Asahina, M., Yamaguchi, K., Yamaguchi, T., et al. (2003). Colonic transit time and rectoanal videomanometry in Parkinson’s disease.j .神经。Neurosurg。精神病学74年,268 - 272。
Sharrad, d F。德弗里斯E。,and Brookes, S. J. (2013). Selective expression of alpha-synuclein-immunoreactivity in vesicular acetylcholine transporter-immunoreactive axons in the guinea pig rectum and human colon.j . Comp。神经。521年,657 - 676。doi: 10.1002 / cne.23198
Stocchi F。,and Torti, M. (2017). Constipation in Parkinson’s Disease.Int,启一般。134年,811 - 826。doi: 10.1016 / bs.irn.2017.06.003
棕褐色,a . H。,Lim, S. Y., Chong, K. K., Hor, J. W., Lim, J. L., Low, S. C., et al. (2021). Probiotics for Constipation in Parkinson Disease: A Randomized Placebo-Controlled Study.神经学96年,e772-e782。doi: 10.1212 / WNL.0000000000010998
田,y . M。陈,X。,Luo, D. Z., Zhang, X. H., Xue, H., Zheng, L. F., et al. (2008). Alteration of dopaminergic markers in gastrointestinal tract of different rodent models of Parkinson’s disease.神经科学153年,634 - 644。doi: 10.1016 / j.neuroscience.2008.02.033
Tolosa E。,Garrido, A., Scholz, S. W., and Poewe, W. (2021). Challenges in the diagnosis of Parkinson’s disease.柳叶刀神经。20岁,385 - 397。doi: 10.1016 / s1474 - 4422 (21) 00030 - 2
华伦天奴,r . J。Kosboth, M。,Colflesh, M., and Miselis, R. R. (2000). Transneuronal labeling from the rat distal colon: anatomic evidence for regulation of distal colon function by a pontine corticotropin-releasing factor system.j . Comp。神经。417年,399 - 414。
Vizzard, m·A。Brisson, M。,and de Groat, W. C. (2000). Transneuronal labeling of neurons in the adult rat central nervous system following inoculation of pseudorabies virus into the colon.细胞组织Res。299年,9-26。doi: 10.1007 / s004419900128
王,z . Y。丽安,H。,Cai,问:问。,Song, H. Y., Zhang, X. L., Zhou, L., et al. (2014). No direct projection is observed from the substantia nigra to the dorsal vagus complex in the rat.j .帕金森氏病说。4,375 - 383。doi: 10.3233 /詹妮弗- 130279
王,z . Y。丽安,H。周,L。,Zhang, Y. M., Cai, Q. Q., Zheng, L. F., et al. (2016). Altered Expression of D1 and D2 Dopamine Receptors in Vagal Neurons Innervating the Gastric Muscularis Externa in a Parkinson’s Disease Rat Model.j .帕金森氏病说。6,317 - 323。doi: 10.3233 /詹妮弗- 160817
燕,j . T。,Liu, X. Y., Liu, J. H., Li, G. W., Zheng, L. F., Zhang, X. L., et al. (2021). Reduced acetylcholine and elevated muscarinic receptor 2 in duodenal mucosa contribute to the impairment of mucus secretion in 6-hydroxydopamine-induced Parkinson’s disease rats.细胞组织Res。2021年,7。doi: 10.1007 / s00441 - 021 - 03515 - 7
张x H。霁,T。,Guo, H., Liu, S. M., Li, Y., Zheng, L. F., et al. (2010). Expression and activation of beta-adrenoceptors in the colorectal mucosa of rat and human.Neurogastroenterol。Motil。22日,e325-e334。doi: 10.1111 / j.1365-2982.2010.01598.x
张x H。张,X。F., Zhang, J. Q., Tian, Y. M., Xue, H., Yang, N., et al. (2008). Beta-adrenoceptors, but not dopamine receptors, mediate dopamine-induced ion transport in late distal colon of rats.细胞组织Res。334年,25至35。doi: 10.1007 / s00441 - 008 - 0661 - 1
张X。郭,H。徐,J。李,Y。李,L。,张X。,et al. (2012). Dopamine receptor D1 mediates the inhibition of dopamine on the distal colonic motility.Transl。Res。159年,407 - 414。doi: 10.1016 / j.trsl.2012.01.002
张X。李,Y。,Liu, C., Fan, R., Wang, P., Zheng, L., et al. (2015). Alteration of enteric monoamines with monoamine receptors and colonic dysmotility in 6-hydroxydopamine-induced Parkinson’s disease rats.Transl。Res。166年,152 - 162。doi: 10.1016 / j.trsl.2015.02.003
郑,l F。、歌曲、J。风扇,R。F., Chen, C. L., Ren, Q. Z., Zhang, X. L., et al. (2014). The role of the vagal pathway and gastric dopamine in the gastroparesis of rats after a 6-hydroxydopamine microinjection in the substantia nigra.学报杂志。211年,434 - 446。doi: 10.1111 / apha.12229
关键字:帕金森病、帕金森病、便秘、骶副交感神经核,乙酰胆碱、肠癌蠕动障碍
引用:张xl,张X h,于X,郑l f,冯X - Y,刘azbxcz,关丽珍Z-S,张朱Y和j X(2021)增强收缩张力和调节毒蕈碱的受体2/3 Colorectum 6-Hydroxydopamine-Induced帕金森病大鼠造成便秘。前面。衰老>。13:770841。doi: 10.3389 / fnagi.2021.770841
收到:2021年9月27日;接受:2021年12月02;
发表:2021年12月23日。
编辑:
李市景心山东大学,中国版权©2021张,张昱,郑冯、刘、张,和朱。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
*通信:Jin-Xia朱,zhu_jx@ccmu.edu.cn