原始研究的文章

前面。地中海,2023年1月18日
秒。风湿病学
卷10 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fmed.2023.1033232

免疫渗滤分析揭示了免疫细胞签名唾腺组织原发性干燥综合征

Hongxiao龚 ^1、2中,

Xiaoting邱 ^1、2中,

记者李^1、2,

润之赵^1、2,

Beijia王^1、2,

凌朱^{2 *}和

果河霍 ^{1 *}

¹科学研究、临床研究实验中心,安徽中医药大学第一附属医院,合肥,安徽,中国
²耳鼻喉科、安徽中医药大学第一附属医院,合肥,安徽,中国

作品简介:小鼠模型是原发性干燥综合征(pSS)的基础研究。然而,对比老鼠和人类的深度唾腺(SG)免疫细胞仍然有限。

方法:SGs的基因表达谱正常受试者和pSS患者从基因表达综合数据库下载。浸润免疫细胞的比例子集当时评估细胞类型鉴定评估相对子集的RNA转录(CIBERSORT)。一个实验性的干燥综合征(ESS)小鼠模型已成功构建使用SG蛋白质。基于鼠标RNA-Seq SG组织数据,seq-ImmuCC模型被用于定量分析的成分比例10 pSS患者的免疫细胞和小鼠模型SG组织。

结果:计算和获得31人类样本数据使用CIBERSORT反褶积方法。免疫细胞浸润的结果表明,与正常人类SG组织相比,γδ的内容与天真的CD4 T细胞明显不同⁺T细胞和显著增加,而浆细胞含量降低。主成分分析表明不同的免疫细胞浸润pSS患者和正常人之间。同时,ESS模型鼠标数据分析,我们发现,巨噬细胞的比例增加,而CD4的比例⁺T细胞、B细胞和单核细胞减少。此外,我们发现单核细胞的比例减少,而巨噬细胞的比例增加的SG组织pSS患者和小鼠模型。CD4细胞的渗透⁺T, CD8⁺T, B细胞也表现出一些差异。

讨论:我们全面分析了SG pSS患者和模型小鼠的免疫渗透。我们演示了守恒和nonconserved方面在老鼠和人类免疫系统的免疫细胞水平来帮助解释的主要调节免疫机制在干燥综合征的发展。

介绍

原发性干燥综合征(pSS)是一种常见的系统性自身免疫性疾病。统计数据表明,其发病率在男性远远高于女性,9-14:1比(1)。这种疾病具有明显的特征,表现为分泌功能的丧失引起的外分泌腺淋巴细胞的浸润。其中,泪和唾腺障碍是最常见的(2)。疾病的发病机制并不完全清楚,可能与免疫损伤有关,环境和基因(3)。异常患者的免疫细胞数量的靶器官和血液也是必不可少的pSS发生和加重(4)。

细胞类型识别估计相对子集的RNA转录(CIBERSORT)算法可以评估免疫细胞渗透在组织基于基因表达数据集(5)。许多研究已经使用该算法探索疾病的免疫细胞组成(6)。RNA序列(RNA-seq)使整个转录组的分析揭示整个信号网络的变化和潜在的基因预测小说的意义。从转录组数据中提取组织免疫环境已逐渐成为一个研究热点,但它很少涉及到鼠标RNA-seq数据。seq-ImmuCC模型是最近开发的描述的构成主要的免疫细胞在不同的组织或器官从鼠标RNA-Seq数据(7)。

小鼠模型是无价的工具来描述信号通路和生物医学研究,pSS和大多数研究都是基于小鼠模型。然而,人类和老鼠免疫之间存在差异(8,9)。通过文献回顾和研究小组先前的研究,发现C57BL / 6小鼠抗原诱导学生的典型动物模型(10- - - - - -12)。我们执行免疫pSS的渗透分析人类唾液腺(SG) CIBERSORT (13)和pSS C57BL / 6小鼠seq-ImmuCC模型。然后,我们进行了全面的比较来确定人类和老鼠的细胞特性和他们的免疫系统进化的相似之处。我们目前的结果可能会提供洞察pSS的免疫调节机制。

材料和方法

数据源

基因表达谱芯片的数据集的SGs正常人和pSS患者(GSE40611)从基因表达综合检索(GEO)数据库。¹31个样本可用,包括16个正常人和15 pSS患者的SG组织。

评价免疫细胞浸润在SG pSS患者的组织模式

我们使用Perl组织基因表达数据与基因基因矩阵的行和列的样本。SG的mRNA表达谱矩阵组织的正常受试者和pSS患者纠正了“BioManager”和“limma”R包。表达上的反褶积分析矩阵与CIBERSORT人类免疫细胞亚型。22免疫细胞组织的相对比例计算,和一个p为每个样本值了。样本根据的筛选p< 0.05和唾腺组织的免疫细胞成分矩阵从16个正常人和15 pSS患者。R语言和相关的包被用来绘制直方图和免疫细胞表达的热图的免疫细胞成分比例两组。“corrplot”R包是用于分析的相关性免疫细胞在pSS患者的SGs和画的热图;“vioplot”R包是用来比较和分析SG免疫细胞的比例在正常人和pSS患者和画一个小提琴图。

干燥综合征小鼠模型的建设

特定的无菌流行女C57BL / 6小鼠从VitalLiver购买实验动物技术。老鼠被安置在恒定的温度和湿度和美联储随意。所有动物实验进行了以下协议经动物实验伦理审查委员会的安徽大学中药(动物伦理数量:ahucm -鼠标- 2021082)。构建SG protein-induced pSS (ESS)小鼠模型(14)、SG蛋白乳状液皮下注射到老鼠的背侧和尾基地建立ESS。我们经常发现小鼠的唾液流0,6、8周(15),加上他染色组织病理学评分来确定小鼠模型的结构(16)。老鼠建模失败被淘汰,成功建立了pSS小鼠模型以临床症状和唾液流量大大减少。RNA-seq,小鼠随机分为两组:控制(n= 3)和ESS (n= 3)组。

RNA-seq

三个控制和六个模型小鼠的SGs RNA-seq选择。模型组小鼠显示显著减少唾液分泌,明显炎症病灶的病理切片标本(RNA-zzseq方法补充材料)。

统计方法

R(版本4.0.2)软件和“Bioconductor²“包被用于统计分析。对数据排序,列表中删除方法进行处理。整个列被删除样本没有任何单个值,这是不适合统计分析。“corrplot”R包被用来检测和画出不同的免疫细胞之间的相关性SG pSS患者的组织;“vioplot”R包是用来计算并绘制不同的免疫细胞的比例两组。我们使用了新开发的seq-ImmuCC³处理在镜头之外的数据,如前所述(7,17)。皮尔森相关系数是用来测量线性度,确定相对大量的免疫细胞之间的协议类型。均方根误差(RMSE)被用来评估估计偏差。热图了使用“pheatmap”R包。所有统计分析使用R软件(18)。唾液分泌水平和一个未配对的双尾进行了分析t以及。正常和方差的同质性验证使用Shapiro-Wilk测试和列文的测试,分别。数据是描述通过±sem。对所有统计测试,P< 0.05被认为是具有统计学意义。

结果

免疫细胞浸润在pSS患者和正常人

CIBERSORT反褶积方法被用来计算并获得31个可靠的样本,包括16正常和15 pSS样本。免疫细胞浸润的结果表明,与正常组相比,CD4 T天真,γδT, B,记忆和记忆CD4 T细胞显著增加pSS组CD8 T细胞没有明显变化,而浆细胞明显减少。树突细胞休息和树突细胞活性并没有明显增加(图1一个)。22的渗透比率提出了免疫细胞类型图1 b。

图1

图1所示。唾腺pSS患者的免疫细胞浸润和正常个体。(一)直方图(对应颜色模块显示类型和大小显示免疫细胞总数的比例)(B)热图22免疫细胞比例的pSS患者的唾液腺和正常个体。

人类免疫细胞的相关分析

免疫细胞之间的相关性分析显示显著正相关γδt细胞和CD4幼稚t细胞(r= 0.61,p< 0.05),休息NK细胞和肥大细胞激活(r= 0.66,p< 0.05)。γδT之间显著负相关检测和浆细胞(r=−0.7,p< 0.05)(图2一个)。小提琴图显示pSS患者比正常人有丰富的巨噬细胞浸润。此外,与正常人相比,pSS患者显著增加内容天真的B,激活内存CD4 T和γδT细胞。另一方面,浆细胞的内容,休息NK细胞和单核细胞显著减少(图2 b)。最后,主成分分析(PCA)基于浸润免疫细胞类型显示pSS和健康组织之间的区别的结果(图2 c)。

图2

图2。相关的唾腺pSS患者和正常人之间的免疫细胞。(一)免疫细胞之间的相关性的子集。γδT之间有显著负相关,浆细胞。(B)比较22免疫细胞子集的唾液腺pSS患者和正常人。M1γδt细胞和巨噬细胞浸润的比例是高pSS患者(p被认为是显著p < 0.05)。(C)主成分分析的唾腺pSS患者的免疫细胞浸润和正常个体。蓝色是正常组;红色是pSS组。

ESS模型的建立

大多数C57BL / 6小鼠模型组发达pSS临床症状与同种异体免疫后SG蛋白质。我们发现模型小鼠的唾液分泌显著减少后从星期6免疫和整体唾液分泌趋于平稳,不同于未接受免疫接种的控件(图3一)。后的组织学分析SG ESS的组织部分模型和控制老鼠,我们发现SGs ESS小鼠的淋巴细胞浸润免疫接种后6周(图3 b)。此外,多个淋巴细胞病灶8周后检测到免疫。我们还观察到模型小鼠受损的腺泡,不同于对照组(图3 c)。然后,我们使用一个评分系统,发现渗透严重程度量化实现直观的表达效果。pSS模型组的组织学评分明显高于对照组。模型组的分数往往随着时间的增加(图3 d)。总之,这些结果表明,该模型成功建立。

图3

图3。鼠标建模的结果。(一)ESS模型小鼠的唾液分泌明显低于正常组。以周6和8 ( $\bar{χ}$ ±s,n= 3),* * *p< 0.001,* *p< 0.01,*p< 0.05和控制。在6周的唾液腺损伤的组织学观察(B)和(C)8在ESS老鼠和控制。(D)唾腺病变的组织学评分在星期6和8周ESS老鼠和控件( $\bar{χ}$ ±s,n= 8),* * *p< 0.001,* *p< 0.01,*p< 0.05和控制。

小鼠免疫细胞浸润

基于鼠标唾腺组织RNA-Seq数据和seq-ImmuCC模型,十个类型的免疫细胞在老鼠身上进行了分析SG组织:B细胞、CD4细胞⁺T细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞CD8⁺T细胞、NK细胞、肥大细胞、树突细胞和嗜酸性粒细胞。我们发现大量的巨噬细胞浸润在所有SG组织(图4一)。聚类分析表明,ESS的免疫细胞渗透模型和控制小鼠明显部落之间的差异(图4 b)。免疫细胞相关分析显示,嗜酸性粒细胞和B细胞显著正相关(r= 0.95,p< 0.05),单核细胞和B细胞(r= 0.86,p< 0.05),中性粒细胞和CD4细胞⁺T细胞(r= 0.77,p< 0.05)、单核细胞、嗜酸性粒细胞(r= 0.69,p< 0.05)。与此同时,巨噬细胞和B细胞(r=−0.78,p< 0.05)、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞(r=−0.6,p< 0.05)、单核细胞和巨噬细胞(r=−0.89,p(< 0.05)有显著的负相关图4 c)。小提琴图显示,控制老鼠相比,ESS的SGs模型小鼠巨噬细胞、CD8的比例明显增加⁺T细胞,而CD4细胞⁺T细胞、单核细胞和B细胞显著减少(图4 d)。

图4

图4。渗透的唾腺在ESS小鼠免疫细胞。(一)10在唾腺组织中免疫细胞的构成基于ImmuCC化验。(B)集群的热图ESS唾腺的免疫细胞的小鼠模型和控制老鼠。(C)免疫细胞亚群之间的相互关系。单核细胞和巨噬细胞之间有负相关(p被认为是显著p < 0.05)。(D)比较唾腺组织浸润免疫细胞子集的ESS模型和控制老鼠。巨噬细胞浸润的比例高于ESS模型小鼠。巨噬细胞在唾液腺组织增加ESS病变。蓝色是正常组;红色是ESS组。

综合分析pSS患者的免疫细胞浸润和ESS模型小鼠

pSS患者的免疫分析渗透和ESS模型小鼠免疫细胞成分的异同。对于人类的数据,我们发现γδt细胞,t细胞CD4天真,天真的B细胞,巨噬细胞M1,激活CD4记忆⁺T细胞明显增加,浆细胞,NK细胞和单核细胞显著减少(图2 b)。在模型小鼠巨噬细胞的数量和CD8⁺T细胞明显增加,而CD4的比例⁺T细胞、B细胞和单核细胞减少(图4 d)。结合这些结果,我们发现pSS患者单核细胞减少的比例(p= 0.001)和SG模型小鼠的组织(p= 0.0489)。另外,巨噬细胞(p在模型小鼠= 0.0476)显著增加,M1巨噬细胞(p在pSS患者= 0.028)显著增加,而M0 (p= 0.173)和M2巨噬细胞(p= 0.207)没有明显增加。CD8的比例⁺T细胞(p= 0.0238)只会增加模型小鼠。另一方面,CD4的内容⁺T细胞(p= 0.0262)和B细胞(p= 0.0431)在模型小鼠的组织不同程度下降但在pSS患者呈现一个上升趋势。

讨论

pSS是一种常见的自身免疫性疾病的中老年女性目标外分泌腺体,如SGs,可能涉及多个器官和系统。许多研究表明,免疫细胞的比例在pSS患者与正常人不同,这也是它的发生和恶化的一个重要因素。高通量分析技术如转录组和表达微阵列分析允许获得洞察免疫细胞成分的变化。本研究的一个独特的特性相关的人类与ESS C57BL / 6小鼠基因表达数据。数据的综合分析使细胞在人类和小鼠模型的描述和可能提供一些见解pSS的免疫调节的机制。

在人类分析,矩阵表达人类免疫细胞亚型deconvoluted和策划在鼠标使用r .分析,我们首先构造一个ESS小鼠模型。然后,我们确定唾液量和淋巴细胞浸润在SG组织的变化来确定模型的成功。接下来,我们收集鼠标SG组织,测序RNA (RNA-seq),处理结果由seq-ImmuCC进行全面分析。通过总结人类和老鼠之间的细胞特征,我们扩大了pSS-related监管机制的理解。

免疫渗滤分析表明,老鼠和人类免疫细胞有一定的共同特征。单核细胞的比例在pSS患者和ESS小鼠颌下腺组织减少。此外,巨噬细胞表现出相同的变化趋势。然而,CD8的比例⁺ESS小鼠T细胞只会增加。CD4的比率⁺T细胞B细胞减少ESS小鼠模型,但增加的人类。对于人类的数据,我们发现γδ和天真的CD4 T细胞和浆细胞呈正相关。此外,天真的B细胞,激活记忆CD4和γδt细胞明显增加,而浆细胞、NK细胞休息,和单核细胞显著减少。此外,主成分分析结果表明,免疫细胞渗透可以用来区分pSS患者和正常的人。对于鼠标的数据分析,我们发现,巨噬细胞和B细胞负相关,嗜酸性粒细胞,单核细胞和巨噬细胞的数量增加。CD4的趋势⁺T细胞、单核细胞和B细胞明显减少。

B淋巴细胞生成造血干细胞的分化,在骨髓中成熟,最后激活在二级淋巴器官。有人建议,autoreactive抗体表达的频率增加了成熟的幼稚的B细胞和外周B细胞受损宽容pSS患者可能参与pSS的发病机理(19,20.)。浆细胞终末分化执行多种功能的B细胞产生抗体和其他细胞因子。我们观察到,天真的pSS患者的B细胞的数量增加,而浆细胞的数量减少。它可能与B细胞pSS患者的早期损坏。巨噬细胞是先天免疫细胞和玩许多重要作用,包括宿主防御,组织内稳态和调节炎症反应(21,22)。巨噬细胞也有炎症细胞浸润唾液腺的一个重要组成部分。许多研究表明巨噬细胞参与的病理损害唾液腺(23- - - - - -25)。巨噬细胞在唾液腺致病性,能分泌细胞因子有关。此外,患者肿胀显著增加巨噬细胞浸润在SGs (23),符合巨噬细胞数量的增加在我们当前的结果。与此同时,他们参与pSS发病机理。越来越多的研究表明,浸润的单核细胞和巨噬细胞表型改变自身免疫性疾病和与小鼠和人类的(26- - - - - -29日)。在pSS患者单核细胞在凋亡细胞的清除效率低下,这也与生产等促炎细胞因子il - 6, TNF-α,il - 10,改变增长factor-β,interferon-α(30.- - - - - -32)。

此外,CD8⁺T淋巴细胞是一个复杂的淋巴细胞有不同的表型。研究表明,激活CD8⁺总在T淋巴细胞凋亡腺泡上皮细胞、CD8⁺CD4 T细胞浸润腺体显示细胞毒性的影响⁺T细胞(33)。随着病情的发展,CD8的比例⁺T细胞在pSS患者比正常人明显增加(34),与我们的结果一致。CD4记忆⁺T细胞是高度相关的自身免疫性疾病,由于其长期存在的特性,有效的反应抗原和潜在调解复发性自身免疫反应(35)。然而,许多关键问题的潜在贡献CD4记忆⁺T细胞自身免疫性疾病仍然悬而未决。一些研究表明,CD4的相对比例的内存⁺T增加pSS患者与正常对照组(36),符合我们人类免疫渗透的结果。然而,记忆的特异性t细胞和pSS是不同的,和他们的关系还没有完全理解。此外,一些学者发现,减少pSS患者的淋巴细胞与天真的CD4的过早衰老⁺T细胞在人体内,这也可能解释CD4的减少⁺T淋巴细胞在鼠标数据(37)。确定免疫生物CD4的角色⁺T和CD8⁺T细胞在pSS是至关重要的发展基于这些细胞的靶向治疗。δ(γ/γδ⁺)T细胞约占2 - 5%的外周血T淋巴细胞主要分布在mucosa-associated淋巴组织。他们的天然免疫与适应性免疫的免疫功能,参与组织内稳态和感染监控(38)。据报道,激活细胞的比例γ/δ⁺在pSS患者的外周血t细胞亚群显著高于控制,和激活细胞相关疾病的频率(39),与我们的结果一致。这些结果也表明,这种t细胞子集可能发挥作用在pSS遇到的病理性免疫反应。

然而,我们的研究也有一些局限性。首先,seq-ImmuCC模型仅覆盖十细胞类型。例如,γδt细胞,在免疫系统发挥重要作用,不包括,进一步改进是必需的。此外,人类的实验是基于生物免疫渗透转录组签名从公共数据集的分析,而且还需要进一步的研究来证实这项发现人类切片观察。

结论

pSS,我们执行免疫渗透分析人类和小鼠模型并预测异常特异免疫渗透模式来揭示pSS的潜在的免疫发病机制。我们发现单核细胞水平减少pSS患者和小鼠模型。然而,需要进一步的实验表明,这些细胞在pSS执行组织损伤,为我们当前的结果显示。因此,我们为疾病修饰免疫疗法提供了见解通过瞄准特定的免疫细胞。

数据可用性声明

DAS公开的数据集进行分析。这些数据可以在这里找到:地理数据库,GSE40611。最初的贡献提出了研究公开。这些数据可以在这里找到:NCBI SRA数据库,根据入世PRJNA839202。

道德声明

综述了动物研究和动物实验伦理审查委员会批准,安徽中医药大学。

作者的贡献

XH构思和设计实验,进行实验,通过最后的版本,和分析数据。XQ和HG起草提交文章,数据分析的准确性,数据的分析和解释。PL、RZ和BW导致收购试剂、材料、和分析工具。XH和LZ导致执行验证实验和修订后的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项研究得到了国家自然科学基金(81803938)和研究安徽省准备计划项目(2022号ah050508)。

确认

我们感谢研究对象和研究人员对这项研究的贡献和承诺。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2023.1033232/full补充材料

脚注

引用

1。Bjrk, Mofors J, Wahren-Herlenius m .环境因素在原发性干燥综合征的发病机理。J内部地中海。287年(2020年):475 - 92。

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2。比啊,Norheim K, Rodahl E,琼森R, Omdal R .原发性干燥综合征和眼睛。Surv分册。(2020)65:119-32。doi: 10.1016 / j.survophthal.2019.10.004