AAV8-mediated sVEGFR2和sVEGFR3基因疗法结合化疗降低人类卵巢癌的生长和微脉管系统,延长小鼠的生存

介绍

卵巢癌(OVCA)是全世界第三个最常见的妇科癌症在2020年有超过300000新病例诊断(1)。OVCA通常是无症状的早期阶段,大约80%的OVCA患者被诊断为晚期疾病(2)。虽然手术和化疗治疗的进步改善了预后OVCA,先进OVCA仍与不良预后相关,妇科癌症中死亡率最高的(3)。

血管生成,定义为从已存在的血管新血管的形成,一直被认为是一个重要组成部分OVCA固体肿瘤的生长和转移的癌症和其他疾病。血管生成主要由血管内皮生长因子(vegf) VEGF-A VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D,及其各自VEGF-tyrosine-kinase受体(VEGFRs) VEGFR1 VEGFR2, VEGFR3。VEGF-A、VEGF-C VEGF-D VEGFR2的配体,调节血管生成,血管生成和血管通透性,而绑定VEGF-C和VEGF-D VEGFR3控制lymphangiogenesis,在肿瘤转移中扮演着重要角色通过淋巴管(4,5)。我们先前的研究已经表明,瘤内血管生成和肿瘤生长OVCA可以抑制adenovirus-mediated可溶性表达VEGFR (sVEGFR)诱饵,绑定VEGF和抑制VEGF / VEGFR信号通路在小鼠模型(6- - - - - -9)。然而,运载体提供一个相对短期的转基因表达,强调需要向量与一个更稳定的转基因表达,如腺相关病毒(AAV)载体(10)。

减积手术和联合卡铂和紫杉醇是目前治疗先进OVCA的黄金标准。虽然大多数患者治疗反应良好,多数患者最终会产生药物抗性和复发的疾病(11)。结合使用carboplatin-paclitaxel和反血管增生基因治疗可以提供一个协同antitumoral效果和改善当前的治疗方案的疗效(12)。

本研究的目的是检查是否AAV8-mediated sVEGFR2和sVEFGR3基因治疗提供了一种更有效的抑制瘤内血管生成比sVEFGR2或sVEGFR3孤独,如果化疗能进一步改善antitumoral基因治疗的效果。我们的研究结果表明,AAV8-mediated sVEGFR2和sVEGFR3基因疗法降低瘤内血管生成和肿瘤生长,从而证明在OVCA反血管增生基因疗法的治疗潜力。

材料和方法

细胞培养

Human-originated OVCA细胞系叫SKOV-3m适应鼠标研究Sallinen et al。13)被用于这项研究。细胞系的设计相似人类OVCA积极上皮表型。5在本人的培养基培养细胞(M8403, Sigma-Aldrich Zwijndrecht, NL)和胎牛血清(的边后卫;Sigma-Aldrich Zwijndrecht, NL)和Opti penicillin-streptomycin 1%^®mem (Sigma-Aldrich Zwijndrecht问)。用胰蛋白酶细胞收获,然后离心,Opti-MEM延迟^®-GlutaMAXTM (GIBCOTM生命技术,美国)。

病毒载体

与巨细胞病毒(CMV)启动子编码AAV8-vectors sVEGFR2 (AAV8-sVEGFR2)和sVEGFR3 (AAV8-sVEGFR3)被用于这项研究。AAV8-vector与CMV启动子没有任何插入(AAV8-CMV)作为一个空白的控制。病毒基因转移1×10的效价¹¹vg /毫升/病毒/鼠标,在200年第四卷μL在0.9%氯化钠。病毒载体筛选是免费的从replication-competent病毒、脂多糖、细菌污染。

动物模型

拥有雌性Balb / cA-nu老鼠(n= 65,泰康利生物科学有限公司)被用于这项研究被Sallinen et al。(13)。所有动物的作品根据动物实验进行许可批准的国家动物实验委员会芬兰南部地区国家行政机构(ESAVI)和芬兰行动指南后进行动物实验(62/2006)。

在实验室老鼠孤立在无菌环境中大学动物中心东部的芬兰。动物饲料、水和层理是热压处理过的。动物被关在笼子里组最多五个动物,并得到了水和饲料随意。SKOV-3m细胞(7.5×10⁶细胞)注射22 G针进入腹膜腔产生腹腔内肿瘤。动物麻醉使用isoflurane-oxygen-anesthesia静脉(异氟烷、百特医疗AB) (注射基因疗法和血液采样。麻醉是发起450毫升空气和4.0 - -4.5%异氟烷;动物后睡着了麻醉的状态的维持剂量降至250毫升空气和1.5 - -2.0%异氟烷。基因转移进行静脉注射后7天尾静脉SKOV-3m细胞注入。

动物每天,很仔细,生存监控。使用二氧化碳安乐死的动物牺牲紧随其后的是颈椎脱位时显著变化观察到他们的总体幸福(如减肥> 20%)或肿瘤的直径超过1.5厘米。建立了人道的端点先天的。在牺牲,所有可见的肿瘤,小(ca。0.5厘米³)组织样本(心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、肠、腹膜)进行组织学分析。所有肿瘤组织称重和腹水的量测量。

学习小组

老鼠被随机分配到三个对照组和4个反血管增生基因治疗接受治疗组(表1)。对照组包括各组(我),(2)与AAV8-CMV空白对照组,和(3)组与联合AAV8-CMV和化疗。治疗组收到(IV) AAV8-sVEGFR2 (V) AAV8-sVEGFR3, (VI)结合AAV8-sVEGFR2 AAV8-sVEGFR3,(七)结合AAV8-sVEGFR2, AAV8-sVEGFR3和化疗。

磁共振成像

磁共振成像(MRI)被用来评估腹腔内肿瘤的发展,腹水形成,基因治疗的效率。MRI是第一次做6天SKOV-3m细胞注射后,然后每周直到死亡的动物(10天,17日,24日,31日从基因转移和38)。MRI测量,水平7 T磁铁是利用(力量PharmaScan,力量BioSpin MRI GmbH德国)和界面的ParaVision 5.1,使用正交发射机体积和3厘米直径环表面接收线圈。动物麻醉最初4%异氟烷(巴克斯特Oy,芬兰赫尔辛基)70% N₂-30%啊₂,在成像过程中,异氟烷水平降至大约1.5%。在核磁共振,动物的呼吸率,用来触发成像,是监测气动枕头(SA乐器,石溪纽约,美国)。小鼠的生理温度是由一个温暖的水垫。

确定肿瘤周围组织的位置以及他们的异常强度和对比。解剖成像是通过使用多层T2三快速自旋回波序列(重复时间(TR) = 3 s,有效回波时间(TE) = 44女士,回波列车长度= 4,平均2,视野(FOV) = 40×40毫米²矩阵大小= 256×256,切片厚度1毫米,30片)与图像覆盖动物的腹腔。从解剖的MRI图像,肿瘤的大小进行了分析,之后每周直到sacrification的动物。肿瘤的面积是手绘解剖图像和肿瘤总量从多个肿瘤位点被计算。

t2加权的解剖图像,一片的顶部显示最大的肿瘤小鼠腹部被选为扩散加权成像。表观扩散系数(ADC)的水是由扩散加权成像使用自旋回波序列与三个正交方向的扩散加权(TR = 2 s, TE = 27女士,b值= 500 s /毫米²女士,扩散时间= 14;女士梯度时间= 4;FOV = 40×40毫米²矩阵大小= 128×64)。此外,一个没有扩散加权图像(b= 0)收集。ADC图计算像素的基础上使用方程

在哪里b是b值,年代_醉酒驾车是信号从微量扩散加权图像,年代₀是信号从b = 0的形象。伊蚊软件包(aedes.uef.fi)和Matlab (MathWorks纳蒂克,MA)被用于核磁共振分析。核磁共振分析都是盲目地完成。

化疗

联合卡铂和紫杉醇化疗后7天基因转移给学习小组第三和第七。腹腔内注射剂量卡铂(10毫克/毫升,Hospira, Hospira英国有限公司)和紫杉醇(Hospira 6毫克/毫升;Hospira英国有限公司)是80年和20毫克/公斤/鼠标。

组织学和免疫组织化学

收集组织标本浸在4%多聚甲醛在磷酸盐(PBS),其次是隔夜浸泡在15%蔗糖。组织样本5μm粗石蜡包埋处理部分和用于组织学和immunohistological分析。

treatment-induced肝脏和肿瘤坏死是盲目地评估haematoxylin-eosin(他)(Sigma-Aldrich Zwijndrecht, NL)彩色部分的病理学家。染色组织学部分拍摄与尼康DS-Ri2共焦显微镜和处理NIS-Elements AR 4.30.02(尼康、东京、日本),ImageJ 1.48 v(美国国立卫生研究院)和Photoshop CS(美国加州Adobe)软件。

抗血管新生治疗效果评估从CD34-A488荧光应用肿瘤部分。肿瘤石蜡包埋切片是安装在玻璃幻灯片。样本deparaffinized和水分,然后洗卫x - 100解决方案(1:50 0稀释在PBS)柠檬酸缓冲(10毫米,pH值6.0)沸腾。与血清样本然后阻塞(1:10稀释山羊血清和1:50稀释鼠血清)在室温下,在孵化前与主CD34单克隆抗体(1:50稀释,MEC 14.7、HM1015 Hycult生物技术,Uden,荷兰)在4°C在潮湿的房间。样本然后二级抗体孵育(1:50稀释,Alexa萤石™488山羊Anti-Rat免疫球蛋白(H + L),由热费希尔科学表达载体,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)在室温下,在那之后与苏丹黑B在70%乙醇(0.1% SBB)。样本用Tween20(0.02%渐变在PBS)被包含在之前安装介质(与DAPI Vectashield, h - 1200,向量)和覆盖着显微镜幻灯片。彩色部分拍摄与尼康DS-Qi2共焦显微镜和彩色血管手动测量从10代表字段与NIS-Elements AR 4.30.02(100×放大)。平均血管密度(MVD)和血管面积(TVA)计算获得的结果。

细胞增殖是估计KI67 immunohistological染色。肿瘤KI67染色,石蜡包埋切片是安装在玻璃幻灯片。样本deparaffinized和水分,然后煮在柠檬酸缓冲(pH值6.0),与过氧化氢和治疗(5%)。与血清样本然后阻塞(1.5%正常马血清在PBS)在室温下,在孵化前与主KI67单克隆抗体(1:50稀释,克隆MIB-1 Dako M7240, Dako-Cytomation,斯特鲁普,丹麦)在4°C在潮湿的房间。样本然后二级抗体孵育(1:10 0稀释,生物素化的马Anti-Mouse免疫球蛋白(H + L),矢量实验室公司、纽瓦克、钙、美国)在室温下。然后每Avidin-biotin-HRP一步是使用Vectastain精英执行ABC工具包(向量实验室公司、纽瓦克、钙、美国),之后样本覆盖tetrahydrochloride 3、3′- diaminobenzidine (DAB)在室温下与哈里斯苏木精复染色,脱水,封装在Permount安装介质(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国),和覆盖着显微镜幻灯片。彩色部分拍摄与尼康DS-Ri2共焦显微镜和KI67的比例计算阳性细胞从10代表字段(100×放大)NIS-Elements AR 4.30.02软件。

统计分析

27统计分析使用IBM SPSS统计软件(美国纽约阿蒙克IBM)。学习小组与单向方差分析比较LSD紧随其后因果分析或克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析在适当的时候。日志₁₀变换用于KI67的结果。生存数据分析与kaplan meier估计和克鲁斯卡尔-沃利斯随后Logrank测试。固定效应分析基于线性混合模型用于分析纵向MRI结果。所有的结果都显示为均值的平均值±标准误差(SEM)。结果被认为是显著的价值p< 0.05 *,p< 0.01^{* *},p< 0.001^{* * *}。

结果

微脉管测量

MVD和流域的测量从微血管cd34多(图1)透露,在一般情况下,MVD低在所有治疗组(组IV-VII)相比,对照组(组》)。MVD最低的是第七组中观察到(48.9±16.9 /毫米²)。然而,基因疗法之间的差异仍然与接收组。MVD显著降低在集团第七组相比,我p= 0.001),二世(p= 0.008)和3 (p= 0.013)。流域的数据遵循相同的趋势与MVD数据:TVA被发现在七组最低(0.45±0.26%),相对于其他组。TVA是统计学上显著降低在七组相比,组我p= 0.006)和二世(p= 0.032)。

组织学

组织学检查高档卵巢上皮癌肿瘤。之间无显著差异在肿瘤坏死组(p= 0.237,克鲁斯卡尔-沃利斯)。最终随访,OVCA组织的形态已经完全或部分取代坏死组织团体,有些团体只显示小局部坏死(图2 a - c)。细胞增殖指数衡量KI67免疫组织化学染色第七组中最高(389±156 /毫米²)相比,另一组(图2 d-f)。肝坏死的显著差异(图2胃肠道)之间的观察组(p= 0.001,克鲁斯卡尔-沃利斯):两两比较显示,肝坏死在第六组更加突出,七世相比,第三组(p= 0.030,p= 0.009,克鲁斯卡尔-沃利斯)。

腹水形成的流体

意思是体积的腹水组为2.16±0.14毫升。腹水形成在第七组相比显著降低第三组(p= 0.017,因果LSD)和V (p= 0.003)。明显减少了大量的腹水液也被发现在第四组(p= 0.015)和六世(p= 0.031)组相比,V (图3)。

磁共振成像

在第十天的小鼠肿瘤体积V组相比明显大老鼠在第六组(p= 0.018)(图4一)。大多数的肿瘤之间的卷组显著差异在17至24天核磁共振扫描检测;在第七天17组显示卷组相比小得多的肿瘤我(p= 0.015),二世(p< 0.001)和V (p< 0.001)(图4 b, C)。在一天24核磁共振扫描,最小的肿瘤第七卷组中发现了相比其他组(p< 0.001)。后计算核磁共振数据只能获得从动物组第六第七,因为老鼠从所有其他组必须牺牲由于sacrification标准。第七组相比显著降低肿瘤卷组第六天31日(p在天38 = 0.003)和(p= 0.041)。

一般来说,老鼠在七组有更高的ADC值一天6相比,对照组(组我,p< 0.001;第二组,p= 0.022;第三组,p= 0.029),或者第四组(p和老鼠群V = 0.001),差异不显著。ADC值的老鼠在七组下降随着时间的推移,在ADC值没有显著差异24天后观察随访。ADC值之间提出了学习小组补充图1。

生存

老鼠的总体平均生存时间是25±1天从SKOV-3m细胞注射。老鼠在七组总生存期最长,34±3天。学习小组之间有显著差异(p< 0.001,克鲁斯卡尔-沃利斯):第七组明显延长生存相比,对照组和组V (图5)。同时,第三组相比有显著延长生存时间组织我p= 0.011)和二世(p= 0.001)。

讨论

VEGF / VEGFR针对抗血管新生疗法是一个有吸引力的方法治疗OVCA由于angiogenesis-dependent肿瘤的增长,不太可能发展的阻力14)。越来越多的VEGF / VEGFR针对治疗代理人介绍了在过去的几年里,但只有少数介质作为贝伐单抗,pazopanib, nintedanib-have显著提高生存在临床试验(11)。基因治疗可以提供更多的持续的抗血管新生因子的表达,从而有助于实现长期治疗效果。我们的方法目标VEGFR2和VEGFR3的配体,它应该提供一个更全面的抑制血管生成和lymphangiogenesis和提高治疗效果与其他代理相比,贝伐单抗等块只有VEGF家族的成员之一。据我们所知,没有临床AAV8-mediated基因疗法试验结合sVEGFR2和sVEGFR3 OVCA小鼠模型已报告。

我们表明,AAV8-sVEGFR2 AAV8-sVEGFR3,结合AAV8-sVEGFR2和AAV8-sVEGFR3基因疗法都减少肿瘤组织中MVD和流域的开发。我们先前的研究已经提供了类似的结果证明结合使用adenovirus-mediated sVEGFR1 (AdsVEGFR1) AdsVEGFR2和AdsVEGFR3基因治疗(6,7)和AdsVEGFR2和AdsVEGFR3基因治疗(8)减少MVD和流域的开发同样的小鼠模型。与Sallinen et al .,我们观察到sVEGFR2 sVEGFR3仅能抑制肿瘤血管生成的方式类似于sVEGFR2和sVEGFR3联合基因治疗。什么仍然开放的利益结合sVEGFR2 sVEGFR3,和使用反血管增生基因治疗与化疗。化疗与一些损害生活质量的负面影响,如恶心、疲劳和神经毒性(15)。人们很容易认为,基因治疗和化疗的联合使用可以让我们减少化疗的剂量,而不丢失antitumoral效应,从而减少化疗所致不良反应的发生率。然而,这需要进一步的研究探讨实现与不同的基因治疗和化疗剂量治疗反应。

类似于我们的最近的研究(9),降低瘤内血管生成并不是直接反映KI67的表达式。老鼠接受AAV8-sVEGFR2和AAV8-sVGEFR3治疗显示调节KI67表达式,从而表明基因疗法促进肿瘤细胞的增殖。被假定的推广扩散,癌细胞可能由于补偿机制被激活的VEGF / VEGFR抑制(16)。存在的补偿机制,支持细胞生存和生存能力抗血管新生治疗期间可以部分解释为什么治疗不完全抑制肿瘤的生长。

与化疗联合使用AAV8-sVEGFR2和AAV8-sVEGFR3发现减少腹腔化疗组相比腹水形成。减少腹水形成似乎与AAV8-sVEGFR2有关,而AAV8-sVEGFR3似乎不太突出的影响。必须指出在控制腹水卷组低于预期,可能是因为肿瘤导致的积极增长sacrification腹水液之前积累的腹腔。VEGF / VEGFR信号之间的联系和腹水的形成还需要进一步研究,但它已经表明,调节VEGF表达增加血管通透性,促进腹水形成OVCA (17)。由于腹水的形成是与不良预后相关,严重受损的生活质量(18),减少腹水的形成是一个重要的治疗效果。

串行MRI成像支持antitumoral效应AAV8-mediated sVEGFR2基因疗法。我们的结果表明,AAV8-sVEGFR2和化疗仅限制肿瘤的生长,而AAV8-sVEGFR3没有显著限制肿瘤的生长。同样,老鼠接受耦合AAV8-sVEGFR2 AAV8-sVEGFR3,化疗显示最限制肿瘤的生长,从而展示可能的协同效益的结合使用抗血管新生治疗和化疗。以前的研究(6,7)观察到一个类似antitumoral AdsVEGFR1的结合使用效果,AdsVEGFR2, AdsVEGFR3。与我们的结果相比,Sallinen等人没有观察到显著的antitumoral效果与AdsVEGFR2或AdsVEGFR3孤单。我们观察到一个临时的ADC增加小鼠接受AAV8-sVEGFR2和AAV8-sVEGFR3基因治疗相结合,这可能表明积极的治疗反应(19)。然而,深远的结论不应该从ADC的结果。

生存分析支持观察反血管增生和antitumoral效果。治疗小鼠的整体存活率提高在所有团体收到AAV8-sVEGFR2基因治疗作为治疗的一部分。虽然最长的平均生存时间观察小鼠接受联合AAV8-sVEGFR2, AAV8-sVEGFR3和化疗,达到改善生存没有显著不同于收到AAV8-sVEGFR2的团体,或耦合AAV8-sVEGFR2 AAV8-sVEGFR3没有化疗。

AAV8具有高度的亲和力肝细胞和轻微的肝毒性是一个比较常见的不利影响AAV8-mediated基因转移(20.)。我们观察到不同程度的肝毒性在所有AAV8-sVEGFR2治疗组AAV8-sVEGFR3和化疗并未显著诱导肝毒性,因此建议尤其是AAV8-sVEGFR2与轻微的肝毒性。一般来说,AAV载体被认为是耐受性良好、高效的病毒载体,和纵向与后续的研究没有显示显著的不利影响与常用的病毒剂量(21)。然而,观察到毒性应谨慎对待和进一步的毒理学研究的话题。

结论

我们的结果表明,与化疗联合使用AAV8-sVEGFR2和AAV8-sVEGFR3大大限制了瘤内血管生成和肿瘤生长在人类OVCA小鼠的异种移植模型,从而展示了潜在的协同耦合的抗血管新生治疗和化疗的好处。尽管AAV8-sVEGFR2和AAV8-sVEGFR3发现抑制瘤内血管生成,antitumoral治疗大多是由AAV8-sVEGFR2驱动的影响,有效地降低瘤内血管生成,腹水形成和肿瘤的生长,提高了整体治疗小鼠的生存。我们的研究结果提供概念的使用可溶性诱饵VEGFRs特别是AAV8-sVEGFR2治疗OVCA明确进一步临床前和临床发展潜力。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

动物研究是国家动物实验委员会进行审核和批准的芬兰南部的地区国家行政机构(ESAVI)。

作者的贡献

AK和EV动物执行工作,核磁共振成像,样品进行实验室和计算机分析,写了初稿的手稿。LT、海关、马、TL和SY-H导致概念和设计的研究。正义与发展党进行了统计分析。橙汁和RS样本组织学临床病理医师的意见。EY-H和HL咨询关于核磁共振和导致了核磁共振成像。LT、HL和JK写的手稿。所有作者导致修订手稿、阅读和批准提交的版本。

资金

本研究从芬兰科学院赠款支持,Kuopio大学医院,芬兰癌症基金会,猎户座研究基金会,Sigrid Juselius基础。

确认

我们感谢图届时协助统计分析。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2022.1018208/full补充材料

引用