评论文章

前面。摩尔。Biosci。,09 January 2019
秒。结构生物学
卷5 - 2018 | https://doi.org/10.3389/fmolb.2018.00112

人类丝氨酸消旋酶的能源格局

Samanta Raboni ¹,

Marialaura马²,

瑟瑞娜Faggiano ^1、3,

芭芭拉Campanini ¹,

斯特凡诺布鲁诺 ¹,

弗朗西斯科·Marchesani¹,

人Margiotta把那些可笑¹和

安德里亚Mozzarelli ^1、3、4 ^*

¹食品和药物、帕尔马、意大利帕尔玛大学
²都灵大学药物科学与技术部门,意大利都灵
³生物物理研究所,国家研究理事会,比萨,意大利
⁴国家Biostructures与生物系统、罗马、意大利

人类丝氨酸消旋酶是一种吡哆醛5′磷酸(PLP)端依赖二聚的酶,这种酶催化的可逆外消旋化L-serine D-serine和丙酮酸和氨的脱水。像D-serine co-agonist的n -甲基- d对谷氨酸受体,最丰富的大脑的兴奋性神经递质,结构、动力学、功能、调节和细胞定位丝氨酸消旋酶的详细调查。丝氨酸消旋酶属于PLP-dependent酶家族的折叠式II和结构模型从几个直接同源是可用的。丝氨酸消旋酶的比较结构co-crystallized有或没有配体表示的存在至少一个开放和封闭的构象,这表明在酶构象的灵活性扮演相关角色的监管。ATP,毫克^{2 +}、钙^{2 +}扶少团团员,阴离子,NADH和蛋白质,以及转录后修饰亚硝基化和磷酸化,精细调整消旋酶和脱水酶活动和它们的相对反应速率。进一步丝氨酸消旋酶的结构和动力学信息的搜索抑制剂与潜在的治疗应用。累积的知识对人类丝氨酸消旋酶允许获得洞察其构象效应之间的景观和相声机制的结合位点和活性部位。

介绍

NMDA (n -甲基- d)受体ligand-gated离子通道参与突触的形成,突触可塑性、学习和记忆增强作用(Paoletti et al ., 2013)。它们是唯一的神经递质受体的激活需要两个不同的受体激动剂,谷氨酸和甘氨酸或D-serine,后者的共享相同的结合位点。犬尿氨酸途径的中间体也绑定NMDA受体:喹啉酸是一个强有力的兴奋剂,而犬尿酸作为拮抗剂(Nemeth et al ., 2006;Lugo-Huitron et al ., 2013)。

水平的提高D-serine与神经会引起过多的钙离子的流入造成的,在一些病理条件下,观察到包括帕金森和阿尔茨海默病、中风和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。另一方面,低水平的D-serine与精神分裂症相关联。这些病理条件促使寻找酶在大脑中负责D-serine的生产。丝氨酸消旋酶(SR)是第一个局部星形胶质细胞和神经元。如今,普遍的观点是,D-serine发生在神经元的主要生产(Wolosker et al ., 2016)。然后,D-serine出口通过ASC-1运输车星形胶质细胞,在存储和随后公布的突触空间(Wolosker et al ., 2016)。其他分子酸,如D-aspartate D-alanine,在大脑中检测到的(桥本et al ., 1992)。消旋酶参与其生产尚未确定(孔蒂et al ., 2011)。提出了SR本身负责生产D-aspartate、门冬氨酸受体的激动剂(Ito et al ., 2016)。

SR活动取决于辅酶维生素b6 5′磷酸(PLP),与此形成鲜明对比的是与其他PLP-independent消旋酶(孔蒂et al ., 2011)。人类SR的特性(高铁)调制的活动由多个配体,蛋白质扶少团团员和转录后修饰(天车),表明重大构象可塑性。在本文中,我们将介绍老结构、动力学、功能和监管,特别强调人类直接同源,讨论酶能源格局的框架。

老结构

在七褶皱类型(PLP-dependent酶分类Grishin et al ., 1995;Jansonius 1998;梅塔和Christen, 2000;施耐德et al ., 2000;Percudani Peracchi, 2009)。传统分类PLP-dependent酶分配绾我天冬氨酸转氨酶家族,最大的和最好的家庭特征(布鲁诺et al ., 2001;菲利普斯et al ., 2002;Kaiser et al ., 2003;Storici et al ., 2004;Spyrakis et al ., 2014)。褶皱II型组包括色氨酸合成酶,O-acetylserine sulfhydrylase,苏氨酸脱氨酶和丝氨酸脱水酶(Bettati et al ., 2000;Campanini et al ., 2003;Raboni et al ., 2003,2005年,2007年,2009年,2010年;Spyrakis et al ., 2006,2013年)。细菌丙氨酸消旋酶是典型的蛋白质分子的折叠类型III和酸转氨酶家庭是最具代表性的IV型折叠子群的例子。磷酸化酶对应于褶皱类型诉褶皱类型VI和七世最近推出了包括D-lysine 5、6-aminomutase和赖氨酸2,分别3-aminomutase。老展品II型折叠,它由一个大的和一个小领域,类似的α/β架构,构成中央β-sheet螺旋线包围。革新劳工党代数余子式,共价绑定到一个大域的赖氨酸,在于两个域之间的间隙(数字1 a, B)。

图1

图1。人类丝氨酸消旋酶的结构(PDB代码3 l6b)两个正交视图所示(A, B)。α-helicesβ-strands属于大域的颜色为青色和红色,分别属于小域而发表在蓝色和橙色,分别。二价阳离子表示为一个粉红色的球。所有循环是粉红色的颜色。天冬酰胺的位置和甘氨酸循环和Arg135用箭头表示。

目前,老10 x射线晶体结构已经存入PDB,,其中,三个人类酶(表的结构1)。在高铁编号,大域是由残留1 - 68和157 - 340,而小域包含残留在78和155之间。连接区域的时间越长,残留69 - 77,形成了一个灵活的铰链,只是部分被x射线晶体学高铁(史密斯et al ., 2010;中田英寿,et al ., 2018)。在酵母粟酒裂殖酵母SR (SpSR),这个区域是折叠形成短α-helix (Goto et al ., 2009;山内et al ., 2009),而在老老鼠(rSR)形成一个循环(史密斯et al ., 2010)。小领域的高铁,三α-helices围绕四个β-strandsβ-sheet (S3-S6)。其中两个螺旋(H4和H5)在同一边对β-sheet躺向大域的界面。第三个螺旋(编辑)是在相反的网站上,形成一个solvent-exposed表面。大域是由六个β-strands,形成一个扭曲β-sheet (S1, S2, S7-S10)和11个侧翼α-helices (H1-H3 H7-H14)(数据1 a, B)。

表1

表1。在PDB丝氨酸消旋酶结构可用。

SpSR的结构性调查(Goto et al ., 2009;山内et al ., 2009序列身份与高铁),该展览35.1%,允许检测得到的构象转变发生在衬底的绑定。这种机制是我前面描述的折叠类型PLP-dependent天冬氨酸转氨酶(Jansonius文森特,1987;贼鸥et al ., 1994;Okamoto et al ., 1994)和几个绾II酶等美洲国家组织和色氨酸合成酶(Raboni et al ., 2009;Mozzarelli et al ., 2011)。SpSR的结构没有任何配体的活性部位(PDB代码:1 v71),是在一个开放的构象(Goto et al ., 2009),而SpSR改性的活性部位与lysino-D-alanyl即模仿衬底被发现在一个封闭的构象(PDB代码:2 zpu) (山内et al ., 2009)。与丝氨酸Co-crystallization这个修改后的形式,仍然可以适应在活性位点尽管修改,也稳定一个封闭的构象(PDB代码:2 zr8) (Goto et al ., 2009)。在观察到封闭的构象,小域经历20°旋转向大域关闭活性部位(图2)。大发生构象变化的天冬酰胺环Ser-Ser-Gly-Asn (SpSR残留81 - 84,83 - 86年老老鼠和人类),氨基端部分的α-helix H5(老H4在老鼠和人类,因为在SpSR存在额外的螺旋螺旋H3)后,形成羧酸盐的结合位点衬底丝氨酸的一部分。此外,羧酸盐参与一个盐桥的氨基端Arg133α-helix H7(一直在老鼠和人类SR) (Goto et al ., 2009)。一个类似的开放闭合构象变化描述rSR史密斯和同事(史密斯et al ., 2010)。秩转换从一个打开的结构构象(PDB代码:3 hmk)酶的一个封闭的构象上形成一个复杂的竞争性抑制剂丙二酸酯(PDB代码:3 l6c)。Arg135(对应于Arg133 SpSR)和天冬酰胺循环走向配体结合到活动网站,类似于行为观察SpSR(图2 b)。高铁与丙二酸酯的结构也报道(PDB代码:3 l6b) (史密斯et al ., 2010)。人类和老鼠SR 90%相同的序列及其结构几乎相同(史密斯et al ., 2010)。比较结构的高铁与丙二酸酯与最近发表自由的高铁结构形式(PDB代码:5 x2l) (中田英寿,et al ., 2018)也证实,高铁经历一个开放闭合构象改变配体时出席了活性部位(图2摄氏度)。老厂的结构从玉米也解决了(PDB代码:5 cvc),显示褶皱与其他老结构类似,除了c端螺旋,突出核心以外的单体(邹et al ., 2016)。

图2

图2。覆盖的(一)打开(PDB 1 v71,浅紫色)和关闭(PDB 2 zr8,光橙色)SpSR结构;(B)打开(PDB 3 hmk,浅蓝色)和关闭(PDB 3 l6c,亮粉红色)结构老老鼠;(C)开放(PDB 5 x2l,蓝色)和关闭(PDB 3 l6b,橙色)结构的高铁。黄色是中。二价阳离子被报告为一个球体的相同的颜色代码卡通表示。主要的构象变化发生在配体结合,即。,一个20° hinge movement of the small domain toward the large domain, is indicated by arrows.

PDB中所有SR沉积结构到目前为止有两个共同特点:存在一个网站绑定的二价阳离子和类似的空间排列PLP-binding网站。二价阳离子的结合位点是在大域和生理上被毫克^{2 +}。二价阳离子的绑定是必不可少的酶正确折叠,稳定和活动(见下文)(库克et al ., 2002;Ito et al ., 2012;布鲁诺et al ., 2017)。老老鼠和人类的结构(除了5 x2l)、锰^{2 +}离子存在,而不是毫克^{2 +},因为MnCl₂是用于结晶缓冲区。这个离子没有生理相关性和锰的存在^{2 +}不改变酶的结构。离子相互作用形成的金属结合位点与羧酸盐组Glu208 Asp214 (Glu210和Asp216秩和高铁),骨干的羰基Gly212 (Ala214秩和高铁)和三个水分子(Goto et al ., 2009;史密斯et al ., 2010;图3)。金属离子是协调的八面体几何。这个网站并不直接参与催化,尽管它是通过水分子连接tetra-glycine循环(g 183-184-185-186 SpSR和183-184-185-186秩和高铁)的氨基端α-helix H9 (SpSR编号,H8秩和高铁),形成一系列H-bonds PLP的磷酸基,导致了代数余子式(图的正确定位3 b)。革新劳工党作为内部醛亚胺环共价相连的赖氨酸残基活性部位(Lys57 SpSR和Lys56秩和高铁)。的结合再保险面对相同的取向向溶剂,在天冬氨酸转氨酶(Goto et al ., 2009)。考虑到高铁编号,守恒的残留在革新劳工党活性部位是由残留形成的图案54-59 (Ser-X-Lys-Ile-Arg-Gly), 313 - 316 (Ser-X-Gly-Asn)和tetra-glycine循环(史密斯et al ., 2010)。Ser84(高铁编号),一个高度保守的残渣,被证明是必不可少的消旋酶和D-serine脱水酶的活动,因为它是参与结合配体的活性部位(见下文)Yoshimura Goto, 2008;Goto et al ., 2009;史密斯et al ., 2010;图3 c)。老出现在解决方案作为一个对称的二聚体,经x射线结晶学、凝胶排阻层析法、戊二醛交联(Goto et al ., 2009;史密斯et al ., 2010;图4)。大部分残留在二聚体界面保存在不同的物种(Goto et al ., 2009)。二聚体被发现在开放和封闭的构象。分析埋monomer-monomer表面积计算秩的开放和封闭的形式表示,二聚体界面有一个高度的灵活性(史密斯et al ., 2010),可能对应两个单体之间的相互作用的重排在配体结合到活动网站,因此开放闭合构象的转变。二聚体和四聚物被描述之间的一个平衡(王Barger, 2011),发现取决于配体和金属离子的存在(布鲁诺et al ., 2017)。

图3

图3。老的结合位点氨基酸参与交互的报告为青色棒,和极地相互作用是突出了黄色虚线。PDB使用3 l6b面板(高铁、封闭形式)(两者)1,世贸中心(spSR AMP-PCP)(D, E)。(一)在高铁二价阳离子结合位点。阳离子(Mn^{2 +})被表示为一个粉红色的球;(B)高铁结合位点中;(C)丙二酸盐结合位点在高铁;(D)在spSR AMP-PCP结合位点。残留的单体在密切接触变构效应报告。Asn25的位置,Phe50、Asn51 Lys52, Met53, Ala115, Tyr119, Asn311 spSR对应His24, Phe49, Asn50, Lys51, Thr52, Ala117, Tyr121, Asn316高铁,分别;(E)残留的第二单体参与互动AMP-PCP报告。星号表明残留属于单体的对面AMP-PCP。Thr31的位置,Ser32、Ser33 Thr34, Arg275, Met276, Lys277 spSR对应Thr30, Ser31, Ser32, Ile33, Arg277, Met278,分别和Lys279高铁。水分子与配体参与SR的绑定所有面板,除了为了简单起见省略了(一)。所有的距离都在3.4之内。

图4

图4。高铁的二聚的结构(PDB代码:3 l6b)。两个单体在青色和绿色。棍棒和丙二酸盐中,分别标上黄色和粉红色。二价阳离子表示为一个粉红色的球。

老的二聚的结构对酶活性的调节是至关重要的。SR绑定到一个稳定的结构模拟的ATP, 5′腺苷二diphosphonate (AMP-PCP),没有配体结合的活性部位,即。在开放形式,解决了SpSR (Goto et al ., 2009)。与Mg AMP-PCP在复杂^{2 +}离子结合成一个裂缝在两个单元之间的接口symmetry-related网站。AMP-PCP与小型和大型域交互的一个亚基,和其他大域的子单元。绑定的Mg·AMP-PCP开放形式变化两个单元之间的相对取向,增加两个单体之间的沟的宽度(图5)。所涉及的残留AMP-PCP绑定包括Ala115 (SpSR编号)和Tyr119,小领域内进行交互。大域绑定AMP-PCP Asn25、Phe50 Asn51, Lys52, Met53,和Asn311残留在循环区域(图3 d)。另一侧,配体与Thr31, Ser32, Ser33, Thr34,和Arg275 Met276, Lys277,终端的一部分α-helices大域的第二单体的二聚体(图3 e)。水分子也参与了绑定。Mg·AMP-PCP一直停靠的位置结构的高铁的丙二酸酯(PDB代码:3 l6b),表明整体与ATP老酵母和哺乳动物之间是相似的(Jiraskova-Vanickova et al ., 2011)。虽然AMP-PCP网站和底物结合位点是15,和两个对称的ATP站点相距24,发生变构沟通,可能通过重排H-bond网络,连接O3′群的与γ-phosphate AMP-PCP。这个网络包括Thr52 Asn86、Gln89 Glu283和Asn316高铁(Met53、Gln87 Glu281, Asn311 SpSR)和两个水分子(Goto et al ., 2009;马et al ., 2013;Canosa et al ., 2018)。

图5

图5。第四纪重排的spSR绑定的AMP-PCP扩大两个单体之间的槽。(一)表面表征的spSR开放形式存在(PDB 1世贸中心,粉红色)和缺乏(PDB 1 v71,青色)AMP-PCP绑定到两个对称的网站二聚体界面。这项计划表明单体的相对位置的变化在两个条件,即:,没有或AMP-PCP。为了突出第四纪AMP-PCP造成的变化,只显示一个单体的叠加(B)面对二聚体界面的方向,在旋转90°的二聚体,(C)对面的亚基,在旋转180°的单体,如二聚体的旋转90°相反的方向。AMC-PCP是黄色的。在(B),只有AMP-PCP绑定到单体的分子。

SR催化

SR催化两个反应,可逆条件下或D-serine外消旋化和不可逆的脱水条件下,丙酮酸和氨的d - s (米兰达et al ., 2002;Foltyn et al ., 2005)。

消旋酶已被列为PLP-dependent或PLP-independent (孔蒂et al ., 2011老),属于第一组。氨基酸外消旋化是一个两步反应,α质子抽象是紧随其后的是对面的re-protonation平面中间。自从pK_一个α质子相当高,pK大约21或更高版本(Yoshimura Esak, 2003),消旋酶发展面对的问题这个质子的酸度增加。在高铁,PLP Lys56共价结合,不同的折叠类型我PLP-dependent酶(格里斯沃尔德和托尼,2011),提出了一种deprotonated吡啶氮(Goto et al ., 2009)。这个特性与褶皱II型PLP-dependent酶,如细菌丙氨酸消旋酶(托尼,2005)、色氨酸合成酶(Raboni et al ., 2009),O-acetylserine sulfhydrylase (Mozzarelli et al ., 2011)。Lys56不仅参与内部的形成与PLP醛亚胺,但是,加上Ser84,也是一个催化残渣和参与质子抽象/ reprotonation丝氨酸的古典两种基本机制(Foltyn et al ., 2005;Goto et al ., 2009;计划1)。老deprotonated形式,底物结合活性部位和经历transaldimination反应与PLP外部醛亚胺的形成。质子化作用的Ser84和Lys56取决于对映体结合酶的丝氨酸。当底物条件下,一个deprotonated Lys56可以抽象α质子导致阴离子醌型的中间。当d - s绑定,Lys56质子化了的Ser84 deprotonated,从而使质子抽象对面的氨基酸。真正的醌型的物种是质疑的存在的缺乏实验观察这个中间值和结构证据表明一个负电荷的吡啶氮不能稳定带正电的残渣,观察氨基转移酶(格里斯沃尔德和托尼,2011)。另一方面,亚稳的形成醌型的特异性反应有利,正如已经观察丙氨酸消旋酶(托尼,2005)。最后一步的反应是reprotonation Ser84或Lys56。人老不外消旋L-Thr,而老古,虽然较低效率对丝氨酸(吴建,等。2008)。然而,最近的工作表明,老老鼠(mSR)可以催化外消旋化L-Asp (Ito et al ., 2016)。D-Asp生产效率大于500倍低于d - s生产(k_猫/ K_米= 12分钟⁻¹·自外消旋化与0.022毫米分钟⁻¹为L-Asp·毫米外消旋化)。培养细胞中表达的SR D-Asp的浓度增加,因此建议另一个相关的角色在活的有机体内这种酶。系统发育分析表明,动物Asp和Ser消旋酶形成一个丝氨酸/天冬氨酸消旋酶家族集群(使用Uda et al ., 2016)和天冬氨酸消旋酶通过收购活动是从SR活动面临的三重丝氨酸循环底物结合位点(使用Uda et al ., 2016,2017年)。

方案1

方案1。老机制催化外消旋化和脱水反应的电子运动的方向所示d - s外消旋化。α-aminoacrylate脱水反应的产物,是自发和快速水解丙酮酸和氨。残留编号是指人类直接同源。修改后的Goto et al。(2009)和史密斯et al。(2010)。

阴离子的中间形式在α质子抽象可以接受β-elimination反应α-aminoacrylate的形成,一个不稳定的中间,很容易水解与修复内部醛亚胺丙酮酸和氨。β-chloroalanineβ-elimination反应也催化,苏氨酸,自旋-O硫酸和L-threo-3-hydroxyaspartate (Panizzutti et al ., 2001;Strisovsky et al ., 2005),不会导致syncatalytic人类酶的失活,一个事件经常在转氨酶(森野et al ., 1979;库珀et al ., 2002)。外消旋化和脱水反应被激活,在不同程度上通过ATP(见下文),条件是受影响最严重的脱水,增加了31-fold催化效率在核苷酸绑定(米兰达et al ., 2002;Canosa et al ., 2018;表2)。在生理条件下,即,SR fully saturated with ATP, the dehydration reaction is several folds more efficient than the racemization reaction. The physiological relevance of D-Ser production by SR has been demonstrated with knock-out mice, which show a D-Ser concentration in the brain that is less than 10% compared to normal mice (莱柏瑞et al ., 2009;Balu et al ., 2013)。另一方面,脱水的作用在活的有机体内仍在讨论和提出相关的d - s退化,特别是在这些大脑区域缺乏分子酸氧化酶(米兰达et al ., 2002)。因为老已经从丝氨酸脱水酶(米兰达et al ., 2000),很可能脱水反应酶的祖先的遗迹,并保持在进化过程中引入体内平衡的贡献。总的来说,SR在d - s生产的效率非常低,可能由于这种氨基酸代谢要求低,生产的需要严格的监管。然而,有证据表明,定位和/或与其他蛋白质可能发挥作用在生理条件下增加推理结果的速度生产(见下文)。

表2

表2。高铁的催化参数丝氨酸外消旋化和脱水的存在和缺乏ATP, Mg的饱和浓度^{2 +}。

SR小配体和蛋白质扶少团团员

高铁活动是精细监管由几个生理效应物,包括ATP、阳离子、阴离子和蛋白质相互作用的波动导致D-serine的体内平衡。

小配体

SR活动的刺激通过ATP首次描述Neidle和邓洛普(Neidle邓洛普,2002)小鼠直接同源,当他们看到一个五倍增加催化活性的存在少量的酵母提取物。连续的实验表明,SR活动引发了镁或钙和核苷酸,最活跃的ATP、ADP和三磷酸鸟苷。同年,其他两个独立研究小组证实二价阳离子的活化作用和核苷酸mSR活动(库克et al ., 2002;米兰达et al ., 2002)。的有效性ADP和ATP non-hydrolyzable类似物(米兰达et al ., 2002;Neidle邓洛普,2002)进一步证明了核苷酸对催化不提供一个充满活力的贡献。

ATP是高铁催化的主要调节器之一,参加一个酶活性(表的微调2)。脱水的催化效率L-serine深受ATP增强,产生31-fold增加激活,k_猫/ K_米8.1±1.1,253.0±15.0 s⁻¹米⁻¹分别在没有和ATP的存在(马et al ., 2013)。否则,在同等条件下,脱水效率的活动D-serine增加4倍,只有一个小的影响ATP D-serine退化率(0.6和2.4⁻¹米⁻¹分别)。L-serine发生的外消旋化的双重提高效率的存在ATP(从9.2到17.5 s⁻¹米⁻¹),但ATP绑定的净效应是一个强烈的刺激L-serine退化,增加从0.9到14.5的两个活动之间的比例没有和ATP的存在,分别为(马et al ., 2013)。如上所示,比较结构的SpSR没有和存在ATP模拟AMP-PCP (PDB 1 v71和1世贸中心)显示的相对取向的变化主要和次要的领域(Goto et al ., 2009),导致一个更广泛的槽。此外,在ATP和甘氨酸或丙二酸酯的存在,高铁活性部位容易出现低于没有ATP,证明PLP荧光猝灭(马et al ., 2015)。此外,通过监测荧光中没有和ATP的存在,这是表明,ATP结合高铁促进减少极性的活性部位,减少它的可访问性(马et al ., 2013)。这些观测结果符合H-bond网络链接的存在ATP结合位点与活性部位(Goto et al ., 2009)和调节活性部位open-to-closed过渡,促进催化残基的正确方向。最近,Gln89指出作为一个关键残留物变构活性部位和磷酸腺苷站点之间的通信。这渣是专门参与脱水反应的激活ATP及其突变阿拉巴马州或遇到完全废除nucleotide-dependent丝氨酸脱水调制(Canosa et al ., 2018)。

基于细胞内ATP浓度、高铁被认为是总是饱和在活的有机体内。然而,在体外研究表明,ATP结合强大的协同(希尔n接近2)和ATP计算K_D高和低亲和力μM 11.5和1.8毫米,分别。这些值属于生理范围(马et al ., 2013),潜在的潜在敏感性高铁活动细胞内ATP的波动。明显的K_D年代的ATP通过荧光测量没有活性部位的配体(0.26±0.02毫米),通过活性测定(0.22±0.01毫米和0.41±0.02毫米L-serine和D-serine脱水,0.22±0.05毫米L-serine外消旋化,分别),非常相似。这一发现表明,期间形成的中间体催化循环不变构影响ATP结合位点,在与甘氨酸形成一个稳定的席夫碱和影响ATP亲和(邓洛普Neidle, 2005;马et al ., 2013)。此外,当活性位点参与PLP之间形成一个稳定的复杂的配体,如甘氨酸、ATP结合高铁在非合作的方式,以50倍更强的亲和力。同样,ATP的底物亲和力影响活性部位(如反映在K_米值),加强了共价的绑定(即。,甘氨酸,15倍)或共价(即。、丙二酸酯10倍)抑制剂(马et al ., 2013,2015年)。根据这些证据,甘氨酸,谷氨酸替代co-agonist D-serine NMDA受体,可以参加的微调活跃和变构站点之间的通信。

至于ATP,还残留参与金属结合位点中高度保守的酵母,小鼠和人SR序列,在所有的三个结构相似的协调(见上图)(Goto et al ., 2009;史密斯et al ., 2010;中田英寿,et al ., 2018)。尽管哺乳动物的酶可以通过激活钙或镁(库克et al ., 2002;米兰达et al ., 2002;Neidle邓洛普,2002),金属结合位点一直认为是生理上被后者由于其细胞内浓度和更强的激活效应对前者。最近,高铁酶活动的调查在体外镁和钙的存在支持两者之间缺乏相关的竞争离子在生理层面上(布鲁诺et al ., 2017)。外消旋化和脱水活动在1毫米L-serine和2毫米ATP浓度接近神经元胞内条件(蛀木水虱et al ., 2000;Foltyn et al ., 2005;Genc et al ., 2011),公布了一个更大的镁对催化效率的影响,与2.5倍的差异对钙。镁和钙结合高铁与亲和力都没有(EC₅₀28±3μM和126±7μM,分别)和ATP (EC的存在₅₀17±1μM和194±6μM,分别)。因此,两个阳离子能引起类似的亲和性不同构象变化负责高铁的活化,从而表现为活化剂(Purich和艾莉森,2002)。在神经传输,Ca^{2 +}局部浓度上升至100μM神经元,但不能绑定到高铁与镁,不影响酶转化率(布鲁诺et al ., 2017)。由于这些原因,对高铁的影响监管在活的有机体内可能是微不足道的。

它已经表明,高铁可以进一步的活动受到卤化物(马et al ., 2015)。其中,氯,唯一一个生理相关性,表现得像一个“竞争力活化剂”(野生et al ., 1976;Maruyama 1990),因为它影响k_猫和K_米,但不改变催化效率(马et al ., 2015)。在成熟的神经元在中枢神经系统中,细胞内氯化物的浓度保持在约5毫米的co-transport不同离子物种(Doyon et al ., 2016)。在动作电位,胞内氯的浓度⁻可以增加五倍,20 - 25毫米,在突触前终端和突触后树突。这种快速变化发生由于GABA激活_一个和甘氨酸受体调节谷氨酸的释放神经递质和抑制性突触后电流(价格和Trussell, 2006年)。有趣的是在体外研究表明,在ATP和Mg的存在^{2 +},高铁四级结构可以影响氯化钠的浓度。特别是高铁作为四聚物存在于氯化钠的缺席,而增加盐浓度的平衡转向二聚的形式(布鲁诺et al ., 2017)。一半的效果对应于20 - 50 mM氯化钠,暗示可能角色的寡聚氯化高铁的分布。

蛋白质扶少团团员

除了小分子感受器和转录后修饰(见下文),SR函数是由交互与特定的蛋白质,特别是与AMPA和NMDA受体相关的蛋白质。特别是c端端,位于ATP结合位点附近,调和与蛋白质伙伴交互。

谷氨酸受体相互作用蛋白(控制)增强了SR活动和D-serine释放神经胶质(金正日et al ., 2005)和转染哺乳动物细胞(Baumgart et al ., 2007)。此外,控制了导致SR构象变化(Baumgart et al ., 2007)。这个结论是由分子之间的交互建模SpSR和GRIP-contained PDZ域(Baumgart et al ., 2007)。

蛋白质相互作用C-kinase (PICK1)是由erythropoietin-producing激活肝细胞受体(以弗所书),促进其释放在星形胶质细胞的胞质,它与老具体来说,弗受体激活后,有离解PICK1与老弗和增加协会(壮族et al ., 2010;Kiriyama Nochi, 2016),伴随着D-serine合成的增加(藤井裕久et al ., 2005;汉利2008;Hikida et al ., 2008)。控制和PICK1都包含一个PDZ域,这是被三个羧基末端氨基酸的SR共识序列(Val-Ser-Val)特征(Baumgart et al ., 2007)。PICK1和控制如何相互作用来调节SR仍不清楚,但他们都是依赖AMPA受体磷酸化状态(Wolosker et al ., 1999;藤井裕久et al ., 2005;金正日et al ., 2005)。磷酸化Ser880导致分离的控制,而PICK1仍然绑定(穆斯塔法et al ., 2004;王Barger, 2011)。其他辅助蛋白质,如Stargazin和突触后密度蛋白95 (psd - 95),也调节AMPA受体(马et al ., 2014)。有证据的形成三元复杂的SR Stargazin和psd - 95,可能影响老活动,因此,谷氨酸神经传递(马et al ., 2013)。

SR的另一个很棒的是Golga-3,蛋白质结合的胞质面高尔基体通过泛素化的抑制和老稳定水平(Wolosker et al ., 1999;藤井裕久et al ., 2005;Dumin et al ., 2006;Canu et al ., 2014)。最近,它还表明精神分裂症1中的蛋白质破坏(断裂),这是涉及主要精神疾病的病理,老绑定,防止其泛素化和退化。糖基截短形式的DISC1无法绑定SR和诱发其退化和D-serine损耗(马et al ., 2013)。FBXO22 ubiquitin-proteasome系统的一个组件,也与SR修改其细胞内组织(见下文)Dikopoltsev et al ., 2014)。

SR转录后修饰

SR据报道,被你修改通过亚硝基化,磷酸化和棕榈酰化。SR水平也由ubiquitin-tagging蛋白酶体降解。

亚硝基化

人类胶质母细胞瘤细胞系实验表明,反向SR的活动是由一氧化氮,并添加D-serine提升denitrosylation小鼠纯化直接同源(Shoji et al ., 2006)。这些结果表明D-serine监管机制,除了酶的底物,也是一个通过denitrosylation活化剂(Shoji et al ., 2006)。亚硝基化网站在小鼠SR决心Cys113,毗邻ATP结合位点的S-nitrosylation显示抑制酶活性约10倍(穆斯塔法et al ., 2007)。这种监管机制是解释为门冬氨酸激活的反馈控制(穆斯塔法et al ., 2007)。不同于小鼠直接同源,人类SR显示在三个半胱氨酸残基,S-nitrosylated Cys113, Cys269,和Cys128 Cys269被独特的人类直接同源(Marchesani et al ., 2018;图6)。两相的抑制动力学,这些残留物表明至少有两个是负责酶抑制,经定点诱变的Cys113 (Marchesani et al ., 2018)。nitrosylated时,高铁将ATP亲和与协调类似于本机酶。然而,亚硝基化不影响缺乏ATP酶活性,表明亚硝基化改变了变构ATP结合位点之间的通信和活性部位,可能通过不同的稳定构象(Marchesani et al ., 2018)。

图6

图6。老网站的亚硝基化和磷酸化。高铁的结构(PDB 3 l6b,亮粉红色)和秩(PDB 3 l6c,橙色)叠加和站点的位置S-nitrosylation(绿色高铁的结构)和磷酸化秩的结构(蓝色)报告。二价阳离子的粉红色。Cys269有两个可能的位置0.5基于PDB文件占用。

磷酸化

小鼠SR的磷酸化发生在胞质和膜结合Thr71老在后者,一个额外的磷酸化网站发现Thr227 (巴兰et al ., 2009;Foltyn et al ., 2010;图6)。磷酸化在Thr71是主要的磷酸化和促进D-serine合成增加酶周转率。事实上,老Thr71Ala展览活动与野生型相比低50%。然而,这种磷酸化网站不保存在高铁,表明它属于rodent-specific监管机制。磷酸化Thr227倾向于老协会的膜。事实上,据报道水平的膜结合SR non-stimulated条件下减少Thr227Ala突变。预测的激酶介导SR磷酸化Thr71 Thr227由在网上分析主题确定proline-directed激酶磷酸化的最强的候选人。然而,预测的激酶抑制剂治疗并没有改变磷酸化概要文件也改变了SR绑定的膜使识别特定激酶仍然难以捉摸。此外,磷酸化在Thr71据报道,由磷酸酶和刺激生长因子存在于血清中,为一个动态的事件如预期。磷酸化蛋白激酶C (PKC)在丝氨酸残基的啮齿动物老穆斯塔法和他的同事们提出的基于两种蛋白质的距离由PICK1绑定(穆斯塔法et al ., 2004)。之后,Vargas-Lopes等人表明,PKC对丝氨酸残基磷酸化SR和老减少活动在体外(Vargas-Lopes et al ., 2011)。类似地,PKC激活增加SR磷酸化和减少D-serine星形胶质细胞和神经元的文化和在大鼠额叶皮质。特别是,PKC-mediated磷酸化调节D-serine可用性在大脑NMDA-dependent与内存相关流程。氨基酸序列的人类、老鼠和老鼠SR透露5守恒的共识序列PKC磷酸化但网站还有待建立。

酰化/棕榈酰化

老并不拥有特定氨基酸prenylation所需图案,isoprenylation或myristoylation。有趣的是,老的是一种罕见的例子O-palmitoylated蛋白质仍然不明身份的丝氨酸或苏氨酸残基(巴兰et al ., 2009)。棕榈酰化导致膜绑定和SR易位从胞质中发挥着关键作用。除了[³H]棕榈酸,[³H]辛酸也纳入SR在神经母细胞瘤细胞,这表明体内啊酰化可能涉及不同长度的脂肪酸(巴兰et al ., 2009)。

泛素化

老有一个相对较短的半衰期兼容的存在一个高效降解/监管体系。事实上,正是证明了SR经历poly-ubiquitination ATP-dependent地在体外和在活的有机体内,从而导致退化ubiquitin-proteasome系统。然而,E3泛素连接酶,将泛素链转移到老仍不明(Dumin et al ., 2006)。泛素系统的关键调节器SR和D-serine水平。伴侣蛋白已报告影响蛋白质降解的速率ubiquitin-proteasome系统,改变其半衰期和老调制函数(见上图)。特别是,与Golga-3互动在体外和在活的有机体内老稳定,防止其泛素化和减缓其降解ubiquitin-proteasome系统。因此,它的半衰期和稳态水平的显著增加间接提高D-serine水平。类似地,老DISC1减少泛素化作为支架,稳定老截断的糖基突变DISC1扰乱生理绑定SR和增加泛素化和退化的SR在星形胶质细胞的减少D-serine生产(马et al ., 2013)。FBXO22,一盒motif-containing蛋白质和组件的自洽场泛素连接酶复杂,老不促进泛素化和它的目标到蛋白酶体系统。事实上,它是自由FBXO22a物种,没有SCF-FBXO22a复杂的参与,从而防止膜结合的积累老物种和调节D-serine合成(Dikopoltsev et al ., 2014)。

SR抑制剂

高浓度的D-serine大脑中与NMDA受体活性高,导致严重的会引起,观察帕金森和阿尔茨海默病,肌萎缩性脊髓侧索硬化症和缺血。因此,重要的努力都朝向活性位点抑制剂的发展与潜在的治疗效果(孔蒂et al ., 2011;Jiraskova-Vanickova et al ., 2011)。

活性部位配体

第一个SR抑制剂被筛选了一系列二元羧酸酸(Strisovsky et al ., 2005)。丙二酸酯(化合物1,计划2)成为最活跃的化合物,K_我mSRμM 27日,77年和710年μM高铁,分别存在和缺乏ATP (马et al ., 2015;表3)。malonate-hSR复杂(图的结构3 c)表明,丙二酸酯H-bonded骨干的蛋白质和氨基酸残基。三个水分子也参与了绑定(Goto et al ., 2009;史密斯et al ., 2010)。试图提高亲和力2,2-dichloromalonate,展品K_我19.3μM mSR (Vorlova et al ., 2015)。其他老抑制剂被确定在小肽库包含3-phenylpropanoic酸一半(迪克森et al ., 2006)。非特异性异羟肟酸衍生品也被确定为SR抑制剂(霍夫曼et al ., 2009)。然而,所有这些抑制剂的亲和力是低于2,2-dichloromalonate。

方案2

方案2。代表SR的抑制剂。

表3

表3。选择高铁的抑制剂。

通过组合在网上筛选和新创合成,化合物2被确定(Mori et al ., 2014),进一步优化生成化合物3显示,一个集成电路₅₀在体外14μM mSR,计算K_我大约4μM(表3)和一个在活的有机体内活动在一个小鼠模型,抑制神经元over-activation (Mori et al ., 2017)。抑制剂IC₅₀1毫米(化合物4)确定并优化了基于结构的药物设计从高铁,导致化合物5,集成电路₅₀0.84毫米(中田英寿,et al ., 2018)和一个计算K_我(表0.207毫米3)。

为了扩大高铁的化学空间抑制剂,在网上小筛选使用的开放和封闭的构象进行了高铁(Dellafiora et al ., 2015)。化合物与不同的化学支架,分享羧酸盐的存在或羧酸盐半个isosters。他们表现出K_我低毫克分子中的值范围,如化合物6拥有三羧酸盐和展品半个计算K_我(表1.3毫米3)。

进行了进一步努力模仿丙二酸酯与环丙烷支架合成取代的环丙烷衍生物的小型图书馆。这些化合物被停靠到高铁结构和评估在体外。最活跃的化合物是二元羧酸环丙烷,结合K_我0.9毫米(Beato et al ., 2016)。

高亲和性的目标发展,竞争性抑制剂类似物的基础上衬底L-serine最初认为是相对容易的,作为开放和封闭的构象结构模型在复杂一些配体为计算机辅助药物设计提供了可能。然而,迄今为止的结果表明,SR是相当困难的药物发现的目标。更多的高铁的配体结构应该帮助映射的构象。此外,到目前为止确定抑制剂表现出相对较低的亲和力使而难以饱和活性部位,从而获得高分辨率的enzyme-ligand结构复杂,阻碍了基于结构的药物发现方法。此外,它应该指出,高铁不容易结晶。

变构配体

据报道,NADH的形式抑制SR活动(铃木et al ., 2015)。这个发现提示潜在链接D-serine浓度的糖酵解通量。一个定义良好的代谢D-serine浓度和糖酵解通量之间的联系是由这一事实L-serine生成磷酸甘油酸酯的三个步骤,是一个主要的糖酵解代谢产物。与ATP NADH的结构相似性,充当变构效应激活高铁,建议一个潜在竞争相同的结合位点。实际上,发现ATP的亲和力高铁的NADH下降和绑定失去协调(布鲁诺et al ., 2016)。NADH类似物的基础上减少n - 1 4 dihydronicotinamidic戒指,包括1-methyl-1 4-dihydronicotinamide (MNA-red)和β-1 4-dihydronicotinamide monucleotide (NMN-red) (化合物7,计划2)被发现部分高铁活动的抑制剂。特别是NMN-red展出一个混合型抑制,K_我18±7μM (布鲁诺et al ., 2016;表3)。通过分子对接,NADH的结合位点,MNA-red和NMN-red被确认是二聚体界面,接近ATP结合位点(布鲁诺et al ., 2016)。

令人惊讶的是,迄今为止的努力仍未开发变构活化剂绑定在ATP站点能够增加D-serine治疗精神分裂症的水平,它的特征是大脑D-serine浓度较低。这个大道可能需要等待复杂高铁interactome的决心。

构象的高铁

老上堆积的证据表明,这种酶是分区不同构象之间以不同的功能性质取决于配体(表4)。其中一些构象是结晶学检测和分类为开放和封闭酶州(计划3)。小域的转换涉及到重新定位对每个单元内的大,导致活性部位的闭包。这样的动态事件是常见的许多PLP-dependent酶,如色氨酸合成酶,O-acetylserine sulfhydrylase和天冬氨酸转氨酶。进一步的构象州,如二价阳离子的形式存在于没有,推断是像基于荧光实验(布鲁诺et al ., 2017)。进一步的复杂程度是由观察表明之间的平衡的存在二聚体和四聚体溶液中的实验mSR和高铁王Barger, 2011;马et al ., 2015;布鲁诺et al ., 2017)。不同的构象具有明显不同的催化特性相关联,从催化效率最低的二价阳离子的缺席,中间20倍高毫克^{2 +}是补充道,当ATP也最高,进一步30倍增加(计划3)。此外,ATP结合合作,从毫克分子离解常数低微摩尔的范围取决于结扎的活性部位。相反,丙二酸酯的亲和力和甘氨酸增加几倍的ATP。

表4

表4。老扶少团团员,对SR结构和功能的影响。

方案3

方案3。老的构象空间构象决定结晶学是标记(*)。的构象特征的催化活性,催化效率的相对价值相比,不含金属的报道形式。通用电气和Mal表明甘氨酸和丙二酸酯,分别。

视角

总的来说,对高铁的结果表明,蛋白质功能是由改变构象分布(表4),即效应器稳定独特的第三纪和第四纪酶构象。这一发现可能对积极和消极的设计利用变构效应物与治疗措施。然而,为了继续沿着这个路径,高铁的三维结构的配体结合活性部位或别构部位应确定。这一目标可能是由于高铁结晶困难发起挑战。事实上,令人惊讶的是,迄今为止的高铁结构存在ATP或稳定的ATP模拟尚未确定。作为低温电子显微镜方法对蛋白质结构测定正接近x射线结晶学的决议,这可能是可行的收集高铁与配体和蛋白质结构扶少团团员为了获得更详细的地图构象的老反过来,这些信息应该提高点击率的识别在网上配体筛选活动。

作者的贡献

MMarc SR,科幻,公元前,某人,MMarg、调频和贡献通过回顾文献和写作的不同部分的手稿。特别是SR和某人专注于铝,科幻小说在结构、BC在催化,MMarc MMarg效应器,AM和FM抑制剂。我设计的手稿和协调活动。所有作者阅读和批准了手稿。

资金

这项工作是支持的帕尔玛大学授予。

利益冲突声明

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

引用

巴兰,L。,Foltyn v . N。Zehl, M。,Dumin E。,Dikopoltsev E。Knoh D。,et al. (2009). Feedback inactivation of D-serine synthesis by NMDA receptor-elicited translocation of serine racemase to the membrane.Proc。国家的。学会科学。美国106年,7589 - 7594。doi: 10.1073 / pnas.0809442106