一种新菌株对异菌甲酮的降解Azospirillumsp A1-3从西藏分离出来
胡锅1，2，
李劲
Wenbin Bu
蚕蛾刘
Yun田- 1西藏农牧业科学院农产品质量标准检测研究所，西藏拉萨
- 2湖南农业大学生物科学与技术学院，长沙
- 3.长治学院生命科学系，中国长治
- 4西藏农牧学院食品学院，林芝
从西藏拉萨大棚蔬菜栽培土壤中分离到一株具有异丙二酮降解能力的细菌A1-3。根据表型、系统发育和基因型数据，菌株A1-3被认为代表一个新属Azospirillum．异菌甲酮作为生长的唯一碳源和能量来源，在25℃条件下，在108 h内异菌甲酮的还原量为27.96 mg/L(50.80%)。在异菌甲酮的降解过程中Azospirillum异菌二酮首先被降解为N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧咪唑烷，然后被降解为(3,5-二氯苯脲)乙酸。然而，(3,5-二氯苯脲)乙酸不能被降解为3,5-二氯苯胺AzospirillumA1-3 sp。一个ipaH该基因与其他文献报道的基因高度相似(98.72 ~ 99.92%)ipaH基因，被呈现在AzospirillumA1-3 sp。Azospirillum迄今为止从未报道过具有异菌二酮降解与固氮相关能力的新菌株Azospirillumsp. A1-3有望应用于异丙二酮污染环境的生物修复。
简介
Iprodione (C13H13Cl2N3.O3.(CAS编号:36734-19-7)，是一种抑制真菌DNA和RNA合成、细胞分裂和细胞代谢的二甲酰胺杀菌剂(Davidse 1986)，常用于控制真菌的侵扰葡萄孢菌，链格孢属sp。Monilinia fructigena，辣椒，菌核病sclerotiorum，青霉菌sp。菌核病和其他作物真菌病原体(慕克吉等人，2003年；莫拉莱斯等人，2013年；Grabke等人，2014；坎波斯等人，2015年)．异菌甲酮在土壤中具有中等持久性，其半衰期为7-60天，视乎环境条件而定(Wang et al.， 2012；Loutfy等人，2015年)，在许多样本中，如作物、土壤、环境水、动物和人类尿液(林德等人，2007年；Grabke等人，2014；卡内罗等人，2020年；塞莱罗等人，2020年)．美国环境保护署、欧盟委员会和加拿大害虫管理机构已将异菌二酮列为对水生动物剧毒、对植物和鸟类中等毒性、对人类可能致癌的物质(Verdenelli等人，2012；伊弗斯等人，2017年；贝尔纳斯等人，2019年)．因此，异菌二酮残留的存在是一个令人严重关切的问题。
一些研究表明，微生物降解是异菌甲酮在环境中消散的主要机制(Zhang等，2021)．迄今为止，已经报道了几种能够降解异丙二酮的细菌菌株，包括节细菌属sp, MA6假单胞菌sp。节细菌属sp, CQH-1小细菌属sp, YJN-G节细菌属sp。C1,无色菌sp。C2,芽孢杆菌sp. KMS-1，和PaenarthrobacterYJN-5 (Athiel等人，1995年；mercader等人，1997年；坎波斯等人，2017年；杨等，2017，2018；曹等，2018；李,2018)．但异菌甲酮在青藏高原的生物修复尚未见报道。本研究的目的是(i)利用表型、系统发育和基因型方法，从西藏拉萨大棚蔬菜土壤中分离出一个具有异菌二酮降解能力的潜在新类群(A1-3); (ii)分析菌株A1-3对异菌二酮的降解特性和途径。这将为异丙二酮污染环境的生物修复提供一种候选方法。
材料与方法
化学品、介质和仪器
异丙二酮(纯度≥96%)、N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧咪唑烷(纯度≥96%)购自多伦多研究化学品公司(TRC)。N-[[(3,5-二氯苯基)氨基]羰基]甘氨酸(纯度≥96%)由上海纳富生物科技有限公司合成。乙腈、丙酮和正己烷(GC级)由Fisher Scientific International Inc.提供。氯化钠(AR级)由Chron Chemicals提供。Luria-Bertani (LB)肉汤由以下成分组成(g/L): 10.0色氨酸，5.0酵母膏和10.0 NaCl。矿盐介质(MSM)由以下组成(g/L): 1.0 NH4没有3.， 1.0 NaCl, 1.5 K2HPO4， 0.5 kh2阿宝4， 0.2 MgSO4h·72O, pH值7.0。酵母形态琼脂(YMA)由以下成分组成(g/L): 14.0甘露醇，4.5酵母粉，0.1 MgSO4h·72O, 0.4 k2HPO4， 0.3 NaCl, 0.01 CaCl2， pH7.0±0.2。气相色谱仪(6,890 N, ECD, HP-5毛细管柱)由安捷伦技术公司提供。气相色谱-串联质谱(450GC-320MS, EI with DB-5MS毛细管柱)由Bruker提供。电子天平(JA2003N)由京华仪器提供。紫外可见光度计(TU-1901)是由北京浦肯野通用仪器有限公司超纯水制备系统(Millipore - q)由Millipore公司提供。
异丙地酮降解菌株的分离
采用富集培养技术分离异丙二酮降解菌。样品采自西藏拉萨(29°66′84.4″N, 90°94′27.6″E，海拔3667 m)大棚蔬菜栽培土壤。将5.0 g土壤样品加入250ml烧瓶中，加入100ml含100mg /L异菌二酮的无菌MSM，在25°C的旋转搅拌器(180 rpm)上孵育5天。将悬液(5 ml)依次转入含有200、300、400 mg/l异菌二酮的新鲜MSM中，分别孵育5天。4轮富集后，稀释培养物，铺于含100 mg/L异菌二酮的固体MSM板上，25℃孵育7天。纯化了一种具有透明环的细菌A1-3，以供进一步研究。
表型特征及16S rRNA基因分析
在酵母甘露醇琼脂(YMA)上对菌株A1-3的表型进行了检测。用光学显微镜(CX31, Olympus)观察25℃培养3天的菌株A1-3的细胞形态。最佳生长温度在5 - 40℃(5、10、15、20、25、30、37和40℃)进行测试。生长的pH范围从pH 4.0到pH 12.0，间隔为1.0个单位。在不同NaCl浓度(0、1、2、3、4、5和6%，w/v)下测定耐盐性。其他生化特征进行Ferreira et al. (2020)．
菌株A1-3在Luria-Broth培养48 h后，使用MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒Version 2.0 (TaKaRa Biotechnology Co.， Tokyo, Japan)提取基因组DNA。16S rRNA基因在以下条件下扩增:95°C 10 min, 94°C 45 s, 56°C 45 s, 72°C 90 s, 30个循环，最后在72°C延长10 min, PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，然后送到GENEWIZ。LNC进行测序。用于16S rRNA扩增和测序的引物描述为Pan等人(2021)．利用EzBioCloud对16S rRNA基因进行比对。1使用MEGA7.0软件构建最大似然(ML)树，自举值为1000个重复(库马尔等人，2016)．
基因组测序和比较基因组分析
利用Illumina和MAGIGENE的Nanopore平台对菌株A1-3的基因组DNA进行测序。A1-3基因组序列信息已提交美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库，登录号为JAMSLU000000000。使用Apades v3.11.0从ONT reads中制备基因组组装草图，使用Glimmer 3.02软件进行基因预测。对预测的编码序列进行翻译，并将其作为查询来搜索COG数据库。
使用基因组到基因组距离计算器(Genome-to-Genome Distance Calculator, GGDC)的推荐设置计算数字DNA-DNA杂交(dDDH)值和置信区间;Meier-Kolthoff等人，2013)．菌株A1-3与该属近缘菌株的平均核苷酸同源性(ANI)测定Azospirillum作者OrthANIu (尹等，2017)．全基因组同源聚类用OrthoVenn2 (徐等，2019)．利用Type (Strain) Genome Server (Meier-Kolthoff等人，2022)．
异菌二酮及其代谢物的测定
菌株A1-3细胞在液体LB培养基中25℃培养24 h, 8000 rpm离心5 min。用消毒过的MSM清洗细胞颗粒两次，调整到光密度为600 nm (OD)600)约为1.5，用作接种剂。将同样的细胞(5%，vol/vol)接种到100ml的erlenmeyer烧瓶中，其中含有30ml的MSM和50mg /L的异菌二酮作为唯一的碳源。然后将烧瓶在25°C摇晃(180 rpm)下孵育。在每个采样点牺牲6个烧瓶进行各种测量，其中3个烧瓶用于测量异菌二酮浓度或GC-ECD或GC-MS /MS鉴定代谢物，另外3个烧瓶用于测定OD值600A1-3菌株。每种处理均重复进行三次，在相同条件下进行对照实验(培养基中无接种物)。
发酵液制样:将20.0 g样品放入150ml烧杯中，加入乙腈40 ml, NaCl 5-6 g，以180 rpm振动10 min，分层30 min后，将上清液10 ml旋转蒸发至接近干燥，取5.0 ml丙酮与正己烷(1:9)作为定容进行GC-ECD或GC-MS /MS分析(塞莱罗等人，2020年)．
气相色谱法测试条件:HP-5毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.45 μm)，载气(N2，纯度99.999%)，流速(3.0 ml/min)，流动方式(10:1)，进样量(1 μl)，入口温度(280℃)，加热过程:150℃~ 0 min, 15℃/min ~ 210℃，10℃/min ~ 260℃，20℃/min ~ 300℃~ 6 min，电子捕获检测器温度(230℃)。
气相色谱-三串联四极杆质谱联用仪的测试条件为:DB-5MS毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，载气(N2，纯度99.999%)，流速(1.0 ml/min)，无流动模式，进样量(1 μl)，入口温度(230℃)，加热过程:60℃~ 1 min, 15℃/min ~ 150℃~ 2 min, 10℃/min ~ 290℃~ 4 min。EI模式，电子轰击能量(70ev)，传输线温度(280℃)，离子源温度(230℃)。采用扫描方式对各组分进行定性分析。扫描质量范围为50-500 amu (Özdoğan等，2018；Dai等，2022)．
放大的ipaH而且ddaH基因
采用MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒2.0版从菌株A1-3中提取基因组DNA。异丙二酮降解基因扩增(ipaH而且ddaH)在95°C 5 min, 94°C 30 s, 56°C 30 s, 72°C 45 s, 32个循环，最后在72°C延长10 min，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后送到GENEWIZ。LNC进行测序。用于扩增和测序的引物ipaH而且ddaH基因被描述为Zhang et al. (2021)．
结果
菌株A1-3的鉴定及16S rRNA基因检测结果
菌株A1-3在YMA固体培养基上菌落呈白色、圆形、湿润、不透明。菌株A1-3为革兰氏应变阴性，棒状弯曲或微弯曲，不动，0.4 ~ 0.6 μm × 2.7 ~ 3.2 μm。菌株A1-3在NaCl浓度为0-2% (w/v)， NaCl浓度为1%时，在15-30℃，pH 6.0-9.0(最适，20-25℃，pH 7.0-8.0)下生长。氧化酶活性、脲酶活性、mr试验阴性，过氧化氢酶活性、淀粉水解、蔗糖发酵、明胶水解均阳性。
菌株A1-3的16S rRNA基因序列与EzBioCloud中保存的序列相似度最高Azospirillum palustreB2T(98.85%)Azospirillum humicireducensSgZ-5T(98.79%),Azospirillum oryzaeCOC8T(98.65%),Azospirillum lipoferumNCIMB 11861T(98.43%)和Azospirillum melinisTMCY 0552T(98.35%)。从完整的16S rRNA比对中得到的ML树显示在图1．16S rRNA的系统发育分析证实了它的位置Azospirillum属，而是形成一个独立的进化分支。但ML树的bootstrap值较低，且ML树与EzBioCloud数据库的数据不一致，菌株A1-3的分类学地位有待进一步确认。
图1．基于16S rRNA基因序列的极大似然树揭示了菌株A1-3与该属其他种的关系Azospirillum．Skermanella aerolata5416年T-32T被用作一个外部组织。巴，每个核苷酸位置有0.01个取代。
基因组特征与比较基因组学分析
以进一步确认的分类地位Azospirillumsp. A1-3，利用Illumina和Nanopore平台对草图基因组进行测序。基因组草图Azospirillumsp. A1-3包含9个带有N的contigs50/ N90值为795,522/606,539 bp。基因组大小和DNA G + C含量Azospirillumsp. A1-3分别为7.71 Mb和67.12 mol%。菌株A1-3与20个相关细菌的全基因组进化树显示，菌株A1-3形成了一个独立的谱系，并具有很高的自举支持。菌株A1-3与其他相关菌株的dDDH和ANI值分别为21.3 ~ 54.4和76.5 ~ 93.8% (图2)，均低于物种区分阈值(70%)及95-96% (Goris等人，2007年；Meier-Kolthoff等人，2022)．全基因组进化树的数据与EzBioCloud数据库的数据一致。所以Azospirillum palustreB2T，Azospirillum humicireducensSgZ-5T，Azospirillum oryzaeCOC8T，Azospirillum lipoferumNCIMB 11861T,Azospirillum melinisTMCY 0552T被选择进行比较基因组分析，基因组特性被列在表1．的正交聚类分析Azospirillumsp A1-3及相关Azospirillum物种显示在图3．Azospirillumsp, A1-3Azospirillum palustreB2T，Azospirillum humicireducensSgZ-5T，Azospirillum oryzaeCOC8T，Azospirillum lipoferumNCIMB 11861T,Azospirillum melinisTMCY 0552T分别鉴定出5,756、6,250、5,295、5,299、6,019和6,309个蛋白，其中仅鉴定出3,795个同源聚类。
图2．A1-3及相关细菌的dDDH和ANI值的全基因组进化树。
表1．基因组特性Azospirillumsp A1-3及其相关菌株。
图3．的维恩图分析Azospirillumsp A1-3及相关Azospirillum物种。
在水稻基因组中发现了一套完整的编码固氮酶的基因(16,025 bp)AzospirillumA1-3号(图4)．的遗传组织nif基因在属间具有较高的相似性Azospirillum，并分布在基因组的三个部分。其中，第一组基因包含fixAB而且nifUSV．的fixAB基因编码一种膜蛋白复合物，参与向固氮酶的电子传递nifUS基因通常致力于固氮酶Fe-S簇的生物发生nifV编码同柠檬酸合成酶，这是固氮酶的重要组成部分(Edgren和Nordlund, 2004；Bellés-Sancho等，2021；Benoit等人，2021年)．第二组包含一系列基因(nifHDK而且nifENX)按相同顺序排列。的nifH编码铁蛋白和nifDK编码MoFe蛋白。NifEN蛋白是FeMo-co的生物合成支架，NifX参与了NifB-co向NifEN蛋白的有效转移过程(费伊等人，2016年；野中等人，2019)．第三组基因包含nifB而且nifTZ参与了固氮酶的合成nifA在Azospirillumsp。A1-3，偶氮螺旋菌B2T，Azospirillum humicireducensSgZ-5T，米氮螺旋菌COC8T．此外,见鬼而且拖已知代谢调节固氮酶的基因(王等，2018)在A1-3被发现，但是见鬼没有出现在Azospirillum palustreB2T，Azospirillum humicireducensSgZ-5T，米氮螺旋菌COC8T，Azospirillum lipoferumNCIMB 11861T,Azospirillum melinisTMCY 0552T．以上分析均证实菌株A1-3为一个新属Azospirillum．
图4．比较nif基因簇Azospirillumsp A1-3与Azospirillum palustreB2T，Azospirillum humicireducensSgZ-5T，Azospirillum oryzaeCOC8T，Azospirillum lipoferumNCIMB 11861T,氮螺旋菌MCY 0552T．箭头表示基因的转录方向。假设的蛋白质被涂成白色。
异菌甲酮的降解Azospirillumsp。A1-3
研究了异菌甲酮的降解动力学Azospirillumsp. A1-3同时被研究(图5)．在最初的84小时内，Azospirillumsp. A1-3生长较快，随后随异菌甲酮用量的减少而略有下降。孵育108 h后，异菌甲酮浓度为27.96 mg/LAzospirillumsp. A1-3降解率约为50.80%，细胞密度(OD600)由0.078增加到0.249。结果表明，Azospirillumsp. A1-3可以利用异菌二酮支持其生长。由此推断，菌株A1-3不能完全降解异菌二酮，但可以利用异菌二酮作为其生长的唯一碳源。
图5．异菌甲酮的应用AzospirillumA1-3 sp。
异菌二酮代谢物的鉴定
接种60 h后的样品，在8.245、6.990和1.598 min通过GC-ECD检测到三种化合物(I、II和III) (图6)．GC-MS/MS检测化合物I、II、III的总离子流图如图所示图6 b- - - - - -D,分别。所有化合物均含有苯环结构和氯离子同位素(Cl35到Cl37−)．发现化合物I、II和III在m/z 314.0999 [C12H10Cl35−2N3.O3.+) / 316.645 (C12H10Cl37−2N3.O3.+[c]9H6Cl35−2N2O2) / 245.9 (C9H6Cl37−2N2O2[C .]7H3.Cl35−2没有+) / 189.0660 (C7H3.Cl37−2没有+),分别。在Bruker-NIST数据库中，化合物I、II、III被鉴定为异菌二酮、N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧咪唑烷和(3,5-二氯苯脲)乙酸，与典型的(杨等，2018)．然而，(3,5-二氯苯脲)乙酸不能被降解为3,5-二氯苯胺Azospirillumsp. A1-3，这可能与相关基因缺失有关(Zhang等，2021)．异菌甲酮的代谢途径Azospirillumsp. A1-3在图7．
图6．异菌甲酮的降解途径AzospirillumA1-3 sp。(一)对菌株A1-3降解异菌二酮过程中产生的代谢产物进行气相色谱分析，(B)化合物I的质谱分析(C)化合物II的MS/MS分析(D)化合物III的质谱分析。
图7．异菌甲酮的代谢途径AzospirillumA1-3 sp。
的放大结果ipaH而且ddaH基因
的ipaH基因可水解异异菌酮的N1酰胺键ddaH基因对N-(3,5 -二氯苯基)-2,4-二氧咪唑胺(Zhang等，2021)．PCR扩增结果ipaH而且ddaH基因在Azospirillumsp. A1-3表明ipaH基因是一个明显的单一带，而ddaH基因弥散，无法测序。测序结果ipaH结果表明，该基因与其他文献报道的基因高度相似(98.72 ~ 99.92%)ipaH基因(图8)．而之前的报道ddaH基因没有出现在Azospirillumsp. A1-3，其他类型的水解酶可能参与N-(3,5 -二氯苯基)-2,4-二氧咪唑烷的海因环裂解过程AzospirillumA1-3 sp。
图8．的差异ipaH基因序列Azospirillumsp. A1-3和其他异丙二酮降解菌株。
讨论
异菌甲酮是世界上广泛应用于多种作物的杀菌剂，微生物降解是其环境耗散的主要途径。已经报道了几种能够降解异丙二酮的细菌菌株，但没有Azospirillum这是一部小说Azospirillumsp.A1-3具有异丙二酮降解能力。Azospirillum具有异菌二酮降解与固氮相关能力的新菌株迄今尚未报道。Azospirillum包含24个有效发表种和9个非有效发表种2在撰写本文时。一些研究表明Azospirillum植物除具有固氮功能外，还具有降解重油、降解阿特拉津、反硝化、产生类胡萝卜素等功能(Jang等人，2019；刘等，2019；吴等，2020；Mishra等人，2021)，以及的功能多样性Azospirillum今后需要研究。
已有研究表明异菌甲酮在不同微生物中的初始浓度为1.5 mM/L - 100 mg/L，降解速率为41.4-100%，降解时间为20 h-10 d (表2；Athiel等人，1995年；mercader等人，1997年；坎波斯等人，2017年；杨等，2017，2018；曹等，2018；李,2018)．在本研究中，50.80%的异菌甲酮被降解Azospirillum经108 h后，异菌二酮可先降解为N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧咪唑烷，再降解为(3,5-二氯苯脲)乙酸。的假单胞菌种虫害和小细菌属该菌能在24 h内快速降解异菌甲酮，但其降解途径和分子机制尚不明确。异菌甲酮的降解途径Azospirillumsp. A1-3与中典型的部分相同Paenarthrobacter菌株A1-3对异菌二酮的初始耐受浓度高于菌株YJN-5和菌株yjn - d。有研究表明，参与上述过程的编码基因具有高度相似性(Zhang等，2021)．在我们的后续研究中，ipaH基因是异菌二酮降解途径的最初步骤，在许多种类的微生物中具有98-99%的相似性(不动杆菌sp。Paenarthrobactersp。小细菌属sp。AzospirillumSp .部分数据未显示;周,2022)．异菌甲酮降解基因的拷贝数差异或氨基酸位点突变可能是异菌甲酮在微生物中降解率不同的主要原因。异菌甲酮降解基因高度相似，异菌甲酮不同降解率的分子机制(ipaH，ddaH,duaH)在不同属微生物中的差异有待进一步研究。
表2．异丙二酮降解菌株的基本特征。
数据可用性声明
本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和存取号可在条款/补充材料中找到。
作者的贡献
HL和YT发起并设计了这项研究。HP和BZ进行实验。HP、JL、ZZ、WB、YD、XL对数据进行分析。BZ、JL、HP三家公司制备的材料。惠普起草了手稿。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。
资金
国家自然科学基金项目(32060025)、湖南省科技创新计划项目(2022RC1170)、长沙市优秀青年创新人才培养计划项目(kq2106049)、湖南省大学生创新创业训练计划项目(S202110537006X)、湖南农业大学大学生创新创业训练计划项目(S202010537078)资助。湖南农业大学双一流建设项目(SYL201802002)。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
脚注
参考文献
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关键词:Azospirillum，新分类群，异菌二酮，降解途径，生物修复
引用:潘红，朱斌，李娟，周震，卜伟，戴勇，陆霞，刘红，田勇(2023)异菌二酮降解的新菌株Azospirillumsp A1-3从西藏分离出来。前面。Microbiol．13:1057030。doi: 10.3389 / fmicb.2022.1057030
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