小分子化合物从AlphaScreen扰乱tau-glycan接口gydF4y2B一个

1介绍gydF4y2B一个

Tauopathies,包括阿尔茨海默病以及额颞叶痴呆,进步为特征的神经退行性疾病的细胞内沉积的错误折叠和聚集microtubule-associated tau蛋白纤维在大脑中(gydF4y2B一个Goedert 2004gydF4y2B一个)。在正常生理条件下,内在无序τ与微管结合,促进他们的稳定性(gydF4y2B一个Goedert 2004gydF4y2B一个;gydF4y2B一个王旭和刘刚,2008年gydF4y2B一个;gydF4y2B一个贝克et al ., 2021gydF4y2B一个)。在病理条件下,τ骨料神经原纤维缠结和形式(非功能性测试)(gydF4y2B一个Dominguez-Meijide et al ., 2020gydF4y2B一个)。错误折叠τ可以传播和τ病理学prion-like的方式传播到大脑(gydF4y2B一个Goedert et al ., 2017gydF4y2B一个;gydF4y2B一个Mudher et al ., 2017gydF4y2B一个)。朊病毒模型,τ总量从供体细胞释放到细胞外空间,然后结合到细胞表面,内源性受体细胞。在受体细胞,内化τ作为模板来促进内源性的错误折叠τ,播种更多的非功能性测试(gydF4y2B一个Stopschinski和钻石,2017gydF4y2B一个)。虽然τprion-like传播的确切机制仍不完全清楚,已是不争的τ识别使用硫酸乙酰肝素(HS)链硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)τ内化(需要在细胞表面gydF4y2B一个福尔摩斯et al ., 2013gydF4y2B一个)。因此,HS和τ交互是一个至关重要的步骤,τ的prion-like传播病理学,可以针对tauopathies像阿尔茨海默氏症的新疗法。gydF4y2B一个

HSPGs由海关,一个线性粘多糖(GAG)链,共价链接到一个核心蛋白质。发现几乎所有细胞表面,HSPGs可以绑定到众多的蛋白质通过HS (gydF4y2B一个Ori et al ., 2008gydF4y2B一个)。HS-protein绑定是由静电相互作用,硫酸盐的负电荷组之间在海关,和带正电的氨基酸的蛋白质(gydF4y2B一个徐和Esko, 2014gydF4y2B一个)。多分散的结构模拟的商品经常用作HS模仿由于其广泛的可用性是肝素(gydF4y2B一个默罕默德和狭谷,2017gydF4y2B一个;gydF4y2B一个Alavi Naini Soussi-Yanicostas, 2018gydF4y2B一个)。肝素与海关的不同之处在于,它有一个更高的硫酸盐化作用水平和较高含量的iduronic酸(gydF4y2B一个默罕默德和狭谷,2017gydF4y2B一个)。gydF4y2B一个

使用肝素和τ代表tau-HS接口,我们开发了一个AlphaScreen试验筛选小分子抑制剂。AlphaScreen(放大屏幕发光接近同质分析)是附近珠分析用来确定小分子化合物可以破坏大分子相互作用(gydF4y2B一个Yasgar et al ., 2016gydF4y2B一个)。一对供体和受体珠子通过亲和标签附加到感兴趣的分子。在我们的试验中,His-taggedτ是被NTA-donor珠子的虽然是被链霉亲和素生物素化的肝素。当珠子带来了接近通过本国生物交互,捐赠者珠在680 nm的激发产生单线态oxygen-mediated能量转移到受体珠和排放在620海里。互动是被一种抑制剂时,荧光发射将会显著降低(gydF4y2B一个Yasgar et al ., 2016gydF4y2B一个)。这种方法被应用到目标至关重要的交互作用在各种疾病,如峰值/ ACE2 SARS-CoV-2互动(gydF4y2B一个汉森et al ., 2020gydF4y2B一个)和rna蛋白质相互作用(gydF4y2B一个贝克et al ., 2021gydF4y2B一个在tauopathies)。gydF4y2B一个

在这项研究中,我们应用AlphaScreen方法筛选化合物扰乱tau-heparin交互。我们发现tau-heparin接口称为A9的微摩尔的抑制剂。表面等离子体共振(SPR)和核磁共振(NMR)研究决定,A9芳香地区结合肝素微摩尔的亲和力。此外,肝素诱发A9抑制τ聚合和细胞吸收的τ∼10 - 20μM功效。因此,A9是一种很有前途的铅化合物的针对tau-glycan接口prion-likeτ病理学的传播。gydF4y2B一个

2材料和方法gydF4y2B一个

中使用的不同的小分子化合物筛选提供由国家癌症研究所(NCI) /国立卫生研究院(NIH)发展(DTP)治疗计划。在DTP的药物合成和化学分支,集VI多样性选择基于他们复合基准。提供的化合物10毫米DMSO股票在96 -孔板储存在-20°C和纯度检查gydF4y2B一个通过gydF4y2B一个LC / MS谱。gydF4y2B一个

重组长篇τ(2 n4r, aa 1 - 441)有或没有一个氨基6 xhis标记表达和纯化如前所述gydF4y2B一个代斯普利司et al ., 2019gydF4y2B一个)。简而言之,全身τ是表达gydF4y2B一个大肠杆菌gydF4y2B一个引起的应变BL21-DE3细胞和0.5毫米β-异丙酯gydF4y2B一个dgydF4y2B一个1-thiogalactopyranoside (VWR,二,PA)。细胞被收集并存储在-20°C的短期或长期存储,直到净化-80°C。细胞颗粒在50 mM resuspended三,200毫米氯化钠,pH值7.5,1.5 x补充EDTA-free蛋白酶抑制剂平板电脑(热费希尔,沃尔瑟姆,MA)和0.1 mM PMSF,然后由三个经过microfluidizer细胞溶解在80 psi。细胞碎片被离心分离颗粒状,上层清液中煮水洗澡,在冰上冷却5分钟,离心机。上层应用于5毫升HisTrap FF列(Cytiva马尔伯勒,MA)和筛选了使用一个咪唑与最后的咪唑浓度梯度350毫米。分数包含τ是汇集和透析在50 mM NagydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}HPOgydF4y2B一个_{4gydF4y2B一个}1毫米EDTA, pH值6.5和应用于5毫升SP FF列。τ是筛选了使用生理盐水与1毫米的最终浓度梯度。分数包含τ是汇集和集中,瞬间冷冻和储存在-80°C。gydF4y2B一个

猪肠道肝素钠USP冻干粉平均分子量∼15 kDa,平均1.4的多分散性和硫酸盐化作用程度的∼3硫酸盐化作用/二糖单位购买的克理索实验室(辛辛那提,哦)是用于这项研究。gydF4y2B一个

2.1 AlphaScreen化验gydF4y2B一个

AlphaScreen化验进行使用optiplate - 384 (PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)平白色底盘子。反应物被稀释1 x AlphaLISA HiBlock缓冲区(PerkinElmer)掌握混合(25毫米玫瑰,0.1%酪蛋白,1毫克/毫升右旋糖酐- 500,0.5% Triton x - 100, 0.5%阻塞试剂,0.5% BSA和0.05% proclin - 300, pH值7.4)。AlphaLISA链霉亲和素受体珠子、生物素化的肝素和6 xhis标记τ(His-tau)被添加到反应混合,导致最终试验浓度的5μg / mL,μM 0.1和0.1分别μM。添加AlphaScreen镍螯合捐赠者珠子在黑暗的房间里进行最小化由于光敏性光漂白的珠子,最终测定5μg /毫升的浓度。在每一个微型板块,化验所组装结合固定体积的A9与主不同浓度混合。板密封,彻底动摇轻轻混合组件,孵化1 h在黑暗中在室温下。进行了激光两种地震激励Tecan无限M1000 Pro标配有AlphaScreen分析软件在680 nm 100 ms和排放记录在620海里。每个AlphaScreen化验样品一式三份,包括两个控件,复合溶剂1% DMSO作为-(无抑制)控制和10μM肝素作为一个积极的(抑制)控制。数据是安装使用日志(A9)和反应(如三参数)模型关于GraphPad诉9.4.1获得ICgydF4y2Ba_{50gydF4y2B一个}与方程gydF4y2B一个 $\mathrm{YgydF4y2B一个}=gydF4y2B一个\mathrm{BgydF4y2B一个}\mathrm{ogydF4y2B一个}\mathrm{tgydF4y2B一个}\mathrm{tgydF4y2B一个}\mathrm{ogydF4y2B一个}\mathrm{米gydF4y2B一个}+gydF4y2B一个\left(\mathrm{TgydF4y2B一个}\mathrm{ogydF4y2B一个}\mathrm{pgydF4y2B一个}-gydF4y2B一个\mathrm{BgydF4y2B一个}\mathrm{ogydF4y2B一个}\mathrm{tgydF4y2B一个}\mathrm{tgydF4y2B一个}\mathrm{ogydF4y2B一个}\mathrm{米gydF4y2B一个}\right)/gydF4y2B一个\left(\mathrm{1gydF4y2B一个}+gydF4y2B一个\mathrm{10gydF4y2B一个}^gydF4y2B一个\left(\mathrm{XgydF4y2B一个}-gydF4y2B一个\mathrm{lgydF4y2B一个}\mathrm{ogydF4y2B一个}\mathrm{ggydF4y2B一个}\mathrm{我gydF4y2B一个}\mathrm{CgydF4y2B一个}\mathrm{50gydF4y2B一个}\right)\right)$ 。偏差系数被定义为分离的比例带信号动态范围的测定:gydF4y2B一个 $\mathrm{ZgydF4y2B一个}=gydF4y2B一个\mathrm{1gydF4y2B一个}-gydF4y2B一个\frac{\left(\mathrm{3gydF4y2B一个}{\mathrm{\sigma gydF4y2B一个}}_{\mathrm{年代gydF4y2B一个}}+gydF4y2B一个\mathrm{3gydF4y2B一个}{\mathrm{\sigma gydF4y2B一个}}_{\mathrm{cgydF4y2B一个}}\right)}{\left|{\mathrm{\mu gydF4y2B一个}}_{\mathrm{年代gydF4y2B一个}}-gydF4y2B一个{\mathrm{\mu gydF4y2B一个}}_{\mathrm{cgydF4y2B一个}}\right|}$ 在σgydF4y2B一个_{年代gydF4y2B一个}和σgydF4y2B一个_{cgydF4y2B一个}样本的标准偏差(肝素)和控制(DMSO),分别和µ吗gydF4y2B一个_{年代gydF4y2B一个}和µgydF4y2B一个_{cgydF4y2B一个}分别表示样本的均值和控制。gydF4y2B一个

2.2表面等离子体共振gydF4y2B一个

肝素生物芯片的制备。gydF4y2B一个肝素的生物素酰化制备类似我们之前的协议(gydF4y2B一个金正日et al ., 2018gydF4y2B一个)。短暂,肝素(2毫克)和amine-PEG3-Biotin(2毫克,皮尔斯)在200年解散μL HgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}O和混合NaCNBH 10毫克gydF4y2B一个_{3gydF4y2B一个}。反应混合物加热在70°C 24 h。这是进一步增加10毫克NaCNBH紧随其后gydF4y2B一个_{3gydF4y2B一个},反应的是另一个24小时。冷却到室温后,混合物与旋转柱脱盐(3000 MWCO Millaporeσ,伯灵顿,MA)。生物素化的肝素是芯片制备冻干。gydF4y2B一个

固定的生物素化的肝素在SA的筹码。gydF4y2B一个链霉亲和素生物素化的肝素是固定化(SA)生物芯片(Cytiva,乌普萨拉,瑞典)根据制造商的协议。总之,20μL heparin-biotin共轭的解决方案(0.1毫克/毫升)resuspended HBS-EP +运行缓冲(0.01 M消息灵通的,0.15 M氯化钠,3毫米EDTA,和0.005%的表面活性剂P20, pH值7.4)在流动注射细胞(FC) 2、3和4的SA芯片在10μL /分钟的流量。的成功固定肝素的观察证实了∼150 -共振单元(俄文)增加传感器芯片。控制流细胞(FC1)是由一个1分钟注入饱和生物素。成功的一代确诊的肝素生物芯片是通过运行全身τ在芯片和比较绑定动力学结果从我们以前发表的作品(gydF4y2B一个赵et al ., 2020gydF4y2B一个)。gydF4y2B一个

动态测量肝素之间的相互作用和A9使用肝素生物芯片gydF4y2B一个。A9稀释在HBS-EP +缓冲(1% DMSO)。不同浓度的A9(3.13, 6.25, 12.5, 25岁,50岁和100μM)被注入30μL /分钟的流量3分钟Biacore T200一样(Cytiva,乌普萨拉,瑞典)。结束时进样,同样的缓冲通过传感器表面促进离解。后3分钟分裂一次,传感器表面被注入30μL再生2 M氯化钠获得再生。响应监测作为时间的函数(sensorgram) 25°C。sensorgram装了一个稳态关联模型(Biacore T200一样评价软件3.0 v) (Cytiva,乌普萨拉,瑞典)。gydF4y2Ba

2.3核磁共振gydF4y2B一个

核磁共振(NMR)谱的肝素和A9在600.13 MHz 20°C NMR谱仪(力量、Billerica MA)配备了低温探头。通过几个A9进行转让gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H (1 d),gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H -gydF4y2B一个^{13gydF4y2B一个}C-heteronuclear单量子相干(HSQC),gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H -gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H杂环的多重键关联(HMBC),核奥佛好塞效应光谱学(NOESY)gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H -gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H相关光谱(舒适)2 d实验。转让100% DMSO的A9完工。在A9的滴定实验和肝素,最后溶剂比例的10/90%或1/99% DMSO-d6 / DgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}使用O。A9转让了100% DMSO肝素钠滴定A9 1% DMSO执行时,由于肝素在DMSO的低溶解度。我们确定的百分比DMSO A9的化学变化的影响gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H -gydF4y2B一个^{13gydF4y2B一个}C HSQCs和gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H光谱。因此,我们进行了DMSO溶液滴定到A9跟踪这些化学位移扰动,提供的补充(gydF4y2B一个补充图S7gydF4y2B一个)。gydF4y2B一个

一系列的gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H和gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H -gydF4y2B一个^{13gydF4y2B一个}C HSQCs 1毫米进行肝素样品通过添加越来越多的A9最终摩尔比1:1,1:5,1:50,1:10 0。肝素和A9溶解在10/90% DMSO / DgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}1:1的O M比滴定实验,10/90% DMSO-d6 / DgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}O为1:5 M比滴定实验和1/99% DMSO-d6 / DgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}O为1:50和1:10 0 M比滴定实验。所有的核磁共振数据处理和分析使用上旋以下4.4.1和NMRFAM活泼的(gydF4y2B一个李et al ., 2015gydF4y2B一个)。gydF4y2B一个

2.4 Thioflavin T荧光化验gydF4y2B一个

τ的动力学和抑制测定使用Thioflavin T(阻)荧光分析,进行Tecan无限M1000微型板块读者。大师组成的混合10μM His-taggedτ蛋白,2.5毫米德勤,10μM肝素,和10μM这是新鲜玫瑰在10毫米,100毫米氯化钠,pH值7.4。A9系列稀释被用来衡量tau蛋白的聚合抑制存在剂量依赖的相关性。组成的并行控制实验设置空白缓冲阻,主人没有肝素混合物(“不羁τ”),主混合物100μM镊子(CLR01,已知的τ聚合抑制剂(gydF4y2B一个Sinha et al ., 2011gydF4y2B一个))(“τ+镊子”),和掌握混合1%二甲亚砜(DMSO)。一式四份样品进行了测试和分析。蛋白质聚合诱导在37°C和轨道摇晃在250 rpm长达60小时20分钟的间隔。令人兴奋的分子的荧光强度是监控在435 nm和记录排放在480海里。最终的数据分析和提取动力学参数进行Igor Pro项目(Wavemetrics、奥斯维戈湖或)。gydF4y2B一个

数据归一化到0 - 1在0和基线的规模最大的A9最低浓度(0.017μM) 1。所有聚合s型函数的曲线拟合gydF4y2B一个 $\mathrm{年代gydF4y2B一个}=gydF4y2B一个\mathrm{bgydF4y2B一个}\mathrm{一个gydF4y2B一个}\mathrm{年代gydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}+gydF4y2B一个\frac{\mathit{马克斯gydF4y2B一个}}{\mathrm{1gydF4y2B一个}+gydF4y2B一个\mathit{经验值gydF4y2B一个}\left(\frac{{\mathrm{xgydF4y2B一个}}_{\mathrm{0gydF4y2B一个}}-gydF4y2B一个\mathrm{xgydF4y2B一个}}{\mathrm{rgydF4y2B一个}\mathrm{一个gydF4y2B一个}\mathrm{tgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}}\right)}$ 提取的一半时间聚合(gydF4y2B一个xhalfgydF4y2B一个)gydF4y2B一个基地,马克斯gydF4y2B一个和gydF4y2B一个率gydF4y2B一个的系数gydF4y2B一个基地gydF4y2B一个设置在小X Y值Y值的X是基地+马克斯。XgydF4y2B一个_{0gydF4y2B一个}集的X值Y(基础+ max / s)和gydF4y2B一个率gydF4y2B一个设置率上升。小gydF4y2B一个率gydF4y2B一个导致更快的上升,具体来说,斜率x =gydF4y2B一个xgydF4y2B一个_{0gydF4y2B一个}是gydF4y2B一个马克斯gydF4y2B一个/ 4 *gydF4y2B一个率gydF4y2B一个。gydF4y2B一个

2.5细胞培养和τ吸收试验gydF4y2B一个

τ蛋白样品制备。gydF4y2B一个τ净化后,内毒素去除进行了使用高容量内毒素去除树脂/制造商协议(热费希尔,沃尔瑟姆,MA)。全身τ标有647 Alexa萤石succinimidyl酯染料(af - 647)以下制造商协议(热费希尔)导致学位标签1.4 PBS透析后去除多余的染料。标记蛋白质储存在-80°C到使用。gydF4y2B一个

细胞吸收化验gydF4y2B一个。人类H4神经胶质瘤细胞从写明ATCC购买的边后卫在DMEM培养媒体补充10%,和100年μg /毫升青霉素和链霉素。实验在大约0.24×10gydF4y2B一个^{6gydF4y2B一个}细胞/ confluency在24-well板。文化有限公司保持湿润空气的5%gydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}在37°C。H4神经胶质瘤细胞细胞核染色的赫斯特33258年被引进到A9 50岁,25岁,12.65和6.25μM(每个浓度三个技术复制)其次是恒定浓度的0.1μMτ贴上Alexa萤石647 (tau-AF647)和孵化为30分钟37°C。孵化后,这些细胞被洗PBS和准备接受活细胞成像在媒体DMEM(没有酚红)补充5%的边后卫。赫斯特33258年核染色成像在DAPI通道而τ的af - 647成像CY5通道下的evo M5000荧光显微镜。计算修正总细胞荧光(CTCF)τ细胞吸收测定显微镜图像完成使用ImageJ和公式gydF4y2B一个 $\mathrm{CgydF4y2B一个}\mathrm{TgydF4y2B一个}\mathrm{CgydF4y2B一个}\mathrm{FgydF4y2B一个}=gydF4y2B一个\mathrm{我gydF4y2B一个}\mathrm{ngydF4y2B一个}\mathrm{tgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{ggydF4y2B一个}\mathrm{rgydF4y2B一个}\mathrm{一个gydF4y2B一个}\mathrm{tgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{dgydF4y2B一个}\mathrm{DgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{ngydF4y2B一个}\mathrm{年代gydF4y2B一个}\mathrm{我gydF4y2B一个}\mathrm{tgydF4y2B一个}\mathrm{ygydF4y2B一个}-\; -\; -\; -\; -\; -gydF4y2B一个\left(\mathrm{一个gydF4y2B一个}\mathrm{rgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{一个gydF4y2B一个}\mathrm{ogydF4y2B一个}\mathrm{fgydF4y2B一个}\mathrm{年代gydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{lgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{cgydF4y2B一个}\mathrm{tgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{dgydF4y2B一个}\mathrm{cgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{lgydF4y2B一个}\mathrm{lgydF4y2B一个}\mathrm{XgydF4y2B一个}\mathrm{米gydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{一个gydF4y2B一个}\mathrm{ngydF4y2B一个}\mathrm{fgydF4y2B一个}\mathrm{lgydF4y2B一个}\mathrm{ugydF4y2B一个}\mathrm{ogydF4y2B一个}\mathrm{rgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{年代gydF4y2B一个}\mathrm{cgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{ngydF4y2B一个}\mathrm{cgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{ogydF4y2B一个}\mathrm{fgydF4y2B一个}\mathrm{bgydF4y2B一个}\mathrm{一个gydF4y2B一个}\mathrm{cgydF4y2B一个}\mathrm{kgydF4y2B一个}\mathrm{ggydF4y2B一个}\mathrm{rgydF4y2B一个}\mathrm{ogydF4y2B一个}\mathrm{ugydF4y2B一个}\mathrm{ngydF4y2B一个}\mathrm{dgydF4y2B一个}\mathrm{rgydF4y2B一个}\mathrm{egydF4y2B一个}\mathrm{一个gydF4y2B一个}\mathrm{dgydF4y2B一个}\mathrm{我gydF4y2B一个}\mathrm{ngydF4y2B一个}\mathrm{ggydF4y2B一个}\mathrm{年代gydF4y2B一个}\right)$ 。CTCF结果关于Graphpad棱镜诉9.4.1处理。和单向方差分析(Dunnett多个对比测试)计算,ns-not显著,* *gydF4y2B一个pgydF4y2B一个< 0.001,* * * *gydF4y2B一个pgydF4y2B一个< 0.0001。gydF4y2B一个

3的结果gydF4y2B一个

3.1 AlphaScreen分析识别小说Tau-HS抑制剂化合物gydF4y2B一个

FDA批准的药物化合物目标tau-heparin界面缓慢tauopathies缺乏的传播。我们开发了一个AlphaScreen化验,我们固定6 xhis-tagged长篇τ(His-tau)螯合镍(镍gydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个}-NTA)捐赠珠子和肝素生物素化的链霉亲和素受体珠子,为了解决这个问题(gydF4y2B一个图1一个gydF4y2B一个)。大规模筛选试验,试验可以评价的质量偏差系数(gydF4y2B一个Zhang et al ., 1999gydF4y2B一个)。如果一个筛选试验的偏差系数为1,这是一个理想的试验。如果该值被发现在1 > Z≥0.5,一个试验被认为是优秀的(gydF4y2B一个Zhang et al ., 1999gydF4y2B一个)。我们分析的偏差系数确定(见0.65gydF4y2B一个补充表S1gydF4y2B一个)。gydF4y2B一个

一个微型板块从NCI多样性集图书馆(DTP)筛选。∼300化合物筛选。所有化合物筛选100μM。荧光信号从每个盘子筛选结果可视化在热图轻易地识别出较低的化合物的荧光信号,对应tau-heparin和潜在的抑制剂tau-HS接口(gydF4y2B一个图1 bgydF4y2B一个)。板4879 NCI的多样性VI筛选鉴定了6个AlphaScreen最低的铅化合物荧光信号(gydF4y2B一个图1 bgydF4y2B一个红色和gydF4y2B一个图1 cgydF4y2B一个)。每个六铅化合物的结构gydF4y2B一个补充图S1gydF4y2B一个。进一步探讨了这些化合物剂量反应AlphaScreen (gydF4y2B一个图1 dgydF4y2B一个),这表明,A9是最好的抑制化合物在这些六、结构所示gydF4y2B一个图3 bgydF4y2B一个。然后我们开始确定集成电路gydF4y2B一个_{50gydF4y2B一个}A9,通过AlphaScreen广泛的浓度。的集成电路gydF4y2B一个_{50gydF4y2B一个}A9的决心是48μM (gydF4y2B一个图2gydF4y2B一个)。gydF4y2B一个

3.2在μM A9与肝素亲和gydF4y2B一个

我们使用表面等离子体共振(SPR)定义动力学参数(kgydF4y2B一个_{在gydF4y2B一个}kgydF4y2B一个_{从gydF4y2B一个}KgydF4y2B一个_{DgydF4y2B一个})A9-heparin复杂决定的亲和力A9-heparin交互。A9稀释在HBS-EP +缓冲(1% DMSO)在减少浓度和注射肝素固定传感器芯片。分析物的A9显示立即饱和30μL /分钟的流量交互时固定肝素,防止典型1:1朗缪尔模型拟合动力学信息。亲和力决定使用一个稳态关联方程,结果KgydF4y2B一个_{DgydF4y2B一个}A9-heparin交互计算11±8μM (gydF4y2B一个图3一gydF4y2B一个),这是在同一个数量级的ICgydF4y2B一个_{50gydF4y2B一个}的48μM AlphaScreen结果。由于难以获得功能性τ固定化SPR芯片,我们使用核磁共振(NMR)探针tau-A9界面,发现A9不绑定到τ(数据未显示)。因此,A9扰乱了tau-HS交互占领多糖,而不是τ。gydF4y2B一个

我们滴定τ或肝素A9在核磁共振实验中了解A9τ/聚糖复杂混乱的基础。首先,A9被分配gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H -gydF4y2B一个^{13gydF4y2B一个}C异核单量子相干(HSQC),gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H -gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H杂环的多重键关联(HMBC),gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H -gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H核奥佛好塞效应光谱学(NOESY),gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H -gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H(见相关光谱(舒适)实验gydF4y2B一个补充材料gydF4y2B一个)。gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H光谱被用来可视化A9的变化信号在滴定肝素(gydF4y2B一个图3 c, DgydF4y2B一个)。在50:1 M A9与肝素的比例,不可见的A9山峰gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H光谱,表明肝素已经绑定所有可用的A9(数据未显示)。100:1 M A9与肝素的比率,叠加的gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H光谱放大芳香的A9显示地区复杂地层为代表的损失gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H信号和重大化学位移扰动(csp) A9的芳香地区肝素的存在(gydF4y2B一个图3 cgydF4y2B一个)。相比之下,覆盖的gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H光谱放大A9的脂肪族地区显示复杂地层由损失gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H信号从A9的脂肪族地区肝素的存在,但不是重要的csp。这表明肝素主要绑定的A9地区是在芳香而不是脂肪族地区。gydF4y2B一个

肝素诱发3.3 A9抑制τ聚合gydF4y2B一个

这是肝素能够诱导全身τ聚合(gydF4y2B一个Goedert et al ., 1996gydF4y2B一个)。结合动力学和亲和力(τ)和肝素是由我们组之前报道:τ与肝素结合KgydF4y2B一个_{DgydF4y2B一个}∼20 nM (gydF4y2B一个赵et al ., 2020gydF4y2B一个)。我们假设如果A9可以中断tau-heparin交互,A9肝素诱发可能会减少τ聚合。使用阻氢荧光分析(gydF4y2B一个周et al ., 2022gydF4y2B一个肝素诱发),我们证明A9可以抑制τ聚合剂量依赖性的方式(gydF4y2B一个图4一gydF4y2B一个)。A9完全抑制τ聚合167μM, A9浓度最高的使用(gydF4y2B一个图4一gydF4y2B一个)。A9浓度降低,抑制增长较弱,和τ聚合变得更加普遍。的集成电路gydF4y2B一个_{50gydF4y2B一个}τ的聚合抑制μM决心是7.3,这是在协议与KgydF4y2B一个_{DgydF4y2B一个}11从SPR±8μM A9-heparin交互(gydF4y2B一个图4 bgydF4y2B一个)。gydF4y2B一个

3.4 A9抑制τH4细胞内化gydF4y2B一个

我们下一个调查A9能否在细胞环境中抑制τ的内化。我们进行了τ细胞吸收测定使用人类H4神经胶质瘤细胞系,已用于τ吸收化验(gydF4y2B一个劳赫et al ., 2020gydF4y2B一个)。HSPGs呈现在细胞表面的H4神经胶质瘤细胞能够绑定和内化τ总量。τ蛋白是用alexa - 647标记染料(tau-AF647)跟踪τ在进入细胞。Tau-AF647 0.1μM被用作控制展示不羁的τ。H4神经胶质瘤细胞被首次引入增加浓度的A9紧随其后的0.1μM tau-AF647。细胞在培养30分钟37°C。在25岁μM A9,明显抑制τ观察吸收而τ控制(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2B一个)。gydF4y2B一个

集中频道覆盖单个细胞图像显示,τ是paranuclear核内体的地区,可能由于内吞作用(gydF4y2B一个图5 bgydF4y2B一个)。量化的修正总τ荧光显示一个明确的抑制τ内化与越来越多的A9礼物(gydF4y2B一个图5 cgydF4y2B一个)。这个结果显示一个近似ICgydF4y2B一个_{50gydF4y2B一个}在25μM浓度。数据强烈表明,A9抑制τ吸收通过阻断的相互作用与细胞表面HPSGsτ。gydF4y2B一个

4讨论gydF4y2B一个

我们报告的鉴定小分子药物A9 (9-hydroxy-2 -乙酸(2-piperidinylethyl) ellipticinium)能够抑制tau-HS接口通过bead-based接近高温超导化验,AlphaScreen。从AlphaScreen实验存在剂量依赖的相关性,A9下定决心要有一个集成电路gydF4y2B一个_{50gydF4y2B一个}∼48μMgydF4y2B一个。gydF4y2B一个不同浓度的A9流淌在肝素在SPR传感器芯片实验,进一步理解A9及其潜在破坏tau-HS接口。平衡离解常数确定(KgydF4y2B一个_{DgydF4y2B一个}11±8μM)。gydF4y2B一个

我们第一次执行各种1 d和2 d核磁共振实验将分子的结构分配给研究A9与肝素在分子水平上。Post-assignment,我们滴定A9肝素在50:1 100:1米比率,后者证明∼50%峰值强度损失的A9质子以及重要的化学位移扰动在芳香的地区。这强烈表明,A9的芳香地区与肝素结合而不是脂肪族碳,类似于肝素和小分子的计算结果π-π叠加(gydF4y2B一个Maszota-Zieleniak et al ., 2021gydF4y2B一个)。此外,需要可视化A9的比例很高gydF4y2B一个^{1gydF4y2B一个}H信号表明A9-heparin复杂不是1:1,并可能多个A9绑定到单个分子肝素链。据推测,这种交互通过静电相互作用,发生类似τ和肝素相互作用的方式。在A9的案例中,带正电的氮可以与带负电荷的交互硫酸肝素组。此外,氢键也可以发生在这种交互通过羟基或A9氮上的氢。虽然这只是一个猜想,我们尚未调查具体的绑定A9与肝素相互作用。gydF4y2B一个

在功能分析,结果表明:肝素诱发A9可以抑制τ聚合与IC剂量依赖性的方式gydF4y2B一个_{50gydF4y2B一个}7.3μM。在一个细胞吸收试验,利用H4神经胶质瘤细胞,通过引入A9抑制τ吸收剂量依赖性的方式。这些数据表明,A9可以针对多个机制的行动(内化、聚合)依赖于tau-HS交互。gydF4y2B一个

HS-tau交互衡量SPR的亲和力是∼20 nM (gydF4y2B一个赵et al ., 2020gydF4y2B一个),而KgydF4y2B一个_{DgydF4y2B一个}这里11μM测量heparin-A9交互。扰乱HS-tau交互,需要更高浓度的A9与HS和τ。因此,在我们AlphaScreen化验,A9时有效地破坏tau-heparin交互出席∼100倍摩尔过剩相对于tau-heparin复杂。同样,在我们的细胞吸收试验,A9使用的浓度远远高于τ的浓度。这些考虑都凸显了需要额外的纳米抑制剂的筛选工作。gydF4y2B一个

在本研究中我们使用单体的τ,而不是错误折叠或聚合τ,代表tau-HS接口prion-likeτ病理学的传播。我们证明使用单体的τ基于结果从单体的τ通常适用于τ总量。例如,最初的研究展示的重要性6-O-sulfation与单体的τtau-HS交互进行,这与τ后验证总量(gydF4y2B一个赵et al ., 2017gydF4y2B一个;gydF4y2B一个劳赫et al ., 2018gydF4y2B一个;gydF4y2B一个Stopschinski et al ., 2018gydF4y2B一个)。在未来的研究中,τ总量将用于AlphaScreen和验证。gydF4y2B一个

其他领域的工作已经完成tau-HS接口,如合成heparanoid结合τ,抑制τ吸收和播种细胞(gydF4y2B一个Stopschinski et al ., 2020gydF4y2B一个)。虽然他们的研究集中在heparinoids作为候选药物结合τ,我们的方法可能产生与肝素的化合物。我们现在描述与商品结合的一种新型小分子。重要的是,A9作为一个强大的化学脚手架主要为优化商品绑定。作为一个例子,A9优化可以通过改变核心thiohydantoin吡咯烷结构。这种变化会模仿的核心结构rhodamine-based化合物用于药物化学,特别是发现抑制τ聚合(gydF4y2B一个Bulic et al ., 2009gydF4y2B一个)。这将打开一个新的治疗靶点,因为大道tauopathies严重缺乏有效的治疗方法,包括阿尔茨海默氏症。gydF4y2B一个

数据可用性声明gydF4y2B一个

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2B一个补充材料gydF4y2B一个,进一步的调查可以针对相应的作者。gydF4y2B一个

作者的贡献gydF4y2B一个

概念化、科幻和连续波;方法论、科幻、WJ,詹,NS,和连续波;正式的分析,科幻,詹,PH值,和连续波;原创作品草稿准备、科幻和连续波;writing-review和编辑、科幻和连续波;资源、RL FZ,连续波。gydF4y2B一个

资金gydF4y2B一个

本研究支持的NIA阿尔茨海默病临床和转化研究培训格兰特(T32AG057464) RF1AG069039 (CW)和国家卫生研究院:S10OD028523 (FZ和RL)。gydF4y2B一个

确认gydF4y2B一个

我们愿意承认马文宾利在细胞培养中专业知识和指导。我们也愿意承认劳伦Gandy Nabin坎德尔,贝利伊甸园,阿什利罐头的实验建议和支持。gydF4y2B一个

的利益冲突gydF4y2B一个

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2B一个

出版商的注意gydF4y2B一个

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2B一个

补充材料gydF4y2B一个

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2B一个https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmolb.2022.1083225/full补充材料gydF4y2B一个

引用gydF4y2B一个