增加肠道细菌的唾液酸酶活动加剧急性结肠炎小鼠gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

胃肠道是一个多元化的社区,微生物,数万亿的编号(gydF4y2BaMatijasic et al ., 2020gydF4y2Ba)。肠道微生物群主要由门拟杆菌门和厚壁菌门,而放线菌的成员,Verrucomicrobia Fusobacteria和变形菌门代表一个小分数(gydF4y2BaShreiner et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaRinninella et al ., 2019gydF4y2Ba)。肠道微生物群中起着至关重要的作用在人类健康,提供必需的营养,训练免疫系统,帮助抵御病原体。肠道微生物群也参与宿主代谢和与多种慢性疾病(gydF4y2Ba侯et al ., 2022gydF4y2Ba)。作为一个复杂的生态系统,肠道微生物群也在不断地竞争营养物质。这种肠道微生物之间的竞争可能导致持久的微生物群的组成变化,因此各种负面的健康结果的主机(gydF4y2BaCoyte Rakoff-Nahoum, 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba施罗德,2019gydF4y2Ba)。例如,生态失调引起的不平衡的肠道微生物群与多种疾病有关,包括肥胖、炎症性肠病和癌症(gydF4y2Ba戈麦斯et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba戈马,2020gydF4y2Ba)。因此,了解竞争营养物质在肠道微生物群是必不可少的促进肠道健康和预防疾病(gydF4y2Ba松嫩堡et al ., 2005gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

获取和处理营养物,肠道微生物表达多种基因,carbohydrate-active酶包括一个庞大的集团,需要消化复杂的低聚糖和多糖。除了消化碳水化合物的饮食,这些酶也活跃在厚厚的黏液层衬里肠道表面,主要特性的gel-forming黏蛋白MUC2, MUC5AC、MUC5B (gydF4y2Ba德赛et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaMelhem et al ., 2021gydF4y2Ba)。细菌carbohydrate-active从膳食碳水化合物酶催化单糖的释放和粘液聚糖进入肠道流明。carbohydrate-active酶参与的消化肠道粘液主要属于糖苷水解酶(gh)类型的唾液酸酶,fucosidases,牛乳糖和己糖胺酶(gydF4y2Ba茨,2022gydF4y2Ba)。大多数gh在肠道产生的门壁厚菌门和拟杆菌门(gydF4y2BaEl Kaoutari et al ., 2013gydF4y2Ba)。单糖释放到肠道流明也促进细菌的生长类群缺乏专门的gh对碳水化合物的分解,从而导致槽通路(gydF4y2BaBerkhout et al ., 2022gydF4y2Ba)。单糖的受益者槽通常促炎症,致病性细菌等gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba或gydF4y2Ba沙门氏菌thyphimuriumgydF4y2Ba(gydF4y2BaNg et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba黄et al ., 2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

主机聚糖的乳沟细菌gh也可能改变碳水化合物结构参与细胞粘附、贩运和激活。特别是fucosylated和sialylated抗原表位被内源性凝集素,如selectins和唾液结合immunoglobulin-like凝集素(siglec),分别调节白细胞贩运和激活,(gydF4y2Ba克罗克et al ., 2007gydF4y2Ba;gydF4y2Ba该基金会2015年gydF4y2Ba;gydF4y2BaTvaroska et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaMurugesan et al ., 2021gydF4y2Ba)。海藻糖的去除细菌fucosidases可能影响免疫调节c型凝集素的信号DC-SIGN树突状细胞(dc)是调节DCs的促炎症反应(gydF4y2Ba范Gisbergen et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2BaGarcia-Vallejo et al ., 2014gydF4y2Ba)。同样,肠道内细菌的唾液酸酶的作用腔可能减少siglec配体的密度,从而降低siglecs的抗炎活性(gydF4y2Ba陈et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaChang et al ., 2012gydF4y2Ba)。唾液酸酶活性被证明能增加免疫细胞的激活上下文中的siglec-mediated信号在癌症免疫疗法(gydF4y2Ba灰色et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaLaubli et al ., 2021gydF4y2Ba)。因此,有可能增加唾液酸酶活性降低的activation-threshold白细胞,从而增加肠道炎症,如我们之前建议的结果(gydF4y2Ba黄et al ., 2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

调查增加了细菌fucosidase和唾液酸酶活动的影响肠道生理和炎症,我们居住的老鼠gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba过度表达选择细菌gh。补充使用这个方法,我们可以比较GH活动增加的影响发展的葡聚糖硫酸酯钠所致急性结肠炎(DSS)摄入,从而展示唾液酸酶活动的促炎作用。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

评估的影响肠道内细菌的唾液酸酶和fucosidase活动增加,一系列候选基因克隆和表达不同gydF4y2BaAkkermansiagydF4y2Ba,gydF4y2Ba拟杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba瘤胃球菌属gydF4y2Ba物种在carbohydrate-active酶(CAZy)家庭GH29 GH95 fucosidases, GH33唾液酸酶。为下游不同的表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,我们选择酶显示特定的活动(高gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)和稳定广泛的温度和pH值。fucosidase活动,我们选择了fucosidase ATCC_03833编码gydF4y2Ba瘤胃球菌属gnavusgydF4y2Ba(UniProt A7B8B7) (gydF4y2Ba吴et al ., 2021gydF4y2Ba)。唾液酸酶的活动,我们选择了BVU_4143唾液酸酶编码gydF4y2Ba拟杆菌vulgatusgydF4y2Ba(UniProt A6L7T1)曾发现在小鼠的肠道扩张在结肠炎(gydF4y2Ba黄et al ., 2015gydF4y2Ba)。我们也选择了rhamnosidase酶控制GH比较选定fucosidase和唾液酸酶酶,鉴于鼠李糖从动物聚糖缺席。的BT_1001 rhamnosidase (UniProt Q8A916)gydF4y2Ba叫多形拟杆菌gydF4y2Ba已被证明是活跃在果胶的乳沟rhamnogalacturonan-II (gydF4y2BaNdeh et al ., 2017gydF4y2Ba)。作为一个细菌宿主表达三个gh,我们选择一个gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应变与肠道发炎的老鼠。这gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应变,称为gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2,血清型是O7: K -: H7和β-glucuronidase是积极的和消极的溶血素和verocytotoxin。三个选定的gh,接下来描述为Rha-ase, Fuc-ase和Sia-ase既定使用向量pSF_OXB20表示gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2,导致稳定rhamnosidase fucosidase和唾液酸酶活性(gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)。由此产生的重组gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2是由填喂法的初始抗生素治疗后小鼠2天减少内源性补充肠道微生物群和打开一个利基gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2。后殖民与重组gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2,老鼠接受3.5% DSS诱导急性结肠炎(5天gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。抗生素治疗的总细菌水平降低了1000倍粪便以定量衡量16 s rRNA PCR分析。细菌水平恢复正常DSS的第五天开始治疗(gydF4y2Ba图1中gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

补充与重组的老鼠gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2持续表达Rha-ase Fuc-ase和Sia-ase导致分别增加rhamnosidase, fucosidase和唾液酸酶活动以盲肠液,直到研究结束的12天(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。DSS也增加了GH活动引起的炎症,但与重组水平低于通过补充gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2。rhamnosidase增加的影响,fucosidase和唾液酸酶活动DSS-induced结肠炎最初评估通过监测治疗小鼠的体重。抗生素治疗造成暂时的下降体重,恢复到原来的水平的第五天,当DSS添加到饮用水。治疗小鼠逐渐失去了大约10%的重量之间的6和11天,这时他们开始恢复一些体重12天(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。老鼠殖民与重组gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2表达Rha-ase和Fuc-ase显示相同的体重的变化控制老鼠后抗生素治疗和DSS吸收(gydF4y2Ba图3 a, BgydF4y2Ba)。相比之下,老鼠补充gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2表达Sia-ase显示体重下降幅度6和10天之间的研究。这群老鼠不得不终止天9和10之间达到他们最初的体重的85%的阈值(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

同意观察到损失的增加体重,小鼠结肠显示增加唾液酸酶活性也增加重量/长度比率(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)和肠道通透性增加以FITC-dextran泄漏到血液中(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。组小鼠增加rhamnosidase fucosidase活动没有显著不同于non-supplemented对照组治疗DSS对结肠重量/长度比和肠道通透性(gydF4y2Ba图4 a, BgydF4y2Ba)。组织学检查确诊的从所有小鼠结肠组织发炎与DSS-induced结肠炎相关典型的改变,如白细胞浸润,上皮屏障和改变隐窝和杯状细胞结构(gydF4y2Ba图4 c, DgydF4y2Ba)。得分的组织学改变证实了DSS治疗引起的病理变化,虽然鼠标组之间没有显著差异,尽管在老鼠身上获得更高的严重程度分数增加唾液酸酶活动(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)。结肠炎症DSS-treated老鼠也监控通过测量标志基因的表达。occludin的转录水平紧密连接蛋白(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba),在伤口愈合和TGF-β诱导(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba),保持不变的急性结肠炎小鼠组。诱导一氧化氮合酶的表达(间接宾语)只有DSS-induced结肠炎中显著增加小鼠唾液酸酶活性增加(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)。的促炎细胞因子TNFα,IL-1β和il - 6也主要在结肠炎症组织的小鼠唾液酸酶活性增加,而老鼠rhamnosidase活动增加显示转录水平较低的三个测量细胞因子(gydF4y2Ba图5 d-fgydF4y2Ba),建议一个rhamnosidase活动对炎症的影响可能通过介导微生物组成的变化。gydF4y2Ba

因此,评估是否与重组小鼠的补充gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2和由此产生的GH活动增加影响肠道微生物群的组成,我们分析了细菌社区出现在治疗的小鼠在DSS政府之前,5天,在研究结束时,12天,比较这些社区出现在未经处理的小鼠。社区组成评估通过16 s rRNA基因测序的粪便。未经处理的小鼠的微生物群分析0天的顺序是由细菌的细菌性的包括类杆菌的家庭gydF4y2Ba,gydF4y2BaMuribaculaceaegydF4y2Ba,gydF4y2BaPrevotellaceae和RikenellaceaegydF4y2Ba。gydF4y2BaLachnospiraceae秩序的真细菌目是革兰氏阳性细菌鉴定的主要组。肠杆菌科的家庭,其中包括gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,代表总额的不到2%,细菌在所有但一个未经处理的小鼠(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。5天,抗生素治疗后,微生物多样性强烈下降,主要是由肠杆菌科和类杆菌(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。值得注意的是,老鼠强饲法的微生物组成与PBS或重组gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2只有较小的生理差异。在研究结束时,所有老鼠组显示出类似的微生物与Lachnospiraceae主导成分,类杆菌和肠杆菌科(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)。鼠标的微生物组成群体的相似DSS治疗前后被布雷Curtis-based主坐标分析说明。尽管细菌社区之间的显著差异治疗组,集群主要重叠在第五天DSS治疗前(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba)和发展后的结肠炎的研究(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

鉴于补充与重组的老鼠gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达不同的gh并未导致出现重大变化的生物治疗组的肠道微生物群组成,我们推断,恶化的结肠炎中观察到小鼠唾液酸酶活动增加不太可能失调有关。结肠增加唾液酸酶的活动也可以改变的发生sialylated结构,从而影响细胞功能依靠唾液酸的识别。确认增加唾液酸酶活动的影响在结肠sialylated聚糖的分布,我们研究了小鼠的唾液酸的损失补充Rha-ase和Sia-ase表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2用花生凝集素染色结肠组织(机构)。机构结合碳水化合物抗原决定基Galβ1 3 galnac (gydF4y2Ba查柯Appukuttan, 2001gydF4y2Ba;gydF4y2BaCorfield 2018gydF4y2Ba),这是经常蒙面终端唾液酸。小鼠唾液酸酶活动增加的确提出了提升机构反应在近端和远端结肠组织相比,老鼠rhamnosidase活动增加和老鼠强饲法与PBS代替重组gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2 (gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。机构信号局部黏液层,适逢Sia-ase释放重组的预期定位gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2。定量分析机构的近端和远端结肠组织的信号在多个部分证实了增加与Sia-ase表达观察小鼠的补充gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2 (gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

除了从粘膜聚糖唾液酸的乳沟,唾液酸酶活性增加可能会减少唾液酸的存在在结肠粘膜的居民白细胞,从而可能改变功能相关蛋白相互作用表面唾液酸。Siglecs信号蛋白主要表达在白细胞,抑制活化的免疫细胞后绑定sialylated配体(gydF4y2BaLaubli Varki, 2020gydF4y2Ba)。几位siglecs sialylated配体广泛暴露在结肠粘膜和粘膜下结缔组织。例如,配体siglec-10在固有层和肌肉的近端和远端结肠,而配体siglec-E主要发现在远端结肠杯状细胞(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。孵化的结肠组织部分Sia-ase导致这些siglec配体的消失,表明这种唾液酸酶能够打通唾液酸siglec激活的急需之物。鉴于DCs的促炎症性质的upregulation由于减少siglec配体(gydF4y2Ba陈et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2Ba皮拉伊et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba•吕贝尔et al ., 2018gydF4y2Ba),我们调查的能力Sia-ase降低叶片表面sialylation propria-derived DCs。孵化的孤立CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CD11cgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ MHCIIgydF4y2Ba^+gydF4y2BaDCs与Sia-ase MAL二世的绑定凝集素减少,但并不是系统网络体系结构(SNA)绑定(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba),这表明Sia-ase能够打通α2,3-linked唾液酸,但不是α2,唾液酸。Sia-ase DCs治疗也导致强烈降低siglec-10和siglec-E绑定(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba)。因此,诱导小鼠结肠炎在Sia-ase补充的恶化可能相关的重构表面sialylation结肠粘膜免疫细胞中发现的。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

我们以前的工作表明,唾液酸酶活性增加鼠标结肠使肠杆菌科的扩张,从而加剧炎症急性结肠炎(gydF4y2Ba黄et al ., 2015gydF4y2Ba)。在目前的研究中,唾液酸酶活动的促炎效应也被扩展到宿主粘膜聚糖的重构,从而减少siglec配体。重组的口服补充gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2 overexpressing gh启用评估的贡献特定rhamnosidase fucosidase和唾液酸酶活动的炎症gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。结果增加各自的GH活动补充小鼠的结肠显然表明方法的有效性描述一个给定的影响酶的发展结肠炎。重组的殖民和肠道扩张gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2本身并不影响疾病的严重程度如图所示的平行结肠炎治疗与观察gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba补充老鼠rhamnosidase活动增加。gydF4y2Ba

没有致病性的影响gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2补充本身对结肠炎还表示,唯一的扩张gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba注射的小鼠肠道里并不足以加强肠道炎症,建议在我们先前的研究(gydF4y2Ba黄et al ., 2015gydF4y2Ba)。细菌鉴定的一个明显的局限性的基础上有针对性的16 s rRNA基因测序的地区缺乏分辨率超出属或种的水平(gydF4y2BaJohnson et al ., 2019gydF4y2Ba)。毒株特异性毒性等特性因素和细菌素的表达,这可能是疾病发展,关键是忽略了只考虑微生物群组成的变化时16 s rRNA基因序列的水平。沿着这条线,碳水化合物释放肠粘膜也会调节毒力因子的表达除了介导的扩张特定的细菌类群。例如,增加免费结肠中海藻糖含量已被证明在肠出血性压制毒性基因的表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肠道粘膜,从而促进其殖民(gydF4y2Ba帕切科et al ., 2012gydF4y2Ba)。同样,唾液酸唾液酸酶释放的活动可能加剧结肠炎症通过毒力因素的调节之外的扩张gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba本身。gydF4y2Ba

除了从肠道粘膜释放唾液酸,细菌的唾液酸酶活性会干扰宿主细胞表面糖基化,如居民免疫细胞。唾液酸在主机聚糖通常是保护从乳沟通过O-acetylation肠道细菌的唾液酸酶(gydF4y2BaCorfield et al ., 1993gydF4y2Ba)。唾液酸O-acetylation在胃肠道(尤其普遍gydF4y2Ba维瑟et al ., 2021gydF4y2Ba)。的gydF4y2Bab . vulgatusgydF4y2Ba无论如何,唾液酸酶应用在我们的研究中能够把唾液酸从肠道粘膜,增加机构绑定如图所示,从固有层DCs。MAL II绑定的损失发现sialidase-treated DCs证实的偏好gydF4y2Bab . vulgatusgydF4y2Ba唾液酸酶对α2 3-linked唾液酸,这是突出代表siglec配体(gydF4y2BaGonzalez-Gil Schnaar, 2021gydF4y2Ba)。siglec配体表达的减少可能因此导致降低的immune-damping活动的上下文中siglecs DSS-induced结肠炎,从而增加炎症反应中观察到小鼠唾液酸酶活性增加。唾液酸酶活动的意义丰富的siglec配体,因此潜在的免疫调节siglecs已经polybacterial脓毒症(所示gydF4y2Ba陈et al ., 2011gydF4y2Ba),gydF4y2Ba链球菌引起的肺炎gydF4y2Ba感染(gydF4y2BaChang et al ., 2012gydF4y2Ba)。值得注意的是,哺乳动物的唾液酸酶也被与调节肠道炎症有关。的host-encoded唾液酸酶NEU3已被证明通过desialylation引发结肠炎肠碱性磷酸酶,导致的解毒细菌脂多糖(gydF4y2Ba杨et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba杨et al ., 2021gydF4y2Ba)。内生的感应gydF4y2BaNeu3gydF4y2Ba表达式可能会因此也为整体贡献分析唾液酸酶活动中观察到小鼠补充gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2表达Sia-ase。gydF4y2Ba

被证明能增加肠道炎症fucosylation小肠,导致增加释放岩藻糖到肠道流明(gydF4y2Ba皮卡德et al ., 2014gydF4y2Ba)。这增加了可用性的海藻糖减少毒性基因的表达和变弱结肠炎引起的gydF4y2Ba枸橼酸杆菌属rodentiumgydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba范教授et al ., 2014gydF4y2Ba),可能通过细菌组成的变化。增加粘膜fucosylationα1老年病,结果2-fucosyltransferase 2gydF4y2BaFut2gydF4y2Ba基因在肠道上皮细胞(gydF4y2BaGoto et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba皮卡德et al ., 2014gydF4y2Ba)。有趣的是,gydF4y2Bar . gnavusgydF4y2Bafucosidase ATCC_03833应用在我们的研究中主要是劈开α1 2-linked岩藻糖,FUT2酶的产品,但是我们没有观察到任何fucosidase活动增加的影响在治疗小鼠结肠炎的严重程度gydF4y2Ba。gydF4y2Ba这种没有任何效果观察到小鼠fucosidase活动增加可能与结肠癌fucosylation水平不变,在炎症局部与老年病的报道gydF4y2BaFut2gydF4y2Ba在小肠(gydF4y2BaGoto et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba皮卡德et al ., 2014gydF4y2Ba)。也,观察小鼠唾液酸酶活性增加,增加fucosidase活动并没有改变治疗组之间的细菌组成,表明结肠炎的严重程度并不影响微生物成分本身在我们的小鼠模型。而fucosidase活动可能影响fucosylated聚糖对宿主细胞的完整性,消除岩藻糖预计不会改变siglec绑定,虽然需要额外的工作来证实这种解释。此外,其他多糖的修改,如硫酸盐化作用是突出发现肠道粘液(gydF4y2BaBenjdia et al ., 2011gydF4y2Ba),还应该研究更好地理解主机粘液和mucin-degrading细菌之间的相互作用。因此,超出了GH活动调查在我们的研究中,老鼠的补充与重组gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2表达carbohydrate-active酶可广泛应用于评估的功能意义进一步活动包括glycosulfatases sialate O-acetylesterases和己糖胺酶在结肠糖基化的改造和多糖carbohydrate-binding信号蛋白配体。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

小鼠急性结肠炎模型gydF4y2Ba

所有的动物实验研究中进行符合瑞士动物保护条例和苏黎世的兽医办公室批准,瑞士。C57BL / 6 8 - 10周大雄性老鼠服用新霉素(1 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),万古霉素(0.5 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),氨苄青霉素(1 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和阿斯巴甜(0.2%,w / v,σ)饮用水2天。在此期间,老鼠强饲法每日150µL抗生素溶液含有新霉素(1 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),万古霉素(0.5 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),氨苄青霉素(1 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和甲硝唑(1 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和阿斯巴甜(0.2%,w / v,σ)。经过1天的恢复,老鼠强饲法在连续两天250µL (5 ? 10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})的重组gydF4y2BaEgydF4y2Ba。gydF4y2Ba杆菌gydF4y2Ba在PBS EHV2悬挂。老鼠接受3.5% (w / v)的DSS(分子量36-50 kDa,议员生物医学)饮用水中5天,紧随其后的是正常水直到安乐死的供应有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba吸入12天或体重达到阈值时的起始重量的85%。建立和DSS治疗都是在三个独立的实验。gydF4y2Ba

糖苷水解酶化验gydF4y2Ba

底物特异性纯化gh的化验使用比色基质4-nitrophenyl (NP) -α-gydF4y2BadgydF4y2Ba-xylopyranoside (Carbosynth) 4-NP-β-gydF4y2BadgydF4y2Ba-xylopyranoside(σ),4-NP-α-gydF4y2BalgydF4y2Ba-arabinopyranoside (Carbosynth) 4-NP-β-gydF4y2BalgydF4y2Ba-arabinopyranoside (Carbosynth) 4-NP-α-gydF4y2BalgydF4y2Ba-rhamnopyranoside(σ),4-NP-α-gydF4y2BalgydF4y2Ba-fucopyranoside (Carbosynth) 4-NP-β-gydF4y2BalgydF4y2Ba-fucopyranoside (Carbosynth) 4-NP-α-gydF4y2BadgydF4y2Ba-mannopyranoside (Carbosynth) 4-NP-β-gydF4y2BadgydF4y2Ba-mannopyranoside (Carbosynth) 4-NP-α-gydF4y2BadgydF4y2Ba吡喃葡萄糖苷(σ),4-NP-β-gydF4y2BadgydF4y2Ba吡喃葡萄糖苷(σ),4-NP-α-gydF4y2BadgydF4y2Ba-galactopyranoside(σ),4-NP-β-gydF4y2BadgydF4y2Ba-galactopyranoside (Carbosynth) 4-NP N-acetyl-α-gydF4y2BadgydF4y2Ba氨基葡萄糖(Carbosynth) 4-NP N-acetyl-β-gydF4y2BadgydF4y2Ba氨基葡萄糖(σ),4-NP N-acetyl-α-gydF4y2BadgydF4y2Ba培养(σ)和4-NP N-acetyl-β-gydF4y2BadgydF4y2Ba培养(σ)。细胞溶解产物的重组gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和鼠标盲肠流体在16000 x g离心20分钟在4°C和上层清液用于GH活性测定。化验4-NP-substrates由10µL上层清液,50µL 7毫米4-NP-carbohydrate衬底和190µL 100毫米磷酸钠缓冲区,pH值6.5。样本在37°C孵化30分钟和化验停止通过添加冰冷的500毫米250µL NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba,pH值10.5。使用微型板块裂解4-NP检测在405 nm读者(Tecan无限M200 Pro)。对唾液酸酶活力测定,10µL上层清液是孵化190µL 0.1毫米fluorogenic衬底2》——(4-methylumbelliferyl) -α-D-N-acetylneuraminic酸(4 mu-neunac Carbosynth) 100毫米Tris-Cl缓冲区,pH值7.4 15分钟在37°C。分析了800年的冰冷的µL 500毫米的NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba之前,pH值10.5,进一步稀释40倍荧光测量的标(Tecan无限M200 Pro)的激发波长360 nm和发射波长440 nm)。gydF4y2Ba

Transepithelial渗透性试验gydF4y2Ba

小鼠禁食4 h和600毫克公斤填喂法gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}体重的FITC-dextran(3000 - 5000兆瓦,σ)。1小时后,全血通过心脏穿刺收集使用氯胺酮麻醉65毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(Vetoquinol AG)、甲苯噻嗪13毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(Graeub AG)、乙酰丙嗪2毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(Arovet AG)和允许血栓在室温下30分钟(RT)。血清离心后收集在1500年gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C为20分钟。血清荧光测量使用multi-detection标(Tecan无限M200 Pro)激发波长的发射波长485 nm和535 nm。Autofluoresence减去通过测量血清的未经处理的血清的荧光。gydF4y2Ba

细菌的DNA分离和定量PCRgydF4y2Ba

DNA分离出粪球使用QIAamp DNA凳子迷你包(试剂盒)根据制造商的说明病原体检测。总细菌的拷贝数16 s rRNA由qPCR决定使用的寡核苷酸5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA a - 3”(515 f)和5′广汽TAC CAG GGT ATC TAA条t - 3”(805 r) (gydF4y2BaWasimuddin et al ., 2020gydF4y2Ba)混合KAPA SYBR快速掌握混合(σ)和放大CFX95触摸™实时系统(BioRad)。在95°C条件50周期为30°s 56°C 50年代在95°C初始变性后3分钟。23日的总反应体积µL包含2µL精胺(σ)溶解在ddHgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO浓度为0.16 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}为了克服由DSS(聚合酶抑制gydF4y2BaKrych et al ., 2018gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

糖苷水解酶的分子克隆和净化gydF4y2Ba

的BVU_4143唾液酸酶从gydF4y2Ba拟杆菌vulgatusgydF4y2Ba(UniProt A6L7T1)从pET16b subcloned表达载体(Novagen)生成之前(gydF4y2Ba黄et al ., 2015gydF4y2Ba)为组成型表达向量pSF_OXB20(σ),变成了gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2 (gydF4y2Ba黄et al ., 2015gydF4y2Ba)。的BT_1001 rhamnosidase从gydF4y2Ba叫多形拟杆菌gydF4y2Ba(UniProt Q8A916)的PCR克隆gydF4y2Ba亚种gydF4y2Ba基因组DNA的寡核苷酸BT_1001 5′atagydF4y2BaCTC呕吐gydF4y2BaATG ATA CTT TTG GGT GCC TTG柠檬酸TTG 3 G′和BT_1001牧师5′ATAgydF4y2BaGGA移行细胞癌gydF4y2BaCTA CAA ACG ATA GGT AAC AAT有条件现金援助TTC-3′,介绍gydF4y2BaXhoIgydF4y2Ba和gydF4y2BaBamHIgydF4y2Ba用于克隆pET16b。PCR条件34周期10 s在98°C, 20年代在64°C, 1分钟在72°C和5分钟后在72°C最终伸长初期变性30年代的98°C。的fucosidase ATCC_03833从gydF4y2Ba瘤胃球菌属gnavusgydF4y2Ba(UniProt A7B8B7)也克隆了PCR从基因组DNA使用寡核苷酸RGN_16710 5′atagydF4y2BaCTC呕吐gydF4y2BaAAT CAG棉酚ATA TGG AAT CGG ACC-3′和RGN_16710转速5′CAGgydF4y2BaGGA移行细胞癌gydF4y2BaTCG手枪GTA亚美大陆煤层气有限公司太极拳答到达目标时间TTC-3′包括gydF4y2BaXhoIgydF4y2Ba和gydF4y2BaBamHIgydF4y2Ba网站的克隆pET16b。PCR条件30周期10年代在98°C, 20年代在64°C, 40年代在72°C和5分钟后在72°C最终伸长初期变性30年代的98°C。基于pET16b的结构变成了gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3)细胞(表达载体)LB培养基中培养与氨苄青霉素(100μg /毫升)补充37°C。在达成ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}0.6蛋白质的表达是通过添加β-异丙酯诱导gydF4y2BadgydF4y2Ba1-thiogalactopyranoside 1毫米的最终浓度和孵化细菌在37°C 4 h。细菌被离心收获3000gydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟。导致细胞颗粒在50 mM Tris-HCl resuspended, 100毫米氯化钠+ 20毫米咪唑和lyzed声波降解法(数字声波降解器,布兰森)。溶菌产物与镍琼脂糖孵化6快流(通用电气医疗集团生物科技AB,乌普萨拉)一夜之间在4°C,与50 mM Tris-HCl洗,100毫米氯化钠+ 40毫米咪唑和筛选了50 mM Tris-HCl, 100毫米咪唑氯化钠+ 500毫米。蛋白质透析使用Pur-A-Lyzer™马克西透析工具包(MW切断:6 - 8 kDa,σ)对一个包含50 mM Na的缓冲区gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba一夜之间,100毫米氯化钠和0.005% Tween20在4°C。所有gh sublcloned pET16b pSF_OXB20使用gydF4y2BaNcoIgydF4y2Ba(ThermoScientific)和gydF4y2BaBamHIgydF4y2Ba(ThermoScientific)。组成型表达向量pSF_OXB20包含三个gh变成了gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEHV2小鼠口服填喂法。gydF4y2Ba

炎症标志物信使rna定量PCRgydF4y2Ba

使用Precellys小鼠结肠组织均质gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba24组织均质器(贝尔坦公司仪器)和RNA分离使用试剂盒试剂(σ)根据制造商的指示。总RNA(1µg)反向转录使用高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司™)根据制造商的指示。为定量PCR反应KAPA SYBRgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba快(σ)掌握混合使用和放大CFX95触摸™实时系统与每个100纳米以下引物:伊诺:5′agc CTT GCA太极拳柠檬酸TTG GG-3 ';伊诺牧师:5′有条件现金援助TTG AGC有条件现金援助TTG TGC TG-3 ';TNFα:5′ggc CTC有条件现金援助CTC ATC AGT TC-3 ';TNFα牧师:5′cac TTG GTG GTT TGC TAC GAC-3 ';IL-1β:5′gct GGA GAG TGT GGA太极拳创新艺人经纪公司三大”;IL-1β牧师:5′tgc TGA TGT ACC AGT TGG GG-3 ';il - 6: 5′cac GGC CTT CCC TAC TTC AC-3 ';il - 6牧师:5′gcc ATT GCA CAA CTC TTT TCT颈- 3 ';TGFβ:5′-TGG AGC AAC ATG TGG AAC TC-3”: TGFβ转速:5′gtc AGC CGG TTA CCA-3”;Occludin: 5′ccc TGA CCA CTA TGA AAC AG-3 '; Occludin rev: 5′-TTG ATC TGA AGT GAT AGG TG-3’. After an initial denaturation at 95°C for 3 min, cycling conditions were 50 cycles at 95°C for 10 s and 60°C for 30 s. The ∆∆c_tgydF4y2Ba方法应用于分析相对基因表达与β-actin标准化参考和未经处理的小鼠样本作为控制样本。为了克服聚合酶抑制的DSS, 5µL精胺(σ)溶解在ddHgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO浓度为0.16 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}添加到20µL逆转录反应总额和qPCR反应(gydF4y2BaKrych et al ., 2018gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

结肠组织的组织学评分gydF4y2Ba

小鼠结肠组织固定在10%中性缓冲福尔马林(σ)24 h和嵌入在石蜡。组织样本切成5µm厚部分,deparaffinized和苏木精和伊红染色(σ)。组织学变化是得分分别由一个独立的调查员蒙蔽的部分来源如下:正常的上皮细胞形态(0),孤立的杯状细胞的损失(1),杯状细胞的损失在很大区域(2),失去了孤立的隐窝(3),隐窝在大区域(4)的损失。白细胞浸润也分级不渗透(0),渗透在地下室基础(1)渗透直达gydF4y2Ba板粘膜肌层gydF4y2Ba(2)广泛的渗透到达gydF4y2Ba板粘膜肌层gydF4y2Ba和增厚的黏膜水肿(3)丰富,渗透的gydF4y2Ba板黏膜下层gydF4y2Ba(4),总分代表上皮和渗透分数之和。gydF4y2Ba

组织化学gydF4y2Ba

孤立的结肠组织紧紧卷起在本身(蛋糕)组织学盒式和孵化2 h在methacarn RT(60%甲醇、30%氯仿和10%乙酸)固定解决方案保存黏液层(gydF4y2Ba费尔南德斯et al ., 2019gydF4y2Ba)。组织随后在甲醇洗1 h,脱水和paraffinized。deparaffinization和补液后,部分5µm厚度被封锁与0.5%的明胶(σ)Carbo-free™屏蔽解决方案(向量实验室)1 h RT,紧随其后的是染色μg 15毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}向量的fluorescein-labelled机构(实验室)和0.1μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DAPI(σ)的溶液中含有1 x Carbo-free™屏蔽解决方案和1 x凝集素染色缓冲区组成的110毫克LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(σ),200毫克LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(σ)和200毫克LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}MnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bax 4 HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO(σ)为1 h RT在黑暗中。对于siglecs的染色,组织部分受到抗原检索用20分钟在柠檬酸缓冲液pH值6.0。组织部分被孵化一夜200µL纯Sia-ase(34μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})或PBS为负控制阻塞后沿Carbo-free™屏蔽解决方案1 h RT, 5μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}siglec-10 (RD系统)或5μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}siglec-E (RD系统)与荧光标记的第二抗体,山羊F (ab) 2反IgG-Fc DylightgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba550 (Abcam)或PE anti-mouse IgG2a抗体(BioLegend),分别为1 h RT在黑暗中与1:10 0的稀释。组织部分被沾siglec-secondary抗体复合物1 h RT在黑暗中。荧光收购使用徕卡显微镜DMi8×20目的。使用ImageJ量化执行机构信号(gydF4y2Ba施耐德et al ., 2012gydF4y2Ba)。机构的信号是由同样大小的选择区域的黏液层。平均机构强度之后,使用一个阈值计算的四个排除背景。gydF4y2Ba

固有层白细胞的隔离gydF4y2Ba

孤立结肠组织三次被哈佛商学院(Gibco)含有2%的边后卫,然后在1毫米孵化德勤(热科学)在哈佛商学院2%的边后卫在37°C下不断搅拌15分钟。组织培养在哈佛商学院2%的边后卫5毫米EDTA(σ)15分钟在37°C下不断搅拌。这个过程被重复两次用新鲜的缓冲区。组织切成小块和孵化RPMI (Gibco),含有2%的边后卫和3毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}胶原酶IV型(σ)和孵化10分钟37°C下不断搅拌。酶消化了通过添加冰冷RPMI 2%的边后卫。细胞悬液于100年首先透过μm细胞过滤器(格林尼),后跟一个40μm细胞过滤器(Falcon)。在350 x g细胞离心10分钟在4°C和resuspended RPMI 10 2%的边后卫的密度1.5gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

流式细胞术gydF4y2Ba

细胞与固有层(1.5十gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})处理50µL纯Sia-ase(34μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})为2 h RT RPMI 2%的边后卫。唾液酸酶反应是停止增加三倍的冰冷的RPMI 2%的边后卫。在350 x g细胞离心10分钟在4°C和resuspended流式细胞仪缓冲区(PBS, 2%的边后卫,5毫米EDTA)或凝集素染色缓冲区(PBS, 1%的边后卫,0.1毫米氯化钙)。细胞首先封锁TruStain FcX™+ anti-mouse CD16/32 (BioLegend)(1:10 0) 15分钟在冰上。5点Siglec-Eμg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(研发系统)和siglec-10μg 5毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(研发系统)被耦合到二次抗体PE anti-mouse IgG2a (BioLegend)或PE反人类免疫球蛋白Fc (BioLegend),分别用1:10 0的稀释30分钟在RT在黑暗中。生物素化的凝集素MAL IIμg 5毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(向量实验室)是第一耦合FITC链霉亲和素1:10 0 (BioLegend) 30分钟在rt,细胞被孵化冰与siglec-Fc调查了40分钟,其次是20分钟孵化与凝集素组成的专家小组,其余染色violet-fluorescent活性染料(表达载体,1:1,000)CD11c (BioLegend 1:10 0)、CD45 (BioLegend 1:200), MHC II (BioLegend, 1:10 0)和外源凝集素系统网络体系结构(SNA) 5μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(向量实验室)。孵化后,细胞用流式细胞仪缓冲或凝集素染色缓冲区,在350 x g离心10分钟在4°C和200年resuspendedµL流式细胞仪缓冲区或凝集素染色缓冲区。样品进行了分析与BD FACSCanto™II流式细胞分析仪(BD生物科学)。gydF4y2Ba

新一代测序gydF4y2Ba

细菌DNA分离粪便满意QIAamp快速DNA凳子迷你包(试剂盒)和放大,使用改进后的引物针对V4-V5地区16 s核糖体基因(515 f;5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′926 r;5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′)。对扩增子PCR总量25μL,包含7µL分子级的水,2µL精胺(σ)为0.16 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},12.5µL KAPA HiFI HotStart ReadyMix(罗氏),1.25µL的正向和反向引物的浓度10µM大约10 ng细菌DNA。骑自行车在95°C条件3分钟紧随其后的是25的循环20年代在98°C, 30年代在56°C, 25 s在72°C,然后由最后一个扩展为1分钟72°C。结果PCR产品纯化使用撒磁珠(AMPure XP,贝克曼库尔特)根据制造商的协议的0.8倍体积的比率AMPure XP珠子每卷PCR产物。接下来,纯化扩增子DNA dual-indexed使用Nextera XT指数工具集a .索引PCR总量是25μLµL纯化PCR产品包含7.5,12.5µL KAPA HiFI HotStart ReadyMix(罗氏),2.5µL每个索引1和索引2。循环条件如下:第一步为3分钟95°C随后12个周期的20年代在98°C, 30年代在55°C。25 s在72°C 1分钟在72°C。索引PCR产品立即净化与AMPure XP珠子0.8倍体积的比率AMPure XP珠子每个卷的PCR产物。库被规范化为2纳米,汇集,变性0.2 N氢氧化钠,稀释HT1杂交缓冲(Illimuna, Inc .)最后一个晚上8点的浓度。PhX测序控制(Illumina公司,Inc .)成立总浓度的12.5点。PhiX在8点库。 Sequencing was carried out on an Illumina MiSeq FGx sequencing platform (Verogen, Inc.) with the MiSeq Reagent kit V3 (Illumina, Inc.), generating paired-end reads of 2 × 300 bp. The raw reads were processed using Cutadapt (v3.7) (马丁,2011gydF4y2Ba)去除引物序列,其次是质量控制和去噪与DADA2 (1.18) (gydF4y2Ba卡拉汉et al ., 2016gydF4y2Ba)。DADA2的参数如下;truncLen:向前读:260,逆向阅读:240;maxN: 0;maxEE: 2.2;truncQ: 2和rm。phix:没错。分类任务是使用破解对席尔瓦四r138(2019)数据库,直到属水平。扩增子序列变异的丰度表(asv)和分类任务导入phyloseq (gydF4y2BaMcMurdie和福尔摩斯,2013gydF4y2Ba下游稀疏),α和β多样性分析。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA901913gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

综述了动物研究和苏黎世的兽医办公室批准。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

研究设计和构思,获得了资金。那表现,分析了实验和准备数据。SG和MH加工和分析组织的组织学。女士,MG, NA,获得和分析16 s测序数据。LT-G THa和流式细胞仪进行实验。那写的手稿。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究收到瑞士国家基金会拨款资助314730 _172880和314730 _212231和诺华FreeNovation。投资者没有参与这项研究设计、收集、分析、解释数据,本文的写作或提交出版的决定。所有作者声明没有任何利益冲突。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmolb.2022.1075459/full补充材料gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba