人类免疫球蛋白运往病毒血巨细胞病毒信封由病毒Fc伽马receptors-dependent和独立的机制gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

由人类巨细胞病毒感染()血巨细胞病毒出现在大多数的人口。原发感染后,病毒建立终身潜伏性感染坚持前体的树突和髓细胞(gydF4y2Ba哈恩et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2Ba福特et al ., 2020gydF4y2Ba)。重新激活或感染在免疫抑制条件下与多种疾病有关gydF4y2Ba布瑞特2008gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在gydF4y2BaHerpesviridaegydF4y2Ba,拥有最大的基因组和血巨细胞病毒携带几个基因产物能够抵消宿主免疫反应包括病毒Fcγ受体(vFcγRs;gydF4y2Ba恩格尔和毕业生,2012年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba贝瑞et al ., 2020gydF4y2Ba)。人类Fc受体(hFcRs)存在的大多数细胞表面的骨髓和淋巴起源和代表之间的连接细胞和体液免疫反应(gydF4y2BaBournazos et al ., 2016gydF4y2Ba)。免疫细胞受益于这些等离子体膜分子传感器的抗原或免疫复合物在细胞外环境中,让这些细胞反应配体接触后感染。免疫球蛋白生产应对病毒感染是一个至关重要的步骤,激活宿主效应函数,包括中和/ (ADCC;吞噬作用过程和依赖抗体的细胞毒性gydF4y2BaNimmerjahn Ravetch, 2008gydF4y2Ba)。几个病毒性疱疹病毒代码Fcγ受体(vFcγRs)结合免疫球蛋白的恒定区。大多数人认识到免疫球蛋白的常数片段(Fcγ)和干扰宿主Fc受体(gydF4y2BaCorrales-Aguilar et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba詹金斯et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科尔布et al ., 2019gydF4y2Ba)。尽管如此,被动转移anti-HCMV限制病毒感染的免疫球蛋白g已被证明在特定环境中,如在移植,作为治疗剂治疗人类患者(急性巨细胞病毒感染gydF4y2Ba索耶,2000gydF4y2Ba;gydF4y2BaSnydman 2001gydF4y2Ba)。两个公认的行动的机制提出了免疫球蛋白的捕捉vFcγRs: (a)抵消中和抗体gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba一种机制被称为“抗体双相衔接”(gydF4y2Ba弗兰克和弗里德曼,1989年gydF4y2Ba;gydF4y2BaVan Vliet et al ., 1992gydF4y2Ba;gydF4y2Ba斯普拉格et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba鲁宾斯基et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaCorrales-Aguilar et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaNdjamen et al ., 2016gydF4y2Ba),抗体Fab结合病毒抗原的过程虽然vFcR结合Fc地区,损害其进一步识别由免疫细胞和(b)清除循环免疫球蛋白通过捕获它们感染细胞表面与顺向内化和溶酶体目标的抗体(gydF4y2Ba斯普拉格et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2BaNdjamen et al ., 2016gydF4y2Ba)。尽管一些迹象支持其中一种或另一种不是相互排斥的假说,vFcγRs的功能作用从来没有完全阐明。gydF4y2Ba

实际上,其他herpesviral Fcγ-binding蛋白质,如1型单纯疱疹病毒通用电气,小鼠巨细胞病毒m138,和水痘一带状疱疹病毒(带状疱疹)通用电气,扮演着至关重要的作用gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba独立感染的抗体结合能力(gydF4y2Ba莫法特et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2BaPolcicova et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2Ba王et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2BaArapovic et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaZerboni et al ., 2011gydF4y2Ba)。最近,gp68 gp34表达了对感染或转染细胞被发现与Fcγ受体激活形成对抗,根据抗体双相衔接模型,三元复合物包括抗原和免疫球蛋白(gydF4y2BaCorrales-Aguilar et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科尔布et al ., 2021gydF4y2Ba)。这样的功能也被描述的产品gydF4y2BaRh05gydF4y2Ba恒河巨细胞病毒的基因,属于RL11 Fcγ-binding蛋白质家族最近被发现(gydF4y2Ba科尔布et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

编码四血巨细胞病毒蛋白质拥有Fcγ-binding能力(gydF4y2BaLilley et al ., 2001gydF4y2Ba;gydF4y2BaAtalay et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaCortese et al ., 2012gydF4y2Ba)。流式细胞术分析是用来评估质膜定位和Fc-binding gp34(基因产品的能力gydF4y2BaRL11gydF4y2Ba)和gp68(基因产物gydF4y2BaUL119gydF4y2Ba)表达腺病毒载体转染gp95(基因产品gydF4y2BaRL12gydF4y2Ba)和gpRL13 (gydF4y2BaAtalay et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaCortese et al ., 2012gydF4y2Ba)。人类免疫球蛋白结合特异性子类这些蛋白质之间的不同。gp34和gp68绑定所有的人类免疫球蛋白子类,而gp95和gpRL13不绑定IgG3和IgG4 (gydF4y2BaAtalay et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaCortese et al ., 2012gydF4y2Ba)。出现在纯化病毒粒子迄今为止报道gp68的蛋白质组学分析和gpRL13确认为一个信封糖蛋白(gydF4y2BaVarnum et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2Ba斯坦顿et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2BaReyda et al ., 2014gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

Fcγ-binding血巨细胞病毒蛋白、gpRL13和gp68已报告后内化Fc绑定在质膜(gydF4y2BaCortese et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaNdjamen et al ., 2016gydF4y2Ba)。内吞作用的病毒蛋白质Fcγ-binding alphaherpesviruses已经被很好地记录下来了。带状疱疹gE蛋白经历clathrin-dependent内吞作用由tyrosine-based图案的胞质尾(gydF4y2BaOlson和格罗斯,1997年gydF4y2Ba)。假狂犬病病毒(减压阀),通用电气负责通用电气的ligand-independent内化:胃肠道自胃肠道本身是无法接受内吞作用(gydF4y2BaTirabassi和小说家,1998年gydF4y2Ba)。带状疱疹一样,HSV通用c端包括tyrosine-containing主题的关键trans-Golgi网络(TGN)通用的排序:胃肠道复杂,一个事件,也驱动正确定位病毒粒子(gydF4y2BaOlson和格罗斯,1997年gydF4y2Ba;gydF4y2BaAlconada et al ., 1999gydF4y2Ba;gydF4y2BaWisner et al ., 2000gydF4y2Ba)。Post-endocytic事件包括回收到质膜或TGN排序(gydF4y2BaAlconada et al ., 1999gydF4y2Ba)。然而,通用电气:胃肠道从HSV显示一个Fcγ-binding-independent至关重要的功能复杂的细胞间传播的病毒,需要主要TGN积累之后再分配和信息枢纽(gydF4y2Ba法恩斯沃思和约翰逊,2006年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

有趣的是,它已经表明,火星科学实验室anti-gH单克隆抗体- 109可以实验感染细胞和病毒粒子合并信封。病毒后代造成完全抗感染但韩剧- 109。虽然的参与任何vFcγRs没有探索,病毒携带韩剧- 109被反抑制抗体针对Fc一半(gydF4y2Ba万利et al ., 2011gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在这里,我们表明,gp34 gp68,但不是gp95包膜糖蛋白。此外,gp68携带人类免疫球蛋白和anti-gH中和抗体与韩剧- 109在病毒粒子。这些vFcγ-binding蛋白从媒介获得免疫球蛋白,调解自己的内化和插入病毒颗粒。令人惊讶的是,除了实验室- 109,所有anti-HCMV对特定病毒膜糖蛋白抗体测试是插入病毒粒子在vFcγR独立路线提供到感染细胞的培养基。这突出了一个潜在的小说的病毒逃避免疫应答机制。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

细胞、质粒和抗体gydF4y2Ba

HFF-1[人类(gydF4y2Ba智人gydF4y2Ba)皮肤/正常包皮成纤维细胞;公司- 1041)细胞培养在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM,写明ATCC 30 - 2002)补充15%胎牛血清heat-inactivated(的边后卫,写明ATCC 30 - 2020), 100国际单位/毫升青霉素和链霉素100毫克/毫升(热费舍尔Penicillin-Streptomycin 10000 U /毫升)。gydF4y2Ba

抗体主要是:鼠标马伯巨细胞病毒IE1和IE2 (Abcam ab53495),鼠标马伯gB (Abcam ab6499),鼠标anti-Cytomegalovirus抗体Alexa萤石488(σ,MAB810X),小鼠单克隆反人类免疫球蛋白(Abcam IG266)多克隆兔anti-Cytomegalovirus gL (MyBioSource MBS1498443),鼠标马伯巨细胞病毒pp65 (Abcam ab6503), 6 xhis标记抗体(表达载体,ma1 - 213115), anti-KDDDDK标记抗体(表达载体,ma1 - 91878),小鼠单克隆抗体anti-GAPDH(σ,g8795 - 200 ul)生产的多克隆anti-HA兔(Abcam ab137838)生产的多克隆anti-TGN46兔(Abcam ab50595),和鼠标单克隆anti-Lamp1 (Abcam ab289548)。重组人类单克隆anti-NHBA 5 h2抗体中描述gydF4y2Ba朱利安尼et al。(2018)gydF4y2Ba。单克隆抗体Fab序列的13 h11, 1 g2 4 i22,和韩剧- 109从文学和恢复,一旦人类IgG1重组,产生内部(葛兰素史克,罗克维尔市网站)。gydF4y2Ba

二次抗体在这项研究中的应用是:Alexa萤石F (ab)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba碎片,488 - 568,和647 -共轭山羊anti-mouse(表达载体)和HRP-conjugated珀金埃尔默的二次抗体。Chrompure DyLight 649 - 549 -共轭人类Fc碎片从杰克逊ImmunoResearch购买。gydF4y2Ba

人类(默克AG714)免疫球蛋白Fc碎片从供应商获得。gydF4y2Ba

免疫荧光显微镜gydF4y2Ba

在感染细胞内化分析HFF-1被播种在玻璃盖玻片和莫伊的1血巨细胞病毒感染。在不同的时间点后感染(显示在图的传说gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),细胞被洗冷PBS和孵化在4°C 20μg /毫升DyLight 649 -共轭人力Fcγ30分钟。广泛的洗后,温度是37°C转向允许内化。表示时间,细胞被固定为3.7%多聚甲醛(默克公司,158127),permeabilized Triton x - 100 0.1%(默克公司,93418年)和孵化阻断缓冲区(PBS + 5%的边后卫)抗体染色前30分钟。抗体阻断缓冲区总是稀释。减少一个特定的信号,5%无免疫力人类血清加入阻断缓冲区。antibody-tagged或荧光融合蛋白的细胞内位置进行激光照明下710年蔡司LMS共焦显微镜和图像捕获使用禅宗软件(卡尔蔡司)。图像分析与ImageJ执行。colocalization分析Coloc2插件使用,简单地说,一个感兴趣的区域周围创建单个囊泡和皮尔森系数计算。积极colocalization被分配如果皮尔森系数≥0.5。gydF4y2Ba

TR血巨细胞病毒重组菌株的建设gydF4y2Ba

细菌人工染色体(BAC) TR血巨细胞病毒株的基因组包含了从俄勒冈健康与科学大学(gydF4y2Ba墨菲et al ., 2003gydF4y2Ba)。Markerless两步RED-GAM BAC诱变用于生成重组病毒(gydF4y2Batisch et al ., 2010gydF4y2Ba)。短暂,卡那霉素抗性盒两侧I-SceI限制性内切酶裂解位点,PCR扩增从pEP-KanS穿梭载体。含有同源区域,允许使用的引物扩增子的集成在该地区利益的BAC DNA通过λ红色可归纳。结合I-SceI解理与第二个红色重组事件删除了耐药基因只留下感兴趣的新序列。复合事件进行gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaGS1783应变包含BAC克隆TR血巨细胞病毒株。的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应变也包含λ红系统和I-SceI基因的控制下热shock-inducible arabinose-inducible推动者,分别。所需的突变经测序整个放大区域和完整性的重组基因组血巨细胞病毒是通过限制检查分析。gydF4y2Ba

重组病毒,MRC-5细胞汇合的T175厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba瓶是胰蛋白酶分离,混合着10μl新鲜准备BAC DNA(约3μg)和1μg pCMVKm2-pp71质粒和electroporated 4毫米在250 V和950μF试管。Supernatant-containing病毒从感染的细胞,当细胞病变效应> 90%。gydF4y2Ba

以下引物被用来生成标记的版本gydF4y2BaRL11gydF4y2Ba和gydF4y2BaUL119gydF4y2BaTR基因组中的基因:gydF4y2Ba

TR -gydF4y2BaRL11gydF4y2Ba哈:gydF4y2Ba

RL11HAFwgydF4y2Ba:5′-GGATACGGAACCTTTGTTGTTGACGGTGGACGGAGATTTGGAATACCCTTACGACGTGCCTGACTACGCCAGGATGACGACGATAAGTAGGG-3′。gydF4y2Ba

RL11HARvgydF4y2Ba:5′-TGTCGGTACGTAAGGTTGTTGCGTCTTTGACGGTTGACGCGCATCTTTTAGGCGTAGTCAGGCACGTCGTAAGGGTATTCCAAATCTCCGTCCACCGTCACAACCAATTAACCAATTCTGATTAG 3′pEP-KanS质粒为模板。gydF4y2Ba

TR -gydF4y2BaUL119gydF4y2Ba国旗,gydF4y2Ba

UL119FlagFwgydF4y2Ba:5′-AGGAGCCCGTTGAGGAAAAGAAACACCCGGTGCCCTACTTCAAGCAGTGGGATTACAAGGATGACGACGATAAGTAGGGATAACAGGGTAAT-3′。gydF4y2Ba

UL119FlagRvgydF4y2Ba:5′-AAGTCAGCGAAATAAAGACAACACAGCAGCCACTCCTCTCGTCTCGGGCCCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCCACTGCTTGAAGTAGGGCACAACCAATTAACCAATTCTGATTAG-3′pEP-KanS质粒为模板。gydF4y2Ba

代的病毒粒子失踪gp68 (gydF4y2BaUL119gydF4y2Ba基因)表达,起始密码子ATG在位置1是一个终止密码子TGA (TR -所取代gydF4y2BaUL119gydF4y2Banull)。这个策略需要自gydF4y2BaUL119-UL115gydF4y2Ba地区代表一个独特的转录单元(gydF4y2BaLeatham et al ., 1991gydF4y2Ba)和基因缺失可能受损的下游基因的转录。以下引物用于UL -gydF4y2Ba119年gydF4y2BaFlag-BAC模板:gydF4y2Ba

UL119StopFwgydF4y2Ba:5′-CGCCGTCTCGTCACACGGCAACATGTGTTCCGTGCTGGCGATCGCGCTCGTAGTTGCGCTCTTGGGCGACTAGCACCCGAGAGTGAAAAGTAGCTAGGGATAACAGGGTAATCGAT-3′。gydF4y2Ba

UL119StopRvgydF4y2Ba:5 ' -AGTAGACGTGACGGTGGTATTACTAGGGGAAGTGACGGCGCTTGTGGTGCTACTTTTCACTCTCGGGTGCTAGTCGCCCAAGAGCGCAACTACGGCCAGTGTTACAACCAATTAAC-3′。gydF4y2Ba

的建设YFP标记gp68,首先包含卡那霉素抗性的穿梭质粒内盒YFP编码区构造。退火的质粒被放大寡核苷酸的3′UL119基因,这样第一个红色重组事件将使集成盒式的巨细胞病毒基因组中所需的网站。卡那霉素磁带是由一个I-SceI站点5′末端和重复区域的50个核苷酸卡那霉素基因的上游和下游,所以在I-SceI感应将秉持I-SceI现场和第二个红色重组事件将导致盒式留下一个完整的去除YFP序列。gydF4y2Ba

插入卡那霉素抗性盒,一个独特的BclI网站介绍了YFP pEYFP质粒序列gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba容易改变主意的诱变使用引物:gydF4y2Ba

YFPgydF4y2BamutFw: 5′-CAACGAGAAGCGTGATCACATGGTC-3′。gydF4y2Ba

YFPgydF4y2BamutRv: 5′-GACCATGTGATCACGCTTCTCGTTG-3′。gydF4y2Ba

卡那霉素抗性基因containig I-SceI站点从pEP-KanS放大使用以下引物(Bcl1地区强调,YFP重复区域以粗体显示):gydF4y2Ba

YFPKanSgydF4y2Ba弗兰克-威廉姆斯5′atagydF4y2BaTGATCAgydF4y2BaCATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGgydF4y2BaGATAAGTAGGGATAACAGGGT-3′。gydF4y2Ba

YFPKanSgydF4y2Ba房车:5′atagydF4y2BaTGATCAgydF4y2BaCAACCAATTAACCAATTCTGATTAG-3′。gydF4y2Ba

PCR产物的克隆BclI网站内的突变pEYFP质粒。最后,完整的磁带被放大与引物包含插入UL119基因的同源区域GS1783电穿孔gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应变的凝胶纯化PCR扩增子和红色介导重组如上所述:gydF4y2Ba

UL119YFPgydF4y2Ba弗兰克-威廉姆斯:5′-AGGAGCCCGTTGAGGAAAAGAAACACCCGGTGCCCTACTTCAAGCAGTGGCGGGATCCACCGGTCGCCACC-3′。gydF4y2Ba

UL119YFPgydF4y2Ba房车:5′-gydF4y2Ba

AAGTCAGCGAAATAAAGACAACACAGCAGCCACTCCTCTCGTCTCGGGCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3′。gydF4y2Ba

免疫印迹进行验证的缺席UL119表达式使用anti-FLAG作为探针。gydF4y2Ba

该地区编码gydF4y2BaRL11gydF4y2Ba,gydF4y2BaRL12,gydF4y2Ba和gydF4y2BaRL13gydF4y2Ba是一个独特的信使rna从gydF4y2BaRL9gydF4y2Ba,包括gydF4y2BaRL10,gydF4y2Ba和终止的3′末端gydF4y2BaRL13gydF4y2BaORF (gydF4y2Ba邓恩et al ., 2003gydF4y2Ba)。这个地区是长末端重复的一部分(TRL)和基因组血巨细胞病毒的一些压力,但不是TR,也出现在内部重复长(IRL;gydF4y2Ba墨菲et al ., 2003gydF4y2Ba)。可以肯定的是,上游的翻译gydF4y2BaRL10gydF4y2Ba基因不受影响,我们设计了引物用于TR-wt-BAC和TR -gydF4y2BaUL119gydF4y2Ba零,介绍了V5标签RL10基因产物(GKPIPNPLLGLDST对应GGCAAGCCCATCCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACAGCACC DNA序列),而删除gydF4y2BaRL11gydF4y2Ba,gydF4y2BaRL12,gydF4y2Ba和gydF4y2BaRL13gydF4y2Ba基因。的重组病毒的表达RL10验证了通过免疫印迹anti-V5抗体。gydF4y2Ba

引物用于代TR-ΔgydF4y2BaRL11-12-13gydF4y2Ba是:gydF4y2Ba

ΔgydF4y2BaRL11-12-13gydF4y2Ba弗兰克-威廉姆斯gydF4y2Ba:5′-AACCGACGGGCACAGACGACGAAGAGGACGAGGACGACGACGTCG。gydF4y2Ba

GCAAGCCCATCCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACAGCACCTAGGGATAACAGGGTAATCGA-3′。gydF4y2Ba

ΔgydF4y2BaRL11-12-13gydF4y2Ba房车gydF4y2Ba:5′-GTTAATTGGTTGTAACACTGGCGGCAAGCCCATCCCCAACCCCCTG。gydF4y2Ba

CTGGGCCTGGACAGCACCTGATATGCACATCAATAAACTTTTTTGTATCTTTAGTTATTAATGTCTGTGTG-3′。gydF4y2Ba

所有突变体都验证了PCR扩增突变基因及其侧翼和通过测序放大区域。gydF4y2Ba

病毒粒子血巨细胞病毒制剂、分馏和Fcs /免疫球蛋白g公司gydF4y2Ba

分析RL11、RL12 UL119定位、成熟病毒粒子被分开浓密的身体血巨细胞病毒(DB)和非传染性的包膜粒子(NIEPs)通过正密度/负粘度step-gradient离心如前所述(gydF4y2Ba托尔伯特和阿尔梅达,1977gydF4y2Ba)。简单,介质从感染的细胞收集6 dpi或当观察细胞病变效应和受600年的90%gydF4y2BaggydF4y2Ba离心20分钟16°C。上层清液被转移到聚碳酸酯管强调与20%蔗糖和离心机在90000年60分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba贝克曼SW32Ti转子。颗粒状病毒resuspended 1毫升PBS和2毫升的四个不同的解决方案包含酒石酸甘油浓度的减少和增加钾的浓度(30%甘油为0和10%酒石酸钾40%)是分层的。管离心机在317516年gydF4y2BaggydF4y2Ba60分钟10°C在贝克曼SW28Ti转子。乐队包含成熟的病毒粒子收集通过注射器resuspended在PBS,离心机在90000年60分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba在贝克曼SW32Ti转子,pellet-containing病毒resuspended PBS。净化的质量通过负染色电镜(EM),评估分析。从衣壳和皮蛋白质单独的信封,纯化病毒粒子与包络提取1:1混合缓冲(1% NP-40,热费希尔85124,4%钠脱氧胆酸盐、热科学B20759.14)和孵化冰与偶尔的涡流30分钟。可溶性部分是通过最高速度离心收集在一个台式离心机在4°C为30分钟。不溶性颗粒被洗两次在PBS可溶性在sds - page示例缓冲区。对于每个萃取,总共四个支流T175厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba烧瓶HFF-1细胞被感染。病毒纯化如上所述,10%是混合了sds - page加载缓冲区,而其余受到蛋白质的提取。gydF4y2Ba

感染血巨细胞病毒在人类面前Fcγ根据执行和免疫球蛋白gydF4y2BaManley et al。(2011)gydF4y2Ba,用细微的修改。短暂,感染后48 h, 6.6μg /毫升Fcγ或13.2μg /毫升的免疫球蛋白被添加到培养基和潜伏期延长2天。然后,细胞被清洗和介质取代了正常的生长介质。上层清液和感染细胞溶解产物收集6天感染和清理由离心细胞碎片在4000×gydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟。上层清液用于细胞或病毒颗粒感染和中和实验被孤立在蔗糖垫进行免疫印迹分析。抗体中和试验是由预处理病毒悬挂1μg /毫升的抗体之前执行感染的细胞。gydF4y2Ba

病毒滴定的流式细胞仪gydF4y2Ba

滴定病毒中,我们使用一个滴定测定之前描述(gydF4y2Ba布瑞特2010gydF4y2Ba),小的修改。总之,5倍系列稀释样品进行与1%胎牛heat-inactivated血清DMEM补充丙酮酸钠和1毫米,和150年μl应用于复制的每个稀释井96井平底集群包含2.5×10板gydF4y2Ba^4gydF4y2BaHFF-1成纤维细胞,孵化一夜(O / N)在37°C公司为5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba之前感染。在受感染的细胞使胰蛋白酶化24主诉,转移集群圆底96孔板,和细胞内染色进行使用488 Alexa萤石共轭鼠标anti-Cytomegalovirus抗体。检测荧光信号,流式细胞仪分析BD LRSII特殊订货系统(加利福尼亚州圣何塞,正欲)配备大规模取样器(高温超导)选项。效价计算使用以下方程:效价(IU / ml) = (N×P) / (V×D)[注:N =细胞数量在每一天用于感染;P =荧光阳性细胞百分比(考虑到稀释的病毒表现出GFP信号< 40%);体积V =病毒用于感染每个(ml);D =稀释褶皱;IU =传染性单元)。gydF4y2Ba

病毒基因组的量化数字PCRgydF4y2Ba

病毒基因组量化是通过数字PCR。感染血巨细胞病毒HFF-1细胞在DMEM + 1%的边后卫在莫伊1 4 - 6 h洗涤和添加新鲜的DMEM + 15%的边后卫。在指定的时间点,200μl文化上层清液是检索,离心机4000×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟透明细胞碎片,和对待DNase(内,M0303S 1:10 0稀释在37°C 1 h)。病毒颗粒被4分钟煮沸灭活,然后样本存储在−20°C进行后续分析。1μl的病毒基因组样本被数字量化PCR与QX200 ddPCR EvaGreen Supermix (BIORAD, 186 - 4036)和以下引物gydF4y2BaUL115gydF4y2Ba(gL);弗兰克-威廉姆斯:ACGCAGGCAGAATTCCTTCA房车:TAACGTGGTGGTGGCCATAC,制造商的指示。信号与QX200液滴获得读者(BIORAD;186 - 4003)。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

蛋白质是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide在4 - 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)预制的凝胶(热费希尔,NP0321BOX)减少或非还条件。蛋白质(10μg)为每个细胞溶解产物被加载。被转移到蛋白质硝化纤维素膜(iBlot交汇处吸墨水系统,表达载体),并与PBS含有0.1%渐变膜被封锁20(热费希尔,ta - 125 - tw)和10%的奶粉(Sigma-Aldrich M7409)。抗体在PBS稀释含0.1%渐变20 - 1%的奶粉。检测主要抗体绑定,辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit或anti-mouse免疫球蛋白抗体和化学发光的过氧化物酶底物(Sigma-Aldrich, 34578),根据制造商的指示。信号强度的光密度分析与图像实验室软件进行免疫印迹(BIORAD)。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

病毒Fcγ受体gp34 gp68 colocalize与内化Fcγ在病毒装配复杂(休假)gydF4y2Ba

间隙的细胞表面束缚人类免疫球蛋白vFcγRs已被建议作为一种免疫系统识别的方法逃避利用在血巨细胞病毒感染。基于观察到的快速周转gp34 gp68, Atalay和同事建议他们的潜在参与运输设备从质膜穿梭于人类免疫球蛋白内化到溶酶体(gydF4y2BaAtalay et al ., 2002gydF4y2Ba)。最近,gydF4y2BaNdjamen et al。(2016)gydF4y2Ba在转染细胞得出相同的结论。我们决定分析人类的内化Fcγgp68和gp34感染血巨细胞病毒的上下文。我们建造两个重组TR病毒编码single-tagged物种的病毒Fcγ-binding蛋白质添加标记和HA标签的糖基gp68 gp34,分别。首先,我们定义两种蛋白的细胞内分布在人类包皮成纤维细胞(HFF-1) TR血巨细胞病毒感染菌株编码gp68和gp34标记蛋白感染细胞的免疫染色和anti-flag anti-HA抗体感染后的5天之后,共聚焦分析。两个蛋白被发现积累在细胞核周围的地区,让人想起细胞质休假,显示几乎完全与包膜糖蛋白colocalization gL和部分colocalization trans-Golgi网络标记TGN46 (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba),可能表明他们定位在细胞质休假。事实上,TGN46信号gp68周围形成一个边缘地区和gp34信号,与报道一致的再定位trans-Golgi舱外边缘的真空吸尘器(gydF4y2BaDas et al ., 2007gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

验证的能力gp68 gp34绑定和内化人类Fcγ在我们的系统中,我们在感染细胞与人类Fcγ孵化。HFF-1 TR-UL119Flag感染或TR-RL11HA 1和莫伊,48 h后,荧光人类免疫球蛋白Fc片段添加到培养基中。额外的48小时孵化后,细胞被清洗和治疗共焦显微镜分析。Anti-Flag和anti-HA抗体被用来分析gp68的本地化和gp34,分别与Fcγ了受感染的细胞(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。gp68和gp34显示水泡模式和一个更加分散gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba,绿色),而内化Fcγ与完全gp68和gp34囊泡(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba),这表明疱疹的病毒蛋白质可能依赖于配体结合和内化,与一个角色相一致的vFcγRs人类免疫球蛋白g内吞作用的活动(gydF4y2BaCortese et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaNdjamen et al ., 2016gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

内化Fc片段在早期HCMV-infected细胞的核内体和积累只有一小部分达到溶酶体gydF4y2Ba

做进一步调查的命运内化Fcγ,时间当然colocalization研究进行感染细胞。荧光人类Fcγ暂时性的添加到HFF-1株血巨细胞病毒感染后5天标记TR和内化之后使用共焦显微镜在不同的时间点。强烈重叠Fcγ片段和早期内体抗原1 (EEA1)信号一旦出现2 h后内化和超过50%的总内化Fcγ碎片仍然与这个舱在24 h post-incubation有关。相反,不到总数的35% Fcγ正面囊泡与溶酶体co-stained隔间在所有时间点(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。接下来,我们试图分析如果抗体针对病毒蛋白质HCMV-infected细胞的膜上遵循相同的途径观察Fcγ碎片内化。这一目标,我们产生了变异TR病毒血巨细胞病毒表达YFP糖基的荧光蛋白标记gp68和重复上面的内化实验是利用人类单克隆抗体与韩剧anti-gH - 109代替Fcγ片段。火星科学实验室内化- 109被发现与gp68-YFP信号在细胞核周围的囊泡和主要是排除在lamp1-positive溶酶体(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba分别)。综上所述,这些数据表明,内化Fcγ和抗病毒免疫球蛋白仍主要与gp68蛋白质和只有一小部分这些分子达到降解的溶酶体。gydF4y2Ba

gp68和gp34包膜糖蛋白gydF4y2Ba

在四个Fcγ-binding血巨细胞病毒蛋白质,只有gpRL13是结构性包膜糖蛋白(gydF4y2Ba斯坦顿et al ., 2010gydF4y2Ba)。我们试图验证如果vFcγgp68和gp34本地化病毒信封。此外,为了测试,同样报道了韩剧- 109 (gydF4y2Ba万利et al ., 2011gydF4y2Ba),人类免疫球蛋白片段可以插入病毒粒子,Fcγ人类免疫球蛋白片段被补充到媒介感染后48 h。孵化的补充中延长2天前被改变了,取而代之的是正常的生长介质。上层清液和感染细胞溶解产物收集6天帖子来自人类Fcγ和未经处理的文化的感染和病毒粒子从细胞培养基纯化使用负粘度正密度梯度,在细胞溶解并受洗涤剂分馏分离衣壳和外皮分数。样本然后治疗免疫印迹分析和代表从这些实验中显示结果gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba。gp34和gp68都显示与油脂的分数有关的病毒粒子(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba),因此,结构蛋白暴露在信封上的成熟的病毒粒子。此外,人类发现Fcγ纯化病毒粒子,而没有观察到的未经处理的控制(乐队gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)。Fc人类免疫球蛋白片段被发现与包膜糖蛋白co-purify L (gL)和两个vFcγRs gp68和gp34信封分数(lane的“可溶性”gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba),而这些蛋白质被发现在皮/衣壳部分(颗粒,由内膜蛋白pp65的存在,gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)。有趣的是,从细胞感染病毒纯化重组病毒携带的标记版本gydF4y2BaRL12gydF4y2Ba显示没有virion-associated gp95信号的分数(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba),这表明不同于所有其他vFcRs, gp95是一种非结构蛋白。这一发现强调了潜在四vFcRs微分作用。gydF4y2Ba

综上所述,我们的实验感染细胞和净化血巨细胞病毒粒子与一个角色相一致的gp68和gp34 Fcγ从质膜的吸收,交通复杂的病毒大会后,插入新生的病毒粒子的信封。gydF4y2Ba

Fc片段和人类免疫球蛋白进行主要由gp68病毒粒子gydF4y2Ba

三个vFcγRs识别哪一个出现在病毒粒子信封Fcγ运输,负责三个重组病毒生成:(a) TR -gydF4y2BaUL119gydF4y2Ba零缺乏表达gp68由于插入一个终止密码子的起始密码子,(b) TR-ΔgydF4y2BaRL11-12-13gydF4y2Ba删除的gydF4y2BaRL11gydF4y2Ba,gydF4y2BaRL12,gydF4y2Ba和gydF4y2BaRL13gydF4y2Ba基因,(c) TR -gydF4y2BavFcγRsgydF4y2Ba空相结合这两个突变,并破坏四个vFcRs的表情。的示意图表示生成病毒所示gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba。没有突变或其组合,影响病毒的复制(gydF4y2Ba补充图1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

识别vFcR负责携带病毒的人类Fcγ信封,细胞被感染与野生型(wt)或vFcRs删除病毒的莫伊1和48 h后感染,6.6μg /毫升Fcγ被添加到媒体。孵化的补充中延长2天之前改变,取而代之的是正常的生长介质。在感染后的6天,浮层被用来准备由蔗糖垫病毒粒子。病毒粒子在detergent-containing缓冲细胞溶解,然后治疗免疫印迹分析。结果所示gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba。在缺乏gp68,乐队对应人类Fc强烈降低(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba巷2),而它几乎消失在突变失踪4 vFcRs (gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba,莱茵4)。相反,删除gydF4y2BaRL11-R12-RL13gydF4y2Ba基因没有改变的能力将人类Fc碎片。gydF4y2Ba

接下来,我们想确认如果免疫球蛋白可以进行病毒粒子像Fc碎片。为达此目的,我们使用一个探针分子重组,因为商业人类免疫球蛋白制剂纯化从捐赠者不检测可以认出信封和积极性血巨细胞病毒糖蛋白。避免风险的绑定通过免疫球蛋白的工厂区域,我们添加了对人类IgG1脚手架单克隆工厂一部分认识到gydF4y2Ba脑膜炎奈瑟氏菌gydF4y2Ba蛋白质NHBA (gydF4y2Ba朱利安尼et al ., 2018gydF4y2Ba)。表达和纯化后,我们用这个重组免疫球蛋白(里格斯)检查其绑定vFcγRs和病毒粒子信封上的交通。HFF-1细胞被感染的莫伊1和48 h后感染,13.2μg /毫升的里格斯被添加到媒体。的孵化后延长2天中被删除,取而代之的是正常生长介质。在感染后的6天,病毒粒子被纯化蔗糖垫和治疗使用反抗体的免疫印迹。免疫印迹代表所示gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba。类似于Fc、免疫球蛋白运输在病毒粒子主要是由gp68 (gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Bagp34巷2),而贡献,gp95和/或gpRL13似乎可以忽略不计(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba,莱茵4)。gydF4y2Ba

,这些实验显示,感染血巨细胞病毒在人类免疫球蛋白的存在导致病毒整合这些分子为主gydF4y2Ba通过gydF4y2Bagp68。gydF4y2Ba

病毒粒子的本地化anti-HCMV人类单克隆抗体gydF4y2Ba

接下来,我们试图验证如果vFcγRs能够携带anti-HCMV单克隆抗体在病毒颗粒。用TR - HFF-1被感染gydF4y2BavFcγRsgydF4y2Banull或TR-wt和生长在有控制或anti-HCMV单克隆抗体在前款规定的报告。单克隆抗体的应用如下:anti-gH 13 h11 (gydF4y2BaMacagno et al ., 2010gydF4y2Ba火星科学实验室),- 109 (gydF4y2BaNokta et al ., 1994gydF4y2Ba),anti-UL130/131A 4 i22 (gydF4y2BaMacagno et al ., 2010gydF4y2Ba),anti-gB 1 g2 (gydF4y2BaPotzsch et al ., 2011gydF4y2Ba)。每个抗体Fab序列的克隆人类IgG1骨干。除了4 i22,据报道,所有选中的抗体中和HFF-1感染血巨细胞病毒。重组人类anti-NHBA被用作控制。gydF4y2Ba

生成TR -gydF4y2BavFcγRsgydF4y2Banull或TR-wt涂上每个抗体,我们使用上面的详细过程。病毒粒子从培养基收集和纯化蔗糖垫在免疫印迹用HRP-conjugated反调查。所示gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba,所有的单克隆抗体进行病毒粒子,但透露vFcγRs微分的依赖。无关的anti-NHBA抗体和anti-gH韩剧- 109运输gydF4y2Ba通过gydF4y2BavFcγRs和完全没有病毒粒子来自零突变(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba、车道3、4和9、10)。anti-gB 1 g2 vFcγRs独立地插入病毒粒子,如图所示,等于没有vFcγRs带强度(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba道11 - 12)。anti-gH 13 h11和anti-UL130/131A 4 i22达到病毒粒子在两个方面:在缺乏vFcγRs,他们出现在病毒粒子,但他们的数量是高于wt病毒(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba、车道5、6和7,8)。gydF4y2Ba

这些数据表明,至少两种机制可能导致人类免疫球蛋白的运输在病毒粒子信封,通过绑定vFcγR Fc部分的,或通过绑定到目标病毒糖蛋白的工厂部分被感染细胞的膜anti-HCMV特定的抗体。gydF4y2Ba

传染性和中和病毒粒子涂anti-HCMV人类免疫球蛋白gydF4y2Ba

探索如果envelope-carried抗体干扰传染性和中和anti-HCMV人类免疫球蛋白,我们比较这两个参数在HFF-1感染antibodies-coated裸TR-wt和TR -gydF4y2BavFcγRsgydF4y2Ba空病毒突变体。gydF4y2Ba

HFF-1细胞被感染了TR wt和TR -gydF4y2BavFcγRsgydF4y2Ba空一式两份。每个受感染细胞的一个板块是孵化与13.2μg /毫升每个马伯48 h后感染和允许内化额外48 h。文化媒体取代新鲜的培养基没有抗体。天6感染后,病毒在DMEM蔗糖垫和resuspended恢复1%的边后卫的媒介。病毒基因组被数字PCR和量化使用新鲜HFF-1莫伊1感染。gydF4y2Ba

中和试验是由pre-incubating病毒悬液anti-HCMV中和抗体。结果所示gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba。所有mAbs-coated wt传染性病毒造成的裸露的控制。同意gydF4y2BaManley et al。(2011)gydF4y2Ba韩剧- 109抑制病毒进入TR-wt病毒但不完全中和韩剧- 109涂层病毒。这种保护作用仅限于实验室- 109涂层病毒病毒涂有13日以来h11或1 g2仍容易受到韩剧- 109中和。相反,TR -gydF4y2BavFcγRsgydF4y2Ba零之前孵化与韩剧- 109结果敏感的中和活动与韩剧- 109。这不是意外的考虑,TR -gydF4y2BavFcγRsgydF4y2Ba零不能使韩剧- 109表面(见gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。此外,13 h11和1 g2,进行病毒无论vFcR存在(见gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba),可以中和wt和由变频控制gydF4y2BaγgydF4y2BaRnull涂层和裸病毒。除了实验室- 109,涂层不抵御抗体的中和活性,排除非特异性机制保护的庇护的病毒粒子与人类免疫球蛋白。gydF4y2Ba

抗体针对人类免疫球蛋白的Fc能涂上anti-HCMV单克隆抗体中和病毒gydF4y2Ba

Manley et al。(2011)gydF4y2Ba报道称,病毒涂有韩剧- 109抗体可以中和反抗体。检查如果这种观察可以扩展到不同的抗体与病毒有关,我们重复了同样的实验测试并行的13个h11 anti-gH, 1 g2 anti-gB和NHBA里格斯涂层病毒。病毒生长在存在马伯,净化后,病毒悬浮液与反抗体之前感染HFF-1孵化。wt和vgydF4y2Ba货物收据gydF4y2Ba空病毒。结果,提出了gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba表明,所有mAbs-coated病毒,除了anti-NHBA-coated的抑制在这些条件。anti-NHBA,一个可能的解释可能是低的anti-NHBA出现在病毒粒子;然而,我们不能排除anti-Fc-mediated中和要求工厂一部分从事绑定其特异性抗原。gydF4y2Ba

缺乏抑制也观察到的vgydF4y2Ba货物收据gydF4y2Ba空病毒生长在存在要么anti-NHBA和韩剧- 109。然而,我们先前的实验强调,不进行病毒免疫球蛋白缺乏vFcR (gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba);因此,没有绑定和中和反人类免疫球蛋白预计在这些条件。gydF4y2Ba

,这些结果证明病毒粒子携带人类免疫球蛋白抗体不受损传染性无论如何定位在信封上。gydF4y2Ba

此外,一致gydF4y2BaManley et al。(2011)gydF4y2Ba,Fc域virus-bound抗体对病毒很重要入口因为挡住了Fc一半可以抑制感染血巨细胞病毒。这种效应似乎并不局限于实验室- 109涂层病毒但也可以观察到,即使不是全部,anti-HCMV mAb-coated病毒。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

在这项研究中,我们展示了gp34和gp68的信封和精制血巨细胞病毒先前的报道暗示这两个蛋白在病毒粒子的存在。事实上,质谱分析纯化的病毒粒子(gydF4y2BaVarnum et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2BaReyda et al ., 2014gydF4y2Ba)透露的存在来自蛋白酶解肽gp68和gp34,暗示这些糖蛋白的病毒粒子协会。早些时候,流动性和同事确定Fc-binding活动通过免疫沉淀反应分析纯化病毒粒子与69 MW和33 kDa,大小与gp68和gp34兼容。然而,通过他们的研究,他们得出的结论是,两种蛋白质出现在皮(gydF4y2Ba1991年,流动性和艰苦的gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

独特的病毒中,编码四vFcγ受体血巨细胞病毒I型跨膜糖蛋白,在病毒生命周期暴露在感染细胞的表面。在这个定位,gp68 gp34,两个vFcγRs血巨细胞病毒更广泛的研究,已经发现。(i)损害依赖抗体的细胞毒性gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba所谓的抗体双相连接(ABB)机制的Fc-mediate捕获宿主抗体与病毒糖蛋白和导致内化和复合物的降解,和(2)对抗细胞Fcγ受体的激活先天免疫反应细胞(gydF4y2Ba斯普拉格et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2BaCorrales-Aguilar et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaNdjamen et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科尔布et al ., 2021gydF4y2Ba)。不过,模糊的角色是另外两个FcγRs gpRL13 gp95。在这个报告中,我们已经表明,gp95是一种非结构蛋白,而第四Fc-binding蛋白质编码的,血巨细胞病毒gpRL13,被指定为结构性包膜蛋白gydF4y2Ba斯坦顿et al。(2010)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

ABB模型规定,一旦受抗体在质膜上gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba复杂的Fc vFcγRs一半,必须进入内吞作用的途径。事实上,吸收人类免疫球蛋白和FcγHCMV-infected细胞碎片在1976年首次报道由凯勒和合作者(gydF4y2Ba凯勒et al ., 1976gydF4y2Ba)。之后,Fcγ-binding能力都被观察到病毒粒子在真空吸尘器和皮(gydF4y2BaMurayama et al ., 1986gydF4y2Ba;gydF4y2Ba1991年,流动性和艰苦的gydF4y2Ba;gydF4y2BaAlwine 2012gydF4y2Ba)。细胞受体Fcγ内化小immunocomplexes和单体的免疫球蛋白在网格蛋白坑的形成和vFcγRs血巨细胞病毒gp68 gp34,当检测内吞作用的活动在瞬时转染系统中,依靠相同的细胞内化机制对应(gydF4y2Ba·亨泽尔和Fumey, 1994gydF4y2Ba;gydF4y2Baet al ., 1994gydF4y2Ba)。在细胞Fc受体的情况下,结合免疫球蛋白可以回收膜或运送到溶酶体降解。回收是常与绑定到单体的免疫球蛋白和新生儿货代使用增加的血清半衰期循环免疫球蛋白或FcγR运输跨上皮细胞表面免疫球蛋白(gydF4y2BaNimmerjahn Ravetch, 2008gydF4y2Ba)。另一方面,交联免疫球蛋白通常触发交付溶酶体在Fcγ-bound immunocomplexes (gydF4y2Ba张和展台,2010年gydF4y2Ba)。HSV gE-gI复杂能够结合免疫球蛋白在中性酸碱但没有观察到绑定6 (gydF4y2Ba斯普拉格et al ., 2004gydF4y2Ba),支持作用抗病毒immunocomplex间隙与gE-gI作为运输设备穿梭从细胞表面免疫球蛋白和释放溶酶体。的确,gydF4y2BaNdjamen et al。(2014)gydF4y2Ba证明1型单纯疱疹病毒gE-gI Fc受体能够内化1型单纯疱疹病毒抗原gD通过双相连接复合体的形成人类anti-gD抗体的存在。细胞内的酸性环境分类核内体允许的离解Fc地区从gE-gI,而晶圆厂部分仍然与gD。在分离,自由gE-gI复杂还是在细胞表面的事情了。gydF4y2Ba

不管他们是否插入到病毒颗粒或护送免疫球蛋白退化,herpesviral Fcγ-binding蛋白质需要针对质膜,然后进入内吞作用的途径。在感染的成纤维细胞,延长colocalization EEA1-positive囊泡内化后,符合衬底gp68绑定的生化特性,让我们假设约束和内化抗体比退化可能会有不同的命运。的确,gp68血巨细胞病毒能够在低pH值5.6(绑定Fc的片段gydF4y2Ba斯普拉格et al ., 2008gydF4y2Ba),这表明配体的受体可能不分离的内吞作用的途径。这个假设被工作的加强gydF4y2BaManley et al。(2011)gydF4y2Ba火星科学实验室演示的能力获得血巨细胞病毒- 109阻力当病毒生长在面前这个anti-gH中和抗体后感染。在这份报告中,显示出的抗体组装病毒粒子,但精确的定位和机制并没有解决。我们的研究表明gp68火星科学实验室针对的是主要负责病毒囊膜通过Fc - 109一半虽然gp34可以内化免疫球蛋白但可有可无的免疫球蛋白g并入病毒粒子。gydF4y2BaNdjamen et al。(2016)gydF4y2Ba确定gp68免疫球蛋白g内化和退化的责任。然而,在他们的工作,他们表示隔离gp68在海拉细胞瞬时转染,如果一个系统不能完全复制的复杂性受感染的细胞。在我们的研究中,我们观察到一个强大的重叠内化免疫球蛋白在共焦和EEA1信号分析。这表明,大多数免疫球蛋白前往随后融入出芽病毒粒子的真空吸尘器。然而,我们不能排除,内化的抗体被运送到溶酶体的一小部分隔间gydF4y2Ba通过gydF4y2Bagp68 gp34。gydF4y2Ba

理想情况下,所有的抗体进行免疫球蛋白Fc地区可以通过gp68纳入病毒粒子。此外,在所有anti-HCMV抗体测试,实验室- 109似乎完全依赖gp68被病毒粒子。相反,单克隆抗体13 h11、1 g2和4 i22,针对不同抗原决定基的gH, gB, UL128/130A,分别在病毒囊膜运输也独立于vFcγRs。韩剧- 109不承认gH病毒粒子,人们认为中和抗原决定基形式一旦gH构象发生改变,允许病毒融合(gydF4y2Ba万利et al ., 2011gydF4y2Ba)。可能是抗体能够目标病毒在感染细胞的膜糖蛋白gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba工厂纳入内化后病毒粒子的复杂,但这一假设需要进一步研究得到证实。然而,据我们所知,这是第一次,病毒被发现收集人类抗体中,甚至可能从人类血清gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba这些分子,产生病毒颗粒装饰着。gydF4y2Ba

在wt病毒,抗体会在两种不同的拓扑(a)绑定到gp68 Fc和暴露工厂外部和(b)gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba工厂目标蛋白质和Fc地区投射。然而,无论拓扑,反抗体针对的Fc领域virus-bound马伯中和传染性。gydF4y2BaManley et al。(2011)gydF4y2Ba还发现,与韩剧- 109 Fc地区必须访问一个富有成效的感染和制定的假设必须参与一个Fc受体吸收血巨细胞病毒,即使没有出现在成纤维细胞。我们已经扩大anti-HCMV抗体的光谱敏感这抑制,表明,该机制是gp68独立对于大多数anti-glycoproteins马伯。考虑缺乏FcγRs在宿主细胞的情况下,我们可以推测,反抗体绑定可以创建一个位阻,损害细胞受体的识别。反抗体绑定也可以交联二价绑定病毒颗粒,形成聚合无法进入靶细胞。gydF4y2Ba

我们发现antibody-coating病毒不受中和同源和异源特定的Abs,虽然清楚只有测试才能获得更多的抗体和条件。因此,为什么和应该获得特定血巨细胞病毒特异性的抗体的信封吗?我们知道至少有一个中和抗体,与韩剧- 109,是专门运输由gp68及其整合呈现相同的抗体的中和病毒的抵抗力。因此,在这个特定的例子中,抗体涂层是一种免疫逃避逃避机制。相反,独立于gp68抗体运输不同族体中和提供阻力。然而,更多的抗体必须被测试来证明如果韩剧- 109是唯一的抗体能够提供保护。gydF4y2Ba

此外,我们假设抗体在病毒表面接触可能会引起感染获得的功能,利用所谓的锁定增强(正面)。正面是由绑定non-neutralizing或次优的中和抗体的浓度病毒导致吸收multimeric virus-bound免疫球蛋白g细胞中表达Fcγ受体(FcγRs;gydF4y2BaHalstead O’rourke, 1977gydF4y2Ba)。尽管正面诱发一些病毒性疾病的恶化,gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba强劲的证据的直接含义FcγRs-dependent内化导致严重疾病取得了只对登革病毒(DENV) (gydF4y2BaKatzelnick et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaBournazos et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaFarouq et al ., 2022gydF4y2Ba),没有发现与其他疱疹病毒疫苗如带状疱疹或HSV。DENV进入吞噬细胞,通过FcγRs,让IgGs-opsonized病毒到达endosomal低pH值环境促进融合蛋白的构象变化和随后的感染(gydF4y2Ba皮尔森和Kielian, 2013gydF4y2Ba)。我们已经表明,可以捕获特定血巨细胞病毒抗体通过他们的工厂通过Fc域和非特异性免疫球蛋白。第一形态将提供一个“规范化”正面机制还gp68绑定到免疫球蛋白g的特点将允许主机FcγRs订婚。的确,gydF4y2Ba斯普拉格et al。(2008)gydF4y2Ba发现gp68-binding地区的俱乐部不同于那些主机FcγRs。最近,科尔布等人与wt病毒和感染细胞突变体单独表达gp34或gp68存在调理免疫球蛋白分析干扰人类FcγRs Fc地区认可。作者发现,个人的表达gp34或gp68减少但不能废除免疫球蛋白识别主机FcγRIIIA, FcγRIIA,和FcγRsIIB / C,而FcγRI绑定几乎不受影响(gydF4y2Ba科尔布et al ., 2021gydF4y2Ba)。当代gp34和gp68,然而,完全与所有主机FcγRs。这些数据导致了一个优雅的模型gp68 gp34工作合作,同时阻止从感染的细胞和免疫复合物内化质膜,因此对抗NK细胞激活的激活(gydF4y2Ba科尔布et al ., 2021gydF4y2Ba)。这样的机制不能由gp34 gp68当出现在病毒囊膜,因此很明显推测,在病毒粒子,vFcR必须发挥不同的功能。我们的数据表明,gp68蛋白质携带上的大多数免疫球蛋白g病毒粒子和最诱人的猜测gp34复合物gp68-IgGs可能是免费的。在这种情况下,gp68-bound免疫球蛋白仍然可以识别主机FcγRs和调解病毒吸收。发现在这项工作总结报告gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba。这个场景图片病毒捕获循环抗体的能力在两个截然不同的举止表明拥有一个特定的血巨细胞病毒的免疫逃逸机制仍然是破译。gydF4y2Ba

例如,在感染血巨细胞病毒gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba天真的人,结合特异性的人类免疫球蛋白g将提供额外的武器病毒感染细胞的先天免疫系统。在这个场景中,单核细胞是目标人群由于它们在传播中的作用和储层潜在的病毒(gydF4y2BaCollins-McMillen et al ., 2018gydF4y2Ba)。单核细胞生产感染血巨细胞病毒后,各种信号通路诱导,其中一个关键的角色是由EGFR-mediatedπ(3)K的感应,一种蛋白激酶,N-WASP, NF-κB, sp 1,促进生存和分化了gydF4y2Ba李et al ., 2021gydF4y2Ba)。单核细胞表达activatory受体,FcγRI、FcγRIIa FcγRIIIa,后者只在10%的单核细胞,抑制受体,FcγRIIb。曾从事调理的病原体,activatory受体触发途径的激活gydF4y2Ba事实上的gydF4y2Ba“同样的效应器(gydF4y2BaBournazos et al ., 2020gydF4y2Ba)。,我们认为这种假设的免疫逃避机制值得进一步调查。gydF4y2Ba

Fcγ-binding蛋白质由病毒颗粒存在于其他物种,但这种独特的功能从来没有被描述。主要的带状疱疹包膜糖蛋白通用电气是一个重要的病毒蛋白,赋予一个Fc受体活动与其他功能包括绑定受体(gydF4y2BaLitwin et al ., 1992gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2BaMaresova et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2Ba李et al ., 2006gydF4y2Ba)。值得注意的是,佐剂的重组能通用电气防护是单一抗原疫苗(gydF4y2Ba海涅et al ., 2019gydF4y2Ba)。通用电气1型单纯疱疹病毒包膜糖蛋白是Fcγ-binding蛋白质分类为非必要gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba增长,但细胞间传播的关键。此外,通用电气零或突变Fcγ-binding域受损的神经毒性gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba(gydF4y2BaJohnson et al ., 1988gydF4y2Ba;gydF4y2BaDingwell et al ., 1994gydF4y2Ba;gydF4y2Ba沙尔丹哈et al ., 2000gydF4y2Ba)。主要与胃肠道,复杂经历内吞作用对免疫球蛋白绑定在质膜(gydF4y2BaNdjamen et al ., 2014gydF4y2Ba)。都遵循相同的路线和vFcγRs进行内化血巨细胞病毒病毒颗粒和这将是有趣的,以验证如果带状疱疹或其他疱疹病毒携带信封免疫球蛋白。1型单纯疱疹病毒通用电气协会与免疫球蛋白是pH敏感和推断,免疫球蛋白g将释放在酸化的内吞作用的途径(gydF4y2Ba斯普拉格et al ., 2004gydF4y2Ba)。然而,目前尚不清楚在哪个阶段的病毒蛋白质的核内体成熟排序休假时也可以,复合体的一部分注定病毒颗粒从未达到pH值接近6.0,不释放。gydF4y2Ba

由于缺乏动物模型,血巨细胞病毒是非常具有挑战性的评估vFcγRs的重要性gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,但是进一步的功能描述这些机制将提供一个更好地了解这种免疫逃逸机制,更好地定义这个类的作用在发病机制和免疫逃避血巨细胞病毒的蛋白质。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

全球之声、SP、射频、SC、通用、DA和MC进行实验。英孚,DM, MC, MM参与的概念和设计研究。全球之声、SP、射频、SC和通用汽车获得数据。全球之声、MC和MM分析和解释结果。在这个项目中,全球之声是一个博洛尼亚大学的博士生。所有作者都参与起草或修订手稿它至关重要的知识内容。所有作者的文章和批准提交的版本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作是由葛兰素史克生物制品公司,没有额外的资金。葛兰素史克公司负责所有费用在出版。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者感谢亚当Feire(诺华BD&L)鼓舞人心的这项工作,并提供宝贵的建议。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

EF和DM是受雇于葛兰素史克。DM和EF报告葛兰素史克公司股份的所有权和/或限制葛兰素史克公司的股票。全球之声,SC,哒,MC博士生由GSK疫苗。SP、射频和通用汽车在葛兰素史克研究生实习。MM是一个员工那不勒斯大学的费德里科•二世与葛兰素史克咨询合同。gydF4y2Ba

本研究作者声明是由葛兰素史克生物制品公司赞助。赞助商有以下参与研究:研究设计、收集、分析、解释数据,本文的写作和提交出版的决定。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.1106401/full补充材料gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba