PIN1和PIN4抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2Baparvulin impeders胡桃酮,加以ATRA 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG挫败乙型肝炎病毒复制gydF4y2Ba
奥马尔赛义德gydF4y2Ba
*gydF4y2Ba和gydF4y2Ba
Zahra Zahid PirachagydF4y2Ba- 医学研究和发展部门,国际医学研究中心(ICMSR),伊斯兰堡,巴基斯坦gydF4y2Ba
作品简介:gydF4y2Ba人类parvulin肽基prolyl cis /反式异构酶PIN1及PIN4仍旧扮演了一个重要的角色在细胞周期进展,DNA结合,蛋白质折叠和染色质重塑,核糖体生物起源和微管蛋白聚合。在本文中,我们发现内生PIN1和PIN4调节在选定的肝细胞癌(HCC)细胞株。gydF4y2Ba
方法:gydF4y2Ba在这项研究中,我们抑制PIN1 PIN4gydF4y2Ba通过gydF4y2Baparvulin抑制剂(胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566, EGCG)。本机琼脂糖凝胶电泳(内奇)免疫印迹分析显示,在PIN1和/或PIN4抑制,不利于蛋白质表达和核心粒子或衣壳合成显著减少。PIN4抑制的影响对乙型肝炎病毒(HBV)的复制比PIN1更加明显。北部和南部印迹显示降低乙肝病毒RNA和DNA水平。gydF4y2Ba
结果:gydF4y2Ba在乙肝病毒的感染,胡桃酮,加以,ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG-mediated PIN1和PIN4显著降低乙肝病毒抑制转录活动在不影响总水平的共价闭合环状DNA (cccDNA)。类似的抑制作用PIN1 PIN4乙肝病毒复制,PIN1击倒,PIN4在乙型肝炎病毒感染细胞显示显著降低大量的胞内负担沉重,哈佛商学院,乙肝病毒pgRNA, SmRNAs,核心粒子,和乙肝病毒DNA合成。同样,PIN1和PIN4 KD废除细胞外的病毒粒子释放,裸衣壳的水平,和HBV DNA水平。与PIN1 KD相比,PIN4 KD显示减少负担沉重和/或核心粒子稳定性,表明PIN4更关键的是参与HBV复制。染色质免疫沉淀反应(芯片)分析显示,与DNA结合PIN4蛋白质,cccDNA的PIN1没有显示绑定。同样,在PIN1 KD,负担沉重国家招聘cccDNA仍不受影响。然而,PIN4 KD显著废除PIN4 cccDNA绑定,其次是国家招聘cccDNA和限制乙肝病毒转录活动。这些影响更明显PIN4 KD HBV-infected细胞细胞在药物治疗。gydF4y2Ba
结论:gydF4y2Ba比较分析显示,与PIN1相比,PIN4更关键的是参与提高乙肝病毒复制。因此,PIN1 PIN4抑制或可拆卸的可能是新治疗靶点抑制乙型肝炎病毒感染。目标抑制乙型肝炎病毒感染。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
人乙型肝炎病毒(HBV)拥有独家取向对肝细胞(gydF4y2Ba格和梅森,2015年gydF4y2Ba)。尽管可用性乙型肝炎病毒疫苗,乙肝病毒仍然是一个巨大的全球公共卫生负担,引起急性肝炎,这可能进一步发展为慢性乙肝病毒也可能进展肝癌(肝癌;gydF4y2Ba格和梅森,2015年gydF4y2Ba)。慢性乙型肝炎(慢乙肝)感染影响了全世界2.57亿人的生命。平均而言,慢性乙肝感染每年导致约088万人死亡(gydF4y2BaRevill et al ., 2020gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
乙型肝炎病毒复制机制是众所周知的;然而,几个宿主细胞蛋白质的影响,支持乙肝病毒复制并不完全理解。考虑乙肝病毒生物学在细胞或分子水平上对设计新型治疗药物对病毒感染很重要。钠/胆汁酸转运蛋白或NagydF4y2Ba+gydF4y2Ba−牛磺胆酸盐协同转运多肽(NTCP)或肝脏胆汁酸转运体(LBAT)是一种蛋白质表面受体,对乙肝病毒进入肝细胞至关重要。NTCP / LBAT由溶质载体家庭10成员1编码基因(gydF4y2BaSLC10A1gydF4y2Ba;gydF4y2Ba燕et al ., 2012gydF4y2Ba)。进入细胞后,乙肝病毒衣壳或核心粒子包含部分双链,轻松圆(RC) DNA传递到细胞核DNA和释放RC。在细胞核,polymerase-bound RC DNA改变成chromatin-like构象称为共价闭合环状DNA (cccDNA),产生乙肝病毒记录。cccDNA的转录成RNA (3.5 kb) pgRNA pre-genomic, 0.7 kb×mrna, sub-genomic(2.4和2.1 kb) mrna (gydF4y2BaNassal 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba格和梅森,2015年gydF4y2Ba;gydF4y2BaLucifora Protzer, 2016gydF4y2Ba)。单个副本cccDNA的肝脏能够re-initiating全面提高乙型肝炎病毒感染(gydF4y2BaNassal 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaLucifora Protzer, 2016gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Peptidyl-prolyl-cis /反式异构酶(PPIases)大量的酶能够调节cis /反式异构化,因此协助目标蛋白质的折叠和函数(gydF4y2BaGothel Marahiel, 1999gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陆et al ., 2007gydF4y2Ba)。PPIase蛋白分为四个家庭,包括FK506-binding蛋白质,还有,对丝氨酸/苏氨酸蛋白质phosphatase-2A (PP2A)活化剂(PTPA)和parvulins (gydF4y2Ba陆et al ., 2007gydF4y2Ba)。两种parvulin基因识别在人类基因组中包括PIN1和PIN4 (gydF4y2Ba陆et al ., 1996gydF4y2Ba;gydF4y2BaRulten et al ., 1999gydF4y2Ba;gydF4y2Ba穆勒et al ., 2006gydF4y2Ba)。PIN1基因生成PIN1蛋白,而PIN4基因生成parvulin 14 (Par14)和/或17 (Par17)蛋白(gydF4y2Ba穆勒et al ., 2006gydF4y2Ba)。PIN1拥有163个氨基酸构成的两个重要领域,即WW和PPIase域。Par14由131个氨基酸组成,而其他同种型,由可变转录起始。Par17,是由156个氨基酸组成的。Par17包含额外的25个氨基酸的氨基形成两亲的α-helix (gydF4y2Ba田et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2Ba穆勒et al ., 2006gydF4y2Ba)。PIN1和PIN4参与了与HBx交互和乙肝病毒核心粒子。parvulin蛋白调节核糖体RNA加工、DNA结合,染色质重塑,微管蛋白聚合,细胞周期进展(gydF4y2Ba蒂埃尔et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaSaningong和拜耳,2015年gydF4y2Ba;gydF4y2BaMatena et al ., 2018gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
几个主机PPIases支持病毒蛋白的修改和复制。猫科动物冠状病毒复制已报道的影响还有还有和B (gydF4y2Ba田中et al ., 2006gydF4y2Ba)。FKBP8与猪瘟病毒的NS5A蛋白促进病毒复制(gydF4y2Ba李et al ., 2016gydF4y2Ba)。FKBP6的意义对丙型肝炎病毒(HCV)的复制也被确定(gydF4y2Ba开赛et al ., 2015gydF4y2Ba)。丙肝病毒NS5A报道作为衬底的PPIase活动还有a和B,而还有B已经丙肝病毒复制的关键(gydF4y2BaWatashi et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2BaHanoulle et al ., 2009gydF4y2Ba)。PIN1扮演着重要的角色在各种病毒的复制如乙型肝炎病毒、疱疹病毒、eb病毒(EBV),猫冠状病毒,艾滋病毒和丙肝病毒(gydF4y2BaMilbradt et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba李et al ., 2021gydF4y2Ba)。突变的研究说明,在Ser19 Par14磷酸化调节的能力结合DNA和导致亚细胞定位核(gydF4y2Ba雷蒙et al ., 2003gydF4y2Ba)。k - ras基因液人类Par14报道来自抵押品肿瘤细胞(gydF4y2BaDemory Beckler et al ., 2013gydF4y2Ba)。据报道,Par14与自身免疫性慢性淤胆型肝脏疾病的发生和原发性胆汁性肝硬化(PBC),这可能导致胆汁郁积的肝纤维化或肝硬化(gydF4y2Ba米切尔et al ., 2011gydF4y2Ba)。据报道,PIN4可能导致更高的接受者癌细胞侵袭性(gydF4y2BaHigginbotham et al ., 2011gydF4y2Ba)。人类蛋白质图谱显示,HCC HepG2 parvulins的高表达细胞株(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba。内源性表达PIN1和PIN4 (Par14 / Par17)在选定的肝癌细胞。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaPIN1序列和PIN4 (Par14和Par17)的蛋白质。PIN1蛋白由163个氨基酸构成的两个重要领域,WW和PPIase域。的PIN4-encoded Par14由131个氨基酸,形成基本的氨基端DNA结合域和PPIase域。类似于Par14, PIN4-encoded Par17有额外的25个氨基酸α螺旋域之前基本和PPIase域。氨基酸序列分析PIN1、Par14 Par17由ClustalW2。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba选择肝癌细胞系表达高水平的内生PIN1,和PIN4蛋白质比THLE-2人类肝上皮细胞永生化。THLE-2(巷1),Huh7(巷2),HepG2(巷3),HepG2.2.15(巷4),PLC / PRF5(巷5),Hep3B(巷6),SNU368(巷7),SNU387(巷8),SNU449(巷9),在TC-containing HepAD38(巷11)或TC-depleted媒体(巷10),Chang(巷11),HEK293T镀(巷12)细胞密度相等(2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞每6厘米板)。人类蛋白质图谱PIN4表达式在HepG2显示引用id HPA054483。gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba相对THLE-2 PIN4基因产物含量,HEK293T, HepG2细胞。THLE-2(巷1),HEK293T(巷2),和HepG2细胞(巷3)被播种如上所述。在72 h种子期后,相同数量的蛋白质(如由布拉德福德化验)从细胞溶解产物,如前面描述的(gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba(D)gydF4y2BaPIN1局部细胞质和细胞核,而PIN4蛋白在核本地化,细胞质和线粒体的地区。HepG2细胞被播种在6厘米盘子一式三份(通道1 - 3)。在72 h post-transfection,细胞分数是准备“材料和方法”一节中描述。sds - page及免疫印迹(与小鼠单克隆anti-PIN1、兔单克隆anti-PIN4兔多克隆anti-Myc,鼠标单克隆anti-GAPDH,兔多克隆anti-H3,和鼠标单克隆抗体anti-VDAC)进行。gydF4y2Ba(E)gydF4y2BacccDNA成对肿瘤和相邻nontumor HBV-HCC患者肝活检样本。细胞溶解产物从活检样本准备的重量/体积w / v比议员缓冲区,前面描述的(gydF4y2BaPiracha et al ., 2020gydF4y2Ba)。cccDNA水平测定的临床样本使用cccDNA-specific引物作为“材料和方法”一节中描述。病人的临床参数包括年龄、性别、ALT, AST,乙肝病毒DNA(国际单位/毫升)所示。数据显示为表示从独立的三个实验。使用学生的统计显著性值测定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.005相对于控制。gydF4y2Ba
胡桃酮(也称为5-hydroxyl-1 4-naphthoquinone)灭活或抑制PIN1 PIN4竞争不可逆抑制剂(gydF4y2Ba亨尼希et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2Ba曹国伟et al ., 2001gydF4y2Ba)。加以(或1、3、6 8-tetrahydro-1 3, 6日8-tetraoxo-benzo [lmn] [3 8] phenanthroline-2 7-diacetic酸,2,7-diethyl酯)是一个竞争力PIN1和PIN4可逆抑制剂(gydF4y2Ba田et al ., 2003gydF4y2Ba)。All-trans-retinoic酸(ATRA)也被称为维甲酸或维生素A酸是一种强有力的parvulin PIN1抑制剂。ATRA抑制PIN1活动直接绑定到催化PPIase域(gydF4y2Ba亨尼希et al ., 1998gydF4y2Ba)。6、7、4′-Trihydroxyisoflavone (6、7、4 ' 7-dihydroxy-3 -THIF), 6日—(4-hydroxyphenyl) 4 h-chromen-4-one或demethyltexasin有效抑制PIN1的异构酶活动,因此作为一个潜在的parvulin PIN1抑制剂(gydF4y2BaLim et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba壮族et al ., 2021gydF4y2Ba)。KPT6566或2 -[[4 -[[[4 -(1,1 -二甲基乙基)苯基]磺酰)亚氨基的]1,4-dihydro-1-oxo-2-naphthalenyl)含硫的]醋酸块PPIase活动并导致PIN1变性(gydF4y2BaCampaner et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaYu et al ., 2020gydF4y2Ba)。儿茶素(EGCG),也称as-cis-2 - (3、4、5-trihydroxyphenyl) 3, 4-dihydro-1 -benzopyran-3 (2 h), 5、7-triol 3-gallate or-cis-3, 3′, 4′, 5、5′, 7 hexahydroxy-flavane-3-gallate,直接与PIN1结合,从而抑制其PPlase活动,因此作为一个强有力的PIN1抑制剂(gydF4y2Ba德拉通过et al ., 2021gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
在此,我们旨在确定的抑制作用PIN1并通过parvulin PIN4抑制剂,即胡桃酮,加以,ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG。parvulins的抑制,有趣的是,负担沉重的表情,负担沉重国家招聘HBV cccDNA,乙肝病毒的转录活动,核心粒子合成、HBV DNA合成,HBV病毒体分泌显著废除。与PIN1相比,PIN4 KD胡桃酮紧随其后,加以,ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG治疗,抑制乙肝病毒复制的影响更明显。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
人类parvulins乙肝病毒复制和non-replicating肝癌细胞中高度表达gydF4y2Ba
人类基因组包含两种parvulin基因,即peptidyl-prolyl顺反异构酶NIMA-interacting 1 (gydF4y2BaPIN1gydF4y2Ba),编码Pin1蛋白质,peptidyl-prolyl顺反异构酶NIMA-interacting 4 (gydF4y2BaPIN4gydF4y2Ba),编码Par14和Par17蛋白(gydF4y2Ba凯斯勒et al ., 2007gydF4y2Ba)。anti-PIN4抗体可以检测蛋白亚型Par14和Par17 (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。人类蛋白质图谱揭示了派拉蒙在肝脏parvulin mrna的表达。我们检查了内生选择parvulin蛋白的表达在人类HBV-replicating non-replicating肝癌细胞株进行比较和永生化肝转变人类的肝脏epithelial-2 (THLE-2)细胞(猴病毒40大肿瘤antigen-immortalized正常人肝上皮细胞表达肝细胞特征)。HepG2 Huh7, PLC / PRF5 Hep3B, SNU 368、387年SNU, SNU 449肝癌细胞系和乙肝病毒复制HepG2.2.15 HepAD38细胞系透露PIN1和PIN4蛋白的高表达(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。自从HEK 293 T细胞被广泛应用于腺病毒载体的传播,我们也包括HEK 293 T确定土著parvulin蛋白的蛋白质含量与正常相比THLE-2细胞。值得注意的是,PIN1和PIN4的表达水平明显高于HepG2和比THLE-2 HEK 293 T细胞(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba上面板,巷1与2 - 13和第二面板中,车道1与2 - 13)。gydF4y2Ba
此外,我们确定的物理定位内生PIN1和PIN4蛋白质在细胞中。通过差速离心技术,细胞分数(细胞质、细胞核和线粒体)准备从HepG2细胞。在细胞质和核分数PIN1本地化(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba前面板,车道1 - 3和车道4 - 6),而PIN4显示定位在细胞质中,细胞核和线粒体区域(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba第二个面板,车道1 - 3、车道4 - 6和车道7 - 9)。gydF4y2Ba
自内生PIN1和PIN4水平仍然高HBV复制和non-replicating HCC-derived细胞系,我们检查了PIN1 PIN4水平切片检查肿瘤和非相邻肝组织获得八HBV-associated肝癌的病人。然而,PIN1 PIN4表达水平保持不变。患者HBV dna的1、2、3和4与肝癌确定为551000,110252,545000,和10115国际单位/毫升。HBV-HCC患者相比之下,5、6、7和8是484000年,511000年,3990年,分别和48000国际单位/毫升(gydF4y2Ba图1 egydF4y2Ba)。从临床标本,乙肝病毒cccDNA水平检查,如前所述(gydF4y2BaZhang et al ., 2017gydF4y2Ba)。值得注意的是,HBV-associated活检肿瘤cccDNA的水平高于nontumor肝组织(gydF4y2Ba图1 egydF4y2Ba巷1和2)。gydF4y2Ba
最佳剂量的parvulin抑制剂在肝癌细胞株gydF4y2Ba
自PIN1 PIN4肝癌细胞中高度表达,我们推测parvulins的抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566, EGCG可能影响乙肝病毒复制(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。最佳剂量决心在几个肝癌细胞株。相比模拟或solvent-treated 10年,20年,30、50或100μM,药物治疗细胞的异常在Huh7 MTT试验测定,HepAD38 HepG2, HepG2.2.15细胞(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。一式三份的数据实验被用来检查50%的细胞毒性浓度(CC50)胡桃酮,加以,ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCGgydF4y2Ba通过gydF4y2BaGraphPad棱镜软件(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。胡桃酮CC50值和加以30和40μM,分别。相比之下,45岁和50μM ATRA和6,7 4′-THIF显示,50%细胞毒性的影响。然而,KPT6566 EGCG描绘45和80μM CC50值,分别。我们优化的胡桃酮的影响并加以parvulin抑制剂在不同乙型肝炎病毒复制的肝癌细胞株在20μM浓度。此外,30μM浓度被用来确定ATRA的影响,6,7,4′-THIF,和KPT6566乙肝病毒复制。而40μM EGCG的浓度是确定优化对乙肝病毒复制多个肝癌细胞株的影响。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba。MTT检测的细胞毒性parvulin抑制剂(胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566, EGCG)。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Baparvulin抑制剂包括胡桃酮的化学结构,加以,ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG所示。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaHepG2 Huh7, HepAD38, HepG2.2.15细胞暴露于不同浓度(10μM, 20μM 30μM 50μM,和100μM)抑制剂胡桃酮,加以,ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG 48 h和测定值gydF4y2Ba通过gydF4y2BaMTT试验。gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba胡桃酮的浓度,加以ATRA 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG的细胞生存能力降低到50% (CC50)的控制(溶剂)细胞治疗的决定。gydF4y2Ba
胡桃酮,竞争不可逆抑制剂PIN1 PIN4,废除表达式的负担沉重,乙肝病毒转录,核心粒子的水平,因此乙肝病毒复制gydF4y2Ba
因为parvulins肝癌细胞中高度表达,我们推测parvulins基因和/或产品可能会影响乙肝病毒复制。Juglone-mediated PIN1抑制乙肝病毒复制和PIN4效果决定在Huh7 HepAD38, HepG2, HepG2.2.15肝癌细胞系。负担沉重的表情,核心粒子的合成,HBV DNA水平大大降低。从表达下调HBc表达式PIN1和PIN4抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba胡桃酮,我们推测Juglone-mediated抑制可能会影响乙肝病毒的转录活动。检查乙肝病毒转录,Northern。乙型肝炎病毒rna的含量显著减少Juglone-treated 1.3 mer HBV-WT转染Huh7 (gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba),HepAD38 (gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba),1.3 mer HBV-WT转染HepG2 (gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)和HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba)细胞(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCgydF4y2Ba道2和3,gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba车道3和4)。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba。抑制作用PIN1和PIN4 Huh7胡桃酮降低乙肝病毒的复制,HepAD38 HepG2, HepG2.2.15。gydF4y2Ba(模拟)gydF4y2Ba胡桃酮降低乙肝病毒复制。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaHuh7细胞mock-transfected(巷1)转染4μg 1.3 mer HBV WT与乙醇和治疗(巷2),或由1.3 mer乙肝病毒转染WT(4μg)和20μM胡桃酮处理72 h(巷3)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaHepAD38是处理模拟(没有,巷1)乙醇(巷2)或接受20μM胡桃酮(巷3)72 h。gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaHepG2细胞转染与模拟(巷1),1.3 mer HBV WT(4μg)转染和治疗与乙醇(巷2),或4μg 1.3 mer HBV WT转染和胡桃酮处理(20μM) 72 h(巷3)。gydF4y2Ba(D)gydF4y2BaHepG2.2.15细胞处理模拟(没有,巷2)或治疗乙醇(巷3)或胡桃酮(20μM)治疗72 h(巷4)。莱恩1表明mock-transfected HepG2细胞(负控制)。溶菌产物进行sds - page及免疫印迹,内奇,北部和南部印迹,如前所述(gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba)。提出了数据代表三个独立的实验。使用学生的统计分析确定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.005,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0005相对于控制。gydF4y2Ba
加以,竞争可逆抑制剂PIN1 PIN4,并限制乙肝病毒复制gydF4y2Ba
以来的竞争不可逆抑制剂PPIase parvulins,胡桃酮,抑制乙肝病毒复制,我们推测,可逆抑制剂加以也可能在多个肝癌细胞株影响病毒的复制。负担沉重的表情,核心颗粒,HBV DNA水平特别是废除。自国家表达下调,我们推测PiB-mediated抑制可能会影响乙肝病毒转录。Northern显示乙型肝炎病毒rna的含量显著降低PiB-treated 1.3 mer HBV-WT转染Huh7 (gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba),HepAD38 (gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba),1.3 mer HBV-WT转染HepG2 (gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)和HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)细胞(gydF4y2Ba数字4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCgydF4y2Ba道2和3,gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba车道3和4)。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba。PiB-mediated抑制PIN1 Huh7 PIN4降低乙肝病毒复制,HepAD38 HepG2, HepG2.2.15。gydF4y2Ba(模拟)gydF4y2Ba加以减少乙肝病毒复制。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaHuh7细胞mock-transfected(巷1)转染4μg 1.3 mer HBV WT,对待DMSO(巷2),或由1.3 mer乙肝病毒转染WT(4μg)和20μM加以处理72 h(巷3)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaHepAD38处理与模拟(没有,巷1)或DMSO(巷2),或接受20μM加以(巷3)72 h。gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaHepG2细胞转染与模拟(巷1),或1.3 mer HBV WT(4μg)转染和对待DMSO(巷2),或4μg 1.3 mer HBV WT转染和加以处理(20μM) 72 h(巷3)。gydF4y2Ba(D)gydF4y2BaHepG2.2.15细胞处理模拟(没有,巷2)或治疗DMSO(巷3)或加以(20μM)治疗72 h(巷4)。莱恩1表明mock-transfected HepG2细胞(负控制)。溶菌产物进行sds - page及免疫印迹,内奇,北部和南部印迹,如前所述(gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba)。提出了数据代表三个独立的实验。使用学生的统计分析确定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.005,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0005相对于控制。gydF4y2Ba
ATRA-mediated PIN1和PIN4减少抑制病毒复制gydF4y2Ba
自从ATRA-mediated抑制PIN1抑制乳腺癌,白血病和肝癌(gydF4y2BaKozono et al ., 2018gydF4y2Ba)。我们问是否ATRA-mediated PIN1 PIN4影响乙肝病毒复制的抑制肝癌细胞。值得注意的是,在ATRA治疗,PIN1和PIN4表达水平的降低。与胡桃酮的影响,加以ATRA-mediated抑制PIN1和PIN4也减少了负担沉重的表情,乙肝病毒RNA转录,核心颗粒,HBV DNA水平Huh7 (gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba),HepAD38 (gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba),HepG2 (gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)和HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba)细胞(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaDgydF4y2Ba道2和3)。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba。PIN1和PIN4抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2BaATRA Huh7废除HBV复制,HepAD38 HepG2, HepG2.2.15。gydF4y2Ba(模拟)gydF4y2BaATRA降低乙肝病毒复制。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaHuh7细胞mock-transfected(巷1)转染4μg 1.3 mer HBV WT,对待DMSO(巷2),或由1.3 mer乙肝病毒转染WT(4μg)和30μM ATRA处理72 h(巷3)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaHepAD38处理与模拟(没有,巷1)或DMSO(巷2),或者接受30μM ATRA(巷3)72 h。gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaHepG2细胞转染与模拟(巷1),1.3 mer HBV WT(4μg)转染和对待DMSO(巷2),或4μg 1.3 mer HBV WT转染和ATRA处理(30μM) 72 h(巷3)。gydF4y2Ba(D)gydF4y2BaHepG2.2.15细胞治疗DMSO(巷2)或ATRA(30μM)治疗72 h(巷3)。莱恩1表明mock-transfected HepG2细胞(负控制)。溶菌产物进行sds - page及免疫印迹,内奇,北部和南部的印迹。提出了数据代表三个独立的实验。使用学生的统计分析确定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.005,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0005相对于控制。gydF4y2Ba
6、7、4′-THIF-mediated PPIase parvulin会使抑制乙肝病毒复制gydF4y2Ba
6、7、4′-trihydroxyisoflavone减少PIN1 PPIase活动,导致食道癌细胞凋亡的增加,抑制扩散(gydF4y2BaLim et al ., 2017gydF4y2Ba)。此外,抗癌活性的6、7、4′-THIF也决定在结肠癌(gydF4y2Ba李et al ., 2011gydF4y2Ba)。我们推测,6、7、4′-THIF-mediated抑制PPIase PIN1和PIN4可能影响乙肝病毒复制。HBc蛋白表达,乙肝病毒转录(pgRNA水平、年代mRNA和X mRNA),核心粒子合成,和乙肝病毒DNA复制明显流产6,7 4′-THIF-treated肝癌细胞(gydF4y2Ba数字6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaDgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba。PIN1和PIN4抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba6、7、4′-THIF Huh7降低乙肝病毒复制,HepAD38 HepG2, HepG2.2.15。gydF4y2Ba(模拟)gydF4y2Ba6、7、4′-THIF废除乙肝病毒复制。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaHuh7细胞mock-transfected(巷1)转染4μg 1.3 mer HBV WT,对待DMSO(巷2),或由1.3 mer乙肝病毒转染WT(4μg),治疗30μM 6, 7 4′-THIF 72 h(巷3)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaHepAD38处理与模拟(没有,巷1)或DMSO(巷2),或者接受30μM 6 7 4′-THIF(巷3)72 h。gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaHepG2细胞转染与模拟(巷1),1.3 mer HBV WT(4μg)转染和对待DMSO(巷2),或4μg 1.3 mer HBV WT转染和处理6 7 4′-THIF(30μM) 72 h(巷3)。gydF4y2Ba(D)gydF4y2BaHepG2.2.15细胞治疗DMSO(巷2)或6、7 4′-THIF(30μM)治疗72 h(巷3)。莱恩1表明mock-transfected HepG2细胞(负控制)。溶菌产物进行sds - page及免疫印迹,内奇,北部和南部的印迹。提出了数据代表三个独立的实验。使用学生的统计分析确定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.005,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0005相对于控制。gydF4y2Ba
可耐福天津公司- 6566限制乙肝病毒DNA复制的针对PIN1和PIN4 PPIasesgydF4y2Ba
可耐福天津公司- 6566以来PIN1共价结合,它能抑制PPIase活动和细胞增殖,因此表现出显著的抗癌潜力(gydF4y2BaCampaner et al ., 2017gydF4y2Ba)。我们问是否可耐福天津公司- 6566 -介导的抑制作用PIN1和PIN4在肝癌细胞中乙肝病毒复制的影响。与其它parvulin抑制剂的结果一致(胡桃酮,加以,ATRA和6、7、4′-THIF),可耐福天津公司- 6566介导抑制PIN1 PIN4也限制国家的蛋白表达,乙肝病毒转录活动,核心粒子的合成,在可耐福天津公司- 6566治疗乙肝病毒DNA复制Huh7 (gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba),HepAD38 (gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba),HepG2 (gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)和HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图7 dgydF4y2Ba)细胞(gydF4y2Ba数字7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaDgydF4y2Ba道2和3)。gydF4y2Ba
图7gydF4y2Ba。可耐福天津公司- 6566介导的抑制作用PIN1 Huh7 PIN4降低乙肝病毒复制,HepAD38 HepG2, HepG2.2.15。gydF4y2Ba(模拟)gydF4y2Ba可耐福天津公司- 6566乙肝病毒复制减少。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaHuh7细胞mock-transfected(巷1)转染4μg 1.3 mer HBV WT,对待DMSO(巷2),或由1.3 mer乙肝病毒转染WT(4μg)治疗30μM可耐福天津公司72年- 6566 h(巷3)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaHepAD38处理与模拟(没有,巷1)或DMSO(巷2),或者接受30μM可耐福天津公司对72 h - 6566(巷3)。gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaHepG2细胞转染与模拟(巷1),1.3 mer HBV WT(4μg)转染和对待DMSO(巷2),1.3或4μg mer HBV WT转染和处理可耐福天津公司- 6566(30μM) 72 h(巷3)。gydF4y2Ba(D)gydF4y2BaHepG2.2.15细胞治疗DMSO(巷2)或可耐福天津公司- 6566(30μM)治疗72 h(巷3)。莱恩1表明mock-transfected HepG2细胞(负控制)。细胞溶解产物进行sds - page和免疫印迹,内奇,北部和南部的印迹。提出了数据代表三个独立的实验。使用学生的统计分析确定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.005,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0005相对于控制。gydF4y2Ba
EGCG-mediated PIN1和PIN4抑制抑制乙肝病毒复制gydF4y2Ba
因为EGCG可以绑定到PIN1和促进抗癌活动和可能诱导癌细胞凋亡(gydF4y2Ba德拉通过et al ., 2021gydF4y2Ba),我们检查是否EGCG-mediated抑制PPIases parvulins PIN1并在肝癌细胞株PIN4影响乙肝病毒复制。负担沉重,核心粒子,HBV DNA水平显著降低。负担沉重国家表达水平下调表明EGCG-mediated抑制可能会影响乙肝病毒转录活动。pgRNA Northern分析显示低水平,mRNA, X信使rna药物治疗和1.3 mer HBV-WT转染Huh7 (gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba),HepAD38 (gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba),1.3 mer HBV-WT转染HepG2 (gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)和乙型肝炎病毒复制HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba)细胞(gydF4y2Ba数字8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaDgydF4y2Ba道2和3)。gydF4y2Ba
图8gydF4y2Ba。PIN1和PIN4抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2BaEGCG Huh7降低HBV复制,HepAD38 HepG2, HepG2.2.15。gydF4y2Ba(模拟)gydF4y2BaEGCG降低乙肝病毒复制。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaHuh7细胞mock-transfected(巷1)转染4μg 1.3 mer HBV WT nuclease-free处理水溶剂(巷2),或由1.3 mer乙肝病毒转染WT(4μg)和治疗40μM EGCG对72 h(巷3)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaHepAD38处理与模拟(没有,巷1)或溶剂(巷2),或者接受40μM EGCG(巷3)72 h。gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaHepG2细胞转染与模拟(巷1),1.3 mer HBV WT(4μg)转染和溶剂处理(巷2),或4μg 1.3 mer HBV WT转染和对待EGCG(40μM) 72 h(巷3)。gydF4y2Ba(D)gydF4y2BaHepG2.2.15细胞治疗与溶剂(巷2)或EGCG(40μM)治疗72 h(巷3)。莱恩1表明mock-transfected HepG2细胞(负控制)。细胞溶解产物进行sds - page及免疫印迹,内奇,北部和南部的印迹。提出了数据代表三个独立的实验。使用学生的统计分析确定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.005,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0005相对于控制。gydF4y2Ba
Parvulin抑制剂废除乙型肝炎病毒感染通过限制乙肝病毒转录和HBV DNA合成gydF4y2Ba
在乙肝病毒感染,乙肝病毒附件和肝细胞发生的入口gydF4y2Ba通过gydF4y2BaNTCP受体。为了证实parvulin抑制限制乙肝病毒复制的结果,我们采用通过乙肝病毒HBV感染设置野生型病毒粒子(准备从HepAD38细胞)介导感染成HepG2-hNTCP细胞为1.7×10gydF4y2Ba3gydF4y2Ba组/细胞,如前面描述的(gydF4y2BaBichko et al ., 1985gydF4y2Ba;gydF4y2BaKo et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaNkongolo et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2020年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。负担沉重,乙肝病毒成绩单、核心粒子,和HBV DNA水平相对较低(gydF4y2Ba数字9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaFgydF4y2Ba道2和3),表明PIN1的重要性和PIN4乙肝病毒的感染。此外,它增加了投机,在乙肝病毒感染,抑制PIN1 PIN4胡桃酮,加以,ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG可能减少乙肝病毒复制或向肝癌进展。gydF4y2Ba
图9gydF4y2Ba。PIN1和PIN4抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566, EGCG HBV-infected废除HBV复制的细胞。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba胡桃酮,gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba加以,gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaATRAgydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba6、7、4′-THIF,gydF4y2Ba(E)gydF4y2BaKPT6566,gydF4y2Ba(F)gydF4y2BaEGCG限制乙肝病毒感染细胞的复制。HepG2-hNTCP-C9细胞被播种和感染,如前所述,在“材料和方法”部分。感染细胞(通道2 - 3)处理溶剂(巷2)或20μM胡桃酮,20μM加以,30μM ATRA 30μM 6, 7, 4′-THIF, 30μM KPT6566, 40μM EGCG(巷3)9天,和溶菌产物进行sds - page及免疫印迹,内奇,印迹,北部和南部的印迹。显示数据是表示从三个独立的实验。统计学意义是通过学生的决定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.005,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0005相对于相应的控制。gydF4y2Ba
胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566, EGCG并不影响HBV cccDNA的水平gydF4y2Ba
自胡桃酮,加以,ATRA 6 7、4′-THIF, KPT6566, EGCG废除乙型肝炎病毒感染和限制乙肝病毒复制(gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba),我们调查是否parvulin PPIase抑制剂影响cccDNA的水平在乙肝病毒的感染。赫特提取方法进行评估乙肝病毒cccDNA的水平,如前所述(gydF4y2BaBichko et al ., 1985gydF4y2Ba;gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2020年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。乙型肝炎病毒感染细胞HepG2-hNTCP-C9紧随其后20μM胡桃酮(gydF4y2Ba图10gydF4y2Ba),20μM加以(gydF4y2Ba图10 bgydF4y2Ba),30μM ATRA (gydF4y2Ba图10 cgydF4y2Ba),30μM 6、7、4′-THIF (gydF4y2Ba图10 dgydF4y2Ba),30μM可耐福天津公司- 6566 (gydF4y2Ba图10 egydF4y2Ba),或40μM EGCG (gydF4y2Ba图10 fgydF4y2Ba)治疗显示类似cccDNA合成而不影响HBV cccDNA的水平。gydF4y2Ba
图10gydF4y2Ba。胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566, EGCG并不影响HBV cccDNA HBV-infected细胞水平。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba胡桃酮,gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba加以,gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaATRAgydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba6、7、4′-THIF,gydF4y2Ba(E)gydF4y2BaKPT6566,gydF4y2Ba(F)gydF4y2BaEGCG parvulin抑制剂并不影响HBV cccDNA的水平。Mock-infected HepG2-hNTCP-C9细胞(巷1)或HBV-infected HepG2-hNTCP-C9细胞(通道2 - 3)处理溶剂(巷2)或20μM胡桃酮,20μM加以,30μM ATRA 30μM 6, 7, 4′-THIF, 30μM KPT6566,或40μM EGCG(巷3)为10天。乙肝病毒cccDNA水平由赫特提取方法,如前所述(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba)。数据提出了三个独立的实验。gydF4y2Ba
比较击倒PIN1和PIN4显示降低HBV病毒粒子释放在乙型肝炎病毒感染系统gydF4y2Ba
比较PIN1和PIN4乙型肝炎病毒感染系统测定PIN1或PIN4选择性击倒后使用shRNA慢病毒系统。乙型肝炎病毒感染后,HepG2-hNTCP-C9转导与控制成分,PIN1成分,或PIN4 shRNA (gydF4y2Ba图11gydF4y2Ba)。结果表明,在PIN1或PIN4 KD,负担沉重,乙肝病毒成绩单、核心颗粒,胞内HBV DNA水平,和表面抗原水平相对较低(gydF4y2Ba图11gydF4y2Ba)。同样,细胞外表面水平,细胞外HBV病毒体分泌,细胞外裸核心颗粒,细胞外的HBV DNA水平显著下调(gydF4y2Ba图11 bgydF4y2Ba)。值得注意的是,cccDNA PIN1 KD设置水平并没有改变;然而,在PIN4 KD水平大大降低。与PIN1 KD相比,PIN4 KD,乙肝病毒复制和HBV病毒粒子释放减少,表明在PIN1 PIN4在乙肝病毒复制的重要性。相比PIN1 KD, PIN4 KD,负担沉重和核心粒子的稳定性显著降低,表明除了PIN1, PIN4相对更多国家的稳定的关键和核心粒子(gydF4y2Ba图11 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图11gydF4y2Ba。与PIN1 KD相比,PIN4 KD进一步降低细胞内乙型肝炎病毒复制和细胞外的病毒粒子释放HBV-infected细胞和细胞外的HBV DNA水平。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba细胞内乙型肝炎病毒复制减少PIN1 PIN4击倒。HepG2-hNTCP-C9(巷1),HepG2-hNTCP-C9 Sh续(巷2),HepG2-hNTCP-C9-PIN1 KD细胞(巷3),或HepG2-hNTCP-C9-PIN4 KD细胞(巷4)被播种和mock-infected(巷1)或乙肝病毒感染(通道2 - 3),如前所述(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。细胞内溶菌产物受到sds - page(13.5%)和内奇免疫印迹,北部和南部的印迹。赫特提取方法采用检查水平的cccDNA水平PIN1 KD或PIN4 KD细胞。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba分泌细胞外HBV病毒粒子被限制在PIN1或PIN4击倒。HBV病毒粒子,裸体核心粒子,哈佛商学院subviral粒子获得non-transduced HepG2-hNTCP-C9(巷1),HBV-infected HepG2-hNTCP-C9 Sh续(巷2),HepG2-hNTCP-C9-PIN1 KD细胞(巷3),或HepG2-hNTCP-C9-PIN4 KD细胞(巷4)检查。sds - page及免疫印迹进行使用anti-HBs、PIN1 PIN4,负担沉重国家抗体。gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba国家和核心粒子的稳定性降低PIN1和PIN4 KD Huh7稳定细胞。控制shRNA-transduced和PIN1或PIN4 KD Huh7细胞转染与Myc-HBc WT。在24 h post-transfection,细胞治疗与100μg /毫升环己酰亚胺,和溶菌产物是准备在指定的时间点。gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba染色质免疫沉淀反应(芯片)中执行HBV-infected PIN1 KD(巷2)或PIN4 KD(巷3)HepG2-hNTCP-C9细胞进行免疫沉淀反应和正常兔多克隆免疫球蛋白或anti-PIN1 anti-PIN4, anti-RNA波尔II, anti-acetyl H3,或者anti-H3抗体。免疫沉淀反应的染色质被PCR分析。提出了数据代表三个独立的实验。统计学意义是利用学生的决定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.005,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0005相对于控制。gydF4y2Ba
PIN1 PIN4 KD胡桃酮紧随其后,加以,ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG治疗限制国家招聘cccDNA,转录激活,因此乙肝病毒复制gydF4y2Ba
因为PIN1或PIN4 KD负担沉重国家蛋白表达显著降低乙肝病毒转录,我们调查是否PIN1 PIN4 KD影响国家蛋白质HBV cccDNA的招聘。染色质免疫沉淀反应(芯片)中执行HBV-infected HepG2-hNTCP-C9 PIN1或PIN4 KD细胞来确定这些parvulins cccDNA的比较效应(gydF4y2Ba图11 dgydF4y2Ba)。染色质是准备和免疫沉淀反应与免疫球蛋白或anti-PIN1,负担沉重,PIN4,乙酰化H3 (anti-AcH3), RNA聚合酶ii (anti-RNA聚合酶ii),组蛋白H3抗体,而且分析了半定量PCR (GeneAmp PCR 2700年,应用生物系统公司;gydF4y2BaBichko et al ., 1985gydF4y2Ba;gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba;gydF4y2BaPiracha et al ., 2020gydF4y2Ba)。与内生PIN1相比,内生PIN4 HBV cccDNA招募。值得注意的是,在PIN1 KD,不利于蛋白质的招聘cccDNA保持不变。然而,PIN4 KD,负担沉重的招聘,anti-RNA波尔二世和anti-AcH3 cccDNA大幅减少,表明PIN1相比,PIN4在增加乙肝病毒复制中扮演更重要的角色。gydF4y2Ba
此外,在HBV-infected PIN4 KD细胞,胡桃酮的影响(gydF4y2Ba图12gydF4y2Ba),加以(gydF4y2Ba图12 bgydF4y2Ba),ATRA (gydF4y2Ba图12 cgydF4y2Ba),6、7、4′-THIF (gydF4y2Ba图12 dgydF4y2Ba),KPT6566 (gydF4y2Ba图12 egydF4y2Ba),EGCG (gydF4y2Ba图12 egydF4y2Ba)确定芯片紧随其后。结果显示,招聘内生PIN4和负担沉重到乙肝病毒cccDNA的parvulin抑制剂的治疗方式可以降低在胡桃酮(gydF4y2Ba图12gydF4y2Ba),加以(gydF4y2Ba图12 bgydF4y2Ba),ATRA (gydF4y2Ba图12 cgydF4y2Ba),6、7、4′-THIF (gydF4y2Ba图12 dgydF4y2Ba),KPT6566 (gydF4y2Ba图12 egydF4y2Ba),EGCG (gydF4y2Ba图12 egydF4y2Ba)。染色质的转录活动(anti-RNA波尔二世和anti-AcH3-specific Abs)进一步减少parvulin抑制剂治疗。值得注意的是,PIN4 KD细胞进一步减少在治疗上述parvulin抑制剂(gydF4y2Ba数字12gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaDgydF4y2Ba巷2和3)。PIN1 KD和/或PIN4 KD parvulin抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566, EGCG可能表明可能的治疗选择功能对预防hepatocarcinogenesis治疗慢性乙肝。gydF4y2Ba
图12gydF4y2Ba。ATRA PIN4 KD其次是胡桃酮,加以,6,7,4′-THIF, KPT6566, EGCG治疗显著降低HBc招聘cccDNA HBV-infected细胞和乙肝病毒转录活动。gydF4y2Ba(f)gydF4y2BaHepG2-hNTCP-C9-PIN4 KD细胞mock-infected(巷1)或乙肝病毒感染(通道2 - 3)和溶剂处理(巷2),或parvulin抑制剂gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba20μM胡桃酮,gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba20μM加以,gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba30μM ATRA,gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba30μM 6、7,4′-THIF,gydF4y2Ba(E)gydF4y2Ba30μM KPT6566,gydF4y2Ba(F)gydF4y2Ba40μM EGCG。染色质的解决方案和芯片进行HBV-infected HepG2-hNTCP-C9-PIN4 KD细胞,如“材料和方法”一节所述,受到免疫沉淀反应与正常兔多克隆免疫球蛋白,anti-PIN1, anti-PIN4, anti-RNA波尔II, anti-acetyl H3,或者anti-H3抗体。免疫沉淀反应的染色质被PCR分析。提出了数据代表三个独立的实验。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
病毒已经采取多种策略来抑制宿主防御机制通过调节几个细胞蛋白质帮助病毒复制。人类PPIases(作为分子开关)扭曲的靶蛋白骨干(cis /反式构象)功能激活或失活的酶(gydF4y2Ba陆et al ., 2007gydF4y2Ba)。病毒使用某些主机PPIases(还有,FK506-binding蛋白质、parvulins和对丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2 (PP2A)活化剂)病毒蛋白修改支持复制(gydF4y2BaGothel Marahiel, 1999gydF4y2Ba;gydF4y2BaUnal Steinert, 2014gydF4y2Ba)。乙肝病毒的生命周期被广为研究;然而,几位宿主因素,参与病毒复制等待进一步调查。parvulins, PIN1与HBx SP交互主题为HBx transactivation和提高hepatocarcinogenesis (gydF4y2Ba彭日成et al ., 2007gydF4y2Ba),而PIN4-encoded Par14 / Par17结合RP图案HBx和移植HBV复制(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。PIN1可以绑定到HBc Thr160-Pro和Ser162-Pro图案,稳定phosphorylation-dependent方式提高乙肝病毒传播(gydF4y2Ba彭日成et al ., 2007gydF4y2Ba)。乙型肝炎病毒核心粒子180或240 PIN4绑定网站(gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba单一的RP在此主题。parvulin-binding RP图案位于n端结构域,这是至关重要的核心粒子组装(gydF4y2Ba加莉娜et al ., 1989gydF4y2Ba;gydF4y2Ba伯恩鲍姆和Nassal, 1990gydF4y2Ba)。我们最近报道,PIN4结合国家和乙肝病毒核心粒子gydF4y2Ba通过gydF4y2BaRP主题在负担沉重,稳定支持乙肝病毒复制(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2021gydF4y2Ba)。此前,PIN1抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566, EGCG在各种癌症被广泛研究。然而,PIN1抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba上述抑制剂的上下文中从未检查乙肝病毒生物学。我们首先证明PIN1和PIN4抑制效果gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566, EGCG在乙肝病毒感染。在此,我们提供证据表明抑制PIN1 PIN4gydF4y2Ba通过gydF4y2Baparvulin抑制剂可以显著废除国家的表情,病毒转录,核心粒子的形成,HBV病毒粒子释放。gydF4y2Ba
PIN1-and PIN4-encoded蛋白质微分对乙肝病毒复制的影响。PIN1可以稳定乙肝病毒核心蛋白,促进复制,HBV-induced HCC可能发挥重要作用(gydF4y2BaNishi et al ., 2020gydF4y2Ba)。PIN4-encoded Par14 Par17可以绑定到负担沉重和乙肝病毒核心颗粒,结合身体cccDNA, HBx-cccDNA之间充当桥梁和HBc-cccDNA (gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。在此,通过一系列的实验,结果表明:与PIN1相比,PIN4在移植中扮演更重要和深远的影响乙肝病毒复制从cccDNA病毒粒子释放。PIN4击倒减少Par14和Par17蛋白质到cccDNA的招聘和潜在的降低与cccDNA绑定,因此降低HBV病毒转录如图所示的污点北部HBV-infected HepG2-NTCP。PIN4绑定的潜在影响国家和乙肝病毒核心粒子也广泛的调查,我们已经表明,高度保守的RP在负担沉重国家起着至关重要的作用在物理与PIN4-encoded蛋白质绑定(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2021gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
除了PIN1和PIN4抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2Baparvulin抑制剂,我们专门撞倒了PIN1 PIN4检查独家这些parvulins乙肝病毒复制的影响。PIN1 KD和PIN4 KD显著降低乙肝病毒复制的病毒转录病毒粒子释放。与PIN1 KD相比,PIN4 KD,此表达式与稳定,乙肝病毒cccDNA的水平,乙肝病毒的转录活动,核心粒子合成和稳定,细胞内乙型肝炎病毒DNA复制、细胞表面抗原水平,细胞外HBV病毒粒子,细胞外裸核心粒子,和细胞外的HBV DNA水平废除更深刻,这表明PIN4比PIN1关键在促进乙肝病毒复制。微管是高效的关键核心粒子形成和乙肝病毒复制(gydF4y2BaIwamoto et al ., 2017gydF4y2Ba)。PIN1 PIN4可以与微管蛋白促进其聚合(gydF4y2BaHamdane et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba蒂埃尔et al ., 2011gydF4y2Ba)。由于我们研究的限制,我们无法确定是否PIN1 PIN4促进乙肝病毒复制gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba增强微管蛋白聚合;然而,证据补充weightage发现PIN1和PIN4有效移植乙肝病毒复制和病毒的生命周期。gydF4y2Ba
乙肝病毒负担沉重和HBx可以影响cccDNA表观遗传动力学(gydF4y2Ba香港et al ., 2017gydF4y2Ba)。以前,这是猜测,国家是由压实cccDNA专制对乙肝病毒转录的影响(gydF4y2Ba一杯啤酒et al ., 2001gydF4y2Ba)。然而,最近的一些研究证据支持的国家可以优先与cccDNA II CpG岛,往往变换核小体的间距cccDNA-bound组蛋白复杂,并能引发hypomethylation组蛋白。这种现象进一步发展对增强招聘循环AMP-responsive增强器结合蛋白水平和增加组蛋白乙酰化作用,因此促进cccDNA转录(gydF4y2Ba郭et al ., 2011gydF4y2Ba)。许多宿主蛋白质可以直接绑定到cccDNA和增强转录(gydF4y2BaMohd-Ismail et al ., 2019gydF4y2Ba)。值得注意的是,与PIN4相比,直接绑定到cccDNA PIN1没有显示。然而,相比之下PIN4 KD (cccDNA水平和国家招聘cccDNA明显下调),PIN1 KD, cccDNA的水平和国家招聘cccDNA保持不变。有趣的是,在PIN4 KD,其次是药物(胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566,或EGCG)治疗,此招聘cccDNA因此乙肝病毒转录活动急剧减少。鉴于调节HBsAg和HBV DNA水平与肝细胞癌的高危的发展(gydF4y2Ba曾et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba丐et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaKawanaka et al ., 2014gydF4y2Ba),PIN1在肿瘤发展中扮演重要角色gydF4y2BaKozono et al ., 2018gydF4y2Ba);PIN4 PGCIα感应和肿瘤恶化至关重要gydF4y2Ba弗拉蒂尼et al ., 2018gydF4y2Ba);和抑制或击倒PIN1和PIN4显著降低乙肝病毒DNA和HBsAg的水平。可以推断,PIN1和PIN4(最好)击倒和/或parvulin抑制可能是重要的治疗选择功能治疗慢性乙肝和/或HBV-associated肝癌。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
细胞培养和DNA转染gydF4y2Ba
PLC / PRF5 SNU368 SNU387, Chang SNU449细胞在DMEM和人类肝脏上皮THLE-2细胞(写明ATCC®crl - 2706™)是生长在支气管上皮细胞基底介质(BEBM;Lonza # cc - 3171)以10%的边后卫(penicillin-streptomycin Gibco)和1% (PS)。基本媒介THLE-2 ATCC-recommended重要媒体和BPE补充,氢化可的松,高能,胰岛素,三碘甲状腺氨酸,转铁蛋白,视黄酸,phosphoethanolamine,重组人表皮生长因子。Huh7、HepAD38 HepG2、HepG2.2.15 HepG2-hNTCP-C9, HEK293T细胞在DMEM和10%的边后卫和1% PS在37°C公司为5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。G418(0.5毫克/毫升)中选择添加HepG2.2.15细胞。HepAD38细胞保持在1μg /毫升的四环素(TC),和中补充了新鲜培养基(TC)发起乙肝病毒复制。第二天HEK293T细胞通道;然而,Huh7 HepAD38、HepG2 HepG2.2.15细胞通过每隔两天。感染相关性实验,然而,对于病毒培养液是收获HepAD38上层清液的细胞(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba)。乙型肝炎病毒表面抗原具有类属特异性的抗原决定簇a和两对互相排斥subtype-specific因素命名为“d”或“y”和“r”或“w”;因此,它可以进一步区分为四个主要亚型包括adr、adw ayw,埃尔(gydF4y2BaBichko et al ., 1985gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
值得注意的是,3×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba6厘米的HepAD38细胞板被播种在TC媒体,和第二天,媒体被替换为新的媒介(TC)。值得注意的是,3×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba盘子HepG2.2.15细胞被播种在6厘米;3×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaHepG2细胞的转染4μg 1.3 mer乙肝病毒与12μg / WT aywμl裴溶解在200μl Opti-MEM。同样的,2×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaHuh7细胞的转染4μg 1.3 mer HBV WT和12μg / 200年裴μlμl Opti-MEM。gydF4y2Ba
建立稳定的细胞系gydF4y2Ba
短发卡rna (shPIN1和shPIN4 shControl)在pLK0.1向量形式购买从西格玛奥德里奇(SHCLNG-NM_006223和SHC001)。生成PIN1或PIN4击倒稳定细胞,1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba6厘米HEK293T细胞板和1.5μg pGAG-Pol triple-transfected, 0.5μg pVSV-G, 2μg pLK0.1-shControl, 2μg pLK0.1-shPIN1或shPIN4。随后pseudoviral粒子,因为shPIN1、shPIN4或shControl rna被接种到HepG2-hNTCP-C9细胞和与嘌呤霉素选择生成PIN1或PIN4 KD稳定细胞。24小时后,手机媒体与新媒体补充,和上层清液(包含慢病毒粒子pseudoviral PIN1或PIN4 KD成绩单)在72 h post-transfection收获。卷2毫升的收集的上清液和10μg /毫升聚凝胺(溴化hexadimethrine Sigma-Aldrich)新鲜2毫升的介质混合和转导HepG2-hNTCP-C9细胞。在24 h post-inoculation,这些细胞被替换为新的媒介,增长到90%以上confluency,稀释用1:2或1:3,开始选择通过嘌呤霉素(10μg /毫升)。gydF4y2Ba
乙肝病毒衣壳或核心粒子隔离和免疫印迹gydF4y2Ba
乙肝病毒核心粒子进行了分析使用50 mM氯化钠,10毫米Tris-HCl (pH值8.0),和1毫米与0.2% EDTA NP-40 (Sigma-Aldrich、美国)细胞裂解缓冲。溶菌产物(4%)受到1%内奇和蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔)。免疫印迹gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba主要anti-HBc 1:1,000稀释的兔多克隆抗体绑定到二级(anti-rabbit 1:5,000稀释)抗体是通过免疫印迹检测试剂和可视化增强化学发光(ECL Amersham)。ImageJ。1.46 r揭示乙肝病毒核心粒子的相对强度,如前所述(gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
细胞的细胞毒性试验gydF4y2Ba
的细胞毒性效应parvulin抑制剂(胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566, EGCG)gydF4y2Ba通过gydF4y2BaMTT (3 - 4, 5-dimethylththiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴)试验测定在Huh7 HepAD38 HepG2, HepG2.2.15细胞系。细胞种植在96 -微型板块和孵化胡桃酮系列稀释,加以,ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566或EGCG 48 h在37°C。细胞的异常检测与100年取代培养基后μl DMEM麻省理工。3 h后,100μl DMSO溶液添加到溶解MTT的甲瓒。吸光度值为570 nmgydF4y2Ba通过gydF4y2Ba板的读者。之后,胡桃酮的浓度,加以ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG的细胞生存能力降低到50% (CC50)的控制被确定。gydF4y2Ba
钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和免疫印迹gydF4y2Ba
布拉德福德进行化验,以确定等于细胞溶解产物中蛋白质含量,如前所述(gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba)。NP-40-NTE溶解产物(0.2%)受到sds - page(13.5%)和免疫印迹使用anti-PIN1(鼠标单克隆1:1,000稀释,圣克鲁斯生物技术# sc - 46660), anti-PIN4(兔单克隆1:1,000稀释,Abcam # ab155283), anti-GAPDH(鼠单克隆1:5,000稀释,圣克鲁斯# sc - 32233), anti-H3(兔多克隆在1:5,000 Abcam # ab1791), anti-VDAC(鼠单克隆1:1,000稀释,Calbiochem # 529532), anti-HBs(兔多克隆1:1,000稀释,Virostat # GF528),和anti-C9(鼠标anti-rhodopsin 1:1,000单克隆,微孔# MAB5356)后跟狂犬病或anti-mouse抗体与辣根过氧化物酶(1:5,000稀释)耦合。免疫印迹可视化使用ECL,和相对蛋白质含量测定使用ImageJ。1.46 r。gydF4y2Ba
北部和南部吸水和放射自显影法gydF4y2Ba
乙型肝炎病毒RNA和DNA合成测定HBV复制细胞使用北部和南部印迹方法,如前所述(gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba)。简而言之,总rna提取根据制造商的指示。rna是变性的卷20μg 10分钟在65°C和受到1.2%内奇(使用超纯琼脂糖,英杰公司# 16500500)与含有10毫米EDTA的缓冲区,200毫米拖把,(1×拖把),50毫米醋酸钠(pH值7.0),和甲醛(Sigma-Aldrich # F8775)。之后,乙肝病毒rna被转移到尼龙膜(罗氏# 11417240001)乙肝病毒完整具体,gydF4y2Ba32gydF4y2BaP-labeled random-primed probe-labeled杂交在68°C (4 h)和放射自显影法。同样,由南方印迹,提取的dna从核心粒子或衣壳是由内奇,转移到尼龙膜(绘画纸# 10416296),gydF4y2Ba32gydF4y2BaP-labeled random-primed探针间接地杂化放射自显影法,如前面描述的(gydF4y2BaBichko et al ., 1985gydF4y2Ba;gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2020年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
HBV病毒粒子分析gydF4y2Ba
分析HBV病毒粒子,6×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba10厘米HepAD38-Par14/17细胞板被播种和TC在24 h种子期后删除。TC切除四天后,细胞收集上层的收获和文化。上层清液通过离心过滤紧随其后通过0.45μM syringe-top过滤器,分层在20%蔗糖垫在缓冲区,并受ultra-centrifugation(贝克曼库尔特最适条件l - 90 K)在26000 rpm在4°C (3 h)。颗粒有裸体核心粒子,哈佛商学院subviral粒子,和HBV病毒粒子re-suspended内奇在《缓冲区和受到1%,13.5% sds - page,和南部的印迹,如前所述(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
核,细胞质和线粒体细胞分离gydF4y2Ba
值得注意的是,3×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba6厘米HepG2细胞板的收获在72 h。细胞的核和胞质分离准备,如前面描述的(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。细胞在0.1毫米0.5% EDTA收获,0.5蔗糖,10毫米玫瑰(pH值7.9),特里同x - 100, 10毫米氟化钠,50毫米氯化钠,1毫米德勤包含缓冲区。5分钟后,溶解产物离心10分钟100×gydF4y2BaggydF4y2Ba。gydF4y2Ba
核分数在颗粒分离细胞质分数gydF4y2Ba
500μl的颗粒被德勤缓冲区包含1毫米,10毫米消息灵通的pH值7.9,0.1毫米EDTA, 10毫米氯化钾,EGTA和0.1毫米。核的核颗粒细胞溶解与300年μl裂解(500毫米氯化钠,德勤1毫米,10毫米消息灵通的pH值7.9,0.1毫米EDTA, 0.1毫米EGTA,和0.1% NP-40)缓冲区。上层清液的离心10分钟在13000×4°CgydF4y2BaggydF4y2Ba收集、碎片被上层清液核分离提取。从胞质分离,分离线粒体分数,如前所述(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba)。简单,差速离心的细胞质上层清液受到在4°C 10000×30分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba。获得的颗粒分离线粒体分数。再次,上层清液分离re-centrifuged 15分钟在13000×4°CgydF4y2BaggydF4y2Ba和收集细胞质分离。孤立的线粒体细胞溶解使用缓冲区包含150毫米氯化钠,50 mM Tris-HCl (pH值7.4),0.5% (v / v)特里同x - 100, 1毫米phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF), 2毫米EGTA, 2毫米EDTA, 1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Calbiochem, 535142) 5分钟。收集到的悬架是离心机在10000×10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba,和上层的碎片被收集作为线粒体分数。gydF4y2Ba
乙型肝炎病毒感染的HBV病毒粒子的制备和行为gydF4y2Ba
从HepAD38乙肝病毒培养液细胞感染实验。HepAD38细胞在DMEM加上10%的边后卫,1% PS, G418(0.5毫克/毫升)、胰岛素(5μg /毫升),和氢化可的松hemisuccinate(50μM)种植,和每三天之后的第十天gydF4y2BathgydF4y2Ba(直到31gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba),媒体上层清液收集和集中gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba20 - 60%蔗糖梯度ultra-centrifugation(贝克曼库尔特最适条件l - 90 K)方法,如前所述(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。考察了颗粒状沉淀剂的HBV dna印迹南部。值得注意的是,2×10gydF4y2Ba5gydF4y2BaHepG2-hNTCP-C9、HepG2-hNTCP-C9-shControl HepG2-hNTCP-C9-shPIN1或HepG2-hNTCP-C9-shPIN4细胞被播种在6-well板块(康宁# 354249)和感染乙型肝炎病毒为1.7×10gydF4y2Ba3gydF4y2Ba组的每个细胞在媒体含有4% (Affymetrix # 25322-68-3)挂钩。第二天,手机媒体在PBS刷新2.5% DMSO包含媒体的清洗和维护。在9gydF4y2BathgydF4y2Ba天感染后,细胞溶解产物是准备和sds - page和免疫印迹,核心粒子免疫印迹,印迹分析。在感染后5天,乙肝病毒RNA水平由北部的印迹。gydF4y2Ba
胡桃酮,加以ATRA 6 7 4′-THIF, KPT6566或EGCG治疗乙型肝炎病毒复制的细胞gydF4y2Ba
胡桃酮(西格玛奥德里奇,AG17724),加以(Calbiochem, ca 64005-90-9), ATRA (Sigma-Aldrich R2625), 6日,7日,4′-THIF(化学的脸,CFN90796) KPT6566 (ProbeChem, pc - 61182),或EGCG(西格玛奥德里奇,989-51-5)治疗Huh7, HepAD38 HepG2 HepG2.2.15, HepG2-hNTCP-C9细胞。在进行实验之前,胡桃酮的毒性影响,加以,ATRA, 6, 7, 4′-THIF, KPT6566或EGCG检查gydF4y2Ba通过gydF4y2BaMTT试验(3 - 4,5-dimethylththiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化),如前面描述的(gydF4y2BaBichko et al ., 1985gydF4y2Ba;gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2020年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。简单地说,选择肝癌细胞系(HepG2, Huh7、HepG2.2.15 HepAD38)在6厘米的盘子是用胡桃酮治疗(20μM),加以(20μM), ATRA(30μM), 6日,7日,4′-THIF(30μM), KPT6566(30μM),或在转染EGCG(40μM)或TC时切除从HepAD38细胞。西格玛奥德里奇,胡桃酮(20μM乙醇AG17724)治疗1.3 mer HBV-WT转染Huh7细胞(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)或TC-depleted HepAD38细胞(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)或1.3 mer HBV-WT转染HepG2 (gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)或HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba72 h)细胞。加以(20μM在DMSO, Calbiochem ca 64005-90-9)是治疗72 h 1.3 mer HBV-WT转染Huh7细胞(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)或TC-depleted HepAD38细胞(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)或1.3 mer HBV-WT转染HepG2细胞(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)或HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)细胞。检查影响乙肝病毒复制,ATRA(30μM在DMSO, R2625 Sigma-Aldrich)是治疗72 h 1.3 mer HBV-WT转染Huh7细胞(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)或TC-depleted HepAD38细胞(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)或1.3 mer HBV-WT转染HepG2细胞(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)或乙肝病毒复制HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba)细胞。6、7、4′-THIF(30μM在DMSO, CFN90796化学面临)是治疗72 h 1.3 mer HBV-WT转染Huh7细胞(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)或TC-depleted HepAD38细胞(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)或1.3 mer HBV-WT转染HepG2细胞(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)或乙肝病毒复制HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba)细胞。可耐福天津公司- 6566(30μM在DMSO, pc - 61182 ProbeChem)是治疗72 h 1.3 mer HBV-WT转染Huh7细胞(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)或TC-depleted HepAD38细胞(gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)或1.3 mer HBV-WT转染HepG2细胞(gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)或乙肝病毒复制HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图7 dgydF4y2Ba)细胞。40卷μM EGCG nuclease-free水(989-51-5,西格玛奥德里奇)治疗72 h 1.3 mer HBV-WT转染Huh7细胞(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)或TC-depleted HepAD38细胞(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba)或1.3 mer HBV-WT转染HepG2细胞(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)或HepG2.2.15 (gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba)细胞。在72 h后处理,细胞溶解产物被准备,如前面描述的(gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba)。感染后2×10gydF4y2Ba5gydF4y2BaHepG2-hNTCP-C9细胞,20μM胡桃酮(gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba),20μM加以(gydF4y2Ba图9 bgydF4y2Ba),30μM ATRA (gydF4y2Ba图9 cgydF4y2Ba),30μM 6、7、4′-THIF (gydF4y2Ba图9 dgydF4y2Ba),30μM可耐福天津公司- 6566 (gydF4y2Ba图9 egydF4y2Ba),或40μM EGCG (gydF4y2Ba图9 fgydF4y2Ba)是治疗9天。gydF4y2Ba
国家的稳定性分析gydF4y2Ba
PIN1 KD或PIN4 KD Huh7 (2×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)细胞生长在6-well盘子和转染与0.5μg Myc-HBc 2μg /毫升的贝聿铭100年μl Opti-MEM。24小时后,介质是补充与新媒体包含100μg /毫升放线菌酮(σ# C1988-1G)。后0、6、12和24小时后处理,这些细胞被收获和溶菌产物进行sds - page,免疫印迹,琼脂糖凝胶电泳和免疫印迹。gydF4y2Ba
cccDNA分析和染色质免疫沉淀反应gydF4y2Ba
乙肝病毒cccDNA合成是研究使用无蛋白赫特cccDNA提取方法。短暂,HBV-infected PIN1或PIN4 KD细胞约100% confluency孵化了10天,细胞溶解10毫米EDTA和10毫米Tris-HCl (pH值7.5)含0.6% SDS-TE缓冲区,治疗16 h通过添加5 M氯化钠的最终浓度1 M,并通过离心沉淀在14500×30分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba。上层清液受到多酚提取物(两次)cccDNA提取紧随其后gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba苯酚/氯仿。包含cccDNA的上层清液由乙醇沉淀,而且分析了南方的印迹。乙肝病毒cccDNA芯片进行使用cccDNA-specific由PCR引物和分析(GeneAmp 2700,应用生物系统公司),如前所述(gydF4y2BaBichko et al ., 1985gydF4y2Ba;gydF4y2BaPiracha et al ., 2018gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2020年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba赛义德et al ., 2019gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2021年gydF4y2Ba)。从临床标本,乙肝病毒cccDNA水平检查,如前所述(gydF4y2BaZhang et al ., 2017gydF4y2Ba),使用251 f 5′广汽双柄陶制大酒杯TGG TGG行动TCT颈- 3′- 1190 r 5′柠檬酸GCA AAY行动YGG CA-3′组引物。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
提出了数据显示为平均值±标准偏差。利用学生的平均值的比较gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。GraphPad棱镜版本5 (GraphPad软件)是用于图表。gydF4y2BapgydF4y2Ba值< 0.05的被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
最初的贡献提出了研究中都包含在本文/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
涉及人类受试者的研究回顾和批准国际医学科学研究中心伊斯兰堡巴基斯坦。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
我们研究构思,进行实验,分析数据,并写了手稿。ZP协助我们进行实验和数据分析和批判性回顾了研究。所有作者的文章和批准提交的版本。gydF4y2Ba
的利益冲突gydF4y2Ba
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba
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关键词:gydF4y2BaPIN1 PIN4,乙肝病毒,胡桃酮,加以ATRA KPT6566, EGCG, THIFgydF4y2Ba
引用:gydF4y2Ba赛义德U和Piracha ZZ (2023) PIN1 PIN4抑制gydF4y2Ba通过gydF4y2Baparvulin impeders胡桃酮,加以ATRA 6, 7, 4′-THIF, KPT6566, EGCG挫败乙型肝炎病毒复制。gydF4y2Ba前面。MicrobiolgydF4y2Ba。14:921653。doi: 10.3389 / fmicb.2023.921653gydF4y2Ba
编辑:gydF4y2Ba
袁高gydF4y2Ba美国密歇根州立大学gydF4y2Ba版权gydF4y2Ba©2023赛义德,Piracha。这是一个开放分布式根据文章gydF4y2Ba知识共享归属许可(CC)gydF4y2Ba。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2BaUmar赛义德,✉gydF4y2Baumarsaeed15@yahoo.comgydF4y2Ba