小说模块化嵌合抗原受体间隔T细胞来源于信号调节蛋白αIg-like域
1月。
1,
Farhana贾汗
1,
像是Luostarinen1,戴安娜Schenkwein2,Seppo Yla-Herttuala2、3,Helka美好1,
赫克托耳Monzo
4,
Paivi m . Ojala
4,Pilvi Maliniemi1和马蒂·Korhonen1*- 1研发、芬兰红十字会血液服务,芬兰赫尔辛基
- 2大学人工智能分子科学研究所维尔塔宁芬兰东部Kuopio,芬兰
- 3基因治疗单位,Kuopio大学医院,Kuopio,芬兰
- 4平移癌症医学研究项目,芬兰赫尔辛基,赫尔辛基大学
背景:T细胞配备嵌合抗原受体(汽车)显示针对B系恶性肿瘤疗效显著。汽车结构的改善是必要的,然而,发展灵活修改间隔器中惰性与不必要的细胞相互作用。具体来说,结合细胞携带受体的免疫球蛋白可结晶的片段(货代),承认IgG-derived汽车领域是被避免。
方法:两个新汽车瞄准CD19抗原IgG1-CH2和ch3域是从signal-regulatory换成Ig-like域蛋白α(SIRPα)设计在网上。IgG1-based汽车和汽车缺乏SIRPα和IgG1域都是用作比较器。扩大细胞的表型和内存表型分析流式细胞术,和汽车T细胞活化和细胞毒性效果评估在共培养实验对CD19的回应+靶细胞。不必要的交互与FcR-expressing骨髓细胞被审问在培养化验THP-1单核细胞的细胞。
结果:制定有效的T细胞携带的小说SIRPα-based汽车在体外对CD19阳性B-lineage白血病细胞细胞毒性,与传统IgG1-based汽车T细胞。培养IgG1-based汽车T细胞与FcR-expressing THP-1单核细胞的细胞导致突出细胞表面表达CD69 T细胞一起生产白介素(IL) 2、Interferon-γIL-1β和生产,分别指示激活T细胞和单核细胞。再培养导致单核细胞的死亡。未发现迹象的T细胞和单核细胞活化与THP-1 SIRPα-based汽车T细胞共培养细胞。武装与SIRPα-based汽车有利于分化对CD4 T细胞+表型在扩张,而影响记忆T细胞的表型之间的等效SIRPαIgG1-based汽车。在试点实验中,T细胞修改的SIRPα-based汽车显示剂量依赖控制白血病细胞。
结论:小说SIRPα基于逆电流器提供一个适合发展的骨干嵌合抗原受体,逃避日常绑定到货代,而细胞保持良好记忆表型和有效的细胞毒性,为未来建立一个有前途的候选人在活的有机体内和临床测试。
1介绍
基于嵌合抗原受体(汽车)的T细胞疗法是一种新颖的血液癌症的治疗方法,具有显著的结果显示治疗难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)患者和复发(莫德et al ., 2018;公园et al ., 2018)、弥漫性大细胞b细胞淋巴瘤(乌龟et al ., 2016;Neelapu et al ., 2017;洛克et al ., 2019;Lamure et al ., 2021)和多发性骨髓瘤(中央邦et al ., 2019)。然而,为了推进汽车T细胞疗法,除了选择合适的细胞内信号和co-stimulatory域,细胞外的汽车结构需要调整,以实现高效但可容忍的细胞毒性,防止多余的相互作用启动可能的副作用。汽车微调经典包括胞内域的选择如激活CD3ζ域(第一代)和比co-stimulatory域CD28、4-1BB, OX40、CD27或国际安全和发展理事会(第二代)或一个激活域有两个co-stimulatory域(第三代)。其他的方法来调整汽车修改单个链变量序列片段(scFv)人性化,使用VHH结合区域(骆驼科抗体;nanobodies),利用bi-specific绑定、修改绑定之间的链接区域,或取代scFv通过使用人造或天然配体蛋白结合域(拉尔森和地磁,2021年)。随着炼油antigen-binding域,垫片的结构/铰链区细胞膜和antigen-binding scFv需要考试,因为它可能支持或阻碍汽车的交互与抗原和activation-induced信号的影响。常用的汽车将逆电流器来自免疫球蛋白G(免疫球蛋白)恒重链(CH),从CD8αIg-like分子(最常见的(Alabanza et al ., 2017)或CD28 (Kochenderfer et al ., 2009 b;Alabanza et al ., 2017)或细胞外NGFR一半(Casucci et al ., 2018)或NKG2D (Sentman和米,2014分别)。
组装一辆车的关键任务功能在活的有机体内是设计一个躲避spacer-related脱靶交互的结构,同时保持一个最佳的激活水平和目标细胞毒性。以前使用IgG1-based汽车(IgG1-CAR)面临类似的障碍及可溶性单克隆抗体(mAb) (吉尔和Schrum, 2013年),即IgG1重链恒定domain-2 (CH2)抗体可结晶的片段(Fc)与Fc受体结合(货代)表达髓细胞,单核细胞/巨噬细胞、NK细胞。货代是促进锁定细胞介导细胞毒性和细胞表面蛋白质抗体介入吞噬作用通过绑定的Fc-region抗体。货代绑定到汽车可能导致骨髓细胞的激活和炎症(Almasbak et al ., 2015车),T细胞活化和破坏FcR-expressing骨髓细胞,封存的汽车T细胞在肺部,激活诱导细胞死亡(上市)和整体减少汽车T细胞活动(Hombach et al ., 2010;Almasbak et al ., 2015;Hudecek et al ., 2015)。实现汽车T细胞功能在活的有机体内要求不与非标靶细胞的相互作用以及由此产生的副作用是消除。
在这里,我们表明,通过替换IgG1-CH2-CH3常数域signal-regulatory蛋白α(SIRPα)Ig-like域,日常互动的汽车就可以避免在不影响汽车的T细胞的功能。
2结果
在我们先前的工作我们使用汽车,合并为间隔IgG1 CH2和CH3域(Kaartinen et al ., 2017;Dufva et al ., 2020)。然而,由于IgG1常数域的交互IgG1-CARs FcR-expressing细胞和由此产生的障碍在活的有机体内如上所述,我们认为,惰性Ig-like域(s)将适合汽车垫片。获得惰性和修改域汽车平台,我们从SIRPα选中的元素。SIRPα形式共价二聚体通过其Ig-like C1-type 1和2域,大约对应IgG1-CH2-CH3常数域的长度(IgG1-CH2CH3:∼9.3 nm;SIRPα-Ig-like C1-domains:∼8.4 nm;数据未显示),并结合目标配体CD47通过v形域的n端(Hatherley et al ., 2009)。我们假设的v形域,其余SIRPα骨干合并在汽车平台与其他受体可能规避不必要的交互,包括货物收据,并提供一个可修改的惰性普遍的间隔。大多数汽车被认为存在称为共价结合二硫化二聚体与桥梁,促进细胞内的co-phosphorylation CD3ζ结合如酪氨酸残基的CD28域在T细胞活化诱导靶细胞(Stoiber et al ., 2019)。促进二聚体形成复杂的汽车结构可能是在设计间距器从小说中非常重要的部分。
2.1生产和嵌合抗原嵌合抗原受体T细胞受体表达
构建一个功能汽车垫片平台,我们设计了新颖的间隔器,1)模块化结构膜距离调整和2)与其他细胞通过汽车的scFv域。测试的功能SIRPα垫片在汽车平台,我们设计了两个小说CD19目标2nd代汽车scFv是来源于CD19针对小鼠单克隆抗体(FMC63)和汽车垫片IgG1常数域替换Ig-like域从SIRPα(FiCAR 1)。此外,我们的第二个结构包括一个近膜从CD28半胱氨酸(FiCAR 2)可能提高汽车的共价二聚作用。对于汽车含有跨膜和胞内信号都CD28和胞内CD3ζ域。作为一个控制我们使用CD19-IgG1 (CH2-CH3) -CD28ζ(这里称为IgG1-CAR), CD19−CD28ζ(FiCAR 7)汽车(图1一个)和一个空(模拟)向量。汽车使用第三代慢病毒载体转导到T细胞的表达汽车是由hPGK-promoter (Schenkwein et al ., 2010)。
图1。原理图和T细胞扩张的汽车动力学(n= 3)。(一)估计汽车结构原理模型。表示二硫桥是假想的。(B)T细胞扩张和台盼蓝和统计评估Bio-Rad TC20自动细胞计数天2、3、6、8、10、13之前接种的细胞。结果显示为平均值与标准差(C)褶皱扩张亚文化之间的细胞是评估每2 - 3天。不同的线表示平均值汽车T细胞。(D)汽车通过流式细胞术表达式分析了13天。结果显示单个数据点和平均值(横线)。
T细胞扩大48 - 260 13天内折,2 FiCAR转导细胞显示与经济增长放缓的趋势(图1 b)。所有FiCAR T细胞出现第二峰值特征增长(图1 c)10.25.3%-88.8%天细胞解冻后T细胞表达汽车以流式细胞仪分析了13天在不同的文化(平均数±标准差;IgG1-CAR 88.8±5.6, FiCAR 1 45.0±22.6, 60.6±22.6 FiCAR 2和FiCAR 7 25.3±14.3)以减去汽车抗体绑定的结果模拟T细胞(13.25±5.2)(图1 d和补充图印地)。代表控制策略所示补充图S2。
2.2不同的嵌合抗原受体有等效影响记忆T细胞的表型和成熟
汽车T细胞的表型和内存表型分析了批量后13天的扩张。大多数的T细胞(CD3细胞+CD56−;86 - 90%),其余NKT细胞(CD3+CD56+;9 - 13%),很少由NK细胞或残余CD3额外贡献−CD56−细胞(图2一个)。13天的扩张,T细胞配备SIRPα-based FiCARs 1 (p= 0.012)和2 (p< 0.001)支持对CD4细胞分化+表现型IgG1-CAR(相比图2 b)。NKT细胞CD4细胞+表型是著名的只有在FiCAR 2转导T细胞(图2 c)。
图2。扩张后特征的细胞表型。T细胞产品(n= 3)扩大为13天及其表型分析流式细胞术。结果显示为单独的数据点的平均值(a - c, E, F)用最大和最小值或平均值(D)。(一)细胞表型测定以下抗体组合:T细胞CD3+CD56−;NKT细胞CD3+CD56+;NK细胞CD3−CD56+和其他细胞CD3−CD56−。(B, C)的比例在T细胞CD4和CD8阳性细胞和NKT细胞群。统计显著性计算使用Mann-Whitney测试(* p < 0.05;* * p < 0.001)。(D)在13天的扩张,细胞表型分析内存。(E)SCM, SCM-like和CM记忆表型组合在一起作为一个“早期记忆表型”集团和EM和Eff作为“效应表型”组。(F)疲惫的细胞进行分析(PD-1积极)和终末分化(CD57积极)组。
早些时候我们曾报道,在汽车- 2 T细胞扩张的浓度影响T细胞记忆表型(Kaartinen et al ., 2017)。因此,我们用100 U /毫升的汽车- 2 T细胞生产规模,以避免过度的T细胞的分化和成熟。扩大的记忆T细胞表型细胞所示图2 d。更好的区分扩张过程的影响和各种汽车记忆表型,我们分组(表1)各种T细胞记忆子组早期记忆(= T供应链管理Tscm-like和T厘米)和效应(= T新兴市场和Teff)组(图2 e)。不同的汽车没有显著影响内存的表现型。此外,不同汽车T细胞相似的整体疲劳水平来衡量使用PD-1表面表达与T细胞终端效应器maturation-associated CD57标志,尽管我们观察到的表达增加与PD-1和CD57 FiCAR2 T细胞。13天的扩张后,在所有不同CAR-transduced T细胞CD4和CD8细胞的大部分是负面CD57和PD-1(66.2 - -79.9%),少数表示一个或两个表面标记(CD57−PD-1+:8 - 30%;CD57+PD-1- - - - - -:0.6 - -9.4%;CD57+PD-1+:0.4 - -14.7;图2 f)。
表1。细胞表面标志物表达模式用于细胞表型和记忆T细胞表型分析。
2.3 FiCARs诱导平等目标相比,T细胞活化和细胞毒性功能与传统IgG1-chimeric抗原受体
建立了T细胞携带SIRPα-based汽车可以成功地生成,我们接下来分析汽车的功能特性依赖于目标激活T细胞反应。分析汽车对CD19 T细胞活化+NALM-6细胞,我们测量细胞因子在隔夜培养生产1:1效应:目标(E: T细胞比例(图3一)。所有的T细胞表达不同的汽车产生大量- 2类似,趋势的更高的生产- 2(由FiCAR 1∼1.3折以上)携带细胞。没有观察到IFNγ产量的差异。
图3。T细胞反应和细胞毒性CD19阳性NALM-6细胞。均值(黑色横线)和个人数据点(图所示(A, B);n= 3)(一)汽车T细胞被NALM-6培养细胞在1:1 E: 18 h T率从共培养的细胞因子进行了分析后上层清液。(B)脱粒的T细胞反应CD19阳性NALM 6细胞被染色分析CD107a 4 h后T细胞共培养在GolgiStop蛋白质运输抑制剂。结果显示CD107a表达细胞的百分比的总T细胞和CD4和CD8的亚种。(C)在体外汽车的细胞毒性T细胞对荧光素酶表达CD19+NALM 6细胞在不同E: T比率。均值±SD。(D)在活的有机体内飞行员实验。0.5 x 106卢克+NALM 6细胞被栽种的道通过尾静脉NSG老鼠(n每组)= 2 0天。表示数量的汽车T细胞注射7天。天4-37之间的老鼠成像和荧光素酶表达CD19的排放总量+NALM 6细胞测量。值意味着+ SD。
然后我们调查了T细胞的能力释放细胞毒性颗粒在回答4 h与CD19培养+靶细胞通过测量细胞表面表达lysosomal-associated膜蛋白1 (CD107a)。布满T细胞的比例对靶细胞平行CAR-expressing细胞的比例在每个文化(图3 b),确认车表达细胞的功能。在FiCAR 1和2 T细胞培养,相对CD4的比例更高+CD107a+细胞被检测到,反之IgG1-CAR和FiCAR 7车更CD8 T细胞培养进行+布满的T细胞。这种差异与CD4就越高+FiCAR中的T细胞内容1和2 T细胞培养(图3 b)。
尽管不同的汽车表达水平和CD8+细胞数量的脱粒试验,在一个18 h与CD19共培养实验+靶细胞,所有汽车T细胞对NALM-6极为相似的细胞毒性细胞显示目标(图3 c)。所有汽车T细胞显示100%杀死功效比例2:1 (E: T)和类似的效率还较低的E: T比率。与其他两个CD19细胞毒性实验+所有的细胞系(Kasumi-2和RS4.11。)显示出类似的结果(补充数据S1C-D)。
进一步评估FiCAR T细胞的功能,我们建立了一个小规模的试点研究调查的功效FiCAR 1 T细胞对建立NALM-6细胞白血病点头。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/ SzJ (NSG)小鼠模型使用不同剂量的FiCAR 1 T细胞。FiCAR 1 T细胞显示剂量依赖的白血病细胞控制指示有效功能(图3 d)。然而,随着试点研究只包含少量的老鼠和没有负控制T细胞,需要更广泛的研究结论如果FiCAR 1 T细胞功能在活的有机体内(人类j . et al .,手稿准备)。
2.4 FiCAR T细胞逃避脱靶激活的骨髓细胞
确认后的细胞毒性功能SIRPα-based汽车,我们评估汽车T细胞与骨髓细胞的相互作用通过T细胞共培养汽车FcR-expressing THP-1单核细胞的细胞系(Fleit Kobasiuk, 1991)在1:1(效应:非标靶细胞;18 h。E: OT)率共培养细胞的激活是衡量染色的白介素2受体α链(CD25)和c型凝集素蛋白(CD69)表明长期和短期激活(Gonzalez-Amaro et al ., 2013;Shatrova et al ., 2016)的T细胞,分别为(图4一),通过测量T细胞产生的细胞因子(图4 b;汽车T细胞:IFNγ和2)和单核细胞反应程度上激活(图4 c;单核细胞:IL-1β)。所有的汽车T细胞表达CD25和等效水平高活化标记有或没有THP-1单核细胞,这可能是由于激活的CD3 / CD28微和补充在汽车- 2 T细胞生产。然而,在与汽车T细胞和THP-1单核细胞共培养,只有IgG1-CAR T细胞表达高水平的细胞表面CD69相比FiCAR-transduced T细胞(p所有FiCARs < 0.001)和模拟T细胞(p= 0.024)。相应地,只有IgG1-CAR activation-induced T细胞产生细胞因子- 2和IFNγ(FiCAR 1与IgG1-CAR,: - 2p< 0.001;IFNγ:p< 0.001和FiCAR 2与IgG1-CAR - 2:p< 0.001;IFNγ:p< 0.001)与THP-1共培养细胞,只有IL-1βIgG1-CAR T细胞诱导生产(FiCAR 1和FiCAR 2与IgG1-CAR,p在单核细胞< 0.001)。除了激活,48 h后汽车与THP-1 T细胞单核细胞共培养,我们观察到一个更高的增殖IgG1-CAR T细胞(图4 d;模拟,p= 0.064;FiCAR 1,p< 0.001;FICAR 2,p< 0.001和FiCAR 7 T细胞,p= 0.001),完全没有THP-1单核细胞与THP-1单核细胞共培养,模拟(p< 0.001)或者FiCAR 1 (p< 0.001),FiCAR 2 (p< 0.001)或者FiCAR 7 (p< 0.001)T细胞(图4 e)。综上所述,这些数据表明,FcR-carrying单核细胞的共培养IgG1-CAR导致T细胞和单核细胞活化T细胞,T细胞和单核细胞杀死,这种现象不是观察FiCAR T细胞与单核细胞的共培养。
图4。汽车T细胞相互作用FcR-expressing THP-1单核细胞。汽车T细胞被单核细胞培养在1:1(效应细胞:非标靶细胞)比(n= 3)18 h(两者)或48小时(D, E)。汽车T细胞的激活是通过分析测量细胞表面活化标志物的表达((一)CD25、CD69;流式细胞术),通过测量汽车T细胞和单核细胞活化诱导细胞因子使用流cytometry-based CBA array [(B)汽车T细胞:IFNγ- 2;(C)单核细胞:IL-1β]。(d e):T细胞(D)和THP-1单核细胞(E)被量化后流式细胞术培养48 h。100%表示T细胞的数量(D)或THP-1细胞(E)单独培养。Mann-Whitney测试(A、D、E)和单向方差分析Bonferroni调整为多个比较(B, C)评估计算统计意义(*p< 0.05;* *p< 0.001)。
3讨论
汽车沿着宽T细胞疗法正在开发前和被批准用于治疗B-lineage淋巴瘤和多发性骨髓瘤。然而,更彻底的汽车本身的结构优化是仍然需要改善汽车T细胞的功能,除了开发方法来实现最佳的T细胞记忆T细胞表型持久和有效的汽车。微调的垫片/铰链区汽车仍然很少研究,及其详细检查可能产生重要的见解优化汽车结构(Leick et al ., 2022)。
古典IgG1-based垫片用于汽车包括两个Ig-domains CH2和CH3,来自重链的恒定区(Hombach et al ., 2010;Almasbak et al ., 2015;Hudecek et al ., 2015;渡边et al ., 2016)。我们推断,代替IgG1 CH-domains,类似的垫片结构可能是有利的。SIRPα骨髓细胞膜受体,与膜蛋白交互CD47,充当自我和负调节吞噬作用的标志通过SIRPα(Hatherley et al ., 2009)。随着IgG1-CH2CH3区域(杨et al ., 2018),SIRPα是共价二聚组成三个细胞外Ig-like领域:跨膜受体的Ig-like C1-type 2, Ig-like C1-type 1和Ig-like v形域(方向从C′N′) (Hatherley et al ., 2009),其中后者结合CD47。SIRPα没有其他已知的相互作用(Hatherley et al ., 2007)。我们假设Ig-like C1-type 1和2型领域可用于FiCARs 1和2,以代替汽车垫片IgG1-CH2和CH3域,包括类似的空间维度没有结构与其他分子的相互作用。
第二,铰链区IgG1包含两个半胱氨酸残基之间形成两个二硫桥IgG1重链(哈里斯et al ., 1998),相信这次共价包含IgG1派生的二聚作用也发生在汽车铰链(Van Der Stegen et al ., 2015)。我们因此将铰链CD19针对单克隆抗体FMC63 FiCAR 1、2和7。然而,二硫桥接汽车的确切功能函数仍然是未知的。因此,在设计FiCAR 2中,我们问了一个问题:将FiCAR结构受益于额外的稳定细胞膜附近,可能这是通过第三个二硫桥吗?效果,我们利用近膜间隔CD28的地区,包含一个半胱氨酸残基,CD28二聚作用(埃文斯et al ., 2005)在构建FiCAR 2。创建“简单”汽车结构FiCAR 7,我们修改发布汽车序列(Kochenderfer et al ., 2009 a),包括相同的FMC63铰链和近膜间隔从CD28 FiCAR采用2。
所有汽车都成功地表达了在T细胞,然而,经过6天的文化FiCAR T细胞的膨胀率似乎有些(与)低于IgG1-CAR和模拟T细胞(图1 c)。扩张后,∼90%的细胞是T细胞和∼10%是NKT细胞正如我们之前所报道的(Kaartinen et al ., 2017)。CD4+:CD8+比率donor-dependent,但FiCAR 1和2产生更CD4 T细胞扩张+细胞相比IgG1-CAR (图2 b)T细胞转导,展示汽车垫片T细胞的影响。CD4的差异:CD8比率表明CD4 antigen-independent信号支持+CD8 T细胞形成或上市+T细胞。然而,没有明显的独立于目标信号是在我们的研究使用Jurkat T细胞配备报告基因,来表达FiCAR 1或2(贾汗et al .,手稿提交)。同时丰富的CD4+(Liadi et al ., 2015;Melenhorst et al ., 2022)和早期记忆T细胞数量(路易et al ., 2011;Biasco et al ., 2021)与T细胞的持久性。此外,使用早期记忆T细胞(分类:明白了表1。)在活的有机体内肿瘤模型导致提高性能(Sommermeyer et al ., 2016)。是否CD4的比例更高+细胞在FiCAR 1和2 T细胞相比IgG1-CAR FiCAR 7 T导致更好的持久性在活的有机体内在进一步的研究中,还有待测试。
在功能分析与CD19涉及汽车T细胞共培养+靶细胞我们注意到一个小但非重大的趋势,高产量,FiCAR 1和2 - 2 T细胞表达相比IgG1-CAR和FiCAR 7。更高的生产- 2可能与CD4就越高+辅助T细胞FiCAR 1和2 T细胞的内容产品,因为这些细胞产生的细胞因子(2008年,)。虽然FiCAR 7和IgG1-CAR包含更高比例的细胞毒性CD8 T细胞+T细胞,FiCAR 1和2 T细胞配备了SIRPα间隔显示细胞毒性效果相等。在此设置,由CD4 - 2+T细胞可能提高CD8的激活和溶细胞的活动+汽车T细胞(詹森et al ., 2003;廖et al ., 2013),解释等于细胞毒性(图3 c)。
传统IgG1-based汽车包含FcR-binding区域与不同结构的非标靶细胞包括髓细胞和NK细胞,阻碍汽车T细胞抗肿瘤活性在活的有机体内并导致上市和汽车T细胞封存在肺部(Hombach et al ., 2010;Almasbak et al ., 2015;Hudecek et al ., 2015)。我们发现FiCAR T细胞相比,IgG1-CAR T细胞被激活,诱导产生和IFN-γ- 2,显示出更高的增殖,并显示非目标在与THP-1单核细胞共培养细胞毒性。我们假设IgG1-CAR T细胞的激活观察到在短期内培养在我们的实验中可以体现上市报告的其他长期动物实验(Hudecek et al ., 2015)。因此,提高汽车T细胞持久性和长期的抗肿瘤功效,FcR-binding网站必须突变或删除。我们已经表明,通过替换(IgG1) CH2-CH3地区SIRPαIg-like C1域,我们创建了功能性间距器对汽车不诱导激活,细胞因子升高生产或FcR-directed细胞毒性T细胞和细胞因子在FcR-expressing THP-1单核细胞(图4)。没有activation-inducing信号表明,没有不良不相干的绑定。虽然功能功效是几乎相同的在所有的汽车,有轻微的非重要记忆的表型差异。目前人口的不同亚型的原因仍然假设但随着培养条件仍然是相同的,我们的研究结果表明,它们可能是由汽车antigen-independent低电平信号,或与其他信号相互作用的汽车半个。
在短期内在体外杀死化验,FiCAR 2 T细胞显示细胞毒性可能配备FiCAR 1, FiCAR 7或IgG1-CAR。然而,我们观察到一个小但非重大的表达增加PD-1和CD57 FiCAR 2 T细胞。这似乎意味着改变功能性质,揭示了在更彻底在体外和在活的有机体内研究人类j . et al .,在准备手稿)。
我们假设FiCAR间距器创造了可以配备替代scFv域目标其他抗原,而且这些SIRPα模块可以用来优化汽车的长度从而提供最优膜接近对于更复杂的或隐蔽的目标抗原,(贾汗f等人提交;Elmadani m等人未发表)。考虑这些结果,SIRPα-based间距器是一种很有前途的汽车结构在未来使用在活的有机体内模型和临床应用。
4材料和方法
4.1设计的嵌合抗原受体
FMC63抗体克隆的序列变量地区(基因库:免疫球蛋白轻链可变区;CAA74660.1和免疫球蛋白重链可变区;CAA74659.1)修改设计CD19针对scFv通过加入轻链和重链可变的变量四个传统GGGGS-linkers。使用的铰链区IgG1-CH1域加入scFv垫片。设计铰链之间的间隔和细胞膜,IgG1-CH2CH3常数域的长度(蛋白质数据银行:1 hzh (蓝宝石et al ., 2001)测量使用软件Bodil(版本5203;Mark Johnson, Abo血型学会大学,芬兰)和SIRPαIg-like C1-type 1和C1-type 2域(蛋白质数据银行:2绕线(Hatherley et al ., 2009)被选为合适的候选人。SIRPα主要从Uniprot获得结构数据库(P78324-1)和考虑最佳的表达和密码子选择性偏差,反向使用翻译智人密码子的基于频率估计概率分布(Quax et al ., 2015)(CD19-SIRPαCD28ζ,后来称为FiCARs 1和2)。细胞外(FiCAR 2),跨膜(TM)和胞内(IC)序列来自T特异性表面糖蛋白CD28 (Uniprot P10747-1)和胞内T细胞受体的T淋巴细胞激活域(TCR CD3ζ-chain;Uniprot P20963-3)。
作为一个积极的控制我们使用了一个IgG1-based第二代汽车(FMC63 scFv, IgG1-CH2-CH3垫片,CD28 TM - & IC-domain和CD3ζ-signaling域;IgG1-CAR;慷慨的礼物Gianpietro多蒂博士,美国北卡罗莱纳大学)和FcR-binding网站自由控制我们使用(CD19 CD28-based车−CD28ζ,;CD28 FMC63 scFv垫片,TM - & IC-domain CD3ζ-signaling域紧随其后;叫FiCAR 7)。T细胞空着慢病毒载体转导(模拟)被用作负控制在所有生产批次。
所有序列进行了分析和组装在网上使用SnapGene®软件(GSL生物技术;可以在snapgene.com)。转基因的合成和克隆(FiCAR 1、2和7)慢病毒载体构建转移(Schenkwein et al ., 2010)是外包给GeneArt(热费希尔科学GeneArt GmbH,雷根斯堡,德国)。第三代慢病毒载体携带FiCARs IgG1-CAR基因和模拟矢量在全国生产病毒实验室人工智能维尔塔宁分子科学研究所(东部大学芬兰,芬兰)。
4.2 T细胞扩张
汽车T细胞是由三个健康的捐赠者如前所述(Kaartinen et al ., 2017)。从自愿献血者,淡黄色的外套,而不是需要治疗的病人,得到从芬兰红十字会血液服务在一个机构许可证(FRCBS 178/39/2019)。外周血单核细胞(PBMC)分开一天老巴菲外套使用Ficoll-Paque溢价(美国通用电气医疗集团,芝加哥)密度梯度分离,分离、激活和T细胞CD3 / CD28微(Dynabeads人类T-Expander CD3 / CD28、热费希尔科学、卡尔斯巴德,美国)在3:1 microbead T细胞的比例。在T细胞培养,X-VIVO 15 (Lonza、巴塞尔、瑞士)中补充5%的人类AB-serum (Seralab,奥维耶多,西班牙)和100 U /毫升- 2(瑞士巴塞尔Proleukin,诺华公司)使用。T细胞密度调整1 x106细胞/毫升0 - 2和2天使用3 T细胞转导理查德·道金斯一代慢病毒载体包含FiCARs 1、2、7、IgG1-based汽车或模拟矢量。3天,洗后的向量,T细胞密度调整为0,5 x106细胞/毫升加入新鲜培养基。汽车T细胞培养,直到第十天,然后低温贮藏。评估汽车T细胞功能,第十天汽车T细胞解冻,调整后的细胞密度0 5 x106细胞/毫升,躺在实验之前完成媒体到13天。记忆的表现型,T细胞培养,直到车日13没有低温贮藏和分析。提出了工作流的实验补充图S1A。
4.3细胞系
NALM-6 (CD19+B家族所有)细胞是一个慷慨的礼物从奥利博士Lohi(芬兰坦佩雷大学)和THP-1(货代+单核细胞、单核细胞的急性白血病)和RS4.11细胞系从写明ATCC购买(THP-1;矿- 202和RS4.11;crl - 1873)。RS4.11转导使用莫伊10 luc2-eGFP向量(Vectorbuilder,芝加哥美国)。NALM-6-luc和Kasumi-2-eGFP-luc细胞株是一个慷慨的礼物博士研究Mustjoki和卢克的生成+前面描述的细胞(Dufva et al ., 2020)。短暂,Kasumi-2 NALM-6细胞转导和慢病毒载体携带eGFP荧光素酶和选择标记(Kasumi-2)或荧光素酶和新霉素抗性基因(NALM-6)聚凝胺的存在下离心2 h(800克)。使用G418抗性NALM-6细胞选择硫酸氢盐(Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国)。所有的细胞系都排序与索尼SH800细胞分选仪(美国索尼生物技术,圣何塞)和高luciferase-expressing克隆选择。rpmi - 1640年所有的细胞系培养介质(热费希尔科学、沃尔瑟姆、美国)补充10%胎牛血清(热费希尔科学),100国际单位/毫升青霉素和链霉素100μg /毫升(热费希尔科学)。
4.4流式细胞仪
这些细胞被固定为1%多聚甲醛(10分钟,+ 4°C)之前与抗体染色。分析48 h T细胞共培养实验的汽车THP-1单核细胞,这些细胞被不是固定的。作为一个控制荧光- 1 (FMO)和/或适当的同形像控制。样本运行在BD FACSAria IIu血细胞计数器(美国BD生物科学,富兰克林湖)或与家(美国贝克曼库尔特、沥青)和结果进行了分析使用FlowJo(版本10.5.3,BD生物科学)软件。
4.5嵌合抗原受体T细胞功能
4.5.1记忆T细胞的表型出现
T细胞亚型和残余NK -和NKT细胞(表1)使用以下反抗体染色BD生物科学:CD3(克隆UCHT1)异硫氰酸荧光素(FITC), CD4(克隆SK3) - BD地平线™艳紫™510 (BV510) CD8 (RPA-T8) - BD地平线™艳紫™421 (BV421)、CD56(克隆B159) -Allophycocyanin (APC)。记忆T细胞表型被确定使用CD27(克隆M-T271) -Peridinin-chlorophyll蛋白质(PerCP)共轭青蓝5.5 5.5 (Cy), CD45RA(克隆HI100) apc, CD45RO(克隆UCHL1) -藻红蛋白(PE)和青蓝7 (Cy7)和共轭CD95(克隆DX2) PE。
使用表达式定义的T细胞记忆表型标记所示表1CD4和CD8的亚种。指定T细胞成熟到一个终端effector-phenotype和疲惫,抗体为CD57(克隆NK-1) bd地平线™艳紫™421 (BV421)和CD279(克隆MIH4) -AF647使用。T细胞的表达终端效应描述标记CD57和程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1 / CD279) CD95评估+CD27±CD45RO±人群。CAR-expression测量使用F (ab′) 2片段goat-antihuman免疫球蛋白(Ig) G (H + L)共轭Alexa萤石®647(杰克逊Immunoresearch Inc .西树林,美国)。
4.5.2细胞毒性试验
的细胞毒性疗效评估汽车,T细胞被Luc培养+NALM-6, eGFP+卢克+Kasumi-2或Luc2+eGFP+RS4.11细胞在不同的效应:target-ratios (18 h。E: T)的培养,荧光素(ONE-Glo荧光素酶试剂、Promega,麦迪逊,美国)添加和生活目标细胞的存在是量化根据制造商的指示与CLARIOstar +多模标(BMG Labtech, Ortenberg,德国)。火星v5.20 R5使用CLARIOstar软件结果进行了分析。
4.5.3脱粒试验
测量目标cell-induced脱粒的T细胞,细胞被NALM-6靶细胞培养在1:1 E: T比例为4 h在存在lysosomal-associated膜蛋白1 (CD107a)抗体(PE共轭,克隆H4A3, BD生物科学)和GolgiStop™蛋白质运输抑制剂(BD生物科学)。脱粒被评估为T细胞表达细胞表面CD107a的比例+总T细胞的共培养,通过流式细胞仪测定。
4.5.4分析证明嵌合抗原受体T细胞与单核细胞的相互作用
分析汽车T细胞与单核细胞的影响,T细胞培养是THP-1单核细胞的细胞系以1:1比例18 h激活测量或48 h + 37°C细胞毒性。18 h共培养后,激活T细胞表面标记物的表达进行了分析通过流式细胞术使用CD25-AF647(克隆BC96, BioLegend)和CD69-PE(克隆FN50, BD生物科学)抗体。识别细胞类型,在这两个时间点细胞染色和CD3-FITC CD32-BV421(克隆FLI8.26, BD生物科学)或CD64(克隆10.1,BD生物科学)和表达式用流式细胞仪测量。
4.5.5细胞因子分析
量化激活诱导细胞因子的细胞毒性试验(IFNγ和2),从分析展示汽车T细胞与单核细胞的相互作用(IFNγ和IL-1β- 2)、细胞培养基(E: T比;1:1)仪分析了珠阵列(CBA人类可溶性蛋白质主缓冲区工具包一起2,IFNγ和IL-1βCBA Flex集,BD生物科学)根据制造商的指示。分析完成使用BD FACSAria IIu血细胞计数器(BD生物科学)。结果分析使用FCAP阵列软件3.0 v (BD生物科学)。
4.5.6在活的有机体内飞行员
一个试点实验研究FiCAR 1 T细胞的功能在活的有机体内进行了使用女性NSG-mice(美国杰克逊实验室)。0.5 x 106卢克+NALM-6细胞的道通过在0天尾静脉到老鼠。FiCAR 1 T细胞解冻并为6天(即亚文化。,until day 17 of the whole expansion protocol) followed by injection通过尾静脉在不同剂量(0.5、1.0和500万T细胞/鼠标;两只老鼠每组)靶细胞注射后7天。生物荧光成像(BLI)之前,老鼠使用异氟烷麻醉(1000毫克/克Attane兽医;皮拉马尔危重病B。V,荷兰)和腹腔内注射D-luciferin(25克/毫升;D-luciferin衬底盐、Synchem德国)。D-luciferin注射后,执行BLI与Lago II(美国光谱仪器成像)和排放总量值收集使用软件版本3.1.0光环(光谱仪器成像,亚利桑那州,美国)。所有动物都是根据批准的机构处理动物保健和使用委员会协议赫尔辛基大学的。批准的协议是芬兰南部地区国家行政机构(ESAVI / 10548/2019)。
4.6统计和数据
统计分析软件SPSS(27.0.1.0版)的使用。可能的捐助者和汽车T细胞相关变量之间的相关性进行了分析使用枪兵的ρ双尾检验和独立的单一团体之间的差异进行了研究t测试,Mann-WhitneyU测试或单向方差分析和多重比较Bonferroni调整。折叠累积扩张之间的差异进行了分析通过非线性回归模型和单向方差分析。时被认为是具有统计学意义的差异p< 0.05。所有的人物都画使用GraphPad棱镜(8.0.2版本)和插图创建BioRender.com。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。
道德声明
动物研究是审查和批准的芬兰芬兰南部地区国家行政机构(ESAVI / 10548/2019)。
作者的贡献
JK进行实验、分析数据,设计了CAR-constructs研究和使用。JK,可,陆地写道。基地建立了扩散、脱粒和扩展方法。DS和S-YH慢病毒载体,并专业提供援助汽车构造设计。HM和PMO进行动物实验。HG产生一个目标细胞系和参与修订实验。可和点设计和监督。所有作者contibuted在论文的写作和批准了最终版本。
资金
研究由录像机状态为芬兰红十字会血液服务研究经费,Lasten syopasaatio Vare,老猎户星座研究基金会,芬兰癌症基金会儿科研究基金会(PMO)和芬兰的文化基础。
确认
作者要感谢Sirkka Hirschovits-Gerz, Anna-Leena Kujala和Sinikka Gronholm从芬兰红十字会血液服务,奥利Dufva从赫尔辛基大学和图尔库大学的Mark Johnson寻求专业的帮助。
的利益冲突
PMO和HM CRO在猎户座公司工作执行基于芬兰开发FiCAR 1车T细胞疗法。可和JK组织专利发明者的一辆车。
其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmmed.2022.1049580/full补充材料
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关键词:汽车(嵌合抗原受体),垫片,SIRPA,信号调节蛋白α,b, CD19,货物收据
引用:人类研究J,贾汗F, Luostarinen Schenkwein D, Yla-Herttuala年代,美好的H, Monzo H, Ojala点,Maliniemi P和Korhonen M(2022)小说模块化嵌合抗原受体间隔T细胞来源于信号调节蛋白αIg-like域。前面。摩尔。地中海。2:1049580。doi: 10.3389 / fmmed.2022.1049580
收到:2022年9月20日;接受:2022年11月21日;
发表:2022年12月13日。
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