安全开关优化提高抗体介入消除汽车T细胞
b . Shabaneh降服
豪厄尔·莫菲特2
__
托马斯Derezes
斯坦·r·里德尔
马克·j·Lajoie- 1免疫疗法综合研究中心,弗雷德哈钦森癌症中心,西雅图,美国佤邦
- 2超过生物公司,西雅图,佤邦,美国
- 3莱尔Immunopharma, Inc .)、美国西雅图,佤邦,
激活一个条件安全开关有可能引发严重毒性逆转的管理工程细胞疗法,包括嵌合抗原受体(汽车)T细胞。功能上的惰性,non-immunogenic细胞表面标志源自人类表皮生长因子受体(EGFRt)是一种很有前途的在多个临床使用安全开关结构,可以西妥昔单抗的目标,一个临床可用的单克隆抗体。然而,这种方法需要高和持久的细胞表面表达EGFRt确保工程细胞的抗体介入损耗是快速和完整。在这里,我们表明,将短近膜序列纳入EGFRt多肽表面增强其表达T细胞(ADCC)及其敏感性依赖抗体的细胞毒性。将这种优化变异(EGFRopt) bicistronic更快速和tricistronic汽车设计结果在活的有机体内消除汽车T细胞和健壮的终止他们的效应活动EGFRt相比。这些研究建立EGFRopt作为一个卓越的安全开关的发展下一代细胞疗法。
介绍
汽车目标T细胞谱系限制性的临床成功表达的抗原B细胞白血病和淋巴瘤是受到毒性在病人的一个子集(Brudno Kochenderfer, 2016)。许多目标分子在追求其他恶性肿瘤也表达了对此类正常组织、增加潜在的严重的目标肿瘤的毒性。事实上,严重的毒性已经在汽车T细胞试验报告在血液和固体癌症和归因于识别正常细胞(摩根et al ., 2010;拉默斯先生et al ., 2013;范Oekelen et al ., 2021)。汽车结构插入T细胞也有一个插入突变和致癌的风险转换(Hacein-Bey-Abina et al ., 2003;Hacein-Bey-Abina et al ., 2010)。这些和其他毒性可能是可逆的,如果有条件的安全开关结合,当目标时,它会迅速而有选择性地消除过继转移患者的T细胞。
几个安全交换机已经发展这一目标。这些策略包括co-expression蛋白质对小分子药物,包括诱导caspase-9 (iCasp9), (Straathof et al ., 2005),单纯疱疹病毒酪氨酸激酶(HSV-TK) (Bonini et al ., 1997),或者人类thymidylate激酶(TMPK) (佐藤et al ., 2007)。然而,病毒的免疫原性派生HSV-TK时可能导致不必要的消除治疗细胞毒性(缺席里德尔et al ., 1996;伯杰et al ., 2006)。高表达水平的HSV-TK是必要的,有效的消除基因工程细胞和消除可能需要数天(Ciceri et al ., 2009)。相比之下,iCasp9,这是人类的派生和不太可能是免疫原性,可以快速的化学小分子药物导致细胞凋亡的细胞的转基因表达水平(高Gargett和布朗,2014年)。在造血干细胞移植的设置,iCasp9-expressing供者T细胞可以快速消除反向器官毒性造成移植物抗宿主病(GVHD)介导T细胞识别主机同种抗原(di史塔西et al ., 2011)。然而,小分子二聚不可用作为fda批准的药物,和效率的iCasp9-mediated消除转基因表达时multicistronic构造,如汽车T细胞,需要临床评估。
与小分子的目标相比,细胞表面标记T细胞的表达促进监测通过流式细胞术(为制造业和药物动力学),使定点清除,实施有针对性的抗体。这些方法包括人类表皮生长因子受体(EGFR) (王et al ., 2011)、RQR8 (菲利普et al ., 2014),或者CD20, (Introna et al ., 2000),允许使用临床批准抗体,如西妥昔单抗或以美罗华为消除注入目标人群。表皮生长因子受体是许多癌症细胞的受体酪氨酸激酶表达,可以有针对性的与西妥昔单抗(雷蒙et al ., 2014)。去除表皮生长因子受体的氨基端细胞外配体结合域I和II与胞内信号模块保留了西妥昔单抗抗原决定基和保留细胞表面表达。这截表皮生长因子受体(EGFRt)已经开发成一个转导标志和安全开关为临床T细胞疗法(王et al ., 2011;乌龟et al ., 2016 a;乌龟et al ., 2016 b;加德纳et al ., 2017;乌龟et al ., 2017),证明函数作为目标抗体介入消除在临床前模型(Paszkiewicz et al ., 2016)。(ADCC)然而,正如cetuximab-mediated依赖抗体的细胞毒性与表皮生长因子受体表达水平,西妥昔单抗抒发缓慢和不完全消融的汽车T细胞与low-EGFR表达式(木村et al ., 2007;Paszkiewicz et al ., 2016)。因此,截断EGFR的效用最大化在活的有机体内损耗,我们试图增加表面标记的表达和稳定。我们证明将短近膜序列合并到一个截断人类EGFR-derived多肽增加其细胞表面表达,导致cetuximab-mediated明显增强在体外ADCC和在活的有机体内汽车T细胞消融相比以前EGFRt描述。优化截断EGFR变异(EGFRopt)可以作为一个卓越的安全开关,以促进新一代汽车T细胞疗法的发展。
材料和方法
病毒的结构
慢病毒载体MND启动子的控制下包括以下编码序列为:ROR1-specific汽车来自R12 scFv CD28跨膜域,4-1BB和CD3z信号域,一个P2A裂解肽,并截断表皮生长因子受体包括域III, IV和跨膜域(EGFRt) (Hudecek et al ., 2013)或一个EGFR变异将额外近膜域中。构造与tricistronic磁带在坐标系联系起来,放置MND的控制下,和包括:人类c-Jun P2A肽,ROR1-specific车,P2A肽,EGFRt或EGFR变异将额外近膜域中。R12 scFv源自R12 anti-ROR1抗体(杨et al ., 2011)。MP71逆转录病毒载体是用来转换小鼠T细胞和编码:小鼠CD8α信号肽(Uniprot P01731 aa1-27), murine-CD19-specific scFv(以下简称“m19”),小鼠CD8α铰链和跨膜(Uniprot P01731 aa151 - 219),小鼠CD28 (Uniprot P31041 aa177 - 218),以及小鼠CD3z (Uniprot P24161 aa52 - 164),由P2A肽序列mouse-codon-optimized截断人类表皮生长因子受体(EGFRt;Uniprot P00533 aa334 - 668)或EGFRopt (aa334 - 671)。表示,喉炎标签II (NWSHPQFEK)和(G4S) 2与scFv铰链。生成tricistronic构造,小鼠c-Jun (Uniprot P05627 aa1 - 334)是m19克隆上游。车,由一条T2A序列连接起来。
逆转录病毒的生产
慢病毒是由瞬态传导转移质粒和第三代辅助质粒用表面(Polyplus) HEK 293 t细胞(写明ATCC)。慢病毒包含上层清液收集3天后,0.45μm过滤器,过滤与Lenti-X集中在一夜之间(豆类)和冷冻−80°C。慢病毒是效价之前使用。逆转录病毒生产,Plat-E细胞(细胞生物学实验室)是暂时性的使用磷酸钙转染(豆类)和retrovirus-containing上层清液收集2天后,0.45μm过滤器,过滤吸附在干冰冷冻储存之前,后来效价。
人类T细胞培养病毒转导
人类CD4预选,低温贮藏的主要+和CD8+T细胞从正常的捐赠者得到验血(西雅图,华盛顿州)。T细胞培养在OpTmizer介质(ThermoFisher)补充免疫细胞血清替代(ThermoFisher), 2毫米谷酰胺(Gibco) 2毫米Glutamax (Gibco), 200国际单位/毫升(研发系统)- 2,120国际单位/毫升IL-7(研发系统),和20个国际单位/毫升IL-15(研发系统)。慢病毒转导,1:10 0稀释的T细胞刺激T细胞处理(Miltenyi) 30 h。Pre-titered病毒然后添加到18 - 24 h。刺激T细胞和病毒感染被终止的7卷的新媒体和细胞因子没有办理,和细胞培养进行额外3 - 7天前分析。
小鼠T细胞病毒转导和过继转移
CD8 T细胞是消极的选择(干细胞)脾和外周淋巴结的6 - 8周前CD45.1老鼠,和刺激1毫克/毫升plate-bound anti-CD3 (145 - 2 - c11)和anti-CD28 20 h在37°C(37.51) 5%的股份有限公司2完全RPMI (RPMI - 1640, 10% heat-inactivated的边后卫,1毫米玫瑰,100 U /毫升青霉素和链霉素,1毫米丙酮酸钠,和50
流式细胞术
人类T细胞进行分析,1 - 2×106细胞染色用染料可以解决的可行性eFluor780 (eBioscience)和抗体EGFR-A488 (Hu1西妥昔单抗生物仿制;研发)、EGFR-BV421 (AY13;Biolegend)、CD3-BUV805 (SK7 ThermoFisher)和CD56-PE (HCF56;Biolegend)冰30分钟。检测R12汽车,纯化重组ROR1-Fc Alexa647内部生产和共轭。细胞被染色洗两次缓冲区(eBioscience)染色前后,固定在FluoroFix缓冲区(BioLegend),储存在4°C在黑暗中直到收购ZE5血细胞计数器(Bio-Rad)。鼠标样品,分析50µL外周血收集到EDTA-coated管,并进行了两轮ACK裂解前表面染色。样本染色使用生活/死亡可以解决的Aqua死细胞染色(英杰公司)在4°C,持续15分钟。细胞被染色的30分钟流缓冲区(PBS, 1毫米EDTA, 2%的边后卫)与抗体CD8α-FITC (53 - 6.7;Biolegend除非另有注明),CD19-PerCP / Cy5.5 (1 d3) CD4-PE-Cy7 (GK1.5) CD45.2-APC / Cy7 (104), CD45.1-BrV421(样子),hEGFR-APC BD钢片琴(AY13)和收购。细胞交替沾抗体CD8α-FITC APC (53 - 6.7), hEGFR-PE (AY13)和生物素化的anti-STII (5 a9f9 Genscript) SAv-DyLight488紧随其后。数据分析进行FlowJo 10软件(Treestar)。
抗体依赖的细胞毒性
自然杀伤细胞冻存隔绝,T细胞耗竭(CD4 / CD8 -) PBMC (AllCells)负选择使用EasySep人类NK细胞工具包(干细胞)根据制造商的协议。激活他们的溶细胞的功能,孤立的NK细胞培养与10 ng / ml RPMI-10补充人类IL-15一夜之间使用前(der et al ., 2012;瓦格纳et al ., 2017)。冻存转导主要T细胞在一夜之间被解冻,pre-cultured OpTmizer介质加细胞因子如前所述。细胞计数,在RPMI-10 resuspended,添加到96 V底板块在100年µl体积和孵化的西妥昔单抗生物仿制表示最终的浓度。IL-15影射NK细胞被添加在10:1比例NK: CAR-T细胞和V底板是轻轻地离心机(100 xg, 30年代)效应和目标细胞在一起。共培养后,剩余的车+ T细胞被流式细胞仪鉴定。样本沾anti-CD3、anti-CD56 ROR1-Fc, FVD780、固定,收购了下体积计算模式。评估了T细胞的抗体特定ADCC通过比较总CD56-CD3 + ROR1-Fc +人口生活在条件与抗体治疗或不治疗。
在活的有机体内西妥昔单抗治疗
传输损耗的EGFRt +车或EGFRopt + T细胞,西妥昔单抗(莉莉)注入的剂量在8天或14表示。当CD19老鼠决心展览b细胞发育不全+在外周血B细胞频率拒绝低于循环内生CD45.2 +细胞总数的3%是由流式细胞术。
基因表达分析
红细胞溶解使用ACK缓冲区进行25 - 35μL外周血,总RNA分离使用RNeasy微工具包(试剂盒)和互补DNA(互补)放大使用上标IV第一链合成系统(表达载体)。基因表达测定存在于ABI QuantStudio 5用TaqMan普遍掌握组合II)(应用生物系统公司)对小鼠pre-validated引物b2m(IDT黄金时段分析毫米。PT.39a.22214835;Ref NM_009735)或专门设计的引物表皮生长因子受体转基因(IDT PrimeQuest工具;FWD CCAACACCATCAACTGGAAGA;牧师GCTACACAGAGCGTGACAAA;探针TCATCAGCAACAGAGGCGAGAACA)。2基因表达测定−(ΔCT),ΔCT=CTegfr-CTb2m,然后折叠变化计算为2−(ΔCT参考sample-ΔCT测试样品)。
研究批准
动物研究按照制度进行IACUC规则(协议No.50884)。C57BL / 6 j (CD45.2)和B6。CD45.1供体老鼠FHCC从杰克逊实验室和获得安置。
统计数据
统计差异决定使用比例搭配t与Šidak测试后测试或方差分析。老鼠被随机分配到治疗组。统计分析使用棱镜9 (GraphPad)和差异被认为是重要的如果p≤0.05。
结果
基本或glycine-rich近膜序列大幅提高表面EGFR-derived蛋白质的表达
受体酪氨酸激酶,如表皮生长因子受体,共享一个共同的体系结构组成的一个细胞外配体结合域,一个单程的跨膜螺旋紧随其后的是一个灵活的近膜域蛋白激酶,c端区域(图1一个)。带正电的残留物可以推动跨膜域拓扑结构(Hessa et al ., 2007)和自由能的跨膜域插入(Lerch-Bader et al ., 2008)。与此一致的是,近膜区基本人类表皮生长因子受体是丰富的残留物,从而形成一个结构化与膜的交互(Mineev et al ., 2015)(图1 a, B)。测试序列的影响,近膜表面上的截断表皮生长因子受体分子,我们生成模块包含一个合成GMCSF-derived信号肽,表皮生长因子受体域iii iv, EGFR跨膜域,和短的胞内域来自本地表皮生长因子受体或合成序列(序列图1 b)。T678以来人类表皮生长因子受体可能是一个网站的监管磷酸化,我们有限的测试序列氨基酸669 - 677 (RRRHIVRKR)。此外,甘氨酸残基可以扰乱α-helical结构,暴露出肽骨干,我们还测试了胞内域包含非结构化甘氨酸/ serine-rich连接器(S-G4Sx2),或一小部分本地近膜域中,后跟一个甘氨酸/ serine-rich链接器(RRRS-G4Sx2)。
图1。基本或glycine-rich近膜序列强烈增加表面显示EGFR-derived蛋白质。(一)结构描述的人类表皮生长因子受体(左)和EGFRopt包含短近膜锚序列(右)基于晶体的表皮生长因子受体细胞外结构域I-IV (PDB ID 1 yy9 (李et al ., 2005)),激酶结构域(PDB ID 3共和党(红色啤酒et al ., 2009),核磁共振EGFR跨膜域和近膜结构域在脂质微粒(PDB ID 2它们(Mineev et al ., 2015)]。蛋白激酶域的序列c端没有显示。(B)肽的序列截断EGFR蛋白模块包括近膜锚序列。星号表示缺乏近膜序列前面描述的EGFRt中。(C, D)从bicistronic截断EGFR的表达模块(C)和tricistronic(D)汽车构造封闭的主要人类汽车+细胞。:代表直方图的表面检测的汽车和表皮生长因子受体在细胞转导EGFRt EGFRopt;底部显示gMFI各种测试序列的汽车和表皮生长因子受体2捐助者。符号代表2捐赠者;分析了方差分析(Dunnet事后)。
主要人类T细胞转导与慢病毒编码ROR1-specific汽车P2A跳过序列有关的各种EGFR变异。汽车的co-expression和EGFR-derived多肽通过流式细胞仪测定。EGFR变异,包括一个基本的或glycine-rich近膜序列一致证明更高的平均荧光强度,相比以前EGFRt描述,而表面表达的转化联系ROR1所有构造(车是一致的图1 c)。相对较高的表达EGFR-derived多肽观察T细胞转导在范围广泛的病毒通过合理和最优时至少使用两个近膜精氨酸残基(补充图S1A, B)。这些数据表明,添加某些近膜序列明显增加截断表皮生长因子受体的水平稳定在T细胞表面表达。
汽车构造通常包含额外的transgenes-such转录因子c-Jun-to增强治疗效果(林恩et al ., 2019)。然而,P2A肽键可以影响基因的表达对多基因磁带的终端(刘et al ., 2017)。来确定近膜序列最大化的表面表达EGFR变异tricistronic格式,我们评估结构,编码c-Jun ROR1车,和截断EGFR变异,包括没有近膜序列(EGFRt)三个精氨酸残基(将从此称为EGFRopt)或九近膜残留(EGFR-RRRHIVRKR) (图1 d)。与bicistronic观察向量,EGFR变异有近膜的表面表达序列EGFRt相比增加了四倍,而最小的减少汽车表达式被观察到。总的来说,这些研究表明,近膜域中的加入提高了细胞表面的截断EGFR的表达,而存款准备金率3氨基酸序列满足这种效果。
EGFRopt增强cetuximab-mediated汽车T细胞的裂解在体外
西妥昔单抗(ADCC)介导依赖抗体的细胞毒性的靶细胞和活动依赖于表面表皮生长因子受体表达水平(木村et al ., 2007)。我们假设高表面截断EGFR的表达会改善其效用作为汽车安全开关T细胞疗法通过加强ADCC CAR-transduced细胞。随着四个变种近膜序列实现类似的增加在人类T细胞表面表达表皮生长因子受体,这些研究主要集中在比较EGFRt(没有近膜序列)EGFRopt(存款准备金率近膜序列)(图2一个)。Bicistronic汽车T细胞表达EGFRt只有适度容易ADCC 4 - h NK细胞和西妥昔单抗治疗后,而T细胞表达EGFRopt是有效针对NK-mediated ADCC,即使在低剂量的西妥昔单抗(图2 b)。
图2。EGFRopt ADCC提高了汽车的目标T细胞在体外。(一)示意图的ADCC协议:人类CAR-T细胞与西妥昔单抗生物仿制pre-incubated之前与IL-15影射NK细胞共培养。共培养后,ADCC被评估为残余CAR-positive T细胞流式细胞术。(B)Cetuximab-mediated ADCC的T细胞转导bicistronic 4 h共培养后构造。(C)Cetuximab-mediated ADCC tricistronic构造的T细胞转导后4或24小时。(D)代表流图显示相对车表情剩下的车从C +细胞在(灰色)或缺乏对西妥昔单抗(白色)。符号在B和C代表生物复制。符号代表2 - 3的捐赠者;分析了比例搭配t测试。
观察tricistronic设置,次优ADCC当目标T细胞表达EGFRt (图2 c(左),而表达EGFRopt显著改善敏感性cetuximab-mediated ADCC (图2 c,对吧)。增加培养时间改善ADCC-mediated T细胞消融,完全消除附近EGFRopt T细胞而杀害EGFRt∼70%细胞(图2 c,对吧)。ADCC EGFRt汽车T细胞表达细胞在很大程度上局限于最高的汽车在两个时间点,只有一个小的人口非常低的汽车EGFRopt T细胞表达仍然是可行的(图2 d)。这些数据表明,增加近膜域截断EGFR提高其安全开关功能,即使在设置涉及低转基因表达。
EGFRopt增强cetuximab-mediated间隙的汽车T细胞在活的有机体内
Paszkiewicz et al。(2016)以前汽车显示小鼠T细胞表达EGFRt可以消除在活的有机体内管理西妥昔单抗。小鼠CD8 T细胞转导与EGFRopt展出更健壮的表面表达EGFRt相比,尽管类似T cell-transduction效率(补充图就是S1C, D)。西妥昔单抗是否消除EGFRopt汽车T细胞迅速超过EGFRt汽车T细胞在活的有机体内,我们过继转移T细胞(m19 murine-CD19-targeting车。汽车T)和monitored their levels in blood 3 h following treatment with cetuximab (图3 a, B)。表皮生长因子受体信使rna转录水平作为汽车替代T细胞水平的高灵敏度存在。老鼠的道与EGFRopt汽车T细胞表现出的降幅(44-fold)表皮生长因子受体转录水平相比,西妥昔单抗后小鼠的道与EGFRt汽车T细胞(3)。汽车的消耗动力学表达T细胞被生成m19证实。CAR containing a STII tag in the hinge region to allow direct staining of CAR T cells在活的有机体内(刘et al ., 2016)。正如所料,下降幅度的频率STII + EGFRopt汽车相比,T细胞EGFRt汽车观察T细胞3 h后西妥昔单抗(14倍和7倍)(图3 c)。值得注意的是,频率EGFRopt汽车T细胞在骨髓西妥昔单抗治疗后24小时EGFRt汽车相比均有显著降低T细胞(9倍和2倍),突显的功效EGFRopt快速安全开关(图3 d)。因此,EGFRopt促进更快速而深刻的cetuximab-mediated消耗的汽车T细胞在活的有机体内。
图3。EGFRopt增强抗体介导T细胞消耗的汽车在活的有机体内。(一)汽车T细胞消耗实验的示意图(罪犯)。老鼠lymphodepleted环磷酰胺(CP)和充满EGFRt或EGFRopt-marked汽车T细胞。一个星期后,老鼠接受100μg西妥昔单抗或不及时治疗。(B)定量rt - pcr分析,表皮生长因子受体水平cetuximab-treated与未经处理的小鼠。(C)汽车血T细胞频率量化流式细胞术3 h和24 h后西妥昔单抗,由垂直的线。(D)频率的汽车T细胞在骨髓24 h后西妥昔单抗。(B)n = 7 - 8,或(c - d)n = 6 - 7小鼠/组;符号和错误代表±SEM手段。没有误差棒显示SEM不到区域由符号表示。分析了方差分析(Šidak事后)。
优越的消除汽车T细胞效应与EGFRopt活动促进正常B细胞的快速复苏
西妥昔单抗管理导致更深刻的损耗EGFRopt m19。CAR cells, which we hypothesized would result in more rapid recovery of circulating CD19+B细胞。m19。CAR T cells expressing EGFRt or EGFRopt were adoptively transferred into lymphodepleted mice, and T cell engraftment and B cell aplasia were monitored in the blood over time (图4一)。正如预期的那样,一个西妥昔单抗剂量耗尽EGFRt EGFRopt汽车T细胞从血液,和汽车仍然抑制T细胞水平在整个观测期间(图4 b)。小鼠接种bicistronic m19。汽车T细胞without cetuximab exhibited a decline in the frequency of CAR T cells as lymphocyte counts recovered from lymphodepletion but had sustained B cell aplasia (图4 b, C)。相比之下,cetuximab-treated老鼠表现出B细胞在2周内恢复的药物管理局EGFRopt群,这是一周前比EGFRt队列,但没有达到统计学意义(图4 c)。群老鼠也接受tricistronic汽车轮廓相同的T细胞图4 a, B随着时间的推移细胞发育不全是血液中跟踪(图4 d)。老鼠c-Jun处理。m19汽车T细胞表现出持续的B细胞发育不全,而B细胞在老鼠cetuximab-treated 10天开始反弹后损耗EGFRopt队列,18天前比EGFRt队列(图4 e, F)。集体这些数据表明EGFRopt展品优越的函数作为一个安全开关EGFRt相比,更迅速恢复正常的CD19和结果+从造血祖细胞B细胞。
图4。EGFRopt展品优势消除汽车T细胞效应的活动。(一)原理图描绘的传输和监控bicistronic m19。汽车T(B, C)或tricistronic c-Jun.m19。汽车T细胞(D-F)。(B)频率的bicistronic m19。EGFRt m19。EGFRopt车西妥昔单抗治疗后T细胞(Cetx;白色的圆)或车辆(阿明费;黑色圆);阴影区域代表损耗。(C)CD19动力学+在m19 B细胞复苏。汽车Tcell-treated mice that received cetuximab or were left untreated.(D)频率的tricistronic c-Jun.m19。EGFRt c-Jun.m19。EGFRopt车西妥昔单抗治疗后T细胞(Cetx;白色的圆)或车辆(阿明费;黑色圆);阴影区域代表损耗。(E)CD19动力学+在c-Jun.m19 B细胞复苏。汽车Tcell-treated mice that received cetuximab or were left untreated.(F)频率的B cell-aplastic CD19老鼠(包含< 3%+总住CD45的B细胞+细胞)西妥昔单抗后消耗的tricistronic c-Jun.m19。汽车的T细胞。(c)n = 5 - 6 /组的老鼠,(D-F)n = 4 - 8老鼠/组;符号和错误代表意味着±SEM, *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001,* * * *p< 0.0001。没有误差棒显示SEM不到区域由符号表示。分析了方差分析(Šidak事后)。
讨论
这里我们报告一个优化的设计细胞表面截断EGFR安全开关,可用于跟踪和迅速切除转移T细胞在活的有机体内。EGFRopt截断,充满人类序列包括短近膜域中但缺乏配体结合和受体酪氨酸激酶信号域。我们证明的三个近膜精氨酸残基明显增加截断EGFR的表达,增强消除设计T细胞在体外和在活的有机体内使用商用抗体。EGFRopt功能惰性;删除细胞外领域I和II以及细胞内激酶结构域可以防止本机绑定和信号传输的表皮生长因子受体的配体(王et al ., 2011)。尽管这些领域,截断EGFR保留其类型我蛋白质构象和西妥昔单抗所针对的抗原决定基。剩余的细胞外域III和IV稳定表达,没有任何已知的配体或细胞粘附的作用。与此一致的是,细胞疗法的临床测试结构和表皮生长因子受体细胞外表面表达域III和IV是安全的,没有报道的毒性与表达EGFR-derived组件(加德纳et al ., 2017;Vitanza et al ., 2021)。EGFRopt是一个紧凑(∼1 kb),模块化的蛋白质,可以很容易地集成到下一代细胞疗法平台作为一个编码区或多基因盒的一部分由2连接器。
EGFR-based安全开关已优于先前描述细胞表面标记提供双重使用转导标记和安全开关。研究利用RQR8,包含一个CD34抗原决定基和两个CD20 mimotypes,展示了完整的T细胞耗竭表达monocistronic RQR8后多剂量的利妥昔单抗(菲利普et al ., 2014)。然而,当汽车T细胞表达bicistronic RQR8,损耗的差别不完全是因为对这些RQR8注入(Myburgh et al ., 2020)。另外,截断LNGFR (Mavilio et al ., 1994)、CD19 (di史塔西et al ., 2011),或者CD34 (Fehse et al ., 2000)表达内源性免疫细胞和缺乏合适的药物级cytotoxicity-inducing抗体。相比之下,表皮生长因子受体表达的不是造血细胞谱系,可以有针对性的商用,fda批准的西妥昔单抗(艾比特思)。我们的研究表明,最优目标EGFRt需要足够的细胞表面表达水平和合适的短EGFR-derived蛋白质的胞内域增加细胞表面显示3 - 5折,可能通过增强膜插入在蛋白质合成或改善膜蛋白的稳定性。这种增强的表面表达EGFRopt也观察到大tricistronic结构。
针对EGFRopt与西妥昔单抗为更快、更完全的消耗的汽车T细胞在活的有机体内车,包括低表达T细胞。自己以前的研究(Paszkiewicz et al ., 2016)和(花王et al ., 2019;王et al ., 2021)展示了效用EGFRt作为汽车的安全开关T细胞在体外和免疫活性的异种移植模型。然而,只有bicistronic构造使用和cetuximab-mediated间隙的汽车T细胞是缓慢的,不完整的,需要多个剂量的西妥昔单抗。EGFRt multicistronic使用的效用也仍不清楚。例如,当血液循环EGFRt-marked汽车T细胞靶向的高剂量(1毫克)西妥昔单抗,他们减少了双重的,需要一个额外的一周减少另一个双重之后第二个剂量(王et al ., 2021)。值得注意的是,西妥昔单抗未能显著减少汽车骨髓(副本王et al ., 2021)。此外,一项研究使用monocistronic EGFRt +细胞在异种移植模型演示了一个2 log向量拷贝数的减少在骨髓12每日剂量为1毫克西妥昔单抗的管理(花王et al ., 2019)。当bicistronic EGFRt细胞使用,拷贝数减少只有2 -折叠在这些组织(花王et al ., 2019)。汽车使用EGFRopt + T细胞,血液中我们的研究揭示了更多深刻的消耗3 h后一个低剂量的西妥昔单抗和骨髓之中减少了24小时后,减轻相比只有1/2当EGFRt + T细胞是有针对性的。因此,我们的工作支持这样的结论:健壮的截断表皮生长因子受体的细胞表面表达抒发迅速和彻底的cetuximab-mediated ADCC。这种增强EGFRopt表达并不影响汽车T细胞细胞毒性的潜力,既EGFRt +车和EGFRopt + T细胞介导的B细胞发育不全的持续时间的研究。
我们的研究仅限于描述EGFRopt在T细胞和不解决其使用去除工程先天免疫细胞如巨噬细胞和NK细胞。西妥昔单抗对某些临床与治疗剂量限制包括在80%的患者的不良反应,与9 - 19%发展中III / IV不良事件(威尔et al ., 2013),包括acneiform卵泡皮肤疹、腹痛、恶心和衰弱(雷诺兹和瓦格斯塔夫,2004年)。西妥昔单抗用于针对EGFRopt的剂量和频率会减少引起的不良事件与EGFR-positive的高剂量治疗恶性肿瘤有关。而完整的人IgG2帕尼单抗目标相同的表位嵌合IgG1西妥昔单抗,但不引起毒性(Sickmier et al ., 2016),目前的研究没有涉及帕尼单抗是否能产生足够的ADCC EGFRopt在绑定在活的有机体内。最后,我们在活的有机体内观察EGFRopt安全开关也局限于免疫活性的小鼠模型,和EGFRopt在患者的安全性和有效性还有待调查。
总之,这项工作的效用EGFRopt作为新一代的高级安全开关,转基因T细胞疗法。更加完整和迅速消耗动力学注入细胞表达EGFRopt可能增加其效用来管理注入导致的急性毒性T细胞。作为细胞疗法的目标扩大和新技术提高细胞持久性和功能,细胞消融策略使用批准临床试剂将成为越来越重要的功能。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。
道德声明
动物研究是审查和批准的机构动物保健和使用委员会弗雷德哈钦森癌症研究中心(协议编号50884)。
作者的贡献
TS,嗯,SS, TD, SP, LT获得数据并进行统计分析。TS,嗯,毫升,SR构思和设计研究。TS,嗯,毫升,老写的手稿。
资金
提供研究支持莱尔Immunopharma(批准号SRA210803)。研究资助者有以下参与:数据收集和分析在体外实验。
确认
作者感谢d . Parilla l .国王和大肠迦得的协助执行鼠标研究;答:陈对输入中存在底漆定制设计;c .猴和美国锹拌准备T细胞用于ADCC化验;吴c .慢病毒生产;和美国Boyken b·萨瑟SP,疯人,和b . Boldajipour有益的讨论。从w . Uckert MP71逆转录向量是一份礼物(Max德尔布吕克分子医学中心)。
的利益冲突
SR莱尔Immunopharma创始人之一,Inc .)和已经收到莱尔Immunopharma赠款资金,公司。SR创始人朱诺疗法,百时美施贵宝公司公司,并担任科学顾问朱诺疗法和自适应生物技术。SP是莱尔的员工Immunopharma公司毫升莱尔Immunopharma创始人之一,Inc .,超过生物。HM andML列为发明家在专利申请相关工作。嗯,LT, andMLare员工超过生物,被许可方的专利权莱尔Immunopharma旗下公司。
其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
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补充材料
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关键词:汽车T细胞疗法,安全开关,截断EGFR-derived多肽,锁定细胞细胞毒性,EGFRopt
引用:莫菲特Shabaneh结核病、高频、横梁SM Derezes T,泰特LJ,公园的年代,里德尔SR和Lajoie乔丹(2022)安全开关优化提高抗体介入消除汽车T细胞。前面。摩尔。地中海。2:1026474。doi: 10.3389 / fmmed.2022.1026474
收到:2022年8月23日;接受:2022年9月27日;
发表:2022年10月11日。
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