生物力学和生物化学评估YB-1 A375黑色素瘤细胞系表达:探索性研究
安娜Cykowska
Ulf案发霍夫曼
Aadhya女子4,- 1矫形外科学系大学医院和医学院,图宾根大学医院,德国图宾根
- 2临床和生物科学,都灵大学当过,意大利
- 3整形外科、创伤和重建手术,亚琛工业大学医院,德国亚琛
- 4系统生物学系,MD安德森癌症中心,休斯顿,美国TX
- 5皮肤病、性病学和变态反应学,大学医院维尔茨堡,德国维尔茨堡
- 6血液学、肿瘤学、肺病学明斯特大学医院,德国明斯特
恶性黑色素瘤是最致命的皮肤癌。Y-box结合蛋白1 (YB-1)在调解中扮演着重要角色的转移行为促进epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)。迁徙的黑色素瘤细胞表现出两个主要的迁移模式:细长的间充质或圆变形。使用A375黑色素瘤细胞系和YB-1淘汰赛模型,我们旨在阐明生物化学和生物力学变化迁移信号通路在黑色素瘤转移的背景下。我们受到A375 YB-1淘汰赛和亲代细胞原子力显微镜(刚度确定),immunolabelling和蛋白质组分析。我们发现YB-1表达细胞明显硬而相应YB-1淘汰赛细胞系。我们的研究表明,YB-1组成型表达的A375黑色素瘤细胞系似乎是密切相关的生物标志物epithelial-to-mesenchymal过渡,巢蛋白、波形蛋白,导致更严厉的表型,以及广泛的蛋白质参与RNA,核糖体,剪接体。YB-1淘汰赛导致巢蛋白耗竭和波形蛋白表达明显降低,以及全球upregulation蛋白与细胞骨架和迁移有关。YB-1淘汰赛细胞演示间叶细胞的形态学特征和生化司机/变形迁移。黑色素瘤是一种高度塑料、适应性强和侵略性的肿瘤实体,能够表现出不同的迁徙模式的特征。
1介绍
恶性黑色素瘤是最致命的皮肤癌。黑色素瘤是一种非常激进的癌症,影响患者的预后是严峻的估计有5年生存率在5% - -19%之间(Sandru et al ., 2014)。在细胞水平上,黑色素瘤利用几种机制的组合来入侵组织:epithelial-mesenchymal过渡(EMT),失去细胞间粘附,cell-matrix粘连,矩阵退化,间充质/变形迁移(儿子和月亮,2010)。Y-box结合蛋白1 (YB-1)是一种多功能冷休克蛋白超家族的成员,有一个双重角色作为转录因子在细胞核和细胞质中的平移监管机构(Lasham et al ., 2013;Kosnopfel et al ., 2014)。YB-1表达预测耐药和在许多肿瘤病人的结果往往是与患者复发和预后不良在大量的癌症类型(哈比比et al ., 2008;Shiota et al ., 2008;Basaki et al ., 2010)。此外,在黑素瘤,YB-1介导转移性行为(陆et al ., 2017),是加剧了肿瘤恶化的生物标志物(费雷拉et al ., 2017)。Kosnopfel等人表明YB-1触发致瘤性和转移性黑色素瘤细胞的潜力,通过促进epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)——流程(Kosnopfel et al ., 2018)。YB-1影响迁移的影响信号通路在黑色素瘤转移的背景下了解甚少。当黑色素瘤细胞从原发肿瘤分离的网站,他们可以以几种不同的方式移动。两个主要的模式是“路径生成”间充质和“拓荒”变形,20倍的入侵在某些癌症比间质表型(中收取et al ., 2017)。周围间充质细胞使用蛋白质水解降解细胞外基质和创建新的路径穿过,而变形细胞更灵活,可以挤过小缺口找到他们,但是他们不能降解ECM或创建新的路径(Yu et al ., 2013;赫克特et al ., 2015)。间叶细胞迁移是一个protrusion-dependent模式和特点是粘着斑的形成,降低肌动球蛋白收缩性(Sanz-Moreno et al ., 2008)。圆变形入侵使用不稳定的气泡,可以通过矩阵挤压,因此表现出较低程度的β1integrin-mediated粘连,减少粘着斑大小、高肌动球蛋白收缩性,气泡的形成和高细胞因子信号(Charras Paluch, 2008)。从结构的角度来看,细胞骨架由三个主要组件:肌动蛋白细胞骨架微管网络,和中间丝(如果有)。虽然这些组件协同作用,细胞迁移所需的驱动力是肌动蛋白细胞骨架(陈et al ., 2014)。也与肌动蛋白细胞骨架微管调节转移潜能通过串扰与肌动蛋白(Eitaki et al ., 2012)。共存的肌动蛋白和微管,中间纤维细胞间负责牵引力量,保护细胞免受破坏。纵观EMT,中间纤维进行重大重组的过程,从cytokeratin-rich切换波形蛋白和nestin-rich网络,导致细胞运动能力的提高(太阳et al ., 2015)。黑色素瘤已被证明是能够利用两种模式的入侵,然而,生化和生物力学信号级联驱动这些变化尚不清楚。需要识别潜在的生物标记两种途径,允许预测变形入侵和转移过程是高度相关的知道哪些蛋白参与开关从变形到间质表型。阐明这种生化和生物力学变化引起YB-1表达我们使用A375黑色素瘤细胞系包括YB1表达黑色素瘤细胞系,和A375细胞YB1击倒。不仅我们的目标是调查到什么程度YB-1影响黑素瘤细胞的生化性质及其细胞骨架,但我们也致力于研究黑色素瘤没有YB-1的适应性。我们也评估两个细胞系的细胞刚度与生化变化作为一个潜在的预后侵袭性的生物标志物。
2材料和方法
2.1细胞系和文化
A375 MelJuso细胞(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国和DSMZ布伦瑞克,德国)在这项研究中,使用父母的(未修改)和淘汰赛(第2.2节中描述)。
在rpmi - 1640细胞系都保持谷酰胺(Gibco,生活技术,达姆施塔特,德国)补充10% (v / v)胎牛血清(默克Biochrom,柏林,德国)和1% (v / v)青霉素和链霉素(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)在孵化器37°C(如前所述)(Kosnopfel et al ., 2020)。对所有实验,细胞通过数字大约80%的5 - 20 confluency收获。黑素瘤细胞系都用于不超过2个月从冷冻解冻后的股票。
2.2 YB-1 A375细胞的淘汰赛
YB-1基因敲除(CRISPR YB-1KO)对A375细胞线使用CRISPR / Cas9-mediated基因组工程和单细胞克隆与有效YB-1淘汰赛被确定(如前所述)(Kosnopfel et al ., 2018;Kosnopfel et al ., 2020)。的序列sgRNAs用于YB-1淘汰赛的慢病毒转移向量(lentiCRISPRv2)用于黑色素瘤转导也以前描述(Kosnopfel et al ., 2017)。成功的淘汰赛YB-1 A375细胞线之前确认缺乏蛋白质表达免疫印迹分析(Kosnopfel et al ., 2018)。
2.3生物力学特性的原子力显微镜(AFM)
测量细胞的刚度,我们使用原子力显微镜(AFM)系统(JPK仪器CellHesion 200年,柏林,德国)安装到一个倒置光学显微镜(AxioObserver D1,卡尔蔡司显微镜,耶拿,德国),它允许我们光学调整悬臂感兴趣的区域,同时测量感兴趣的特定区域在单个细胞(图1)。悬臂的校准是一个空的培养皿中充满了预热至37°C莱博维茨的l - 15中没有谷酰胺(默克公司,达姆施塔特,德国)。收回的执行校准曲线和弹簧常数是由使用热噪声方法纳入设备软件(JPK仪器,柏林,德国)。测量是在力谱模式通过记录单force-distance曲线在感兴趣的位置没有横向扫描样本。使用球形压痕进行提示5µm(模型:SAA-SPH-5UM k = 0.2 N / m,力量,Billerica,妈,美国)。细胞生长前48 h AFM生物力学测量在碗的底部(TPP电子塑料制品AG)、Trasadingen、瑞士),直到足够confluency (±80%)。培养基(2.1)中描述了24和48 h后播种。机械测量之前,细胞培养基被删除了,满是贝克汉姆的l - 15中没有谷酰胺(默克公司)。消除干扰邻近细胞的细胞骨架的安排和形态,随机选择单个细胞测定(图1)。评估A375和MelJuso细胞的弹性,我们缩进选定的细胞大约在单个细胞的细胞核周围的地区。压痕曲线在采样2 kHz,力触发∼10 nN和5μm /秒的速度。我们测量30细胞/条件和每个细胞都在一个测量自动测量五次。总的来说,我们在三个独立的重复测量所有的细胞系。杨氏模量为每个单独的细胞从force-distance曲线计算每个测量用赫兹适合模型纳入数据处理软件(JPK仪器),与泊松比设置为0.5。除了A375细胞,MelJuso YB-1表达细胞也受到细胞刚度测量调查可能的异质性肿瘤细胞内的弹性特性,可能会有所不同。
图1。显微图像代表感兴趣的地区受到AFM测量。(一)细胞系A375父母和A375 YB-1淘汰赛,以及MelJuso父母(补充图S1),受到AFM测量。白色的箭头表示悬臂用于缩进。黑色箭头显示该地区被测量感兴趣的细胞——一个模范。(B)示意图的单个细胞缩进球形AFM悬臂(5µm)。图像获取与反向AxioObserver D1光学显微镜AFM系统×10放大。酒吧(黑色)代表30µm规模。缩写:AFM -原子力显微镜,PA -父母,KO -淘汰赛。
2.4 NanoLC-MS / MS分析和数据处理
蛋白质组分析前,YB-1存在/缺乏细胞行验证通过免疫印迹分析如前所述Kosnopfel et al ., 2018)。蛋白质组学研究,蛋白提取纯化使用SDS PAGE(热科学)。Coomassie-stained凝胶块切除和凝固态使用胰蛋白酶消化前面描述的(Borchert et al ., 2010)。脱盐C18舞台技巧后,提取肽分离Easy-nLC 1200系统耦合一个问Exactive高频质谱仪(热科学)所描述的其他地方Kliza et al。(Kliza et al ., 2017),轻微的修改。使用1小时梯度肽混合物分离。七个最强烈的前体离子分散在每个扫描周期顺序使用的高能碰撞离解(HCD)分裂。女士获得光谱处理与集成的仙女座1.6.7.0 MaxQuant软件包版本的搜索引擎(考克斯et al ., 2011)。执行数据库搜索target-decoy智人蛋白质数据库获得Uniprot包含96817项和286年普遍观察到的污染物。Endoprotease胰蛋白酶被定义为一个蛋白酶,最大的两个错过了分裂。蛋氨酸氧化和氨基乙酰化作用被指定为变量的修改,而carbamidomethylation半胱氨酸被设置为一个固定的修改。最初的最大允许质量公差是4.5 ppm (ppm)前体离子和20 ppm碎片离子。启用LFQ (Label-Free量化)算法,以及运行之间的匹配(Schwanhausser et al ., 2011)和LFQ蛋白强度被用于蛋白质相对定量三个复制。基因本体论(去)浓缩生物过程的分析和分子功能进行使用ShinyGO v0.741 (通用电气et al ., 2020)(http://bioinformatics.sdstate.edu/go/),确切概率法,错误发现率(罗斯福)校正,并选择一个0.05p价值截止。ShinyGO也用于生成棒棒糖图表和丰富通路之间的关系网络。
2.5免疫荧光
细胞被洗3次磷酸盐(PBS)和固定为2% (w / v)甲醛和PBS 15分钟。钱伯斯在PBS洗了三次5分钟。随后,透化作用是特里同x - 100年完成0.2%,PBS,和1% BSA和阻塞的3% (w / v)牛血清白蛋白和PBS阻滞剂30分钟。这一过程伴随着孵化YB-1(兔子,1:10 0 # ab76148 Abcam)、波形蛋白(兔、1:10 0 # D21H3,细胞信号),巢蛋白(鼠标、1:50 # sc23927,圣克鲁斯,达拉斯,得克萨斯州,美国),beta-tubulin(兔、1:10 0 # 2129 9 f3,细胞信号,丹弗斯,妈,美国),TGM2(兔、1:10 0 # 3557,细胞信号),Fascin-1(鼠标、1:50 # sc46675, Santa Cruz), Zyxin(鼠标、1:10 0 # Z0377,默克公司,达姆施塔特,德国),和Septin-9(兔、1:50 0 # nbp1 - 28711,罗福斯生物制剂,纪念,有限公司,美国)主要抗体以及f -肌动蛋白(1:10 0 # 596 phalloidin A12380 Alexa的萤石,热科学)和G-actin染色(1:10 0 # D12371 DNase我Alexa萤石488共轭分子探针,尤金,或者美国)共轭抗体在2.5% (w / v)牛血清白蛋白在PBS一夜之间在4°C湿度室。之后,部分主要抗体与二次孵化抗体(Alexa萤石- 594山羊anti-rabbit免疫球蛋白,# a21429,热科学;Alexa萤石488山羊anti-mouse免疫球蛋白,# ab - 150116, abcam;Alexa萤石594山羊anti-mouse免疫球蛋白,# - 21429,热科学;Alexa萤石488山羊anti-rabbit免疫球蛋白、# ab150116 abcam) 2 h的稀释1:10 0 0.5% (w / v)牛血清白蛋白在黑暗中在室温下。钱伯斯是洗了三次PBS各5分钟。核染色进行1% (v / v) DAPI(生活技术,达姆施塔特,德国)成像前5分钟。Fluorescence-stained组织部分与卡尔蔡司观察家Z1可视化荧光显微镜(卡尔蔡司显微镜,耶拿,德国)×40放大。染色都是重复两次。 For negative controls, we omitted primary antibodies.
2.6统计分析
进一步分析,算术平均的5个使用AFM测量每个细胞。基于non-normality 30测量细胞/这些手段的条件下,AFM值作为中值(最小最大),并以图形的方式显示为箱线图。描述性统计包括标准差和标准误AFM的均值数据另外显示(图2 b;补充图S1)。推论统计学进行非参数Mann-Whitney U测试组比较差异基于α为0.05。使用SPSS统计分析进行统计22 (IBM公司,阿蒙克,纽约,美国)软件。
图2。单元刚度以杨氏模量(kPa)在YB-1更高表达父母的A375细胞相比,其YB-1淘汰赛细胞系。(一)箱线图显示更高的刚度值衡量AFM和父母之间YB-1淘汰赛(p< 0.001),(B)与下面的描述性统计分析。*p< 0.05;缩写:PA -父母;KO -淘汰赛;AFM -原子力显微镜。
蛋白质组学数据,统计分析进行了使用条款(https://provision.shinyapps.io/provision/)——一个网上开源的数据分析平台,允许分析MaxQuant文件(勇敢的et al ., 2020)。简单地说,逆向数据库连接次数、污染物和蛋白质被网站修改被移除。每个蛋白质组的文件进一步过滤含有至少两个独特的肽。随后日志分配LFQ强度值2转化为获得两个值的正态分布,并进一步过滤至少一组。这导致高信心表达数据集和缺失值的截断正态分布估算转换LFQ强度。分位数的情节都是在应用程序提供检查数据常态之前统计测试。统计学意义是由一个未配对的双尾学生的学习任务(p> 0.05)。多重假设检验是纠正使用Benjamini-Hochberg(罗斯福)设置为0.05,和拷贝数截止实施。
2.7 In-silico分析
火山的阴谋和集群的热图生成使用条款(https://provision.shinyapps.io/provision/)。分析和浓缩蛋白质间交互作用分析是使用字符串执行数据库(https://string-db.org/)通过提交等级(使用效果)的蛋白质组正常基因分析和执行功能富集分析用标准设置(0.4中信心)。的功能富集分析和可视化基因本体论(去)3分子功能执行2021年和2021年去分子组件使用Enrichr web工具(https://maayanlab.cloud/Enrichr/)(陈et al ., 2013;Kuleshov et al ., 2016)。京都基因和基因组的百科全书(KEGG)途径进行了分析和可视化使用ShinyGO v0.741 (通用电气et al ., 2020)(http://bioinformatics.sdstate.edu/go/),确切概率法,错误发现率(罗斯福)校正,并选择一个0.05p价值截止。
3的结果
3.1 YB-1呈现细胞更强硬
总共30每细胞系细胞/条件受到刚度测量在细胞核周围的地区通过AFM,每个细胞自动测量五次在三个独立的重复。因此,共有1350名进行了测量(每个细胞株/条件450测量)。测量细胞弹性模中描述图2A375细胞系(YB-1淘汰赛和父母)。刚度对A375父母与内生YB-1表达明显高于细胞系(p< 0.001)比A375 YB-1淘汰赛(图2)。总的来说,绝对的值从而减少34%的中位数1.16 kPa A375亲代细胞的中位数0.76 kPa A375细胞淘汰赛。有趣的是,我们还观察到不同的父母和淘汰赛A375细胞表型(图1)父母细胞更全面和更大而淘汰赛细胞更小更细长(见也图1一个)。考虑到可能的异质性肿瘤细胞的力学性能MelJuso细胞系是与此同时受到AFM刚度测量(补充图S1)。相当刚度降低是表示当比较两个YB-1表达细胞系:A375 MelJuso,绝对值减少了27% (补充图S1)。这补充认为癌症是一个异构的病理,肿瘤细胞的力学性能上的差异。
3.2蛋白质组学分析的A375黑色素瘤细胞系回应YB-1淘汰赛
蛋白质组学分析旨在进一步识别主要的蛋白质和蛋白质网络与YB-1的表达及其与黑素瘤A375细胞的生物力学和生物化学方面与一个特定的专注于细胞骨架蛋白参与EMT或变形迁移。这种分析允许我们揭示潜在的生物化学变化和信号流程当YB-1在场和缺席。使用LFQ数据,t以及分析如2.6节所述MaxQuant使用日志中的1.0倍改变截止透露331年1657显著调节蛋白质。128年被调节的A375父母。265蛋白是调节A375 YB-1淘汰赛细胞系。尺寸(折叠Upregulation指最高的影响2改变)相对于其他细胞系,这凸显了存在和表现的变化缺乏YB-1黑色素瘤细胞系。的完整列表显著调节蛋白在父母和YB-1淘汰赛细胞系基于它们的影响大小排序和比较其他细胞系是可视化图3 a, B。他们根据他们的影响大小排序(褶皱2改变)。与最大的差异表达蛋白质(最调节1细胞系和缺席,或几乎没有其他细胞系)提出了集群的热图图3 c。跻身前5调节蛋白质也缺席,或几乎没有在A375父母细胞系(为了)巢蛋白(NES) YB-1 (YBX1),实际上复杂的亚基SPT16 (SUPT16H)核糖体蛋白质生物起源BOP1 (BOP1)和层粘连蛋白亚基γ1 (LAMC1) (图3 c)。在A375 YB-1淘汰赛细胞系,顶端5调节蛋白质是(为了)Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 (TGM2), 14-3-3蛋白σ/ Stratifin (SFN),顺乌头酸酶1 (ACO1), LIM域和actin-binding蛋白1 (LIMA1)和zyxin (ZYX股票)(图3 c)。有趣的是,在黑素瘤YB-1淘汰赛细胞系,巢蛋白几乎缺席和波形蛋白表达水平显著降低(图3一)。之前它已经表明,波形蛋白表达水平不是由巢蛋白改变的淘汰赛(山et al ., 2019),其中牵扯到的YB-1参与波形蛋白表达转录因子和转化。相关蛋白与细胞骨架调节两种细胞系是火山的情节(图3 d)。父母A375细胞行,这些是YB-1 (YBX1)、波形蛋白(来),fascin-1 (FSCN1) septin-9 (SEPT9) profilin-2 (PFN2),和巢蛋白(NES)。在A375 YB-1淘汰赛细胞系这些转谷氨酰胺酶(TGM2) Coronin 1 b (Coro1B) Vinculin (VCL)和zyxin (ZYX股票),ezrin (EZR)和Ezrin-Radixin-Moesin绑定Phosphoprotein-50 (SLC9A3R1)。
图3。可视化的显著调节蛋白质A375父母和A375 YB-1淘汰赛细胞系(p> 0.05,截止日志2褶皱变化> 1.0)(一)一个热图的日志2转换和估算LFQ强度值在A375父母和A375 YB-1淘汰赛(3复制/细胞株)显示一个完整列表显著调节蛋白的细胞株(p> 0.05)。蛋白质是根据其大小排序效果。睡眠中产生矩阵可视化(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)。(B)数值可视化总数的蛋白质鉴定的蛋白质组分析和显著调节蛋白质的数量。的1657个蛋白质,统计分析显示331的总数显著调节蛋白质,其中128为显著调节A375父母和203年A375 YB-1淘汰赛细胞系。(C)集群的热图(完整的方法)五大显著调节蛋白的细胞株显示最高的蛋白质表达的大小相比其他细胞系。列在每个单元格行代表一式三份的日志2转换和估算LFQ强度值。行显示每个蛋白质两种细胞系表达强度。分析和可视化提供(https://provision.shinyapps.io/provision/)。(D)火山情节可视化蛋白质包含在蛋白质组学分析的基础上p价值和日志2褶皱变化值。每个点代表一个蛋白质。垂直线代表1.0的褶皱变化截止。蛋白质最高的和最低的日志2褶皱变化(y设在)代表最调节蛋白质在每个细胞株。选择蛋白质注释。分析和可视化提供(https://provision.shinyapps.io/provision/)。缩写:LFQ-Label-Free量化;PA-parental;KO-knock-out。
3.3 YB-1淘汰赛诱发强烈的细胞骨架蛋白upregulation
理解全球生化和细胞信号变化发生在细胞当YB-1在场和缺席,我们进行功能富集分析三个层次:首先检查功能和身体蛋白质交互使用字符串(图4)。其次,我们使用基因本体论(去)的分子功能和细胞分类组件分析基因和基因产物的特性从不同的角度(图5)。第三,我们探索KEGG通路检查的关键调节信号通路细胞系(图6和图7)。作为输入的字符串分析中,我们使用一个排名列表(基于计算的效果t以及)的显著调节蛋白在父母和YB-1淘汰赛细胞系。在A375父母的细胞系,字符串分析显示(PPI)浓缩蛋白质间交互作用p值< 1.0 e-16,也就是说,意味着有更多的蛋白质相互作用本身比预期的随机的一组蛋白质。蛋白质网络显示不同的集群,高度相互关联。泛函分析在弦很强upregulation整个集群的蛋白质参与核糖体生物起源,RNA加工、RNA成熟,RNA绑定,蛋白质折叠,核糖体生物起源,泛素化,剪接体。大多数蛋白质co-shared功能,因此,分析的目的,我们只标志着大多数功能不同,功能丰富的集群。虽然它不是功能丰富,揭示了巢蛋白的物理和直接网络的交互,fascin-1,波形蛋白,和septin-9强烈调节A375父母的细胞系。128个蛋白质,只有7可能与细胞骨架,profilin-2 (PFN2)、CD63,蛋白质使同族体(ENAH)、波形蛋白(VIM) septin-9 (SEPT9)和fascin-1 (FSC1)。相反,蛋白质的数量参与RNA成熟,绑定和生源论是62年。此外,富集分析显示强烈的分子组件存在于事实和表达PeBoW复合物。复杂中扮演着一个关键的角色在转录起始,转录延伸率(肝,2020)、DNA复制和DNA修复而PeBoW复杂核糖体生物起源和细胞周期的进展至关重要。核糖体生物起源的控制是一个关键的细胞节点和核糖体的管制可能导致致癌作用(Finkbeiner et al ., 2011)。在A375 YB-1淘汰赛细胞系PPI浓缩p值也小于1.0 e-16。在YB-1淘汰赛,令人惊讶的是,最调节蛋白与肌动蛋白丝,应力纤维、细胞骨架,粘着斑,肌动球蛋白,钙粘着蛋白绑定,integrin-mediated细胞粘附,粘着斑。、VEGF-VEGFR2信号通路或lamellipodium形成。的203个蛋白质,42参与细胞骨架组织与A375父母行只有7蛋白质可能与细胞骨架。这些蛋白质是互联网络内,没有任何明显的和功能分离集群表明全球和组织细胞内的集中在细胞骨架变化。显著调节蛋白质,也介绍了功能丰富补充表S1(父母A375细胞线)补充表S2(A375 YB-1淘汰赛)。
图4。字符串分析显示显著的调节功能和物理相互作用蛋白质网络的A375父母和A375 YB-1淘汰赛细胞系。红色箭头指向的蛋白质与immunolabelling染色。背景着色A375父母细胞系凸显了集群网络内。光环的颜色代表了效果。断开连接的节点被移除。缩写:PA-parental;KO-knock-out。
图5。基因本体论(去)显著调节蛋白质的富集分析A375父母广告A375 YB-1淘汰赛细胞系。分析和可视化进行Enrichr web (https://maayanlab.cloud/Enrichr/)(陈et al ., 2013;Kuleshov et al ., 2016)。调节蛋白质的列表为每个细胞株用于生成结果。丰富分子功能和细胞顶部为每个细胞株可视化组件。所有结果的排序p值排名。缩写:GO-Gene本体,PA-parental;KO-knock-out。
图6。KEGG通路富集分析A375父母细胞系。红色代表高表达。缩写:KEGG-Kyoto基因和基因组百科全书,PA-parental;KO-knock-out。图6。KEGG通路富集分析A375 YB-1淘汰赛细胞系。红色代表高表达。缩写:KEGG-Kyoto基因和基因组百科全书,PA-parental;KO-knock-out。
图7。Immunolabelling A375细胞骨架蛋白的父母和A375 YB-1淘汰赛细胞系。从上到下,co-labeling: YB-1 -绿色,f -肌动蛋白-红色,核-蓝色;波形蛋白——红色,巢蛋白-绿色,nuclei-blue;nuclei-blue beta-tubulin -红色;nuclei-blue fascin-1——红色,TGM2 -绿色;nuclei-blue zyxin-red septin-9——绿色,进行这两个细胞系A375父母(左)和A375淘汰赛(右侧)。箭头表示形态差异:f -肌动蛋白(绿色箭头标记),起泡(蓝色箭头),丝状伪足的形成(红色箭头)。板状伪足(白色箭头),压力(黄色箭头标记)。Alexa 488 -绿色标签,Alexa 594 -红色标签,DAPI -蓝(细胞核染色)。酒吧(白色)代表20µm规模。 Abbreviations: PA - parental; KO - knock-out.
基因本体论(去)十大最丰富的分子功能和细胞在每个细胞株可视化组件图5。在父母的细胞系,RNA相关的关键分子功能绑定和顶部细胞组件包括核仁,核内腔,preribosomes,细胞内non-membrane-bounded细胞器。在A375 YB-1淘汰赛,关键分子功能相关的细胞基质连接,粘着斑,和细胞骨架而最高纯度的细胞钙粘着蛋白绑定组件,RNA绑定和肌动蛋白绑定。
突出的调节信号通路诱导YB-1我们使用了两个顶级丰富KEGG通路和可视化(红色)调节组件内的通路。A375父母的细胞系,YB-1表达相关的两个关键通路被剪接体和核糖体生物起源(图6)。在A375 YB-1淘汰赛细胞系的两个主要途径是adherens结和粘着斑(图7)。
3.4定性评估和本地化的细胞骨架蛋白表达
探讨生化和生物力学的变化之间的关系,以及选定的蛋白质的细胞定位YB-1表达和non-YB-1表达细胞系,我们用免疫荧光(如果有)。我们选择的目标对应于感兴趣的细胞骨架蛋白,根据当前文学和蛋白质组分析的结果。我们的免疫荧光分析证实了存在和稳定的淘汰赛,即YB-1强烈表达A375父母的细胞系和完全缺席A375淘汰赛。这些结果与Kosnopfel et al .,确认CRISPR-based淘汰赛YB-1技术在黑素瘤A375细胞呈现稳定的蛋白表达基因变化(损失Kosnopfel et al ., 2018)。关于细胞骨架蛋白的immunolabelling, G-actin(球状)和f -肌动蛋白(丝状)与YB-1 co-stained。在YB-1表达细胞系,G-actin强烈和优先表示核地区。相比之下,G-actin是广泛表达于细胞核和细胞质YB-1淘汰赛。f -肌动蛋白的主要驱动力是在间充质细胞的能动性,变形迁移(Izdebska et al ., 2020)。箭突出显著的差异在f -肌动蛋白组织A375父母和YB-1淘汰赛细胞系。在A375父母的细胞系,f -肌动蛋白细丝拉长,薄。在A375 YB-1淘汰赛细胞系G-actin和f -肌动蛋白的区别不明显。压力在某些细胞,丝状肌动蛋白纤维(绿色箭头,已经完全丧失了图6),发生在间充质变形过渡。一些细胞呈现出“起泡”表型也变形迁移(的一个特点赫勒et al ., 2019)(蓝色箭头标记,图6)。值得注意的是,并不是所有的A375细胞YB-1淘汰赛相同的表型。在一些有明显的丝状伪足的形成(红色箭头,图6)。,in others, lamellipodia are more pronounced (marked by white arrows,图6)。相反,在A375父母的细胞系,细胞相对一致的组织构成的。在YB-expressing细胞系,应力纤维清晰可见所有细胞(黄色箭头,图6)。巢蛋白和波形蛋白在细胞质和细胞核的丰富的父母细胞系。波形蛋白表达与多间充质细胞形状和增加粘着斑形成结构与应力纤维(Ostrowska-Podhorodecka et al ., 2022)。在A375父母的细胞系,我们观察到一个非常强大的波形蛋白的表达,这与f -肌动蛋白的存在应力纤维。在A375 YB-1淘汰赛细胞系,波形蛋白表达的仅仅是细胞核周围的,而巢蛋白似乎完全缺席。这一观点也符合LFQ数据显示,巢蛋白的蛋白质组学研究结果在淘汰赛细胞系中几乎不存在。另一个重要的细胞骨架成分的标签——beta-tubulin表明,微管蛋白网络强烈表达了在这两种细胞系,然而,在父母的细胞系,尤其是富裕细胞核周围的网络比的淘汰赛。TGM2有微弱信号在父母的细胞系,但强烈和广泛表达在YB-1淘汰赛。TGM2信号最强的细胞核周围的。对于fascin-1,强烈表达的核区域A375父母的细胞系,但它显示的微弱信号YB-1淘汰赛细胞。后者也与定量蛋白质组学分析的结果一致。Septin-9强烈表达父母的细胞系,露出well-interconnected的纤维网络集中在单元边界。 In contrast, septin-9 expression in YB-1 knock-out was very weak with notably less prominent filaments. Zyxin immunolabelling exhibited a notably weaker and less prevalent signal in the parental cell. Contrastingly, in YB-1 knock-out cells, zyxin was strongly expressed in the nucleus as well as in the cytoplasm with visible string networks observed.
4讨论
恶性肿瘤具有较高的适应能力选择性压力遇到肿瘤发展的每个阶段,从肿瘤发生的早期阶段,通过疾病进展,以及对治疗的反应。信号可塑性是用于各种癌症侵袭性和细胞迁移等机制,包括间质和变形迁移。皮肤黑素瘤是高度转移性肿瘤,使用两种模式的迁移。Y-box结合蛋白1 (YB-1)是一个重要的致癌蛋白过表达在恶性黑色素瘤肿瘤恶化期间增加蛋白质含量(Sinnberg et al ., 2012;Kosnopfel et al ., 2018)。之前一直显示在恶性肿瘤细胞外YB-1促进翻译信使rna编码的蛋白质参与epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)黑色素瘤迁移,入侵在体外致瘤性(Evdokimova et al ., 2009;El-Naggar et al ., 2015)。YB-1分泌与不良预后相关的YB-1强调一个重要的角色在黑色素瘤的发展和进展(Evdokimova et al ., 2009;汗et al ., 2014;Kosnopfel et al ., 2018)。YB-1影响迁移信号通路在黑色素瘤转移的背景下,如何将这些信号通路成为入侵hyperactivated表型不完全理解(de Winde et al ., 2021)。虽然EMT是一个很好的描述过程,变形迁移还没有完全理解。使用淘汰赛模型,我们旨在阐明生化信号以及生物力学性质的黑色素瘤细胞与细胞骨架的生化成分。根据我们的蛋白质组学的结果,在YB-1表达黑色素瘤细胞系,高度调节蛋白质的核糖体紧密相关,信使rna,剪接体,与之前的研究结果相一致阐明细胞质YB-1的角色是信使核糖核蛋白的一部分粒子(mRNPs)和控制器信使核糖核酸的翻译和稳定(Evdokimova et al ., 2001;Mordovkina et al ., 2020)。有趣的是,YB-1表达诱导强烈的表达中间丝(如果)——巢蛋白(3年来变化)和波形蛋白(2倍改变),而YB-1淘汰赛诱导完全耗尽巢蛋白和波形蛋白的表达明显降低。波形蛋白是一个规范化的标志EMT (Satelli和李,2011年)和其高表达,类似于YB-1,已被证明导致高度运动型,侵入性黑色素瘤表型。先前的研究表明,巢蛋白淘汰赛不影响波形蛋白表达(山et al ., 2019),这表明YB-1 upregulation扮演一些角色的巢蛋白和波形蛋白,这都是高度相关的预后标记黑色素瘤的恶性肿瘤。有趣的是,先前的研究显示,尽管在侵入性黑色素瘤巢蛋白强烈调节,巢蛋白消耗也增强了黑色素瘤入侵在体外(李et al ., 2014)。波形蛋白之前已经涉及在其中扮演着重要的角色在维持细胞骨架体系结构和细胞的机械强度。波形蛋白中间丝(如果)表现出不同的粘弹性性质,没有表现出其他丝状生物聚合物,如肌动蛋白丝(沙et al ., 1998)。波形蛋白缺乏纤维母细胞更兼容和不能动的(王Stamenović,2000),它可以解释低细胞刚度YB-1淘汰赛细胞系,波形蛋白表达明显降低。Downregulation巢蛋白和波形蛋白的以前与黑素瘤的耐药性,以及upregulation PI3K / AKT信号等过程,重构焦粘连,肌动蛋白细胞骨架和信号转导(施密特et al ., 2019)。
总的来说,调节蛋白质的景观父母黑色素瘤细胞系似乎与蛋白质周转,泛素化,细胞生存、增殖,和抗凋亡特性(超出了本研究的范围),以及已知的间质表型标记。之前没有提到过的唯一的细胞骨架蛋白,调节相对于YB-1淘汰赛是profilin-2 (PFN2) septin-9 (SEPT9)和fascin-1 (FSC1)。Profilin-2,下游TGF-β/ Smad信号调节器,扮演pro-tumoral角色与结直肠癌(EMT过程金正日et al ., 2015)。Septins通常所需的间叶细胞迁移,而fascin-1 (刘et al ., 2021参与EMT)超表达。在先前的研究中,结果差别YB-1对这些不仅在降低黑色素瘤细胞的增殖率,而且在更高的凋亡细胞的数量和对化疗的敏感性增加(Schittek et al ., 2007)。在我们的研究中,完成YB-1淘汰赛诱导upregulation大量蛋白质的参与途径增加侵袭性和运动性。显著调节蛋白质非常互联的网络,没有明显的断开连接的集群在YB-1表达黑色素瘤细胞系,建议组织参与细胞骨架蛋白的过度表达,粘着斑和adherens结(图4)。Immunolabelling YB-1 f -肌动蛋白的淘汰赛细胞系表现出的间质表型,包括板状伪足或丝状伪足。我们发现强烈upregulation coronins,包括Coronin 1 b (Coro1B)这是肌动蛋白结合蛋白,控制肌动蛋白网络经典板状伪足(沃纳et al ., 2020)。Vinculin和zyxin适配器蛋白质参与形成更稳定的焦粘连(Pankova et al ., 2010),而组织转谷氨酰胺酶(TGM2)促进粘附,细胞传播,增强病灶粘连间充质细胞迁移的关键(霍英东et al ., 2006)。immunolabelling,我们也证明了YB-1淘汰赛黑色素瘤细胞系显示变形迁移的重要特征,如起泡和肌动蛋白丝的损失。这种表型将符合等重要蛋白质参与起泡的upregulation ezrin (EZR)和Ezrin-Radixin-Moesin绑定Phosphoprotein-50 (SLC9A3R1)。变形迁移是归因于RhoA-ROCK信号轴(图8),增加肌动球蛋白生成膜气泡的收缩性,强化了木菠萝,STAT3信号。STAT3之前已经与圆的形态和amoeboid-type运动有关。在我们的研究中,也发现显著调节YB-1淘汰赛黑色素瘤细胞系。这加强了我们的假设,全球蛋白质组变化YB-1淘汰赛细胞群显示间充质和变形迁移的迹象,随着转变可能是一个连续的梯度,不是一个二进制开关见先前的研究。之前的研究表明,黑色素瘤细胞采用间充质和变形的特征迁移(Gabbireddy et al ., 2021),我们的研究证实了这一观点。
图8。信号级联的示意图表示参与黑色素瘤细胞的运动。Rac1激活降低肌动球蛋白的收缩性,促进间充质运动,而RhoA /摇滚级联的激活增加肌动球蛋白收缩,导致变形运动。p21-activated激酶(PAK)结合GTP-bound Rac1,激活LIM-motif-containing蛋白激酶(LIMK)开车cofilin-mediated肌动蛋白营业额。IRSp53(胰岛素受体酪氨酸激酶衬底p53)是一个适配器蛋白质结合Rac1和2波,从而导致板状伪足的形成。应力纤维、板状伪足和丝状伪足是间叶细胞的表型特征。圆的形态、肌动蛋白丝,形成气泡的变形表型特征。改编自(圣文德et al ., 2013)。
变形表型是柔软和更可变形(Pankova et al ., 2010一起),如果如巢蛋白和波形蛋白的损耗可能解释为什么YB-1淘汰赛黑色素瘤细胞系是更有弹性(硬)与父母相比,YB-1表达细胞系。在这项研究中,我们已经表明,黑色素瘤是一种非常塑料和适应性强的肿瘤实体,能够同时表达间充质和变形表型特征,可以很容易地补偿和开关替代信号通路来恢复入侵属性(沙尼Packirisamy, 2020)。刚度一直猜测是一个转移潜能和一些的潜在生物标志物在体外研究报道称,高细胞刚度可能表明低转移性潜力(渡边et al ., 2012),然而,我们的研究权证谨慎当使用刚度作为转移性的潜在指标。表现型似乎仅在黑素瘤而不是刚度更重要,因为它是与多种蛋白质的表达的环境,因此,我们的研究证实,它不太可能,刚度仅将转移潜能的一个可靠指标。黑色素瘤癌细胞能够波动范围内导致刚度变化的迁徙模式。此外,可在数小时内造成这些变化取决于环境因素。我们的研究表明,组成型表达的YB-1黑色素瘤似乎是紧密相关的,巢蛋白和波形蛋白表达导致更严厉的表型,以及广泛的蛋白质参与RNA,核糖体,剪接体在黑素瘤A375细胞线。我们发现,YB-1淘汰赛导致巢蛋白耗竭和波形蛋白表达明显降低。此外,YB-1淘汰赛诱发全球细胞变化集中在细胞骨架和迁移,这可能是为了弥补缺乏YB-1导致一个强大的传播途径信号间充质/变形迁移。
到目前为止,这是第一个研究专门探讨YB-1的角色,一个已知的EMT诱导物和生物标志物的转移性黑色素瘤细胞的潜能。我们的研究探讨了蛋白质景观和信号参与从变形转换到间质表型变化可能导致潜在生物标志物的鉴定,允许预测变形入侵和转移性进展。我们的蛋白质组学研究表明,信号通路参与阿米巴样的间质表型很塑料,适应性强,给洞察YB-1潜在迁移表型表达的含义和信号通路。YB-1表达预测耐药和在许多肿瘤病人的结果,我们发现YB-1淘汰赛模型的相关性,值得进一步的研究。
5的结论
YB-1调节复杂的表达和内在网络和细胞通路在A375细胞整体呈现硬黑素瘤细胞系。YB-1淘汰赛诱发全球细胞upregulation细胞骨架相关的蛋白质,包括两间充质特性和变形迁移。黑色素瘤是一种高度塑料、适应性强和侵略性的肿瘤实体,能够表现出不同的迁徙模式的特征。
6研究的局限性
虽然我们的研究提供了一个有趣的新视角黑色素瘤和细胞通路的可塑性使细胞更加激烈,所使用的方法意味着艰巨的工作。结果,只有三个独立实验为每个细胞株最终被执行。这解释统计结果时应该考虑的,但测量趋势不应该受到影响。此外,细胞异质性肿瘤细胞是一种行之有效的现象(赫胥黎,1958;Alizadeh et al ., 2015),被认为是耐药的一个重要原因,阻碍治疗结果虽然我们的研究只调查了一个黑素瘤细胞系,这可能并不代表整个肿瘤细胞群,我们的研究结果与先前的研究是高度一致的,看了看,发现高生化和生物力学的可塑性黑色素瘤(韦德et al ., 2014;施密特et al ., 2019;Avagliano et al ., 2020)。最后,尽管CRISPR / Cas9技术已经成为研究最多的基因编辑技术,近年来由于其简单的设计,它仍然面临着许多挑战,如非标靶的发生修改,不能总是提前预测。
数据可用性声明
现有的数据可以显示在一个公开访问存储库:公开的数据集进行分析。这些数据可以在这里找到:https://www.ebi.ac.uk/biostudies/studies/S-BSST1067。
作者的贡献
交流进行了实验,做了统计分析,和写的手稿;设计研究,监督工作,并批判性修订后的手稿;在设计研究;CK细胞系,并帮助提供了解释数据;RR帮助实验和解释数据;医学研究设计,监督工作,并参与了手稿。所有作者批判性阅读和批准最后的手稿。
确认
我们要感谢蛋白质组中心,德国图宾根大学进行NanoLC-MS / MS数据生成。我们也承认支持开放获取出版图宾根大学的基金。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
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关键词:黑色素瘤、原子力显微镜、YB-1组学,蛋白质组学,细胞骨架,迁移,黑色素瘤
引用:Cykowska,霍夫曼英国女子,Kosnopfel C,里斯R和Danalache M(2023)的生物力学和生物化学评估YB-1 A375黑色素瘤细胞系表达:探索性研究。前面。摩尔。地中海。3:1050487。doi: 10.3389 / fmmed.2023.1050487
收到:2022年9月21日;接受:2023年3月23日;
发表:2023年4月20日。
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