假设和理论文章

前面。摩尔。地中海,2022年11月01
秒。分子心脏病学医学
卷2 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fmmed.2022.970744

矩阵杯子的血管保护作用的蛋白质在肾损伤

Yujiro智库 ^1、2*和

Ikuyo山口 ^1、3*

¹组织和细胞科学中心,西雅图儿童研究机构美国西雅图,佤邦,
²美国肾脏学,Takashimadaira Chūō总医院,东京,日本
³儿科肾脏病学会分工和高血压,儿科,俄克拉荷马大学健康科学中心,俄克拉何马州儿童医院,你健康,美国俄克拉荷马城,好吧,

矩阵杯子蛋白(MGP)是一个小的分泌蛋白质和维生素K需要依赖γ-carboxylation函数。MGP已被确认为血管钙化的当地抑制剂,因为MGP-deficient老鼠死亡由于严重的动脉钙化和动脉破裂。临床试验显示,减少活跃MGP预测患者预后不良心血管并发症。然而,最近的研究表明,MGP控制血管生成在开发过程中。MGP-deficient老鼠表现出异常hypervascularization和肾脏动静脉畸形和其他器官。这异常的血管生成在很大程度上是由于过度表达血管内皮生长因子a (VEGF-A)和VEGF受体2 (VEGFR2)。然而,只有少数研究调查MGP角色的组织损伤。我们观察到的系膜细胞增殖和温和的肾脏间质纤维化除了增加毛细血管MGP-null老鼠即使没有受伤。我们还创建了一个与肾损伤小鼠模型,发现肾脏损害大大增加MGP表达管周毛细血管内皮细胞和肾小管上皮细胞。MGP表达的最后,我们的研究表明,损伤加剧管周毛细血管膨胀和积累collagen-producing myofibroblasts肾损伤。 Peritubular capillary damage induces capillary loss as well as trans-differentiation of vascular pericytes into myofibroblasts. These results indicate that MGP has the vascular protective effect in the injured kidney. Clinical trials have already started to test the efficacy of MGP activation to repair vascular calcification in patients with chronic kidney diseases. In this “Hypothesis and Theory” article, we discuss possible mechanisms by which MGP protects against vascular damage during tissue injury based on our experimental results and previous results from other research groups.

介绍

血管是一个复杂的管道网络传输含氧血液在我们的身体和营养。如果排成一列,这些船只包括动脉、静脉和毛细血管从一个典型的成人将绕地球两次。血管的生长是必不可少的器官发展和组织修复(Carmeliet Jain, 2011)。我们的身体保持一个紧密的平衡proangiogenic因子(诱导血管生成)和抗血管新生因子(抑制血管生成)来防止不必要的血管的形成。这个血管生成过程的不平衡对我们的健康产生重大影响,导致各种疾病,包括癌症的发病机理,缺血性疾病和组织纤维化(Carmeliet 2003)。在肾脏,过度和受损的血管生成原因中断正常的肾脏架构没有任何有害的侮辱(刘et al ., 2007;Hakroush et al ., 2009;Dimke et al ., 2015)。因此,是一个伟大的需要更好地了解血管生成过程在正常和病变的器官来开发新的治疗方法。最近的研究显示,矩阵杯子蛋白质(MGP)是一种血管生成的关键调节器在多个器官包括肺和肾脏在开发过程中(姚明et al ., 2011)。MGP已被确认为一种血管钙化的有效抑制剂(罗et al ., 1997)。血管钙化是一种过程,其特征是动脉壁增厚和肌肉弹性损失。重要的是,血管钙化是普遍和显著增加发病率和死亡率在慢性肾脏疾病(CKD)患者(民主党和Tintut, 2008;鉴定et al ., 2013)。在“假说和理论”的这篇文章中,我们描述1)MGP的激活过程,2)抑制作用的MGP血管钙化,3)MGP的角色在正常血管生成,4)角色具有抑制受损,延伸MGP的血管生成和MGP激活5)治疗的影响。

MGP的结构和激活

MGP是一个小的分泌蛋白(10.6 kD人类)包含多个γ-carboxyglutamate (Gla)氨基酸残留和一个二硫键(图1一个)(价格et al ., 1983;Hackeng et al ., 2001)。MGP激活两个转译后的修改,丝氨酸磷酸化和维生素k依赖γ-glutamate羧化作用(图1 a - c)(Hackeng et al ., 2001;Schurgers et al ., 2007)。活跃MGP后释放到细胞外空间,主要局限于细胞外基质(ECM)和调节血管内稳态。

图1

图1。结构、钙绑定函数和矩阵杯子蛋白质的活化过程(MGP)。(一)MGP由84个氨基酸组成,包含三个可以由Golgi-casein激酶磷酸化的丝氨酸残基(位置3、6和9)和五个谷氨酸残基可以γ-carboxylated(在位置2,37岁,41岁的48岁和52)。这两种类型的转译后的修改(serine-phosphorylation和γ-glutamate羧化作用)激活MGP。MGP只有一个两个半胱氨酸残基之间的二硫键(54和60)。号表明每个氨基酸的位置。γ:γ-glutamate S:丝氨酸、C循环:半胱氨酸,P的橙色椭圆:磷酸化,C在绿色三角形:γ-carboxylation(B)维生素K-dependentγ-carboxylation谷氨酸(Glu)转换成γ-carboxyglutamate(γ-carboxyglutamic酸)(Gla)。这个反应会增加MGP的负电荷,促进电气MGP之间的绑定和带正电的钙离子。红色部分是新附加后Gluγ-carboxylation反应。(C)天真MGP经历γ-carboxylation在内质网(ER)维生素K依赖的方式,导致脱去磷酸(desphosphorylated)羧酸盐MGP (dp-cMGP)。随后,dp-cMGP经历serine-phosphorylation Golgi-casein激酶在高尔基体(高尔基)。由此产生的磷酸化羧酸盐MGP (p-cMGP)是完全活性形式,这在很大程度上是位于细胞外基质(ECM)。一小部分p-cMGP进入血液循环。根据维生素K缺乏症,MGP磷酸化和γ-carboxylated(脱去磷酸uncarboxylated MGP, dp-ucMGP)。这种活动形式的MGP也进入循环。

抑制MGP的角色在血管钙化

MGP已被确定为当地钙化的抑制剂,因为MGP-deficient老鼠死后2个月内由于严重的动脉钙化和动脉破裂没有动脉粥样硬化斑块罗et al ., 1997;Malhotra et al ., 2019)。一致,检测到动脉钙化的患者Keutel症状识别功能丧失MGP基因的突变(Cancela et al ., 2021)。血管钙化发生在两个不同的网站,内层的内侧动脉壁层。而内层的钙化与动脉粥样硬化斑块,内侧钙化,也称为Monckeberg硬化,特点是血管硬化和动脉硬化(鉴定et al ., 2013)。MGP-deficient老鼠证明动脉钙化没有动脉粥样硬化斑块的证据(罗et al ., 1997),MGP功能的障碍主要是有助于内侧钙化和血管硬化。内侧钙化通常被发现在CKD患者(鉴定et al ., 2013)。

MGP抑制血管钙化通过多种途径

MGP由84个氨基酸组成,包含三个可以磷酸化的丝氨酸残基(位置3、6和9)和五个谷氨酸残基可以γ-carboxylated(在位置2,37岁,41岁的48岁和52岁)(图1一个)。完整的MGPγ-carboxylation(氨基酸1 - 84),γ-carboxylated MGP片段(氨基酸35至54岁)要高许多,和丝氨酸磷酸化MGP片段(氨基酸3日- 15日)抑制钙化而MGP片段(氨基酸54 - 84),uncarboxylated MGP片段(氨基酸35至54岁)要高许多,和脱去磷酸MGP片段(氨基酸3日- 15日)没有影响钙化(Schurgers et al ., 2007)。这一结果表明,转译后的修改(γ-carboxylation或丝氨酸磷酸化)MGP必须抑制组织钙化。γ-carboxylation MGP谷氨酸残基增加负电荷,促进MGP之间的绑定和带正电的离子(钙图1 b)。这个函数的MGP抑制钙离子进入羟磷灰石(血管钙化的基本组件)(Nigwekar et al ., 2018)。另外,MGP直接与羟磷灰石晶体生长和吸收(O 'Young et al ., 2011)。MGP没有丝氨酸磷酸化和γ-glutamate羧化作用显著减少拆卸羟磷灰石的能力。Fetuin-A(α₂-Heremans-Schmid糖蛋白)是一种带负电荷的蛋白质,主要是发布的肝脏,在从血清钙离子和磷酸离子(Ketteler et al ., 2003;谢弗et al ., 2003)。fetuin-A之间的交互和γ-carboxylated MGP集成钙和磷酸盐簇为无定形的蛋白质的球形粒子,称为calciprotein粒子,50 - 500 nm直径(Kutikhin et al ., 2021)。这些粒子运输钙和磷酸盐的骨头和预防血管钙化通过抑制生长和聚集的羟磷灰石(Jahnen-Dechent et al ., 2011)。MGP缺乏上调runt-related转录因子2 (Runx2)的表达,促进血管平滑肌细胞trans-differentiation (VSMCs)成osteochondrogenic细胞(Malhotra et al ., 2022)。这些transdifferentiated VSMCs分泌钙离子和磷酸离子,加速血管钙化(斯皮尔et al ., 2009;乃文et al ., 2011)。骨形成protein-2 (BMP-2)是主要的配体诱导osteochondrogenic VSMC的upregulation Runx2 (李et al ., 2003;李et al ., 2008;中川et al ., 2010)。MGP结合BMP-2,隔绝它从它的受体(Zebboudj et al ., 2002;Zebboudj et al ., 2003)。此外,MGP-deficient VSMCs破坏弹性蛋白纤维的完整性,提高胶原蛋白合成在媒体上的动脉,进一步增加血管硬化(Malhotra et al ., 2022)。MGP-deficient老鼠,提高血清水平的MGP并不影响血管或ECM钙化,表明MGP调节组织钙化但不是本地系统(Murshed et al ., 2004)。

临床证据MGP在血管钙化的抑制作用

Calciphylaxis是一种罕见的和威胁生命的疾病,严重的血管钙化出现在脂肪和皮肤组织。这种疾病通常发生在CKD患者(Nigwekar et al ., 2018)。尽管calciphylaxis患者提高表达水平uncarboxylated MGP和γ-carboxylated MGP在受影响的组织,uncarboxylated MGP表达主要是调节相比γ-carboxylated MGP表达式(Kramann et al ., 2013)。因此,这些病人减少相对γ-carboxylated MGP表达式(计算[γ-carboxylated MGP表达式]/[总MGP表达式])在受影响的组织(Kramann et al ., 2013;Nigwekar et al ., 2017;Nigwekar et al ., 2018),支持患者MGP anti-calcification功能活跃。的循环水平不活跃MGP(脱去磷酸和uncarboxylated MGP, dp-ucMGP)与CKD患者主动脉钙化的严重程度(Schurgers et al ., 2010),预测长期石灰质的瓣膜主动脉瓣狭窄患者的死亡率(Ueland et al ., 2010)。更高的循环活动MGP也与他们罹患心脏衰竭的风险和外周动脉疾病(Dalmeijer et al ., 2013;Malhotra et al ., 2022)。动脉硬化是由于过度受损MGP激活增加了脉动的左心室后负荷,减少冠状动脉灌注压在心脏舒张期,导致心脏衰竭(chirino 2022)。这些结果暗示激活MGP预防血管钙化和心血管疾病。

角色MGP在正常的血管生成

异常血管生成MGP-null老鼠

在MGP-deficient老鼠,钙化影响到所有动脉弹性和肌肉,但不是小动脉,静脉或毛细血管(罗et al ., 1997)。这一发现表明,毛细血管MGP的主要作用不是抑制钙化,但血管生成有关。姚等人发现MGP-deficient老鼠异常血管和肺和肾脏动静脉畸形(姚明et al ., 2011)。MGP-null老鼠比野生型控制小鼠肺血管和肾脏,而转基因小鼠MGP超表达转基因小鼠(MGP)肺血管和肾脏表现出低于野生型小鼠(姚明et al ., 2011)。在肾脏MGP-null老鼠,每个微观领域的肾小球数量增加比野生型(3倍),和管周毛细血管密度也增加比野生型(4倍)。这种增强血管生成中发现MGP基因敲除小鼠产生不正常的血管因为异常的动静脉分流频繁出现,让血液绕过肾小球和管周毛细血管(姚明et al ., 2011)。微血管密度也增加心脏肌肉和骨骼肌肉MGP基因敲除小鼠(Sharma Albig, 2013)。

过度表达血管内皮生长因子a MGP-deficient肾脏

MGP-deficient肾脏异常的血管生成的机制是什么?主要的解释是提高表达血管内皮生长因子a (VEGF-A) MGP-null肾脏(6倍控制从野生型小鼠肾脏)(姚明et al ., 2013)。过度VEGF-A诱发异常的血管生成和破坏肾小球和管周毛细血管结构(刘et al ., 2007;Hakroush et al ., 2009)。除了VEGF-A的异常高表达,表达的激活素受体激酶受体5 (ALK5)也是调节MGP淘汰赛肾脏(姚明et al ., 2011)。ALK5转变增长factor-β(TGF-β)I型受体。根据TGF-β激活,大量表达ALK5管状上皮细胞提高蛋白表达的低氧factor-1α(HIF-1α)(Basu et al ., 2011在这些细胞),该触发器VEGF-A合成(Manotham et al ., 2005;木村et al ., 2008)。肾小管上皮细胞(厚提升四肢亨利的循环,远端小管,和近端小管)和肾脏足细胞是VEGF-A的主要来源(Dimke et al ., 2015)。目前尚不清楚MGP-null小鼠肾小球异常主要来自增加管VEGF-A足细胞的表达或增加VEGF-A表达式,因为没有信息的表达从MGP ALK5和VEGF-A足细胞基因敲除小鼠。有明显的证据表明,VEGF-A参与骨形成和成骨细胞分化(梅斯et al ., 2002;街et al ., 2002)。考虑到相似性骨形成和血管钙化,VEGF-A可能发挥作用在血管钙化(斯沃夫et al ., 2013)。事实上,VEGF-A可能上调BMP-2表达培养内皮细胞(Bouletreau et al ., 2002)。因此,增加VEGF-A表达式可能会损害动脉钙沉积在MGP基因敲除小鼠。

内在MGP-deficient内皮细胞在肾脏的异常

MGP基因敲除小鼠也增加表达VEGF受体2 (VEGFR2)肾脏(野生型的15倍)(姚明et al ., 2016)。尽管VEGFR2主要是表达内皮细胞在正常肾脏(Schrijvers et al ., 2004VEGFR2),这增加表达野生型(15倍)不能被解释为肾小球和管周毛细血管密度的增加(野生型)的3 - 4倍MGP-null肾脏。因此,损失的内皮MGP似乎上调VEGFR2表达内皮细胞。的长期和强烈刺激VEGFR2足以诱发小鼠毛细血管异常增殖及肾小球硬化不间质性纤维化的发展(佐藤et al ., 2011)。此外,增加VEGFR2表达式通常观察到在糖尿病肾病的早期阶段,在系膜基质沉积是著名的(库珀et al ., 1999)。Sharma Albig报告,MGP-null主动脉环加强船相比,从野生型小鼠主动脉环(Sharma Albig, 2013)。据报道,尽管MGP-deficient主动脉环上调Notch信号活动相对于野生型主动脉环(Sharma Albig, 2013),切口激活可能是继发于过度发芽MGP-deficient内皮细胞,因为Notch信号限制杂乱无章的萌芽和分支的内皮细胞(赫尔et al ., 2007;智库et al ., 2016)。Anti-sense-mediated MGP击倒的斑马鱼胚胎结果没有血液流动的一些主要血管(Sharma Albig, 2013)。总的来说,这些发现也证实MGP-null内皮细胞造成异常血管的形成。

自发破坏正常的肾脏结构MGP-deficient老鼠

我们调查了肾血管MGP-deficient老鼠和MGP转基因小鼠的表型。此前报道,MGP-null肾脏演示管周毛细血管密度增加,而MGP转基因肾脏显示密度降低(图2一个,我们的未发表的数据,看到细节补充材料)。我们还观察到血小板衍生生长因子receptor-β(PDGFRβ)阳性细胞增加MGP-deficient肾脏的肾小球和间质(图2 a, B,我们的未发表的数据,看到细节补充材料),这表明intraglomerular PDGFRβ⁺系膜细胞和间质PDGFRβ⁺微血管周被激活和增殖在没有任何外部损伤。MGP-deficient肾脏也增加了组织纤维化和collagen-producing myofibroblasts积极的α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA) (图2 a - c,我们的未发表的数据,看到细节补充材料)。肾脏功能也略有但明显受损MGP基因敲除小鼠与野生型相比控制老鼠(图2 c,我们的未发表的数据,看到细节补充材料)。这些特征让人想起血管形成VEGF-A overexpressing肾脏(刘et al ., 2007;Hakroush et al ., 2009)。为了应对VEGF-A的过度表达,肾小球和管周毛细血管内皮细胞强烈表达PDGF-B和TGF-β(Hakroush et al ., 2009)。肾小球,增强PDGF-B表情刺激系膜细胞增殖和系膜基质沉积,导致肾小球硬化(Johnson et al ., 1992)(图3 a, B)。间隙空间,PDGF-B PDGFRβ扩散的原因⁺周和PDGFRβTGF-β造成分化⁺到周围的周α-SMA⁺分别myofibroblasts (吴et al ., 2013)。高水平的VEGF-A足以产生肾小球硬化,长期蛋白尿、肾功能受损(刘et al ., 2007)。虽然在肾脏肾小球体积大大增加VEGF-A超表达(刘et al ., 2007;Hakroush et al ., 2009),我们没有看到扩大MGP-null肾脏肾小球(图2一个,我们的未发表的数据,见细节补充方法),这表明一些异常发现MGP-deficient肾脏被增强表达VEGF-A解释不好。相结合,我们的观察和这些以前的结果表明,强劲的表达VEGF-A VEGFR2和合成不成熟的血管形成MGP-null老鼠足以启动肾损伤没有任何有害的刺激。

图2

图2。肾脏的结构和功能异常MGP-null老鼠。(一)Immunofluorescent CD31染色,血小板衍生生长因子receptor-β(PDGFRβ)和α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)的肾脏MGP转基因,野生型,MGP基因敲除小鼠。CD31染色(绿色,内皮标记)透露,管周毛细血管(PTC)密度增加MGP基因敲除小鼠,而PTC密度降低MGP转基因小鼠与野生型小鼠相比(顶面板)。证明PDGFRβPDGFRβ染色(红色)⁺肾小球系膜细胞增殖在MGP基因敲除小鼠(中间面板)。α-SMA染色(绿色,myofibroblast标记)确定α-SMA的出现⁺在MGP myofibroblasts基因敲除小鼠(下半部分)。箭头表示α-SMA⁺的间质myofibroblasts MGP-null肾脏没有受伤。注意α-SMA表达式是可检测的小动脉和小动脉,但不是在正常肾脏的间质。TG: MGP转基因老鼠,WT:野生型小鼠,柯:MGP基因敲除小鼠,g:肾小球,答:小动脉,星号:小动脉,蓝色:核染色。酒吧,规模50μm。(B)双immunofluorescent染色PDGFRβ(红色)和α-SMA(绿色)使用肾脏受伤的野生型和MGP基因敲除小鼠。与野生型小鼠相比,PDGFRβ⁺肾小球系膜细胞和PDGFRβ⁺周间质增多的MGP-deficient老鼠。大多数PDGFRβ⁺周间质中积极为α-SMA MGP-null肾脏(箭头所示),证明MGP缺陷诱发pericyte-myofibroblast过渡。WT:野生型小鼠,MGP柯:MGP基因敲除小鼠,g:肾小球,答:小动脉,蓝色:核染色。酒吧,规模50μm。(C)Picrosirius红点的纤维胶原蛋白在肾脏受伤的野生型和MGP基因敲除小鼠(左面板)。纤维胶原沉积增加偏振光在MGP-null探测到肾脏。WT:野生型小鼠,MGP柯:MGP基因敲除小鼠,酒吧,规模50μm。测量血尿素氮(BUN)在老鼠身上没有受伤(右面板)。包子水平升高MGP基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,表明MGP不足导致受损肾小球滤过率(GFR)。TG: MGP转基因老鼠,WT:野生型小鼠,柯:MGP基因敲除小鼠。结果意味着±SEM。n= 8 - 9 /组。*p< 0.05与野生型老鼠的学生的t以及。

图3

图3。在MGP-deficient小鼠肾小球病变。(一)健康的肾小球的结构。肾小球毛细血管支持两种类型的细胞,足细胞(黄色)和系膜细胞(绿色)。足细胞培养毛细血管内皮细胞合成(红色)的血管内皮生长因子a (VEGF-A)。足细胞足突和毛细血管基底膜(大胆的蓝线)构成毛细管壁垒防止蛋白尿(血浆蛋白漏尿)。系膜细胞收缩细胞表达血小板衍生生长因子receptor-β(PDGFRβ)。他们周围毛细血管控制毛细管流,确定single-nephron肾小球滤过率(GFR)。肾小球毛细血管血液流入通过传入小动脉、肾小球的流出通过一个传出小动脉。(B)在MGP-deficient肾脏肾小球内皮细胞(红色)由于增加VEGF-A表达明显增多。为了应对VEGF-A刺激,内皮细胞合成PDGF-B,导致PDGFRβ扩散⁺系膜细胞(绿色)。系膜细胞形成毛细管系膜增殖及压缩,导致毛细血管基底膜的破坏和毛细血管闭塞。这最终导致蛋白尿和肾小球滤过率(GFR)失去whole-kidney(肾功能丧失的)。

MGP不得影响骨形成protein-2或者BMP-4管周毛细血管内皮细胞的信号

先前的研究表明MGP抑制牛和人类主动脉内皮细胞扩散通过抑制BMP信号(姚明et al ., 2009;姚明et al ., 2011)。因此,我们调查是否MGP抑制管周毛细血管内皮细胞BMP信号。我们与BMP-2孵化管周毛细血管内皮细胞,BMP-4或BMP-2和BMP-4 3天。管周毛细血管内皮细胞隔离使用fluorescence-activated从野生型小鼠的肾脏细胞排序(流式细胞仪)正如我们之前报道(智库et al ., 2013)(见细节补充材料)。然而,无论是BMP-2还是BMP-4影响野生型扩散管周毛细血管内皮细胞所评估的MTS试验(图4一,我们的未发表的数据,看到细节补充材料)。管周毛细血管内皮细胞分离MGP转基因肾脏从野生型增生性大大小于控制肾脏(图4 b,我们的未发表的数据,看到细节补充材料),这是与我们的一致在活的有机体内结果MGP转基因肾脏毛细血管密度的减少(图2一个)。通过使用- sensing西方分析,我们研究是否MGP抑制表达水平的磷酸化Smad1/5/8(规范化下游目标BMP-2或BMP-4)管周毛细血管内皮细胞。没有区别在磷酸化Smad1/5/8表达式控制野生型和MGP转基因内皮细胞(图4 c, D,我们的未发表的数据,看到细节补充材料)。此外,我们发现几乎没有激活Smad1/5/8野生型内皮细胞(图4 c)。相反,我们发现过度MGP会使磷酸化ERK表达(图4 e,我们的未发表的数据,看到细节补充材料),这是符合减少VEGFR2活动。激活ERK是一个主要的下游目标VEGFR2信号诱导内皮细胞增殖(Kroll和Waltenberger, 1997)。虽然BMP-4可以激活ERK在人类脐静脉内皮细胞,与BMP-4伴随着磷酸化ERK激活Smad1/5/8 (周et al ., 2007)。集体,我们不确认MGP抑制BMP-2或BMP-4管周毛细血管内皮细胞的信号。这种差异可以解释为不同BMP刺激主动脉内皮细胞和管周毛细血管内皮细胞之间,因为微血管内皮细胞在不同的组织拥有不同的表型(诺兰et al ., 2013)。

图4

图4。没有抑制作用MGP在肾脏毛细血管内皮细胞bmp信号。(一)微血管内皮细胞(MVECs)扩散管周毛细血管被MTS试验评估MVECs BMP-2或BMP-4孵化后3天。无论是BMP-4 BMP-2,或是BMP-2 / BMP-4对肾脏MVECs扩散有重要的影响。结果意味着±SEM。n= 4 /组。(B)MTS试验的结果表明,扩散的MVECs MGP转基因(TG)肾脏小于MVECs从野生型(WT)的肾脏。结果意味着±SEM。n= 4 /组。*p< 0.05和MGP WT MVECs学生的t以及。(C)代表图像的信号强度磷酸化Smad1/5/8 (pSmad1/5/8)和磷酸化ERK(活跃)MVECs隔绝野生型(WT)和MGP转基因(MGP TG)肾脏- sensing西方分析评估。绿色的强度在每个显示蛋白质表达水平。注意几乎没有表达pSmad1/5/8 WT和TG MVECs。(D)pSmad1/5/8信号强度的量化MVECs隔绝野生型(WT)和MGP转基因(TG)肾脏。没有显著差异WT与TG MVECs pSmad1/5/8表达式。结果意味着±SEM。n= 4 /组。(E)活跃信号强度的量化MVECs隔绝野生型(WT)和MGP转基因(TG)肾脏。活跃的表达是WT MVECs相比,TG MVECs受损。结果意味着±SEM。n= 4 /组。*p< 0.05和MGP WT MVECs学生的t以及。红色虚线显示1.0(对照组)的参考价值图4 a, B, D, E。

角色MGP血管损伤的肾脏

增加总MGP肾损伤后的表达

正如我们上面所描述的那样,MGP至关重要生理血管生长和维护(正常的血管生成)。MGP也扮演一个角色在组织损伤血管损伤?据我们所知,只有很少有研究调查组织损伤后MGP是如何工作的。在动脉粥样硬化小鼠模型,MGP超表达改善动脉粥样硬化和动脉钙化(姚明et al ., 2010),这表明积极MGP防止血管损伤。虽然总MGP肾脏中表达显著增强小计切除模型和肾缺血/再灌注损伤模型(Basile et al ., 2005;宫田康弘et al ., 2018),我们仍然不知道MGP抵消肾脏损伤。

增强肾损伤由于受损MGP表达式

描述的角色MGP肾损伤后血管损伤,我们遭受野生型老鼠单侧输尿管梗阻(UUO)作为古典进行性肾损伤模型(艾迪et al ., 2012)。此前报道,MGP表达显著和显著调节UUO后肾损伤(图5一个,我们的未发表的数据,看到细节补充材料)。除了管状上皮细胞,内皮细胞增加MGP表达在肾损伤(图5 b,我们的未发表的数据,看细节补充方法)。从sham-operated控制和UUO-damaged肾脏,我们孤立管周毛细血管内皮细胞用流式细胞仪和细胞之间的基因表达模式相比控制肾脏和那些来自UUO肾脏。MGP是坚持最久的一个调节基因UUO肾损伤后内皮细胞(图5 c,我们的未发表的数据,看到细节补充材料)。探讨血管保护作用的MGP反对组织损伤,我们受到控制小鼠和野生型MGP杂合的基因敲除小鼠(MGP^{+ /−}老鼠)UUO肾脏损伤。MGP^{+ /−}老鼠演示更严重的管周毛细血管膨胀(图6,我们的未发表的数据,看到细节补充材料)和更大的α-SMA积累⁺myofibroblasts比控制野生型小鼠(图6 b,我们的未发表的数据,看到细节补充材料),而不浸润的巨噬细胞的数量是不同的两组(数据未显示)。管周毛细血管稀疏被驱动的肾脏损伤进展(梅耶,2011;长et al ., 2012;智库et al ., 2014;重击,2020)。这些结果强烈表明,受损MGP表达式UUO恶化血管损伤的肾损伤。我们没有发现任何差异的表达Vegfa成绩单(VEGF-A mRNA)控制和MGP之间^{+ /−}老鼠预处理具有抑制受损(数据未显示),延伸或VEGF-A可能不是一个中央机制来解释MGP的保护作用。图6 c显示可能的机制严重毛细管稀疏和强烈的组织纤维化中发现MGP肾损伤后基因敲除小鼠。在正常毛细血管床,PDGFRβ⁺肾周紧密依附于毛细管毛细血管内皮细胞和稳定。然而,内皮细胞激活和受损是由于增加VEGF-A / VEGFR2表达MGP-null肾脏即使没有受伤。为了应对过度VEGF-A信号,内皮细胞移植PDGF-B表达式,进而外膜细胞分离毛细管(林et al ., 2011)。MGP不足,肾损伤表现为协同作用促进内皮损伤和周皮细胞分离。毛细管分离的周不再稳定,开始表达α-SMA,导致毛细管稀疏和受损的毛细血管血流量(智库和达菲尔德,2011年;Schrimpf et al ., 2012;智库et al ., 2013)(图6 c)。

图5

图5。MGP表达野生型小鼠的肾脏损伤。(一)MGP Immunofluorescent染色(绿色)控制(虚假的手术)和UUO肾脏post-UUO手术(7天)(左面板)。MGP表达增加肾小球细胞,间质细胞,肾小管上皮细胞后UUO受伤。g:肾小球。蓝色:核染色。酒吧,规模50μm。Mgp记录在整个肾脏也增加UUO受伤后沿时间进程(右面板)。post-UUO d3UUO: 3天,post-UUO d7UUO: 7天。结果意味着±SEM。n= 5 - 6 /组。*p< 0.05和虚假的组的学生t以及。(B)MGP表达在肾小球毛细血管内皮细胞除了管状皮质和髓质上皮细胞的控制(虚假的手术)和UUO肾脏(第三天post-UUO手术)。UUO肾损伤增强MGP表达式在肾小球和管周毛细血管和小管的顶端。箭头表示管周毛细血管内皮细胞阳性MGP(绿色)和CD31(红、内皮标记)。g:肾小球,蓝色:核染色。酒吧,规模50μm。(C)管周毛细血管内皮细胞被fluorescence-activated孤立的细胞分类(流式细胞仪)。流式细胞仪分离细胞CD31阳性(内皮标记)和消极CD11b和CD45(白细胞标记)。孤立的内皮细胞培养和染色VE-cadherin(红、内皮标记)和MGP(绿色)(左面板)。蓝色:核染色。比例尺,10μm。Mgp成绩单在孤立的测量管周毛细血管内皮细胞(右面板)。Mgp信使rna增加从UUO肾脏毛细血管内皮细胞相比从控制(虚假的手术)肾脏。post-UUO UUO: 3天。结果平均数±标准差。n虚假的= 5,n为UUO组= 6。*p< 0.05和虚假的组的学生t以及。

图6

图6。MGP在肾损伤的血管保护作用。(一)CD31 Immunofluorescent染色(绿色,内皮标记)使用肾脏的野生型和MGP^{+ /−}老鼠(左面板)。非凡的毛细管MGP回归检测^{+ /−}小鼠与野生型小鼠相比UUO后7天。g:肾小球。管周毛细血管密度(PTC)评估通过计算CD31的百分比⁺网格(右面板)。PTC MGP密度显著下降^{+ /−}小鼠与野生型小鼠相比,7天post-UUO受伤。MGP WT:野生型^{+ /−}:MGP杂合的基因敲除小鼠。结果意味着±SEM。n= 4 /组。*p< 0.05和MGP WT组的学生t以及。g:肾小球,酒吧,规模50μm。(B)Immunofluorescent染色对α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)(红、myofibroblast标志)使用肾脏的野生型和MGP^{+ /−}老鼠(左面板)。非凡myofibroblast MGP积累检测^{+ /−}小鼠与野生型小鼠相比UUO后7天。Myofibroblast积累被测量量化α-SMA的百分比⁺区(右面板)。α-SMA⁺区域在MGP显著扩大^{+ /−}小鼠与野生型小鼠相比,7天post-UUO受伤。MGP WT:野生型^{+ /−}:MGP杂合的基因敲除小鼠。结果意味着±SEM。n= 4 /组。*p< 0.05和MGP WT组的学生t以及。g:肾小球,酒吧,规模50μm。(C)示意图显示MGP-null毛细血管损伤小鼠有或没有受伤。(模型)在一个健康的毛细管,毛细血管内皮细胞(健康EC,粉红色)粘膜毛细血管基底膜(大胆的灰色线)和紧密相连的周(健康电脑,绿色)。(cb)在MGP-null毛细血管损伤,一些毛细血管内皮细胞自发损坏。受损的内皮细胞(EC受损、橙)激活一些周。激活的周(激活PC,浅绿色)迁移从毛细血管内皮细胞开始产生胶原等细胞外基质成分(棕色的波浪线)。激活内皮细胞诱导血小板聚集,导致凝固。这损害毛细血管内的血液流动。(碳碳)在MGP-null毛细血管损伤,毛细血管内皮细胞进一步激活和损坏。激活的周transdifferentiate成collagen-producing myofibroblasts(苔绿色),导致组织纤维化。不支持的周,毛细血管基底膜破坏,导致毛细血管闭塞,没有血液流动。

MGP激活血管保护治疗的影响

MGP活动的损伤导致血管损伤,这可能是重要的提高水平的积极MGP保护肾脏或其他器官与组织损伤。所示图1维生素K控制MGP的激活。华法林(最常用的口服维生素K拮抗剂)增加血清水平的不活跃的MGP,减少活性MGP主动脉组织,导致osteochondrogenic VSMCs分化转移(Krűger et al ., 2013)。低摄入维生素K与循环水平的增加不活跃MGP在肾移植受者(Boxma et al ., 2012)。在慢性肾病动物模型,维生素K缺乏症或使用华法林加剧血管钙化和增加血管硬化(McCabe et al ., 2013)。与此一致的是,华法林使用加剧动脉钙化或没有CKD患者(Tantisattamo et al ., 2015;Alappan et al ., 2020)。华法令阻凝剂使用大大提高终末期肾病患者血管钙化(最严重级别的CKD) (Alappan et al ., 2020)。MGP无关,高磷血症,慢性肾病的主要并发症之一,直接移植Runx2和诱发osteochondrogenic VSMC分化转移Sirtuin-6彻底镇压,导致血管钙化(李et al ., 2022)。Sirtuin-6是一种血管保护性蛋白(智库et al ., 2016)。这些研究结果表明,维生素K缺乏和慢性肾损伤协同扰乱生理血管结构和加重血管钙化(图7)。然而,补充维生素K 2年不正确的冠状动脉钙化,腹主动脉钙化,也没有血液透析患者的动脉硬化,虽然等离子体水平的不活跃MGP (dp-ucMGP)降低(Levy-Schousboe et al ., 2021)。血管钙化的过程是人类比老鼠更复杂。尽管MGP基因敲除小鼠显示严重动脉钙化在生活早期,血管钙化通常不出现在Keutel综合症患者伴随的损失函数MGP基因的突变(Cancela et al ., 2021)。激活的MGP维生素K单一疗法可能不足以抵消血管损伤患者的严重的肾损伤。如果可能的话,对病人有害的血栓的风险增加,华法林将取代直接口服抗凝血剂(DOACs),因为DOACs不对抗维生素k .然而,DOACs疗效和安全性的晚期CKD患者仍在调查中,尽管一些研究表明DOACs并不次于华法林在终末期肾病患者预防血栓形成和心房纤颤(Siontis et al ., 2018)。

图7

图7。维生素K的保护作用相关的激活MGP对血管钙化。MGP是激活γ-glutamate羧化作用依赖维生素K的方式。然而,华法林(最常用的维生素K拮抗剂)损害MGP激活通过抵消维生素k .慢性肾脏疾病(CKD)也块MGP激活。摄入的维生素K是降低CKD患者(特别是血液透析患者)由于饮食限制和低食欲。在CKD患者,血管钙化是由受损MGP激活和其他慢性肾病相关因素如高磷血症,血钙过多,继发性甲状旁腺功能亢进。打开蓝色箭头或线表示有益影响血管钙化,而填充红色箭头或线表示对血管钙化的有害影响。箭头表示积极的监管。⊥:负监管。

结论

尽管活跃MGP作为局部血管钙化的抑制剂,最近的研究表明,MGP也控制在开发过程中血管生成。MGP不足导致过度VEGF-A / VEGFR2信号的不正常的血管增生,导致轻度组织损伤没有外部损伤。我们发现MGP减损加剧肾损伤由于增强毛细血管损伤,表明MGP在损伤血管的保护作用。图8是一个示意图显示可能的机制来解释MGP不足引起肾损伤前后的血管损害。然而,我们仍然不知道如何MGP调节VEGF-A / VEGFR2信号,上游信号分子控制MGP表达式,什么和下游效应器分子MGP信号的确定结果。进一步的研究需要回答这些问题和修改MGP信号来治疗许多患者异常的血管生成和血管并发症。

图8

图8。可能的机制增加血管损伤MGP-deficient老鼠。在MGP-null肾脏,肾小管上皮细胞(黄色)上调ALK5的表达,导致VEGF-A分泌增加通过HIF1α激活。MGP-deficient内皮细胞(红色)上调VEGFR2的表达。为了增加VEGF-A, MGP-null内皮细胞合成和分泌大量PDGF-B TGF-β通过高架VEGFR2表达式。不受控制的PDGF-B分泌增加系膜细胞的增殖和间隙的周。夸张的沉积系膜基质破坏肾小球毛细血管结构,导致蛋白尿和肾小球硬化。激增的周transdifferentiate成collagen-producing myofibroblasts通过无拘无束的表达TGF-β,导致组织纤维化。TGF-β也刺激VEGF-A合成管状上皮细胞通过ALK5。强烈的信号通过VEGF-A / VEGFR2引起异常的血管生成,血管形成和血管阻塞导致不稳定。这些病事件最终导致管周毛细血管回归。肾损伤似乎增强系膜基质沉积,pericyte-myofibroblast过渡,形成不稳定的毛细血管,毛细血管闭塞MGP基因敲除小鼠。HIF1αALK5:激活素受体激酶受体5:低氧诱导因子1α,PDGF-B:血小板衍生生长因子b, TGF-β:转变增长factor-βVEGF-A:血管内皮生长因子a, VEGFR2: VEGF受体2。⊥:MGP抑制ALK5的过度表达在肾小管上皮细胞和内皮细胞过度表达VEGFR2,分别。

作者的贡献

即执行实验,写的手稿,并创建了数据。IY设计实验。YK IY编辑,审查,批准了手稿。

资金

作者欣然承认研究支持从美国国立卫生研究所拨款DK080926 IY()和DK080926-02S1 IY(),和西雅图儿童研究机构。

确认

作者承认Bie的优秀的技术援助Nga (Angela) Tchao。作者感谢运城姚明和克里斯蒂娜博斯特罗姆(加州大学洛杉矶分校、钙、美国)MGP击倒和MGP转基因小鼠和杰里米·达菲尔德(美国华盛顿大学、西雅图、佤邦)对肾脏孤立管周毛细血管内皮细胞消化协议。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmmed.2022.970744/full补充材料

引用

Alappan, h·R。考尔,G。、Manzoor年代。Navarrete, J。和奥尼尔,w . c (2020)。华法令阻凝剂加速内侧动脉钙化。Arterioscler。Thromb。Vasc。医学杂志。40岁,1413 - 1419。doi: 10.1161 / ATVBAHA.119.313879