原始研究的文章

前面。Microbiol。,06January 2023
秒。系统微生物学
卷13 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.1098814

Proteiniphilum和Methanothrix harundinacea成为主导醋酸应用者在产甲烷反应器在氨较强的压力

高风 ¹,

燕曾²,

Hui-Zhong王¹,

Ya-Ting陈³和

Yue-Qin唐 ^1、4、5 ^*

¹建筑与环境学院、四川大学、成都,四川,中国
²新能源和低碳技术研究所,四川大学,成都,四川,中国
³灾害管理研究所和重建,四川大学,成都,四川,中国
⁴四川省环境保护重点实验室有机废物的稳定物价,成都,四川,中国
⁵替代能源材料工程研究中心&设备,教育部,成都,四川,中国

微生物在厌氧消化(广告)很容易受氨,尤其是acetoclastic产甲烷菌。因此,在ammonia-suppressed广告系统,据报道,乙酸降解进行主要的合作syntrophic醋酸氧化剂和hydrogenotrophic产甲烷菌。先前的研究已经显示氨抑制微生物菌群的广告表现,但氨对微生物代谢的作用机理仍然知之甚少。在这项研究中,我们构建了一个嗜中温恒化器再辅以醋酸作为唯一碳源,逐渐增加了总氨氮(TAN)浓度从1 g L⁻¹6 g L⁻¹采用16 s rRNA基因,宏基因组和metatranscriptomics分析来反映微生物群落结构和代谢行为特征。结果表明,即使在谭6 g L⁻¹(pH值7.5),甲烷生成保持正常,沼气产量大约是92%的1 g L的棕褐色⁻¹和乙酸降解率达到99%,这表明强烈的谭宽容微生物群落的丰富。16 s rRNA基因分析表明,微生物群落结构随着TAN浓度发生了变化。Methanothrix主导产甲烷菌,占主导地位的物种逐渐取代m . soehngenii来m . harundinacea与增加的棕褐色。占主导地位的细菌物种也改变了Proteiniphilum与谭增加呈显著正相关。Meta-omics分析表明,6克的绝对优势微生物在谭L⁻¹是m . harundinacea和Proteiniphilum,这两个高表达基因的氧化压力。m . harundinacea第二个主要产烷生物甲烷八叠球菌属高度表达醋酸乳沟和有限公司₂降低途径,表明这两个途径导致甲烷生成的可能性。Proteiniphilum和其他一些物种在厚壁菌门和醋酸Synergistetes可能氧化剂在社区高度表达基因syntrophic醋酸氧化,H₂代,电子转移。这些结果表明,Proteiniphilum以及m . harundinacea有很强的氨宽容和ammonia-suppressed条件下在乙酸降解扮演关键角色。研究成果将有助于广告的监管和管理过程。

1。介绍

厌氧消化(广告)是有机废物处理的核心技术,生成甲烷作为可再生清洁燃料。然而,广告很容易受到各种抑制剂的影响,其中氨(NH₃)和(NH铵₄⁺)是最著名的抑制剂(汉森et al ., 1998;Yenigun德米雷尔,2013)。虽然适当的铵有利于广告稳定,浓度过高可能达到降解的有机废物,尤其是那些具有高蛋白质和尿素的内容。人们普遍认同的主要因素导致广告抑制氨,导致质子失衡和钾的损失和影响微生物的新陈代谢(Gallert et al ., 1998)。麦卡蒂和麦金尼(1961)发现,0.15 g L⁻¹NH₃广告完全被抑制。另一项研究表明,总氨氮(TAN)约1.7 - -1.8 g L⁻¹造成广告失败(Melbinger et al ., 1971)。因此,研究氨或棕褐色广告微生物的影响是至关重要的发展对策以减少抑制和保持稳定的广告运营。

挥发性脂肪酸(vfa)是最重要的中间体在广告过程中,尤其是乙酸,70 - 80%的甲烷的来源(麦基和科比,1981年)。众所周知,醋酸可以转化成甲烷通过两种途径:醋酸劈理(情商。)和醋酸氧化(方程式2,3)。

\begin{array}{l} C H_{3} C O O^{-} + H_{2} O \to C H_{4} + H C O_{3}^{-} Δ G^{0'} = - 31.0 k J / 米 o l & (1) \end{array}

\begin{array}{l} {CH}_{3} {首席运营官}^{-} + 4 H_{2} O \to 2 {HCO}_{3}^{-} + 4 H_{2} + H^{+} Δ G^{0'} = + 104.6 kJ / 摩尔 & (2) \end{array}

\begin{array}{l} 4 H_{2} + {HCO}_{3}^{-} + H^{+} \to {CH}_{4} + 3 H_{2} O Δ G^{0'} = - 135.6 kJ / 摩尔 & (3) \end{array}

由于热力学不利的能量,乙酸氧化强烈依赖的H₂通过与合作伙伴合作hydrogenotrophic产甲烷菌(服部年宏,2008)。这样syntrophic合作是为两个微生物的生长提供能量有限,导致较低的增长率。然而,先前的研究已经发现氨抑制产甲烷菌,特别是acetate-consuming产甲烷菌(Westerholm et al ., 2012)。因此,ammonia-inhibition条件下,syntrophic醋酸氧化是报道成为主要的甲烷生成途径(她和Nordberg, 2008)。江泽民et al。(2018)使用¹⁴醋酸C放射性标记的研究之间的联系谭和甲烷生成途径。结果表明,hydrogenotrophic产甲烷的比例高(11.1 g / kg)和低(0.2 g / kg)谭浓度条件是68 - 75%和9 - 23%,分别表示强烈的氨的宽容syntrophic醋酸氧化甲烷生成途径。

因此,研究乙酸降解和氨应力下的甲烷生成途径调节广告和衰减抑制是至关重要的。先前的研究已经显示氨抑制微生物菌群的广告表现;然而,氨对微生物代谢的作用机理还不清楚。与此同时,大多数以前的研究都使用批处理执行文化,它不同于一般实际广告过程的连续状态。因此,在目前的研究中,我们构建了一个嗜中温恒化器美联储以醋酸为唯一碳源,逐渐增加了适应TAN浓度。我们采用16 s rRNA基因、宏基因组和metatranscriptomics分析微生物群落结构和代谢行为的描述syntrophs醋酸和支持厌氧产甲烷菌退化。这项研究提供了一个为基础开发技术来提高氨宽容和广告的操作稳定性。

2。材料和方法

2.1。恒化器操作和性能

acetate-degrading厌氧恒化器是使用连续搅拌釜反应器构造(装运箱),工作容积的1.8 l混合使用电磁搅拌器在300 - 400转/分(补充图S1)。核反应堆是如何将沉浸在水浴的温度保持37°C。种子从猪的粪便处理厂污泥(四川省,中国)被用来接种反应堆。人工废水含有醋酸作为唯一碳源由蠕动泵不断提供给装运箱的氛围下N₂从u形管,污水流出(补充图S1)。废水(总有机碳(TOC)浓度的8.0 g L⁻¹)包含以下组件每升蒸馏水:醋酸钠,5.46克;醋酸、16.0克;KH₂阿宝₄,0.3克;KHCO₃,4.0克;NH₄Cl, 1.0克;氯化钠,0.6克;MgCl₂h·6₂啊,0.82克;CaCl₂h·2₂啊,0.08克;和cysteine-HCl·H₂啊,0.1 g,补充了10毫升318年DSMZ中微量元素溶液(德意志Sammlung冯Mikroorganismen和Zellkulturen(德国)由1.19毫克L⁻¹的倪^{2 +}L和0.34毫克⁻¹的有限公司^{2 +}318年DSMZ介质、维生素和10毫升溶液没有维生素B₁₂。

反应堆操作在稀释速率为0.05 d⁻¹。系统达到稳定运行后,额外的北半球₄Cl是添加到逐渐增加TAN浓度从1 g L⁻¹6 g L⁻¹。沼气生产、气体成分、pH值、挥发性悬浮固体的浓度(VSS)、悬浮物(SS), TOC以及vfa定期测量使用协议之前报道(陈et al ., 2020 b)。微生物形态学观察在每个阶段使用激光扫描共聚焦荧光显微镜(日本奥林巴斯FV1000)。稳定运行期间在每个TAN (N0 ~ N6)浓度,生物质收集肉汤和用于DNA和RNA的提取。

2.2。DNA提取、16 s rRNA基因PCR, Illumina公司测序和数据处理

探讨微生物群落,40毫升肉汤的恒化器(天103、138、187、222、250、301和390年)在无菌收集DNase-free离心管,离心10分钟在10000 rpm在4°C,并与无菌磷酸盐缓冲盐水冲洗三次(PBS)(10毫米,pH值7.5)。总DNA提取通过的cyltrimethyl溴化铵(CTAB)法(格里菲思et al ., 2000)。DNA提取受到16 s rRNA基因扩增子测序。的V4-V5细菌和古细菌的变异度高的地区16 s rRNA基因放大使用通用引物515 f (5 ' -GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3 r′)和909 (5 ' -CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)。PCR产物纯化、Illumina公司测序和数据处理进行了如前所述(郑et al ., 2019)。16 s rRNA基因测序的原始读取存入NCBI的序列读取存档(SRA)数据库与加入PRJNA524473数量。

2.3。宏基因组和metatranscriptomics测序和生物信息学分析

分析社区在高氨的代谢特征应力(TAN浓度6 g L⁻¹)、污泥样品进行宏基因组和metatranscriptomics测序收集在390年和393年。提取总DNA和RNA通过CTAB方法(格里菲思et al ., 2000)。metagenome DNA测序Illumina公司HiSeq 3000平台上(Illumina公司)。获得的原始数据被削减了通过Trimmomatic v0.36 (博尔格et al ., 2014)质量截止30日6个基点的滑动窗口,100个基点的最小长度切断。从两个基因组相应co-assembled清洁读取通过黑桃v.3.5.0 (Bankevich et al ., 2012)被使用MetaBAT (康et al ., 2015),检查完整性和污染使用CheckM (公园et al ., 2015),并计算相对多度使用BBMap (布什内尔2014人)。Phylogenomic树还建有PhyloPhlAn v0.99 (- u选项)Segata et al ., 2013)。基因被注释使用Prokka (Seemann 2014如前所述(执行)和人工管理陈et al ., 2020 a)。

metatranscriptomics测序,总RNA DNase处理以去除残余DNA使用RNase-free DNase组(试剂盒、希尔登,德国)。核糖体RNA (rRNA)从DNase-treated RNA中删除通过Ribo-Zero rRNA删除包(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。RNAseq图书馆使用TruSeq创建的RNA样品准备工具包(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)与标准协议。样本库是测序Illumina公司3000年HiSeq编曲。metatranscriptomics序列被削减为上述DNA-trimming步骤和映射到宏基因组垃圾箱使用Bowtie2对准器(Langmead扎尔茨贝格,2012)。特定基因的表达水平从每本分别计算每千碱基读取记录每百万读取(RPKM)映射到本平均从复制样品。热图插图,基因表达水平进一步规范化中基因表达水平的平均每本(RPKM-NM)复制样品(Nobu et al ., 2017)。宏基因组和metatranscriptomics测序的原始读取访问http://bigd.big.ac.cn/gsa加入数量:CRA008529。

3所示。结果

3.1。恒化器操作和性能

反应堆操作连续超过400天,产甲烷浓度保持稳定在每一个阶段有不同的棕褐色(N0 ~ N6阶段)。pH值稳定在大约7.5阶段。从N0 N2阶段,沼气产量没有减少,醋酸美联储完全退化。从N3,沼气产量略有下降,但在N6阶段,它是大约92%的~在N0 N2 (图1)。在沼气,CH₄占53 - 59%,有限公司₂占41 - 47%,和H的分压₂还不到1 Pa。醋酸建立在它们的初始阶段和N6,但随着运行时间的延长,降解。99%的醋酸纤维降解率高在N6阶段。党卫军和VSS浓度与棕褐色的增加略有增加约1.69和0.98 g L⁻¹分别在舞台N6 (图1)。这些结果表明,甲烷生成显然不是压抑甚至在谭6 g L⁻¹(免费氨氮浓度的0.23 g L⁻¹)。

图1

图1。厌氧恒化器的性能用醋酸作为唯一碳源在不同浓度。

我们进行了荧光观察每个阶段的微生物群落。F_420年,独特的关键辅酶hydrogenotrophic甲烷生成途径,可以使细胞发出荧光蓝在420毫米波长紫外线照射下(Braks et al ., 1994)。在N0陶瓷阶段,微生物形态主要是管状,几乎没有荧光细胞检测(补充图S2)。当谭浓度到达5 g L⁻¹球形细胞显然是观察,以及强烈的荧光检测(补充图S2)。这一结果表明,与谭浓度的增加,细胞能产生甲烷通过hydrogenotrophic通路可能增加,也可能表明,乙酸氧化发生在反应堆。

3.2。微生物多样性和群落组成的acetate-fed恒化器在氨抑制

使用污泥的微生物群落进行了分析样品的最后一天(N0 ~ N6)每个操作阶段。基于16 s核糖体RNA基因分析、微生物群落结构的变化大大增加TAN浓度(补充图S3)。与细菌相比,古细菌数量明显抑制,和相对丰度下降到3.54%在N3的阶段和陶瓷(补充图S4)。谭浓度继续增加,古生菌的相对丰度逐渐恢复到18.35%。进一步揭示了谭对微生物群落的影响,占主导地位的细菌和古细菌(在任何阶段相对丰度> 1%)社区的运营分类单元(OTU)水平进行了分析和斯皮尔曼相关系数的计算来说明微生物群落结构之间的相关性和褐色浓度(图2)。占主导地位的细菌类群包括拟杆菌门,Synergistetes,厚壁菌门和Spirochaetae (图2一个;补充图S6A)。辣子鸡在高谭条件,拟杆菌门占了上风的相对丰度Petrimonas(OTU230)和非保密Lentimicrobiaceae (OTU281)与棕褐色浓度和极显著的正相关关系Proteiniphilum(OTU214)极显著相关,表明高谭宽容这些辣子鸡。在Synergistetes门Thermovirga(OTU244)成为主流N2阶段(61%),但相对丰度在后期继续减少。中含量最丰富的OTU厚壁菌门Ruminiclostridium(OTU97)与谭浓度负相关,而syntrophic丁酸盐(Syntrophomonas[OTU233])和乙酸(Tepidanaerobacter syntrophicus[OTU176])氧化细菌与谭呈正相关。主要属Spirochaetae非保密螺旋体科(OTU4)和Sphaerochaeta(OTU275, 202、220和222),他们的反应TAN压力是正好相反的。非保密螺旋体科(OTU4)被谭强烈抑制,而Sphaerochaeta不是。

图2

图2。相对丰度在不同阶段和枪兵与棕褐色的细菌浓度的相关性(一)和热点(B)辣子鸡。丝带宽度表示的相对丰度。红色代表正相关;蓝色代表一个负相关;显著的相关性(价值p≤0.05)*标记;(价值极其重要的关联p≤0.01)由* *标记。

关于古社区,辣子鸡是在物种水平取决于系统发育分析(补充图S5)。其中,Methanothrix是最丰富的产烷生物的所有阶段,属主要包括什么m . soehngenii(OTU99)和m . harundinacea(OTU256)显示完全相反的趋势(图2 b)。与谭浓度的增加,主要产烷生物的恒化器逐渐取代m . soehngenii(OTU99)m . harundinacea(OTU256),这表明m . harundinacea更宽容的抑制。此外,产甲烷菌的多样性与谭浓度的增加显著增加。甲烷八叠球菌属(OTU 268)才发现在N6阶段,及其相对丰度占总额的23.5%热点(图2 b;补充图S6B)。

分析TAN-tolerant细菌和产甲烷菌的代谢功能,宏基因组分析微生物群落进行样本N6阶段的恒化器在两个不同的日期。总的来说,34英镑宏基因组序列得到干净。Illumina公司从两个重复样本co-assembled paired-end读取,和装箱基因组的重叠群装配了89箱。其中,45细菌和6古细菌箱子至少有72%基因组完整性和<污染CheckM所估计的6.5% (公园et al ., 2015)进行了分析(补充数据S7、S8;补充表S1)。进一步揭示微生物种群的代谢行为,5660万年metatranscriptomic读取(4.5英镑)生产并映射到metagenomic垃圾箱。metatranscriptomic读取映射到显性基因组的百分比,分别分析两个采样时间点,两个转录组分析显示类似的结果(图3)。基于映射meta-omic读取获得的垃圾箱,检索到的细菌种类占86和60%的宏基因组和metatranscriptomic读取,分别为(补充图S9)。在所有细菌类群,拟杆菌门代表16 s rRNA的主要分数(40.85%)、基因组(49.59%),和metatranscriptomes(39.15%)在N6阶段(图3;补充数据S6A)。主要在拟杆菌属Proteiniphilum(Bin76 Bin79 Bin41),非保密拟杆菌(Bin83和Bin32),和Paludibacter(本89;(图3)。此外,观察到的16 s rRNA基因分析、人口与已知syntrophic脂肪acid-oxidizing细菌(TepidanaerobacterBin10和SyntrophomonasBin24)被发现在厚壁菌门(图2一个,3)。

图3

图3。宏基因组丰富(G)和百分比metatranscriptomic读取(T)的细菌和古细菌垃圾箱。相应的大量的基因组垃圾箱N6阶段估计从宏基因组覆盖率的百分比计算宏基因组(MG)读取映射到每个基因组相对于总读取映射到所有细菌和古细菌的基因组。这些基因组的估计活动显示为metatranscriptomic的百分比(MT)读取映射到每个基因组相对于总读取映射到所有细菌和古细菌的基因组。G,总MG读取;T,总太读;T1,太读取采样时间点1;T2,太读取采样时间点2。

至于产烷生物,m . harundinacea(Bin85)是最丰富的,占9.10和28.07%的宏基因组和metatranscriptomic读取,分别为(图3)。第二个主要产烷生物甲烷八叠球菌属(Bin33) metagenomic metatranscriptomic丰度和8.98%的丰度为1.95%。值得一提的是,m . soehngenii(Bin57)仅占0.58和0.65%的宏基因组和metatranscriptomic读取,符合16 s rRNA基因分析的结果(图2 b,3)。

3.3。在产甲烷菌产甲烷途径和节能的新陈代谢

社区承载多样化的产甲烷菌,包括m . harundinacea(Bin85),m . soehngenii(Bin57),甲烷八叠球菌属(Bin33),Methanoculleus chikugoensis(Bin50),甲烷细菌属arcticum(Bin58),Methanomassiliicoccus luminyensis(Bin45) (补充图S8;补充表S1)。这些甲烷生产产甲烷菌具有不同的底物范围,包括醋酸裂解途径,有限公司₂还原途径和甲基乳沟通路(图4一;补充表S2)。在甲烷生成,产甲烷菌合成ATP通过一个跨膜钠⁺/小时⁺梯度形成的电子传递链(图4 b;补充表S3)。进一步理解产甲烷菌的代谢状况,我们分析了目标的产甲烷和能量代谢途径垃圾箱相比UniProt数据库中已知的通路,然后映射metatranscriptomic读取垃圾箱和计算RPKM-NM分析目标通路的表达水平(图4 c)。

图4

图4。甲烷生成的代谢途径(一),产甲烷电子转移(B)和基因表达水平(C)产甲烷菌的N6阶段。基因表达水平计算每千碱基读取的记录每百万读取映射到单个垃圾箱(RPKM)基因表达中值归一化相应的本(RPKM-NM)平均从复制样品。通路包含基因RPKM-NM 0和大于octile和四分位数(开放的三角形,填充和开放点,分别)。阐述了在酶缩写及其对应的基因补充表S2、S3。

具体地说,m . harundinacea(Bin85)和甲烷八叠球菌属醋酸(Bin33)表示利用途径高度(最高octile表达基因对应的本)m . soehngenii(Bin57)表示在一个较低的水平(数字4,C;补充表S2)。的m . harundinacea和甲烷八叠球菌属相应的高度(最高四分位数或octile)基因表达acetoclastic甲烷生成由Fpo(没有FpoF)和H₂骑自行车(通过EchA-F VhoACG;图4 b,C;补充表S3;Welte Deppenmeier, 2014)。

垃圾箱的hydrogenotrophic产甲烷菌,如m . chikugoensis(Bin50),m . arcticum(Bin58),甲烷八叠球菌属(Bin33),编码和表达基因有限公司₂减少甲烷生成(数字4,C;补充表S2)。的Methanoculleus(最高四分位数或octile)高度表达的基因的氧化H₂(MvhADG-HdrABC和FrhABG)和甲酸(FdhAB;图4 b,D;补充表S3)。另一个小时₂氧化的人口,m . luminyensis(Bin45)、高表达基因H的耦合₂氧化与还原的甲醇和二甲胺甲烷(图4;补充表S2、S3)。有趣的是,Methanothrix是一个著名的预留acetotrophic产烷生物(服部年宏,2008),但我们发现公司的表达₂减少甲烷生成途径是高的Methanothrix,尤其是在Bin85 (数字4,C;补充表S2;福尔摩斯et al ., 2017)。然而,Methanothrix没有表达的关键基因利用H₂(图4 b,C),它可以直接使用减少细胞外电子有限公司₂对CH₄(Rotaru et al ., 2014;赵et al ., 2020)。因此,acetate-fed恒化器不仅可能会产生甲烷通过acetoclastic途径也是可能的通过的有限公司₂在高TAN-suppressed条件下还原途径。

3.4。Syntrophic acetate-oxidizing社区的新陈代谢和能量守恒

正如上面所讨论的,在acetate-fed TAN-suppressed产甲烷系统,除了直接将醋酸分解为甲烷,产甲烷菌还可以使用产品(电子,H₂、有限公司₂醋酸)syntrophic氧化剂产生甲烷。目前有两个醋酸氧化途径报道(朱et al ., 2020),扭转Wood-Ljungdahl通路和甘氨酸裂解途径,在CH的过程是不同的₃-CO-S-CoA, CH₂=四氢呋喃(图5一个)。系统地分析系统中的潜在acetate-oxidizing细菌,细菌45箱被注释,然后与已知acetate-oxidizing UniProt数据库路径(补充图S10;补充表S4)。我们筛选20醋酸细菌垃圾箱完全氧化途径或宏基因组丰度大于1%,然后映射metatranscriptomic读取垃圾箱和计算RPKM-NM分析醋酸氧化相关基因的表达水平,H₂/甲酸代谢和电子传递(图5)。

图5

图5。醋酸氧化代谢途径(一)H₂/甲酸代谢和电子转移(B)和基因表达水平(C)N6 syntrophs可能syntrophically降低醋酸的阶段。基因表达水平计算每千碱基读取的记录每百万读取映射到单个垃圾箱(RPKM)基因表达中值归一化相应的本(RPKM-NM)平均从复制样品。通路包含基因RPKM-NM 0和大于octile和四分位数(开放的三角形,填充和开放点,分别)。阐述了在酶缩写及其对应的基因补充表S4, S5。

acetate-degrading社区内,非保密Thermoanaerobacteraceae (Bin68)编码基因逆转Wood-Ljungdahl和甘氨酸裂解途径GlyA的高表达和GcvP(最高四分位数的表达基因对应本;图5一个,C;鲁伊et al ., 2011)。人口(Bin10)与一个已知acetate-degrading属,Tepidanaerobacter表示,甲酸酯转换成通过逆转Wood-Ljungdahl通路(图5一个,C;Westerholm et al ., 2011)。另一个人口(Bin54)属于梭菌的基因表达乙酸降解(研磨、GlyA GcvP, GcvT,和GcvH)在高水平(最高octile;图5 c;Westerholm et al ., 2018)。值得注意的是,Proteiniphilum(Bin76 Bin79和Bin41)丰度最高的宏基因组和metatranscriptomic读(图3甘氨酸裂解途径)和高表达基因(最高四分位数或octile;图5一个,C);因此,这些人群有可能小说醋酸降能器。

多个基因或基因簇编码甲酸脱氢酶和氢化酶检测到上述syntrophs甲酸和H₂的一代。这些酶是必要的再氧化减少等价物(即。,米enaquinone, NADH, NADPH, and reduced ferredoxin [Fd]) generated during acetate oxidation (图5 b;补充表S5)。所有syntrophic甲酸代谢,代谢在厚壁菌门表示Fd-dependent甲酸脱氢酶(FdhH) NADH-dependent甲酸脱氢酶(FdhAB),并假定的electron-confurcating甲酸脱氢酶(FdhA-HydBC)除外Tepidanaerobacter(Bin10)和非保密Peptococcaceae(Bin87;图5 b,C;补充图S11)。其中,非保密梭状芽胞杆菌Bin8高度表达FdhAB(最高octile;图5 c)。对H₂代,所有syntrophic代谢在厚壁菌门(除外Syntrophomonas)表示细胞质(象皮病)类型electron-confurcating氢化酶(HydABC) (图5 b,C;补充图S11)。这些氢化酶催化的热力学有利生产H₂从Fd_红色的开车的不利生产H₂从NADH (上,肖,2013)。我们发现高表达(象皮病)型辅酶ii⁺端依赖氢化酶(HndABCD)在非保密梭菌属的(Bin22),Tepidanaerobacter(Bin10),Sphaerochaeta(Bin29),Proteiniphilum(Bin79)和非保密Bacteroidia (Bin42)(最高octile或四分位数;图5 c;德卢卡et al ., 1998)。

支持热动力挑战性的H₂和甲酸生成,syntrophs也表达了节能电子转移酶。的Proteiniphilum人口(Bin79和Bin41)高表达(octile)膜结合Rhodobacter固氮复杂(RnfA-G),可以挤压阳离子和Fd的电子转移_红色的对NAD⁺获得能源和运输的阳离子向内和电子转移NADH Fd_牛开车electron-confurcating氢或甲酸的一代(图5 b,C;Biegel et al ., 2011)。此外,Proteiniphilum(Bin79)也高度表达了辅酶ii(最高四分位数)⁺注册表_红色的氧化还原酶(NfnAB)转移电子从NADPH河畔⁺和Fd_牛通过电子歧化(图5 b,C;王et al ., 2010)。

3.5。氧化应激在syntrophs和产甲烷菌

自从ROS-detoxification支持的适应机制Proteiniphilum物种(吴et al ., 2021)和氨氧化应激引起的产甲烷菌(加藤et al ., 2014;李et al ., 2022),我们还研究了抗氧化基因的发生目标垃圾箱(图6;补充表S6)。所有的数量Proteiniphilum表达基因的高表达基因(顶部octile对应的本)编码超氧化物歧化酶(Sod)和抗氧化蛋白(插件可以),分别属于无能量活性氧清除剂(补充表S6;马丁斯et al ., 2019)。产甲烷菌,除了探测高度表示Sod和插件可以,我们还发现了能量依赖性ROS拾荒者的表达(过氧化物还原酶、Sor;rubrerythrin, Rbr) (图6;补充表S6),它需要额外的能源与F_420年H₂作为最终电子供体(马丁斯et al ., 2019)。Methanothrix harundinacea(Bin85)和甲烷八叠球菌属(Bin33)代表主要的分数在产甲烷菌的基因组和metatranscriptomes高度表达规则与基于事例相结合转速(前octile;图3,6)。因此,主要的细菌属Proteiniphilum和TAN-suppressed系统产甲烷菌的氧化应激机制从而抑制条件下提供一个选择性的优势。

图6

图6。基因表达水平氧化应激在syntrophs和产甲烷菌。基因表达水平计算每千碱基读取的记录每百万读取映射到单个垃圾箱(RPKM)基因表达中值归一化相应的本(RPKM-NM)平均从复制样品。通路包含基因RPKM-NM 0和大于octile和四分位数(开放的三角形,填充和开放点,分别)。阐述了在酶缩写及其对应的基因补充表S6。

4所示。讨论

一般报道,棕褐色的浓度在1.7 - -1.8 g L⁻¹完全抑制unacclimated接种条件下广告,和谭水平可能增加5 g L⁻¹适应(艾伯森,1961;Melbinger et al ., 1971)。在这项研究中,美联储连续厌氧消化反应器与醋酸作为唯一碳源浓度稳定在一个较高的棕褐色(6 g L⁻¹)经过长期不断适应逐渐增加晒黑。在适应过程中,细菌和古细菌社区经历了重要的物种周转率(图2;补充图S3)。因此,我们评估为什么在这种强有力的棕褐色的抑制,Methanothrix harundinacea能够主导产甲烷菌,唯一占主导地位的细菌是什么Proteiniphilum物种。

至于产甲烷菌,属只占主导地位Methanothrix在适应过程中,尽管multitrophic甲烷八叠球菌属出现在N6阶段,Methanothrix仍占主导地位。这一结果表明,醋酸乳沟可能是高谭应力下的甲烷生成的主要方式,这在某种程度上与先前的研究,产甲烷途径从acetotrophic hydrogenotrophic下氨压力(她和Nordberg, 2008;Yenigun德米雷尔,2013;高et al ., 2015;江et al ., 2018)。此外,基于F的荧光_420年观察到在产甲烷菌和细菌(相对丰度的增加补充数据S2, S4),它是合理的推测细菌的一部分进行醋酸氧化代谢在高谭阶段。澄清这一矛盾,进一步的验证与meta-omics甲烷生成途径。

Methanothrix harundinacea(Bin85)和甲烷八叠球菌属在产甲烷菌(Bin33)成为主流N6阶段(图3)。通过meta-omics分析,我们发现m . harundinacea高度表达了两个公司₂减少和醋酸裂解途径,醋酸乳沟的表达途径是高(图4 c),与现有的研究结果一致(福尔摩斯et al ., 2017)。不过,我们没有发现关键基因负责利用H₂在m . harundinacea(图4 c),暗示的可能性m . harundinacea使用直接减少细胞外电子有限公司₂(Rotaru et al ., 2014;赵et al ., 2020)。人们已经发现,Methanothrix可以减少有限公司₂甲烷直接接受电子核废料旁边在一个广告反应堆提供颗粒活性炭(杨et al ., 2019)。它是可能的m . harundinacea类似于multitrophic甲烷八叠球菌属,这可能会获得更多的能量通过多种途径应对氨压力(郝et al ., 2015)。虽然m . soehngenii报告也可以接受减少细胞外电子有限公司₂对CH₄(杨et al ., 2019),可能由于其低得多耐氨(规则与基于事例相结合的转速更低表达;图6相比),它失去了竞争力m . harundinacea。据报道,m . soehngenii可以完全抑制在一个棕褐色的浓度560毫克L⁻¹在纯文化(Sprott和帕特尔,1986年)。为什么以前的研究报道,甲烷生成途径从acetotrophic变成hydrogenotrophic受到氨应力可能是没有强烈的ammonia-tolerantm . harundinacea在他们的系统或缺乏适应环境氨(Zhang et al ., 2014;江et al ., 2018)。

此外,关键基因无能量和能量依赖性的氧化应激机制被发现在产甲烷菌,可能扮演的角色在耐氨造成的氧化应激,从而有利于适应高氨条件(吴et al ., 2021)。在我们的研究中,只有米。harundinacea和甲烷八叠球菌属高度表达依赖资源氧化应激基因(琼和rbr),这使他们主要的产甲烷菌在N6阶段。占主导地位的Methanothrix和甲烷八叠球菌属产生了甲烷可能通过醋酸乳沟和有限公司₂减少,有限公司₂降低途径可能为氧化应激代谢提供能量,从而实现ammonia-inhibition阻力。然而,由于基因的表达在途径并不意味着途径代谢活动,还需要进一步的研究在未来获得公司的直接证据₂还原途径两个主要产甲烷菌的活动。此外,进一步的研究使用纯文化的产甲烷菌应获得生理生化耐氨的证据。

至于细菌,Petrimonas,Proteiniphilum非保密Lentimicrobiaceae,Syntrophomonas,Sphaerochaeta表现出显著正相关趋势与棕褐色浓度(图2)。正如上面所讨论的,产甲烷菌需要电子从syntrophic acetate-oxidizing细菌为有限公司₂减少。根据宏基因组分析,我们发现几个垃圾箱acetate-oxidizing壁厚菌门的潜力,如非保密Thermoanaerobacteraceae (Bin68),非保密梭菌的(Bin54)Tepidanaerobacter(Bin10)等,与先前的研究一致(服部年宏,2008;Westerholm et al ., 2018)。有趣的是,Proteiniphilum唯一占主导地位的细菌属于拟杆菌属,也充分表达了醋酸氧化途径(图5 c)。目前,人们相信的功能Proteiniphilum物种只有水解和发酵,乙酸氧化能力是一个新发现,并没有在以前的研究中被发现(Hahnke et al ., 2016;吴et al ., 2021)。它是合理的假设Proteiniphilum代表了一种广泛的代谢功能,包括水解和发酵和醋酸氧化获得更多的能量,所以它可以抑制环境中占主导地位。我们发现一个完整的基因组的甘氨酸裂解途径孤立p . acetatigenes和p . saccharofermentans(数据未显示)。隔离的p . acetatigenes被发现能减少公司吗₂与H₂生产乙酸(金正日et al ., 2020),这表明甘氨酸乳沟通路的表达。一些醋酸syntrophic氧化剂包括Thermacetogenium phaeum,ultunense梭状芽胞杆菌等,也可以作为还原产乙酸菌(服部年宏,2008)。因此,基于我们的分析结果,这些报告,Proteiniphilum在我们acetate-fed恒化器主要是醋酸syntrophic氧化剂。此外,Proteiniphilum高表达的基因无能量氧化压力,使之更适应氨压力,与先前的研究一致(吴et al ., 2021)。多个研究表明Proteiniphilum可以在抑制条件,如高氨、高盐和高氧(他et al ., 2017年;李et al ., 2019;吴et al ., 2021)。进一步确定醋酸氧化的能力Proteiniphilum使用纯粹的单一文化,进一步的研究Proteiniphilum或与产甲烷菌共培养在未来可以执行。

5。结论

本研究揭示了微生物群落组成和产甲烷代谢网络acetate-fed恒化器在高谭的条件。通过逐步适应,恒化器能够稳定运行在一个棕褐色的浓度6 g L⁻¹。Methanothrix主导产甲烷菌,占主导地位的物种逐渐取代m . soehngenii来m . harundinacea随着TAN,暗示强TAN的宽容m . harundinacea。此外,我们发现的基因有限公司₂减少甲烷生成途径m . harundinacea有高表达水平,暗示的可能性Methanothrix可能直接使用从syntrophic细菌减少细胞外电子有限公司₂对CH₄。在适应过程中,细菌社区经历了重要的物种周转率。我们发现不同的潜在acetate-oxidizing细菌在高谭的条件下,包括唯一占主导地位的细菌,Proteiniphilum醋酸,高表达基因退化。因此,Proteiniphilum人口在恒化器可能是小说醋酸降能器。这项研究的结果提供依据提高氨宽容和运行稳定的广告。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以发现:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/PRJNA524473;http://bigd.big.ac.cn/gsa,CRA008529。

作者的贡献

GF反应堆操作,分析数据,并写了手稿。YZ和H-ZW反应堆操作和分析数据。Y-TC分析数据。Y-QT指导实验、数据分析和手稿修改。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

本研究在经济上支持中国国家重点研发项目(2022 yfe0108500)和中国国家自然科学基金(51678378)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.1098814/full补充材料

引用

艾伯森,o . e . (1961)。氨氮和厌氧环境。j . Pollut水。美联储控制。33岁,978 - 995。

谷歌学术搜索

Bankevich,。、Nurk年代。,Antipov, D., Gurevich, A. A., Dvorkin, M., Kulikov, A. S., et al. (2012). SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.j .第一版。医学杂志。19日,455 - 477。doi: 10.1089 / cmb.2012.0021