先进的评估通过完整的糖肽分析英夫利昔单抗的生物制剂和生物仿制
Hyejin金
1、2
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Geul爆炸
1、3
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誉恩公园1,Moonhee公园4,荣格胡恩崔4,
文金哦
5、6,
Hyun Joo一
5、6,郑大世Shin柳1、6,
Youngja黄公园
1、3
*,金年轻的金1*和
Heeyoun黄
1*- 1Bioconvergence分析研究中心、韩国基本科学研究所,所领导,韩国
- 2生物和大脑工程系、韩国先进科学技术研究所、韩国大田市
- 3代谢组学实验室、药学院、韩国大学世宗,韩国
- 4生化分析,韩国基础科学研究院、所,韩国
- 5分析科学与技术,研究生院忠南国立大学,韩国大田市
- 6忠南国立大学亚太作者参考网站,韩国大田市
描述的治疗性单克隆抗体(mab)代表一个重大的挑战分析科学由于其异质性与转录后修饰(天车)。蛋白质糖基化需要全面的识别,这可能影响马伯的结构及其功能。这里,我们展示了高分辨率与终极高性能液相色谱串联质谱表征和比较生物学和生物仿制英夫利昔单抗的先进水平。比较和N - O-glycopeptides概要文件,共有49和54糖肤被确认为每个产品的生物制剂和生物仿制,分别。我们还发现一本小说N-glycosylation网站在轻链生物制药和一个小说O-glycopeptide只有生物仿制的重链。特有的糖肽分析过程将是一个强大的和有用的技术来评估治疗马伯和复杂的糖蛋白产品。
介绍
生物仿制药品被定义为生物医药产品非常相似,没有从现有参考产品临床有意义的差异。在过去的10年,创建全球生物仿制药物增加了为了减少财政负担相关的医疗体系与发起人进行昂贵的生物药物。生物制剂和生物仿制产品代表非均匀变异表现为糖基化的差异,氧化、糖化,聚合状态和脱酰氨基作用。蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,改变属性,包括药物动力学(PK)药效学(PD)效应函数,溶解度和稳定性(阿诺德et al ., 2007;刘,2015;Higel et al ., 2016)。即便是轻微的糖基化模式的差异也会引起免疫原性;因此,糖基化的一致性是必要的证明药物的安全性和有效性,以确定是否为候选人非常类似于参考产品。例如,存在高甘露糖型N-glycans治疗马伯导致降低人类(半衰期戈艾滋et al ., 2011)。N-glycolyl-neuraminic酸(NeuGc),非人类哺乳动物中发现的唾液酸,可以导致人类的免疫反应(Padler-Karavani Varki, 2011)。因此,糖基化的比较生物制剂和生物仿制产品是至关重要的,以确保类似的疗效和安全性水平(Pisupati et al ., 2017)。
评估治疗马伯,多糖分析与质/女士用的释放方法从蛋白质N -和O-glycans peptide-N-glycosidase F (PNGase F)和碱性β-elimination,分别。然而,这样的分析不能提供信息在蛋白质糖基化的网站,因为他们执行马伯的裂解聚糖(Fekete et al ., 2016)。在另一方面,自顶向下的方法是通过分析完整的蛋白质糖基化使用质只提供信息的水平总糖基化(Fekete et al ., 2016;Zhang et al ., 2016)。第三,middle-down方法,分析蛋白质片段;马伯治疗与免疫球蛋白G-degrading酶裂开重链低于铰链区或二硫苏糖醇(DTT)减少二硫键。middle-down分析往往导致蛋白质片段与高质量,更少的多糖成分可以区分由于缺少决议相比与其他质谱(MS)的方法(De Leoz et al ., 2020)。最后,糖肽分析被认为是一个自底向上的方法,产生的糖肤酶消化使用质或MALDI-MS糖蛋白进行了分析。串联分析糖肤女士,特别是,可以揭示糖基化位点,多糖成分,多糖结构(Desaire 2013;Zhang et al ., 2016;哦,et al ., 2022)。
英夫利昔单抗是一种代表马伯,与目标肿瘤坏死因子α(TNF-α)治疗自身免疫性疾病,如类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、成人斑块性银屑病,小儿和成人溃疡性结肠炎和克罗恩病(Scallon et al ., 2002;Willrich et al ., 2015)这种药物是基于小鼠变量地区和人类Fc地区Sp2/0 IgG1表达的细胞系。有一个N-glycosylation网站Fc地区英夫利昔单抗(李et al ., 2017)。在先前的研究中,28多糖形式被确定在英夫利昔单抗(Pisupati et al ., 2017)。
在这项研究中,N-linked糖基化的生物制剂和英夫利昔单抗生物仿制,分别分析了在糖肽水平与关注通过串联女士光谱分析多糖成分。基于数量的确定糖肽谱匹配(gsm),英夫利昔单抗的发起人和生物仿制比较定量评估它们的相似性。
材料和方法
样品制备
每5个批次的英夫利昔单抗生物制剂的Remicade®(很多# GBL15016, GGL49016、GKL81014 HEL20014, ICL88011,詹森)及其相应的生物仿制Remsima®(很多# 14 b1c002ba1 15 b1c01ba1 15 b1c05ba1 15 b1c07ba1,和18 b1c23ba1 Celltrion)是在水中溶解和稀释达到20μg /μL的浓度。随后,50μl这种药物的解决方案是buffer-exchanged成50毫米碳酸氢铵(ABC, 1066 - 33 - 7, Sigma-Aldrich)缓冲区使用10 kDa MWCO Amicon超离心过滤器(UFC501096,微孔)。每种药物是量化量子位蛋白质分析工具包(Q33212英杰公司)然后用50 mM ABC稀释缓冲实现1μg /μL的浓度。然后,30μg样本变性5分钟在90°C。样本,减少1 20毫米,4-dithiothreitol(德勤,3483-12-3,Sigma-Aldrich) 1 h 60°C,烷基化和40毫米碘乙酰胺(IAA, 114-48-9, Sigma-Aldrich) 45分钟在室温下在黑暗中,并与1.5μg胰蛋白酶消化(V528A Promega)一夜之间在37°C。随后,胰蛋白酶的肽被SpeedVac干。浓缩的糖肤进行ZIC-HILIC ProteoExtract®糖肽富集工具包(72103 - 3,Novagen)按照制造商的协议和SpeedVac干。干糖肤治疗马伯的溶解在30μl H2O / (99.9:0.1 v: v)。
纳米LC-ESI-MS / MS分析
nano-flow超高性能液相色谱(UHPLC)系统(EASY-nLC™1200系统,热费希尔科学、圣何塞、钙、美国)耦合热科学Orbitrap融合Tribrid™质谱仪是用于所有实验的分析英夫利昔单抗糖肤。两个或两个5μl胰蛋白酶的糖肤(1μg /μl)注入和分离EASY-Spray PepMap™RSLC C18柱ES803A(2μm, 100 A, 75μm×50厘米,热费希尔科学),在40°C。从5%到95%的流动相梯度B应用超过90分钟的流量250 nL /分钟;流动相是H2O / FA (99.9:0.1 v: v)和B流动相乙腈/ H2O / FA (80:19.9:0.1 v v: v)。ESI电压1800 - 1850 V,离子传输管温度为275°C。
UHPLC-MS / MS数据是基于视榜单模式,由一个全扫描,最大化一份扫描的数量超过3 s的周期时间。全扫描(MS1) Orbitrap分析仪检测的分辨率为120 K,质量范围350 - 2500 m / z。自动增益控制(AGC)目标值是4 e5,最大注射时间是100 ms,包括电荷状态2 - 10。第二次扫描(一)包括HCD-triggered CID EThcD模式。HCD光谱被Orbitrap分析仪检测的分辨率30 K,固定碰撞能量的30%。最大注射时间是54女士,隔离窗口大小是2,AGC目标值是5 e4,和固定的第一质量是110 m / z。如果HexNAc和碎片离子HexNAc(204.0872, 126.0550, 138.0555, 168.0661,和186.0766 m / z)发现了至少一次或两次,然后CID EThcD一份在同一前体离子被触发。CID和EThcD光谱Orbitrap分析仪检测到的30 K的一项决议,54女士的最大注射时间,隔离2的窗口大小和AGC目标5 e4的价值。CID碰撞的能量35%,执行和执行EThcD SA碰撞能量的15%,对超过100 ms。
数据分析
糖肽的分析、原始文件转换为ms1和一份RawConverter(美国斯克里普斯研究所)(他et al ., 2015年)。构建GPA 2.0数据库、蛋白质组搜索是由整合蛋白质组学平台(IP2)女士数据分析(力量,马萨诸塞州,美国)。以下IP2参数使用:DBs混合序列的基础上,英夫利昔单抗(思路™马伯英夫利昔单抗,MSQC9, Sigma-Aldrich,密苏里州,美国),人类免疫球蛋白和全鼠标蛋白质(Uniprot,下载2019)前体/肽质量公差是10 ppm,片段质量公差是20 ppm,内部没有分裂的最大数量是1。半胱氨酸残基被搜查了与静态修改carboxyaminomethylation(+ 57.02146)和微分修改蛋氨酸氧化。多肽/蛋白质的最小数量是2,和假阳性率为0.01在光谱的水平。
特定场地N -和O-glycopeptides被GlycoProteome分析仪(GPA) 2.0 (KBSI、韩国)(公园et al ., 2016,2020年),确定蛋白质的糖肽DBs生成结合351 N-glycans和11 O-glycans (公园et al ., 2016,2020年;黄et al ., 2020;李et al ., 2020)。以下参数的平均绩点2.0使用:N -和O-glycopeptide搜索是“允许”多个糖基化站点“不允许”,一份噪声阈值为2.0,前体和HCD质量公差是0.02哒,CID和要领质量公差是0.05 Da, Y-score阈值是60.0。分析后,确定糖肤回馈他们相应的前身质量误差与PPM。为了量化确定糖肤,我们使用了一个内部程序编码由Python 3.8中提取和总结的强度M M M + 1, + 2从相应的色谱同位素分布。评估相似糖基化的发起者和生物仿制,皮尔森相关系数的计算是一个内部程序,编写的python(版本2.7)使用熊猫模块(版本0.24.2,https://pandas.pydata.org/)。
结果
识别位点专一的N -和O-glycopeptides英夫利昔单抗
英夫利昔单抗是一种转基因马伯,四聚物的糖蛋白,由两个灯和两个沉重的锁链。一个简单的原理图与糖蛋白英夫利昔单抗,重链和轻链构造。根据先前的研究,有一个N-glycosylation站点位于Fc区域(图1一个)(Pisupati et al ., 2017)。在这项研究中,我们已经表明,利用串联质谱的糖肤可以用于特定的糖基化分析和量化英夫利昔单抗。一个流程图开发的工作流分析N -和O-glycopeptides英夫利昔单抗的发起人和生物仿制。(图1 b)。5批次的发起者和准备评估特定站点的相似性为糖基化使用皮尔逊相关系数基于糖肽谱匹配(gsm)的数量。糖肤准备通过胰蛋白酶消化和HILIC浓缩,然后质/ MS分析。N -和O-glycopeptides可以确定使用GPA 2.0处理程序。糖肤用肽序列,其单糖组成的数量己糖(十六进制)、n -乙酰氨基己醣(HexNAc),海藻糖(Fuc) N-acetylneuraminic酸(NeuAc) N-glycolylneuraminic酸(NeuGc)如下;肽sequence_ # Hex_ # HexNAc_ # Fuc_ # NeuAc_ # NeuGc,例如EEQYNSTYR_4_3_1_0_1。
图1。英夫利昔单抗的实验策略和分子结构的概述。(一)英夫利昔单抗的图解说明。重链和蓝线表示,和光线连锁店以黄线表示。(B)glycoproteome工作流分析N -和O-glycopeptides英夫利昔单抗。
在以前的报告中,N-glycopeptide只是位于N300 Fc的位置区域(Pisupati et al ., 2017)。这里,我们确定的糖肽不仅N300网站,而且N41站点(表1,补充表S1和2)。共有49和54糖肤被确定在生物学和生物仿制两个站点,分别。N41网站,5和7 N-glycopeptides(32 - 149光谱)被确定在生物制剂和生物仿制,分别和core1类型O-glycosylation THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK(226 - 251)的氨基酸被发现只有在生物仿制。(补充图S2)我们还发现了12和18糖肤与NeuGc(618年和678年光谱)(补充表S5),4和3糖肤(23和34光谱)包含NeuAc生物制剂和生物仿制,分别。图2显示代表串联光谱与NeuAc N-glycopeptide EEQY300年NSTYR_4_3_1_1_0, N-glycopeptide NeuGc EEQY300年NSTYR_4_3_1_0_1。这些肽序列是相同的,但只有唾液酸的多糖不同。我们证实,碎片离子显然是匹配如下:EEQY300年NSTYR_4_3_1_1_0山峰分配给NeuAc (m / z292.1027)和NeuAc-H2O (m / z在HCD谱(274.0921)图2一个)。另一方面,EEQY300年NeuGc NSTYR_4_3_1_0_1有其碎片离子(m / z308.0976)和NeuGc-H2O (m / z在HCD谱(290.0870)图2 b)。这些氧鎓离子被用于诊断,以确定哪些唾液酸是包括在内。因为肽序列和多糖结构没有唾液酸的两个糖肤一样,Y离子由糖苷乳沟CID谱几乎是相同的。一些多糖片段离子被观察到在CID谱比HCD光谱,在那里,他们含有唾液酸氧鎓离子与大分子量等m / z657.236和m / z673.232。
表1。确定N-glycopeptides和糖基化网站从串联英夫利昔单抗的光谱。
图2。代表串联光谱N-glycopeptides NeuAc和N-glycopeptides NeuGc Fc地区英夫利昔单抗。(一)EEQY300年NSTYR_4_3_1_1_0 (m / z 962.38, 3 +)(B)EEQY300年NSTYR_4_3_1_0_1 (967.71 m / z, 3 +)。
在N41网站,只有混合动力型和高甘露糖型糖基化表达,与N300网站(补充图S1, S2)。两个的糖肤N41位于轻链所示图3。HCD光谱,七氧鎓离子,5 Y离子,1 T Y离子礼物41NN-glycopeptide GSPR_6_3_0_0_0,混合类型(图3一)。HCD频谱中,七个氧鎓离子,九个Y离子,2 Y离子明显证明糖肽分裂模式高甘露糖型N-glycopeptide T41NGSPR_7_2_0_0_0 (图3 b)。CID谱Y离子是顺序匹配。
图3。代表串联光谱混合类型的小说N-glycopeptide从英夫利昔单抗和high-mannose类型。(一)T41NGSPR_6_3_0_0_0 (m / z 738.63, 2 +)的混合类型N-glycopeptide和(B)T41NGSPR_7_2_0_0_0 (m / z 1086 .93点,2 +)的high-mannose N-glycopeptide类型。
定量分析和评估发起人和生物仿制之间的相似度
label-free定量分析的60英夫利昔单抗糖肤,我们使用了一个内部程序(由Python 3.8编码),提取并总结强度M, M M + 1, + 2从相应的色谱同位素分布。(补充表S6、S7基于标签免费量化结果,图4显示的相对丰度排名前十的丰富的糖肤从五批生物制剂和生物仿制。排名前十位的糖肤都表示N300现场。整体定性资料的发起人和生物仿制看起来相似。最经常表示多糖是G0F(3 _4_1_0_0)和G1F N300(4 _4_1_0_0),这与先前的研究结果一致。(方et al ., 2016;Pisupati et al ., 2017)。的糖肤fucosylated, 4 10 sialylated糖肤与NeuGc附加。
图4。相对丰度分布的前10名丰富N-glycopeptides从五批Remicade®和Remsima®。
EEQY300年NSTYR和T41NGSPR包含10和3改变,分别。(图5 a, B)。微量的糖肤EEQY丰富300年NSTYR马伯相似。N300网站,最丰富的是asialo-fucosylated复杂糖肤(82.4%,发起者和88.6%,生物仿制)afucosylated高甘露糖糖肤(4.5%,发起者和为4.2%),和sialo-fucosylated复杂糖肤(3.4%,发起者和3.3%,推出)。另一方面,N41网站,afucosylated高甘露糖糖肤推出的非常高。
图5。改变配置文件的特定站点N-glycopeptides发起者(Remicade®)和生物仿制(Remsima®)。酒吧图表显示改变配置文件的比较Remicade®和Remsima®EEQY基于gsm的数量300年NSTYR(一)和T41NGSPR(B)。误差棒表示标准误差。
评估所有批次的发起人之间的相似性和生物仿制,皮尔森相关系数是计算的相对丰度(图6)。一个值接近+ 1.0意味着更好的相关性。批次之间的相似之处同样的马伯(0.93 - -0.97)高于发起者和生物仿制(0.84 - -0.94)之间的关系。因此,这些结果提出不同批次之间的相似性比英夫利昔单抗的发起者和生物仿制。
图6。一个热图显示光谱相似性发起人(Remicade®)和生物仿制(Remsima®)批次。热点图中显示的数字代表了皮尔森相关系数值。
讨论
英夫利昔单抗治疗性单克隆抗体靶向肿瘤坏死因子-α(TNFα),用于治疗炎症性疾病。英夫利昔单抗被发现有一个N-glycosylation Fc地区(Pisupati et al ., 2017),糖基化是一个非常重要的目标来分析治疗马伯,因为它影响PK, PD,效应函数,溶解度和稳定性。(阿诺德et al ., 2007;刘,2015;Higel et al ., 2016)。在这项研究中,工作流的发展分析中的糖肤治疗马伯的报道。的质/ MS方法的有效性,进行了比较分析通过识别和相对量化的特有的糖肽来英夫利昔单抗和它的推出。
英夫利昔单抗的糖基化分析,以往的研究检查本机质谱,离子迁移率和量化多糖。京方et al。(2016)显示,使用UPLC-MS N-glycan公布分析评估发起人之间的相似之处和可能的差异和推出。(方et al ., 2016)。总共有23日和21日聚糖识别对英夫利昔单抗及其生物仿制。同样,Pisupati等人发现了大约25改变Remicade®和Remsima®和观察到的改变人口的差异。(Pisupati et al ., 2017)。这些研究报告只有N-glycosylation Fc地区。在我们的研究中,我们确定了49和54 N - O-glycopeptides生物制剂和生物仿制,在那里我们发现了大约两倍数量的比Pisupati N-glycopeptide研究。此外,我们首次发现一本小说N-glycosylation站点在N41站点从轻链英夫利昔单抗和O-glycopeptide AA 226 - 251 Fc地区只有生物仿制。N41网站,5和4个混合动力型和高甘露糖型N-glycopeptides新发现,分别。在N41站点站点特定的糖基化的信息无法获得与传统方法使用多糖分析释放的蛋白质或自顶向下分析完整的蛋白质。此外,评估治疗马伯的NeuGc是很重要的。很多动物,包括牛、马、老鼠,老鼠,产生NeuGc (某个et al ., 1998)。因为人类不能由于删除胞嘧啶核苷的合成NeuGc monophospho 5′-N-acetylneuraminic酸(CMP-NeuAc)羟化酶基因(周et al ., 1998)。在这项研究中,更多的N-glycopeptides NeuGc发现比N-glycopeptides NeuAc英夫利昔单抗,和四个糖肤与NeuGc N-glycopeptides。
定量比较生物制剂和生物仿制,糖肤似乎相似的分布模式,但主要多糖的结构不同取决于糖基化位点。因此,评价糖基化的糖肽分析适合于治疗马伯与多个糖基化的网站。此外,糖基化的马伯的相似性计算的基础上糖肤使用皮尔逊相关系数的定量数据。它显示出更高的相关性比不同批次相同的马伯马伯。我们显示的特定场地分析糖肤使用串联质谱分析是有用的在生物制药评价提供更复杂的信息。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset?ID=pxd035788。
作者的贡献
HH设计和监督项目和修订后的手稿。JK和YP解释结果和编辑的手稿。香港和GB进行蛋白质组学分析和写的手稿。YP、议员和JC分析数据,调整数据,写的手稿。莫、HA和司法院收集样品和提供专业建议。所有作者的手稿提交审查和批准的版本。
资金
这项工作是支持部分由韩国基本科学研究所(D210600)。这项工作也由国家研究基金会的研究项目(NRF)由科技部资助的ICT (NRF 2021 m3h9a2097108),和韩国国家研究基金会授予由韩国政府(MSIT)(格兰特没有:联盟- 2020 - r1a2c2103067)。
确认
英夫利昔单抗的样品都是由Pf。, h . j .忠南国立大学的众议员的韩国。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmolb.2022.1006866/full补充材料
引用
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关键词:单克隆抗体、翻译修饰的超高分辨率质谱,英夫利昔单抗,糖肽
引用:金正日H,爆炸G,公园,公园,崔JH,哦,乔丹,沪江,Yoo JS,公园YH、金司法院、黄H(2022)先进的评估通过完整的糖肽分析英夫利昔单抗的生物制剂和生物仿制。前面。摩尔。Biosci。9:1006866。doi: 10.3389 / fmolb.2022.1006866
收到:2022年7月29日;接受:2022年10月26日;
发表:2022年11月29日。
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