纳米双官能团的水凝胶作为潜在指示造血干细胞分化的平台gydF4y2Ba
Domenic KratzergydF4y2Ba
1、2gydF4y2Ba
安妮塔Ludwig-HusemanngydF4y2Ba
1、2gydF4y2Ba
凯瑟琳荣格gydF4y2Ba1、3gydF4y2Ba
Udo GecklegydF4y2Ba4gydF4y2Ba
科妮莉亚Lee-ThedieckgydF4y2Ba
1、2gydF4y2Ba
*gydF4y2Ba
- 1gydF4y2Ba研究所的功能接口,Eggenstein-Leopoldshafen、德国卡尔斯鲁厄理工学院gydF4y2Ba
- 2gydF4y2Ba细胞生物学和生物物理学研究所的莱布尼兹汉诺威大学,德国汉诺威gydF4y2Ba
- 3gydF4y2Ba教师4:能源、过程和生物工程,斯图加特,德国斯图加特大学gydF4y2Ba
- 4gydF4y2Ba应用材料研究所——能量存储系统,Eggenstein-Leopoldshafen、德国卡尔斯鲁厄理工学院gydF4y2Ba
造血干细胞(hsc)是造血细胞具有分化成各种血细胞的能力。T细胞是一个重要的细胞类型肝星状细胞能分化成,通过相应的祖细胞。T细胞是适应性免疫系统的一部分,因为他们调节细胞免疫反应。由于这个至关重要的函数,gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaT细胞分化是当前生物医学领域的研究的主题而言,细胞移植。研究表明,固定化的密度等级配体Delta-like 1 (DLL1)在肝星状细胞的环境能激发他们对T细胞的分化。可靠的合成细胞培养系统的发展呈现变量密度DLL1承诺未来扩张的T细胞的临床应用。这里我们介绍双官能聚乙烯二元醇(PEG-based)水凝胶作为一个潜在的指导平台人类造血干细胞和祖细胞的分化(公司)T细胞。盯住水凝胶的细胞粘附支持主题RGD (arginyl-glycyl-aspartic酸)是由紫外线引起的自由基共聚合成的丙烯酸和RGD制成改性丙烯酸酯挂钩挂钩。水凝胶被此外纳米公司的金纳米颗粒阵列产生的嵌段共聚物胶束纳米(BCML)。BCML允许表面的装饰与金纳米粒子在一个六角形的方式定义良好的颗粒间的距离。确定DLL1密度对细胞分化的影响,水凝胶粒子的距离~ 40和90纳米合成金纳米粒子与DLL1功能化。27天之后在文化、公司展示了unphysiological分化状态,因此,被评价为非典型T淋巴差异化。集群的区别(CD) 4是唯一检测T细胞标记表示显然在所有样本。 Thus, although the applied nanopatterned hydrogels affected two important signaling pathways (integrins and Notch) for T cell differentiation, it appears that more functionalities that control T cell differentiation in nature need to be considered for achieving fully synthetic在体外gydF4y2BaT细胞分化策略。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
造血干细胞(hsc)血液系统的干细胞,为人体不断提供新鲜血液细胞的整个生命周期。造血作用发生的过程通过肝星状细胞的分化成个人成熟血细胞通过相应的祖细胞(gydF4y2Ba小川,1993gydF4y2Ba)。肝星状细胞具有多能造血作用潜力,这意味着他们可以分化成任何类型的血细胞,但不是成其他类型的细胞(gydF4y2Bashutt broeke, 2011gydF4y2Ba)。T细胞是血液细胞的一个重要类型,可以由肝星状细胞的分化。这个细胞类型是适应性免疫系统的重要组成部分和细胞免疫反应的中介无关的结构。T细胞的特点是存在的抗原特异性T细胞受体(TCRα/β)表示在外层细胞表面,形成一个复杂的集群也呈现分化标记的分化3 (CD3)。与额外的分化标记CD4和CD8,整个复杂作为细胞的“眼睛”,认识到外部和内源性抗原,启动细胞内信号转导(gydF4y2Ba墨菲et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2Ba溜冰场et al ., 2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
能够检测和消除多余的结构使T细胞高度有趣的生物医学应用程序(gydF4y2Ba苔藓和Rickinson, 2005年gydF4y2Ba)。治疗造血系统疾病(如白血病)经常涉及的淘汰和替换整个造血系统通过辐射或化疗后造血干细胞移植(HSCT)。由于分化,迁移和成熟过程中,T细胞需要~ 100天形成HSCT后(gydF4y2Ba列文et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaBahceci et al ., 2003gydF4y2Ba)导致一个相当长和高风险期的免疫缺陷病人。但由于T细胞分化和成熟在接受者体内,他们学会识别内源性抗原规避自体免疫反应的发生(gydF4y2BaDumont-Girard et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2Ba杜克et al ., 2000gydF4y2Ba;gydF4y2BaRoux et al ., 2000gydF4y2Ba)。另一种方法提供了直接免疫反应HSCT后注入捐赠者的T细胞以及肝星状细胞(gydF4y2BaGrob et al ., 1987gydF4y2Ba;gydF4y2Ba博兰et al ., 1992gydF4y2Ba)。这种方法的主要缺点是Graft-vs的发生。- - - - - -Ho年代t- - - - - -D我年代e一个年代e(GvHD) in which the donor T cells react against recipient's cells (Shlomchik 2007gydF4y2Ba;gydF4y2Ba费拉拉et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaAnasetti et al ., 2012gydF4y2Ba)。然而,一个弱化版的形式的所谓Graft-vs这种疾病。肿瘤(GvT)效果绝对是可取的。这里,向剩下的病理细胞移植的T细胞反应,否则可能会发起一个递归(gydF4y2Ba科尔布et al ., 1990gydF4y2Ba;gydF4y2BaCarlens et al ., 2001gydF4y2Ba;gydF4y2Ba苔藓和Rickinson, 2005年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba施密德et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2BaWelniak et al ., 2007gydF4y2Ba;gydF4y2Ba费拉拉et al ., 2009gydF4y2Ba)。因此,一个是处理一个棘手的平衡抑制有害GvHD HSCT后但维护所需的GvT效应。为了克服这些问题,各种研究关注注入的影响gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaT细胞分化的祖除了肝星状细胞(Donor-Lymphocyte-Infusion)。细胞免疫收益的调整速度相比,T细胞游离HSCT,此外,移植物抗宿主病的发生减少,同时启用了GvT-effect。此外,gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba利用差异化的T细胞在Donor-Lymphocyte-Infusion防止机会性感染的患者消除或严重受损的免疫系统(gydF4y2Ba苔藓和Rickinson, 2005年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba公园et al ., 2006gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
利用成熟的T细胞和T细胞祖细胞在细胞免疫疗法与T细胞发展的强化。努力诱导T细胞分化gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba一直局限主要是由于这样的事实,胸腺,T细胞发育的器官,是一个复杂的三维网络的上皮细胞(gydF4y2Ba荷兰人et al ., 2006gydF4y2Ba)。这胸腺微环境决定了T细胞谱系的承诺通过信号的关键介导T细胞代比如切口配体Delta-like1 (DLL1)和DLL4,白介素7 (IL-7) FMS-like酪氨酸激酶3配体(Flt3L),和干细胞因子(SCF) (gydF4y2BaPawelec et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2BaBesseyrias et al ., 2007gydF4y2Ba;gydF4y2BaHozumi et al ., 2008gydF4y2Ba)。其中,Notch信号在T细胞发展中扮演着重要的角色。自从发现公司表达切口受体(gydF4y2Ba米尔纳et al ., 1994gydF4y2Ba;gydF4y2BaVarnum-Finney et al ., 1998gydF4y2Ba),发现Notch1受体介导信号的独特之处在于它能够诱导胸腺T血统规范而不含B细胞谱系的承诺(gydF4y2BaRadtke et al ., 1999gydF4y2Ba;gydF4y2BaBesseyrias et al ., 2007gydF4y2Ba;gydF4y2BaHozumi et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科赫et al ., 2008gydF4y2Ba)。有四个级距受体(Notch1 2、3和4)和五个结构相关,单次的跨膜切口配体(DLL1 3和4和Jagged1和2)迄今为止已知的哺乳动物(gydF4y2Ba韦伯和Calvi, 2010年gydF4y2Ba)。Notch信号是基于相邻细胞间直接接触被切口Notch-activating配体的受体。DLL1刺激的结果,细胞内的一部分,单次的跨膜切口受体首先是裂解迁移之前的核基因表达是操纵,进而影响增殖和分化的行为。gydF4y2Ba
固定化Delta-like1 (DLL1),要么cell-bound (gydF4y2Ba施密特和Zuniga-Pflucker, 2002年gydF4y2Ba;gydF4y2BaLa Motte-Mohs et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2BaAwong et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba范Coppernolle et al ., 2009gydF4y2Ba)或substrate-bound (gydF4y2Ba费尔南德斯et al ., 2014gydF4y2Ba),特别是诱发Notch信号级联(gydF4y2BaVarnum-Finney et al ., 2000gydF4y2Ba)。几项研究发表在关注这个概念在细胞培养系统的应用。虽然DLL1表达动物馈线细胞共培养系统,如OP9-DLL(鼠标基质细胞)和FTOC(胎儿胸腺器官培养)显示的有前景的结果切口ligand-mediated T细胞分化,系统缺乏临床适用性需要使用纯人类T细胞(gydF4y2Ba施密特和Zuniga-Pflucker, 2002年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2006年gydF4y2Ba;gydF4y2BaSmedt et al ., 2004gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2011年gydF4y2Ba;gydF4y2BaBesseyrias et al ., 2007gydF4y2Ba;gydF4y2BaMohtashami et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2BaVan De机器人瓦力et al ., 2013gydF4y2Ba)。Montel-Hagen &同事开发了一个人工胸腺瀑样(ATO)系统。其中,DLL1-expressing小鼠基质细胞与人类公司聚合,形成一个3 d-organoid支持健壮的人类CD3的分化和成熟gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba公司(gydF4y2Ba甜美et al ., 2017gydF4y2Ba)。但使用小鼠基质细胞在ATO系统仍限制了这个应用程序的非临床的。Feeder-free系统涉及substrate-immobilized重组切口配体合成表面也被用来诱导分化的公司早期T细胞(gydF4y2BaIkawa et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2BaReimann et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba费尔南德斯et al ., 2014gydF4y2Ba)。这些系统通常需要添加大量的胎牛血清,因此,患有non-robustness由于血清批次的变化(gydF4y2BaGstraunthaler et al ., 2013gydF4y2Ba)。添加动物性血清而且不包括临床应用。gydF4y2Ba
所以,Notch-directed干细胞分化成淋巴细胞的关键概念是合成生物材料系统,免费送料器细胞和血清。一个系统概括最小的胸腺利基是由gydF4y2Ba舒克拉et al . (2017)gydF4y2Ba这是由表面束缚DLL4和血管细胞粘附分子1 (VCAM-1)在无血清培养基。吸附DLL4的研究揭示阈值浓度高于7.5μg /毫升的频率大幅增加后期proT细胞后7天公司文化。早期的研究显示公司DLL1浓度依赖的扩散行为公司的上下文中可用的细胞因子gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba文化。而低密度的DLL1结合原始公司细胞因子促进公司扩张规模multi-log (gydF4y2BaOhishi et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2Ba德莱尼et al ., 2005gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2010年gydF4y2Ba),更高密度的DLL1结合淋巴细胞因子导致T细胞谱系的承诺和分化(gydF4y2BaVarnum-Finney et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2Ba达拉斯et al ., 2005gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2007年gydF4y2Ba)。使用DLL1-functionalized水凝胶系统,我们组决定少量的~ 43000 DLL1分子/细胞有必要加强人类脐带血的扩散(UCB)派生CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba公司(gydF4y2Ba温克勒et al ., 2017gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
获得ligand-density控制DLL1表示公司因此促进分化成T细胞,我们现在纳米双官能聚乙烯二元醇(PEG-based)水凝胶作为一个潜在的指导平台人力公司T细胞的分化。水凝胶是特别适合应用在哺乳动物细胞培养领域由于其结构相似的细胞外基质含水量,柔软的一致性和孔隙度(gydF4y2Ba阮和西部,2002年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba特鲁里街和穆尼,2003gydF4y2Ba;gydF4y2BaBae et al ., 2011gydF4y2Ba)。尤其是PEG-based水凝胶已被证明是适合细胞培养应用程序(gydF4y2Ba费尔班克斯et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba艾登et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2BaPlatzman et al ., 2013gydF4y2Ba)。PEG-based水凝胶应用于细胞培养通常需要额外的功能化步骤与细胞相互作用。氨基酸序列arginine-glycine-aspartic酸(RGD)是一个细胞粘附的主题发现在许多蛋白质的细胞外基质,例如纤连蛋白(gydF4y2Ba克莱恩,1995gydF4y2Ba)。纳入PEG-based聚合物网络,RGD主题显示支持多种细胞类型的附着力,如KG-1a, (gydF4y2BaPlatzman et al ., 2013gydF4y2Ba),HSCPs (gydF4y2BaMuth et al ., 2013gydF4y2Ba)和人类成纤维细胞(gydF4y2Ba苍鹭和哈贝尔,1998年gydF4y2Ba)维护粘附在细胞培养潜力。二维nanopatterning通过嵌段共聚物胶束纳米(BCML)提供了一种优雅的方式来控制固定化分子的密度(gydF4y2BaAltrock et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaPlatzman et al ., 2013gydF4y2Ba)。一方面,加载块主要胶束药物控制交付应用程序(可以申请gydF4y2Ba郑et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2018 agydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba),而另一方面有发球权BCML-it允许的情况下还与金纳米粒子表面的装饰(国民生产总值)六角的方式定义良好的颗粒间的距离。随后的纳米粒子转移到随后的水凝胶粒子进一步功能化装备所需的化学功能的生物材料。这个概念已经成功地应用于我们的团队提高人类CB-derived CD34的扩散gydF4y2Ba+gydF4y2Ba公司通过提供固定化DLL1在不同密度(gydF4y2Ba温克勒et al ., 2017gydF4y2Ba)。我们现在扩大这个有前途的一类生物材料的应用,介绍纳米,RGD / DLL1功能化PEG-based水凝胶作为潜在指导平台人力公司T细胞的分化。国民生产总值阵列产生通过BCML被转移到PEG-based水凝胶的细胞粘附支持主题RGD,是被自由基聚合合成。随后gnp官能团,从而导致纳米水凝胶固定化DLL1定义密度。确定DLL1密度的影响公司的细胞分化,水凝胶粒子的距离~ 40和90 nm被应用于细胞培养的研究。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
化学和生物材料gydF4y2Ba
溶剂、试剂和化学物质被购买的记述,ABCR,阿尔法蛇丘,默克,卡尔•罗斯Sigma-Aldrich,或VWR,除非另有规定。所有的溶剂、试剂和化学物质被用作购买,除非另有规定。Diblock共聚物为BCML从聚合物源公司,购买多瓦尔,加拿大。DNA染色(凝胶红色™)从Biotum购买,海沃德,美国。AbC™捕捉珠子(“积极的珠子”)和“负珠”从英杰公司购买AG),卡尔斯巴德,美国。琼脂糖(TopVision™)下令从Fermentas GmbH,圣Leon-Rot德国。消息灵通的缓冲区(99%)被命令从Amresco LLC梭伦,美国。HPC媒体扩张,淋巴细胞分离介质和细胞因子组合E购自PromoCell GmbH,德国海德堡。RGDSK-PEG-acrylate所提供的合成和休伯特Kahlbacher,德国图宾根大学。媒介T细胞分化(X-VIVO™10)购买从Lonza集团、瑞士巴塞尔。 Loading buffer for gels and buffer for the qualitative PCR were ordered from Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany. EDTA-Solution (1% in PBS, without Ca2 +gydF4y2Ba和毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba从Biochrom GmbH)下令,柏林,德国。NTA-thiol马普研究所智能系统,是由德国斯图加特。台盼蓝细胞培养(0.4%)从Amresco购买,美国克利夫兰。超纯水是内部制造和使用高压蒸汽灭菌。溶剂混合物可以理解为体积/体积。人类CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞分离脐带血银行提供的捐助UCB der德国Knochenmarkspenderdatei,德累斯顿,德国,和德意志腐烂Kreuz,曼海姆,德国后书面知情同意的捐赠者和当地伦理委员会的批准(b - f - 2013 - 111)。CD34-MicroBeads(共轭单克隆鼠IgG1-anti CD34-antibody)从Miltenyi购买研究,Bergisch-Gladbach,德国。牛血清白蛋白(Fraktion V, pH值5.2)从PAA实验室购买GmbH,派斯克,奥地利。以下组件买来Miltenyi研究,Bergisch-Gladbach,德国:anti-CD3-antibody(人类,PE-conjugated) anti-CD4-antibody(人类,FITC-conjugated) anti-CD7-antibody(人类,PE-conjugated) anti-CD8-antibody(人类,PerCP-conjugated) anti-TZRα/β-antibody(人类,PE-conjugated) IgG2a-antibody(鼠、FITC - PE -或PerCP-conjugated), IgG2b-antibody(鼠、VioBlue-conjugated)、白介素2(- 2,人力,提高序列),Interleukin-3 (IL-3、人力)、白介素- 7 (IL-7、人力),fc受体阻断剂(货代、人力)、干细胞因子(SCF、人力)。Human-delta-like-1蛋白(DLL1、人力6倍组氨酸标签羧基端,产生细胞系NS0)购买从研发系统,明尼阿波利斯,美国。胎牛血清(的边后卫、过滤消毒)购买从西格玛奥德里奇GmbH德国慕尼黑。以下组件从英杰公司购买AG),卡尔斯巴德,美国:IgG1-antibody(鼠,FITC - PE-conjugated);PE-conjugated anti-CD34-antibody(人类)。Anti-CD19-antibody(人类,PE-conjugated)和anti-CD2-antibody(人类,FITC共轭)购买从ImmunoTools GmbH, Friesoythe,德国。gydF4y2Ba
描述和技术设备gydF4y2Ba
细胞流式细胞仪分析了使用色调gydF4y2Ba®gydF4y2Ba与调声聚焦血细胞计数器gydF4y2Ba®gydF4y2Ba仪软件v2.1热费希尔科学Inc .,沃尔瑟姆,美国。分析软件FlowJo_V10从FlowJo购买,美国亚什兰。固体基质在氧等离子体清洗和激活或使用Pico氢等离子体PCCE设备由Diener电子GmbH Co .公斤,Ebhausen,德国。分析了纳米BCML玻璃基板通过扫描电子显微镜(SEM)使用由卡尔蔡司梅林SMT GmbH是一家现代化的、从德国。玻璃样品第一次气急败坏的说~ 15纳米厚度的碳层。SEM图像捕获在三个不同的位置在每个表面与50000倍放大用背散射电子探测器(疯牛病)。玻璃基板的gnp的转移到水凝胶以及CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba使用扫描电镜细胞水凝胶也可视化。SEM图像被韦恩Rasband使用ImageJ 1.50我分析,国立卫生研究院、美国贝塞斯达和ImageJ analyse2插件点。插件点analyse2马普研究所是由智能系统,在斯图加特的纳米颗粒表面形成的结构分析。这个插件措施每个黄金纳米颗粒间的距离和周围的纳米粒子,紧随其后的是计算的平均粒子距离和偏差。此外,插件能够验证和评估质量的六角形阵列基于数学算法描述gydF4y2Bawillig et al . (2013)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
方程1。根据实证分析等方程。gydF4y2Ba
ΨgydF4y2Ba6gydF4y2Ba叫做留学生和定向排列有序参数及其价值评估的准确性六角结构由国民生产总值。θ是中央纳米颗粒之间的角度和它的两个最近的邻近的纳米颗粒。1 / NgydF4y2Ba债券gydF4y2Ba规范化Ψ的计算值gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。样本使用基督冻干α1 - 4 b·布劳恩生物技术国际Melsungen,德国。苹果电脑gydF4y2Ba®gydF4y2Ba搅拌机(MACSmix™管旋转)Miltenyi研究,德国Bergisch-Gladbach用于HSC隔离。超纯水(Typ 1根据美国社会检测和材料)从Arium获得gydF4y2Ba®gydF4y2Ba缝匠肌pro系统AG)、德国哥廷根。Spin-coated样本涂层使用ws - 650 - mz - 23 - npp Laurell技术公司,北威尔士,美国。使用Variomag反应和解决方案了gydF4y2Ba®gydF4y2Ba聚固美磁搅拌器由热费希尔科学Inc .,沃尔瑟姆,美国。少量的水混合物被埃普多夫转移用埃普多夫研究+吸量管,德国汉堡。使用si - 234固体物质被重平衡丹佛仪器,缝匠肌公司,波西米亚,美国。光敏反应进行了使用Vilber Lourmat VL8。L, 8瓦和365 nm紫外线灯由Vilber麻仁法兰,法国。样品,需要超声治疗被VWR国际GmbH在超声波清洁处理,二,美国。一些样品是离心机使用Hereaus Multifuge X3R热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,美国和离心机5415 D, 5415 R, R或5418埃普多夫,汉堡,德国,分别。执行所有的工作与哺乳动物细胞与层流气流无菌的长椅上。这些细胞只有接触无菌材料。发生在无菌培养细胞培养瓶或无菌细胞培养板在孵化器37°C, 5%的公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和95%的湿度。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
嵌段共聚物胶束纳米(BCML)gydF4y2Ba
BCML用于生成PEG-based水凝胶与六角有序阵列的国民生产总值纳米粒子是等距的整个表面区域。整个过程包括几个步骤包括沉积逆diblock共聚物胶束,富含金盐前体,在玻璃基板和随后的国民生产总值减少转移到水凝胶(gydF4y2BaSpatz et al ., 2000gydF4y2Ba;gydF4y2BaLohmuller et al ., 2011gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
最初,一些玻璃基板轴承纳米国民生产总值生产不同颗粒间的距离。为此,diblock共聚物解决方案5毫克/毫升的浓度gydF4y2Ba昊图公司gydF4y2Ba二甲苯是准备。纳米阵列的40纳米粒子间的平均距离,组成的嵌段共聚物苯乙烯单元288和119 2-vinyl吡啶单元(PSgydF4y2Ba288年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BabgydF4y2Ba-P2VPgydF4y2Ba119年gydF4y2Ba,ÐgydF4y2Ba*gydF4y2Ba= 1.06)。纳米阵列平均粒子90海里的距离是由应用组成的嵌段共聚物苯乙烯单元1056和671 2-vinyl吡啶单元(PSgydF4y2Ba1056年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BabgydF4y2Ba-P2VPgydF4y2Ba671年gydF4y2Ba,ÐgydF4y2Ba*gydF4y2Ba= 1.09)。聚合物解决方案在300 rpm搅拌过夜为了提供足够的时间逆胶束的形成。24小时后,前体tetrachloro-auric (III)三水酸(HAuClgydF4y2Ba4gydF4y2BaH·3gydF4y2Ba2gydF4y2BaO)添加到聚合物胶束加载过程的解决方案。在提出研究中,目标加载因子gydF4y2BalgydF4y2Ba聚合物胶束的0.3,这被定义为前体的数量盐的数量相比,两副总裁重复单位(gydF4y2BalgydF4y2Ba=gydF4y2BangydF4y2Ba(HAuClgydF4y2Ba4gydF4y2BaH·3gydF4y2Ba2gydF4y2BaO) /gydF4y2BangydF4y2Ba(俄文gydF4y2Ba2副总裁gydF4y2Ba)]。加载因子定义了颗粒大小的最后的玻璃衬底上的国民生产总值。盐前体的相应金额的计算是根据执行gydF4y2Ba方程2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
金盐前体是重使用玻璃刮刀避免非盟的不受欢迎的削减(III)的物种。添加金盐之后,混合搅拌了额外的24小时在黑暗中在300 rpm。此后,解决方案是一个聚四氟乙烯注射器过滤器过滤孔径为0.2μm。方形玻璃幻灯片的大小18毫米x 18毫米BCML过程中被用作基质。这些最初清洗和激活把它们在卡罗酸(1 HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2BaH和3部分gydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)1 h。后来,玻璃幻灯片在超声波浴用超纯水洗净,在氮气流干。在下一步中,活化的玻片与聚合物胶束溶液旋涂。旋转涂布过程是在一个静态模式进行1分钟对PS 2500 rpmgydF4y2Ba1056年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BabgydF4y2Ba-P2VPgydF4y2Ba671年gydF4y2Ba并为PS 7000 rpmgydF4y2Ba288年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BabgydF4y2Ba-P2VPgydF4y2Ba119年gydF4y2Ba,分别。达到所需的转速后,25到50μL相应的聚合物溶液放到了旋转样本3厘米的距离。激活玻璃表面之间的相互作用和极地胶束核导致胶束的自组装单层quasihexagonal数组。在最后一步,氢等离子体被用来同时去除有机共聚物胶束和减少黄金前体盐元素国民生产总值。为此,自旋涂样本放置在等离子体室45分钟0.4 mbar和100%性能对应~ 200 W的等离子体装置使用。gydF4y2Ba
水凝胶的合成gydF4y2Ba
PEG700-DA和超纯水在等量混合。聚合的混合比1:1导致水凝胶的溶胀比约为1,因此,不再肿胀发生在最后的水凝胶,纳米结构的变形可以预防(gydF4y2Ba艾登et al ., 2010gydF4y2Ba)。2959剂Irgacure溶解在70%的乙醇浓度是100毫克/毫升。然后,Irgacure 2959的解决方案是添加到聚合物溶液浓度达到0.5毫克每毫升2959 Irgacure PEG700-DA。这种混合物,RGDSK-PEG-acrylate添加实现32μM的浓度。PEG700-DA crosslinkable聚合物溶液,Irgacure 2959和RGDSK-PEG-acrylate离心机100 rcf 6分钟。水凝胶形成的模具是由显微镜载玻片(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。最初,一个玻璃盖片的大小18毫米x 18毫米都集中在中间的显微镜幻灯片。一个玻璃盖片的尺寸24毫米x 60毫米随后被放置在两个500μm高间隔器桥中央部分。然后,100年μL聚合物解决方案是用移液器吸取到中央盖玻片之间的差距和上覆盖玻片。这种方式,产生的水凝胶厚度从0.34到0.37毫米不等。聚合是由14.8 mW / cm2 UVA照射波长为365 nm 12分钟。结果挂钩水凝胶与超纯水洗了三次在4°C至少2 h为了消除潜在剩余non-polymerized单体的行为对哺乳动物细胞毒性。最后,凝胶可以存储在超纯水在4°C的几个月,如果必要的。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba。GNP-hydrogels的准备。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba扫描电镜的图像quasi-hexagonal GNP-40玻璃基板转移过程之前,gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba试验装置的制备GNP-hydrogels PEG700-DA紫外线诱导自由基共聚,RGDSK-PEG-acrylate和N -丙烯酰胺(2-mercapto-ethyl)链接器,和gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba扫描电镜的图像GNP-hydrogel转换过程。gydF4y2Ba
纳米水凝胶的合成gydF4y2Ba
1毫米的解决方案gydF4y2BaNgydF4y2Ba,gydF4y2BaN 'gydF4y2Babis(丙烯酰)乌洛托品(BAC)乙醇制备和放置在一个孵化器瓶在400 rpm和21°C在黑暗中过夜。纳米玻璃表面被孵化的BAC解决方案1 h在黑暗中为了thiol-gold债券形式。后,表面用乙醇洗涤三次10分钟,在氮气流和立即使用干了一章中所描述的水凝胶的合成纳米水凝胶的合成。纳米颗粒的传输是通过取代18×18毫米的载玻片模具用于普通水凝胶的合成(纳米水凝胶的合成章)与相应的玻璃衬底轴承BAC-functionalized国民生产总值。这种方法导致水凝胶配备RGD细胞粘附图案和表面束缚quasi-hexagonally安排国民生产总值。gydF4y2Ba
定性的验证国民生产总值的转移gydF4y2Ba
水溶液中HAuCl(超纯水)的0.1%gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在0.2毫米羟胺。解决方案被带进接触的纳米水凝胶为5分钟。在这个过程中羟胺作为还原剂的阳离子溶解黄金。由此产生的元素被看好黄金矿床在国民生产总值。经过足够的增长时期,黄金粒子可以观察到紫色的外观颜色的典型金胶体外观(gydF4y2Ba埃弗雷特,1992gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Biofunctionalization DLL1的水凝胶gydF4y2Ba
水凝胶是穿孔用一叠穿孔直径15毫米。以下步骤都是在无菌条件下进行的:凝胶在70%乙醇消毒30分钟。之后,他们三次短暂下跌100%的乙醇,以去除水中残留的后续反应步骤。之后,样品被放在培养皿放置在一个潮湿的室。后,50μL 1毫克/毫升NTA-thiol乙醇溶液是用移液器吸取到水凝胶。一块塑料薄膜与乙醇消毒是贴在水凝胶,以确保没有气泡均匀分布的解决方案,防止蒸发的乙醇。潮湿的房间是关闭密封和水凝胶在孵化NTA-thiol解决方案1 h在黑暗中。这后,凝胶简要旋转与4 - 100%的乙醇,然后洗(2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic酸(玫瑰)缓冲盐水(哈佛商学院的解决方案:超纯水+ 20更易与L / L玫瑰+ 150更易与氯化钠,pH值调整到7.4和热压处理过的)~ 2分钟。随后的水凝胶被转移到新鲜的培养皿中孵化1毫升的25μM NiCl氯化镍溶液(HBS溶液+ 0.1%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba抑制的解决方案;NiClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba抑制的解决方案= + 25更易/ L NiCl HBS的解决方案gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在黑暗中茎解决方案),持续15分钟。镍溶液与哈佛商学院的另一个当时被洗2分钟。然后水凝胶是放置在磷酸盐(PBS)在黑暗中15分钟。最终,水凝胶被转移到一个新的培养皿在潮湿的室和均匀覆盖50μL 5μg /毫升DLL1在PBS溶液由鉴定人在不含气泡的一块消毒的衬托。潮湿的房间是关闭密封水凝胶是孵化DLL1解决方案在4°C在黑暗中过夜。孵化后,盖箔是PBS的被添加。水凝胶被放置在一个细胞培养24-well板(15.6毫米)直径biofunctionalized一边向上翘着。水凝胶与PBS洗两次,然后孵化在孵化器1毫升细胞特定的媒介。此后,细胞可以播种到水凝胶。gydF4y2Ba
同质黄金表面也携带DLL1为了获得控制样品细胞培养实验。黄金表面的功能化是近似地描述上面的水凝胶的功能化。结果黄金表面而且涂有纤连蛋白与DLL1孵化后为了介绍RGD主题:黄金表面洗两次与PBS和放入培养皿放置在一个潮湿的室。50微升的5μg /毫升纤连蛋白在PBS溶液用移液器吸取到表面均匀分布,在不含气泡的粘贴一块消毒的衬托。潮湿的房间是关闭密封和表面在黑暗中孵化2 h。这之后,黄金样本一样对待biofunctionalized DLL1孵化后水凝胶。gydF4y2Ba
水凝胶的制备与Semi-adherent细胞扫描电镜gydF4y2Ba
CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞在扩张中孵化(HPC扩张中+ 1%的细胞因子组合E + 1%的青霉素、链霉素)一夜之间的纳米水凝胶粒子间的平均距离~ 40 nm。细胞被固定在水凝胶2.5%戊二醛溶液2 h。样品被暂停然后脱水50,70年,90年,95年,100%乙醇为10分钟。这后,水凝胶被储存在−80°C在一夜之间100%的乙醇,然后冻干最后存储在干燥器之前进行了扫描电镜分析。在目前的研究中,贴壁细胞GNP-40样本成像典型地。细胞播种DLL1-functionalized gnp - 90与相同浓度的RGD肽共聚水凝胶到PEGDA水凝胶表现出一个等价的粘附行为所示一个先前的研究(gydF4y2Ba温克勒et al ., 2017gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
隔离的CD 34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba人类脐带血细胞gydF4y2Ba
CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞被从人类分离UCB根据制造商的指示(CD34 MicroBead装备,人类,Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)。的联合处理后48 h内集合。CD34的纯洁gydF4y2Ba+gydF4y2Ba检查细胞通过流式细胞术和细胞培养总是> 99%。gydF4y2Ba
流式细胞术gydF4y2Ba
孤立以及培养细胞被流式细胞术分析。标记的表达是与公司的特定CD34抗体检查,对张cd和CD7早期T细胞,对CD3, CD4, CD8,后期TZRα/βT细胞,对CD19 B细胞。为此,2×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba1×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞在50μL PBS和0.1%的边后卫和21%货代阻塞试剂沾2.5μL抗体溶液或各自的同形像在黑暗中控制在4°C 1 h。在这之后,这些细胞被固定为3.7%甲醛和储存在4°C在黑暗中,直到他们进行了分析。额外的信息关于中列出的各种标记分子支持信息(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)。血液单核细胞UCB被用作正控制样本流仪抗体。那些出现在在CD34磁选后的洗脱体积gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞隔离。gydF4y2Ba
T细胞分化的集群分化34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞DLL1-Functionalized纳米水凝胶gydF4y2Ba
无血清培养基(X-VIVO™10)与10 ng / mL FMS-like补充酪氨酸激酶(外语教学)3-ligand 300 ng / mL白介素(IL) 2, 100 ng / mL IL-3和ng / mL干细胞因子(SCF),和100 ng / mL IL-7。以后,这种媒介将表示当T细胞分化(TCD)中。细胞生长在浴室中、青霉素、链霉素的1%。各种细胞因子的具体功能描述的支持信息(gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba)。CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,UCB隔绝,所以被播种在DLL1纳米水凝胶的细胞数量2×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞表面。在最初的实验中CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在扩张培养基培养细胞也由HPC扩张中补充了1%的细胞因子组合E和1%的青霉素和链霉素。CD34的培养gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞的水凝胶是在一段时间内进行交换的媒介是27天,每周两次。同时,细胞的数量决定,如果有必要,以便减少细胞的数量没有超过5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞每样例。总量是增加到2毫升14和17天之后,分别。一半的体积(1毫升)取代新鲜的浴室中第二天。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
GraphPad棱镜6执行统计分析软件。当比较两个的数据,统计显著性由未配对的双尾学生的决定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及和一组α-level为0.05。gydF4y2Ba
结果与讨论gydF4y2Ba
纳米结构和功能化PEG-Based水凝胶gydF4y2Ba
为了研究板对切口的影响配体在不同密度DLL1公司T细胞的分化,水凝胶与六角有序阵列的国民生产总值纳米粒子是等距的整个表面被制造。整个过程包括几个步骤包括沉积逆,黄金precursor-loaded diblock共聚物胶束在玻璃基板通过BCML和降低国民生产总值的后续转移到水凝胶(gydF4y2BaSpatz et al ., 2000gydF4y2Ba;gydF4y2BaLohmuller et al ., 2011gydF4y2Ba)。最初,quasi-hexagonal数组的国民生产总值两种不同颗粒间的距离后玻璃基板上组装了一个既定BCML准备策略。玻璃基板上的国民生产总值的颗粒间的距离确定的密度等级配体DLL1人造水凝胶。颗粒间的距离可能是由不同应用嵌段共聚物的分子量和通过改变之间的分数比两个街区。Quasi-hexagonal数组的国民生产总值粒子间的平均距离为42.47±1.41 nm准备利用嵌段共聚物组成的288苯乙烯单元和119 2-vinyl吡啶单元(PSgydF4y2Ba288年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BabgydF4y2Ba-P2VPgydF4y2Ba119年gydF4y2Ba,ÐgydF4y2Ba*gydF4y2Ba= 1.06)而平均90.55±2.23纳米颗粒间的距离可以达到利用嵌段共聚物组成的1056苯乙烯单元和671 2-vinyl吡啶单元(PSgydF4y2Ba1056年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BabgydF4y2Ba-P2VPgydF4y2Ba671年gydF4y2Ba,ÐgydF4y2Ba*gydF4y2Ba= 1.09)。这两个结果数组类型将在以下称为GNP-40和gnp - 90。纳米玻璃基板是由SEM分析以评估粒子间的距离以及沉积的有序度计算的国民生产总值(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。为此,由此产生的SEM显微图进行了分析使用一个定制的插件ImageJ hexagonallity定义为实证分析的数学定义(gydF4y2Bawillig et al ., 2013gydF4y2Ba)是应用(见部分描述和技术设备)。在这里,由此产生的六角Ψ命令参数gydF4y2Ba6gydF4y2Ba等于1的完美六角顺序和方法零随机考虑结构越明显。计算了Ψ6价值0.52±0.01 GNP-40数组和一个ΨgydF4y2Ba6gydF4y2Ba值为0.54±0.03 - 90年国民生产总值为数组。两个值作为quasi-hexagonal获得结构的描述。gydF4y2Ba
在接下来的步骤中,国民生产总值从玻璃基板转移到PEG-based通过共聚水凝胶的一步。国民生产总值必须配备一个polymerizable组聚合前为了完成转移。纳米水凝胶应用于本研究合成了紫外光诱导自由基共聚的PEG-diacrylate分子量为700克/摩尔(PEG700-DA) RGDSK-PEG-acrylate和gydF4y2BaNgydF4y2Ba,gydF4y2BaN 'gydF4y2Babis(丙烯酰)乌洛托品(BAC)。后者一个国民生产总值共价链接到水凝胶在反应。RGD序列也纳入水凝胶是一个最小的细胞粘附的主题,发现许多蛋白质的细胞外基质(ECM),例如纤连蛋白(gydF4y2Ba克莱恩,1995gydF4y2Ba)。在细胞培养中常用的应用程序,因为它能模仿ECM的胶粘剂性能的结构被细胞膜上的整合素受体(gydF4y2Ba温克勒et al ., 2017gydF4y2Ba)。转移的目的,玻璃基板上的国民生产总值首次携带BAC利用元素之间的强关联黄金和硫醇组。Thiolate-gold债券之间形成BAC和gnp在潜伏期在减少BAC N - (2-mercaptoethyl)丙烯酰胺(gydF4y2Ba艾登et al ., 2010gydF4y2Ba)。表面附加链接器被用于参与PEG700-DA自由基共聚,通过终端RGDSK-PEG-acrylate丙烯酸酯组在玻璃纳米阵列使水凝胶粒子的共价结合。Thiolate-gold债券170年和200年之间有很强的结合能焦每摩尔相比相对较弱的国民生产总值和玻璃表面之间的静电相互作用。聚合后,小心分离产生了水凝胶的功能化玻璃衬底,国民生产总值被成功传送到水凝胶,同时保持他们的定义良好的quasi-hexagonal秩序以及颗粒间的距离几乎完全(gydF4y2Ba艾登et al ., 2010gydF4y2Ba)。实验,这是通过使用一个定制的设置中显示gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba。BAC-functionalized玻璃基板被放置在一个白手起家的玻璃模具组成的显微镜幻灯片和玻璃盖(技术细节见2.3章)。聚合的解决方案是用移液器吸取到产生的差距之后,用紫外线照射。此外,单功能的非结构化的水凝胶组成的(PEG700-DA)和RGDSK-PEG-acrylate合成,用作控制样品在单元测试实验。gydF4y2Ba
有效整合RGD-sequence的水凝胶在先前发表的研究中被证实我们组的荧光测量使用FITC-tagged RGD-PEG-acrylate以及飞行时间二次离子质谱(gydF4y2Ba温克勒et al ., 2017gydF4y2Ba)。化学镀黄金是利用间接验证方法来评估纳米颗粒的质量转移。的减少和随后的沉积过程溶解金阳离子在板对gnp的羟胺作为还原剂,即国民生产总值作为结晶核。在这一过程中,生成的元素被看好黄金矿床在国民生产总值作为这个过程是热力学首选而不是新黄金粒子的形成解决方案(gydF4y2BaStremsdoerfer et al ., 1988gydF4y2Ba;gydF4y2Ba布朗和•,1998年gydF4y2Ba;gydF4y2BaLohmueller et al ., 2008gydF4y2Ba)。由于显著的增加国民生产总值的大小,水凝胶的颜色出现紫色足够的崛起时间后,典型的胶体金的存在(gydF4y2Ba埃弗雷特,1992gydF4y2Ba)。相应的玻璃衬底,另一方面,仍几乎无色平等待遇后,表明大部分的国民生产总值都被转移到水凝胶(gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba)。成功的转移是由水凝胶表面的SEM分析进一步验证。gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba清楚地显示了水凝胶上的国民生产总值在传输过程,并同时保持quasi-hexagonal秩序。很明显从SEM图像,然而,quasi-hexagonal订单的质量以及颗粒间的距离略下降后的反应。这效应最有可能发生由于变形和收缩的水凝胶在干燥过程之前,SEM分析。额外的水凝胶表面的曲率可以由电子束本身引起的。据一位等人水凝胶由PEG700-DA拥有一定程度的肿胀等于1时,聚合溶液由相同体积分数的水和挂钩(gydF4y2Ba艾登et al ., 2010gydF4y2Ba)。因此我们认为秩序的程度以及国民生产总值的颗粒间的距离经常肿胀的水凝胶在相应的玻璃基板相媲美。纳米水凝胶是另外携带人类切口的配体DLL1为了目标应用的Notch通路细胞并诱导其分化成T细胞。把国民生产总值作为锚点附件的配体和DLL1在最终产品的密度决定的。起初,thiol-functional链接器次氮基三乙酸(NTA-thiol)附着在国民生产总值通过thiol-gold键的形成。表面束缚的自由羧酸团体NTA被用来形成一个与镍离子螯合物。DLL1是附加在随后一步利用镍复杂之间的强烈的亲和力和咪唑环的氮原子提供的6倍组氨酸(他的序列gydF4y2Ba6gydF4y2BaDLL1糖基的标签)。通过他的这个绑定策略gydF4y2Ba6gydF4y2Ba标签与蛋白质修饰纳米结构证明还在其他研究高效、特定的(gydF4y2Ba艾登et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaDeeg et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba爱立信et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba维格纳和Spatz, 2013年gydF4y2Ba)。通过这种方式,可以固定在一个特定的蛋白质定位确保细胞的受体结合方面可用Spatz还在以前的研究中显示的组(gydF4y2Ba玻璃et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2BaDeeg et al ., 2013gydF4y2Ba)。绑定的广泛调查DLL1黄金表面一般以及黄金nanopatterned水凝胶在特定先前发表的研究中所示的group by QCM-D测量和immunofluorescent使用DLL1特定抗体染色,分别为(gydF4y2Ba温克勒et al ., 2017gydF4y2Ba)。在当前的研究中,同质黄金表面功能化DLL1和细胞粘附,RGD含蛋白纤连蛋白的制备和使用nanopatterned水凝胶的旁边。这些样本作为控制探讨T细胞分化差异DLL1呈现在一个定义的顺序和密度和DLL1以无序的方式在更高的密度。gydF4y2Ba
CD34的附着力gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞纳米DLL1-Functionalized水凝胶gydF4y2Ba
基本公司为了诱导分化成T细胞CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞被播种DLL1功能化水凝胶的建立gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaT细胞分化系统。最初,细胞的相互作用的纳米双官能团的水凝胶进行了SEM,确保细胞实际上坚持RGD含有水凝胶,让一个固定切口表面配体之间的相互作用DLL1和CD34的切口受体gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba显示代表CD34的扫描电镜图像gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞被孵化DLL1 40纳米水凝胶粒子间的平均距离。细胞CD34后直接被播种到水凝胶gydF4y2Ba+gydF4y2Ba隔离。为了提供足够的时间对细胞粘附,细胞培养进行CD34在相应的扩张中gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。图像清楚显示细胞突起形成的接触表面,证明双官能水凝胶的细胞的粘附。此外,它可以表明,粘附细胞保留他们的生理球形形态,因此,双官能团的水凝胶可以被认为是应用细胞类型的粘合剂。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba。代表SEM显微图与不同的放大显示胶CD34的行为gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞播种DLL1 / RGD功能化水凝胶粒子间的平均距离40 nm。在上面的行gydF4y2Ba(A, C, E)gydF4y2Ba代表图像显示了一整个细胞进行描述。包围区域(白色矩形)在图像放大显示在较低的行gydF4y2Ba(B, D, F)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba显示了包围区域的放大gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba,gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba的gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba(F)gydF4y2Ba的gydF4y2Ba(E)gydF4y2Ba。规模的酒吧gydF4y2Ba(A、C、D、E、F)gydF4y2Ba:1μm;gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba:200海里。gydF4y2Ba
CD34扩散gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞纳米DLL1-Functionalized水凝胶gydF4y2Ba
人类UCB-derived CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞培养为27天要么DLL1-nanostructured RGD-hydrogels ~ 40和90纳米的颗粒间的间距,分别与非结构化no-ligand RGD-hydrogel控制,或培养的黄金基质biofunctionalized DLL1和纤连蛋白。然而,后者文化基质礼物DLL1在随机点分布在高密度培养5μg DLL1毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,黄金纳米颗粒bound-DLL1暴露在quasi-hexagonal时尚密度较低,~ 722分子DLL1μmgydF4y2Ba−2gydF4y2Ba40纳米颗粒间的间距和141个分子DLL1μmgydF4y2Ba−2gydF4y2Ba90纳米粒子间距(通过计算拉格朗日密度最大圈包装中描述gydF4y2Ba温克勒et al。(2017)gydF4y2Ba。在长期CD34的文化gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,细胞扩张被计数细胞每周两次检查。细胞的总数不断增加在所有调查表面上27天(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)表示正在进行的扩散。扩散的促进作用水凝胶体系相比,有或没有Notch-ligand DLL1-fibronectin-gold和组织培养塑料(TCP)成为第一个可见文化(14天后gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。天24/25的细胞总数90海里DLL1-functionalized RGD-hydrogel文化相比显著升高DLL1-fibronectin-gold表面以及标准文化基质TCP。这种差异对TCP表面保持重要也经过27天的文化(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。在任何时间点进行分析,没有明确的差异在总细胞数明显细胞培养与interligand DLL1-nanostructured水凝胶之间的距离~ 40和90海里,也没有从纯RGD-hydrogel截然不同。因此,占总细胞数的整体扩散能力来自公司并不是减少了Notch信号的感应DLL1密度提供的纳米水凝胶。一个成功的协议的基础上extrathymic人类T细胞分化gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba我们使用无血清细胞因子定义中补充了一个鸡尾酒推荐gydF4y2BaPawelec et al。(1998)gydF4y2Ba,包括额外IL-7,因为它已经被证明可以提高早期T细胞分化(gydF4y2BaOhishi et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaVarnum-Finney et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2BaIkawa et al ., 2010gydF4y2Ba)。缺乏血清是T细胞制造的先决条件和化学血清替代品也同时有效定义为人类T细胞扩张或胎牛血清(gydF4y2Ba史密斯et al ., 2015gydF4y2Ba)。无血清培养基建议提供一个更好的环境最近报道的T细胞增殖gydF4y2Ba徐et al。(2018)gydF4y2Ba。我们最初测试的总细胞扩张的捐赠者CD34派生而来gydF4y2Ba+gydF4y2Ba开始人口TCP的HPC扩张中量和TCD的媒介。文化在HPC扩张中细胞数量达到~ 10倍高于文化在浴室中后21天(文化gydF4y2Ba补充图3gydF4y2Ba)。使用不同的表面上的浴室中分化分析导致整个细胞群的扩张的最大因素39后27天的纯RGD水凝胶~ 2.4倍高于TCP (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。总细胞扩张公司的效率在浴室中27天之后在我们的双官能团的水凝胶系统(32倍在90 nm DLL1-RGD-hydrogel 40 nm和30倍)远远低于效率达到支线细胞系统中,例如,总细胞数的UCB-derived公司在OP9-DLL1 coculture增加超过10000倍后4周左右的时间(gydF4y2BaSmedt et al ., 2011gydF4y2Ba)。然而,在基质细胞coculture条件的细胞因子组合(支持馈线分泌细胞层)主要是未定义的,而不是稳定的。因此,这种不完全定义系统不适合临床设置。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba。双官能团的表面上培养的细胞总数为27天。细胞生成的2×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba人类UCB CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞DLL1-nanostructured和纯RGD-PEGDA水凝胶以及DLL1-non-structured纤连蛋白(FN)黄金基质。纳米结构定义一个DLL1间隔40和90 nm,分别。可行的细胞被列举在指定的时间点。标准表面(TCP)文化。数据代表的意思(SD)细胞数量gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 6每个样本表面类型,执行三个独立的实验。显著差异说明如下:*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;* *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01。gydF4y2Ba
CD34的T细胞分化gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞纳米DLL1-Functionalized水凝胶gydF4y2Ba
在27天,我们决定如果图案surface-immobilized DLL1 RGD水凝胶能够指导T谱系分化和产生早期或晚期T淋巴细胞。因此,分析了文化的存在CD7作为早期T细胞表面标记,以及CD2, CD3, TCRα/β,CD4, CD8, CD4, CD8 T细胞发展的顺序定义后阶段(gydF4y2BaAwong et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba温顺的et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2Ba费尔南德斯et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaFamili et al ., 2017gydF4y2Ba)。额外的信息关于中列出的各种标记分子支持信息(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)。到了27天,大多数的细胞CD34表面条件gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD34的频率gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞从超过99%的人口开始下降到<总人口的10% (gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)显示进步的分化。此外,我们可以排除向B细胞谱系分化为CD19的数量gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在所有调查表面细胞很低,甚至大大降低90相比nm-DLL1-RGD-hydrogels RGD-hydrogel控制(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。尽管检测后27天文化,无论是CD7gydF4y2Ba+gydF4y2Ba张cd,也不gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞固定化DLL1频率表示的影响(gydF4y2Ba图4 c, DgydF4y2Ba)。后T细胞的成熟阶段发展的特点是CD4的表达顺序gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba双阳性(CD4细胞gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)细胞和高水平的CD3和TCRα/β,绝对必要的继续发展成为完全成熟的CD4阳性gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba−gydF4y2Ba或CD4gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2BaFamili et al ., 2017gydF4y2Ba)。CD4的频率gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,CD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaTCRα/βgydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaTCRα/βgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞在天27被发现是非常低(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaDgydF4y2Ba,gydF4y2BaFgydF4y2Ba)和关于这些标记表达式的结果细胞Notch-induced (DLL1)文化没有不同于no-ligand控制。调查的抗原,只有CD4显示一个明确的表达式(意味着在所有表面> 5%;gydF4y2Ba图5 egydF4y2Ba)。即将到来的CD4水平gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在细胞表面是在人类中间阶段(ISP)阳性的特征,在发展中积极的CD4的两倍gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,并最终进入成熟的CD4阳性gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(gydF4y2BaHalkias et al ., 2014gydF4y2Ba)。也表达了CD4单核细胞/巨噬细胞和NK细胞(gydF4y2BaKazazi et al ., 1989gydF4y2Ba;gydF4y2BaFilion et al ., 1990gydF4y2Ba;gydF4y2BaMilush et al ., 2009gydF4y2Ba)。然而,在浴室中淋巴细胞因子的结合通过DLL1切口激活,促进淋巴细胞的分化对T细胞(gydF4y2BaVarnum-Finney et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2Ba达拉斯et al ., 2007gydF4y2Ba;gydF4y2Ba费尔南德斯et al ., 2014gydF4y2Ba),使骨髓分化的诱导极不可能的。我们不能确切地分配这些生成的CD4细胞的成熟阶段gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,同时很大程度上CD3gydF4y2Ba−gydF4y2Ba和TCRα/βgydF4y2Ba−gydF4y2Ba,我们国家获得细胞代表人口已经越过了一个非典型T细胞分化更加明显在90 nm DLL1-RGD-hydrogels相比40 nm DLL1——甚至纯RGD-hydrogels (gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba)。然而,90 nm DLL1-RGD-hydrogel(141个分子DLLμmgydF4y2Ba−2gydF4y2Ba)显示,T细胞分化方面的最有前途的结果从UCB-derived公司结合血清和细胞因子定义核心媒介相比,40 nm DLL1-hydrogels(722分子DLL1μmgydF4y2Ba−2gydF4y2Ba)和更密集DLL1-fibronectin黄金基质。因此,似乎对T细胞分化,刺激,而低DLL1表面密度是有利的。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba。细胞表面标记物的表达表明T细胞分化的阶段从人类UCB CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞暴露于DLL1-nanostructured和纯RGD-PEGDA水凝胶以及DLL1-non-structured纤连蛋白黄金基质27天的文化。DLL1 nanopattern定义了一个分子间间距~ 40和90海里,分别。培养细胞通过流式细胞仪分析表面干细胞标记CD34的表达gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaCD19, B细胞标志gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba,CD7 T细胞标记gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba张cd和后面的成熟阶段gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba。数据的标记阳性细胞百分比表示为箱形图gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 6井相同的表面类型从三个独立的实验。TCP、组织培养塑料;FN,纤连蛋白。显著差异*表示gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba。细胞表面标记物的表达表明T细胞分化的阶段从人类UCB CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞暴露于DLL1-nanostructured和纯RGD-PEGDA水凝胶以及DLL1-non-structured纤连蛋白黄金基质27天的文化。DLL1 nanopattern与颗粒间的空隙~ 40和90海里。培养细胞通过流式细胞仪分析表面表达CD3的T细胞标记,TCRαβ,CD4和CD8单一阳性gydF4y2Ba(A, B, E, F)gydF4y2Ba或双阳性细胞gydF4y2Ba(C, D)gydF4y2Ba。数据提出了箱形图显示细胞阳性的比例不同的标记。数据从gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 6样本的每个表面类型三个独立的实验。TCP、组织培养塑料;FN,纤连蛋白。显著差异,*表示gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
切口的影响在T细胞分化是高度依赖于各自的T细胞亚群寻找。在其他研究中也利用non-cell膜固定化DLL1 T细胞分化他们应用更高密度最高的10μg毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba28天的HSC文化。分析细胞群也表现为缺乏成熟的T细胞CD3等标记gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(gydF4y2Ba达拉斯et al ., 2007gydF4y2Ba)或CD4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,CD19gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(gydF4y2BaVarnum-Finney et al ., 2003gydF4y2Ba)。他们产生了大量的早期定义的CD25的T细胞gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD44gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba+gydF4y2Ba表型分别主要特点的鼠科动物物种,但不同的表现型代表人类T血统的承诺(gydF4y2BaHalkias et al ., 2014gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
从公司来研究人类T细胞分化,联合是一个容易公司源代码,也用于我们的实验设计。一些研究调查的影响DLL1 UCB-derived分化的公司。所有这些研究的共同点主要促进T细胞分化的早期阶段。gydF4y2Ba德莱尼et al。(2005)gydF4y2BaDLL1密度制约的效果gydF4y2Baext−免疫球蛋白gydF4y2Ba在造血细胞的生长和分化。他们展示了CD7的绝对数量的增加gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞DLL1gydF4y2Baext−免疫球蛋白gydF4y2Ba配体浓度从1.25到20μg毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba和进步的CD34的比例增加gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD7gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞DLL1浓度增加gydF4y2Baext−免疫球蛋白gydF4y2Ba。在他们的实验中他们用无血清培养系统定义,而gydF4y2Ba费尔南德斯et al。(2014)gydF4y2Ba成功生成CD1agydF4y2Ba+gydF4y2BaCD7gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaOP9-DLL1早期T细胞条件培养基补充与人类重组Flt3L IL-7 ng(5毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)Fc-DLL1(2.5μg毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba25天后)涂层板。Ohishi等人报道,增加IL-7 ng(100毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba无血清培养系统)定义推广CD34的生成gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD7gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞和CD25gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD7gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞CD34gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba+gydF4y2BaUCB-derived公司培养3周的固定化DLL1的存在gydF4y2Baext−mycgydF4y2Ba(1μg毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)(gydF4y2BaOhishi et al ., 2002gydF4y2Ba)。值得注意的是,没有细胞表面表达CD3、TCRαβ或TCRγδ或CD19检测,观察是否切合相同标记的频率很低我们用于流式细胞分析仪分析。切口的结合配体的上述影响DLL1 IL-7增强T细胞分化也将以剂量依赖的方式视为OP9-DLL1 cocultures成年小鼠造血祖细胞显示,只有低剂量ng(< 5毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)IL-7 CD4的频率增加gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2Ba黄et al ., 2005gydF4y2Ba)和双重否定双重积极CD4的分化gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞仍Notch-dependent但不再IL-7-dependent (gydF4y2BaBalciunaite et al ., 2005gydF4y2Ba)。类似的效果是显示人类公司在剥夺IL-7 OP9-DLL1 cocultures,然而只有当anti-CD3刺激(紧随其后gydF4y2Ba帕特尔et al ., 2012gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
旁边一个立即可控变异浓度的可溶性因子如Flt3L或IL-7调整空间固定的配体的数量在一个人工胸腺文化系统是特别具有挑战性,因为受配体是一个静态的环境中,而T细胞发育是一个高度动态的过程。在胸腺成熟期间,通过不同的胸腺T淋巴细胞迁移的区域提供stage-specific发育信号(gydF4y2Ba皮特里Zuniga-Pflucker, 2007gydF4y2Ba)。途中他们感应不同切口配体(JAG1, DLL1, DLL4和JAG2)的表达式是管制空间,定义了不同的胸腺Notch信号细分市场(gydF4y2BaGarcia-Leon et al ., 2018gydF4y2Ba)。T细胞的主要网站成熟胸腺皮质(gydF4y2Ba格里菲斯et al ., 2009gydF4y2Ba)。缺口分析配体表达模式在人类后出生的胸腺表达的可视化,DLL1皮质和髓胸腺上皮细胞,而大多数皮质胸腺上皮细胞缺乏DLL4与鼠标(gydF4y2BaGarcia-Leon et al ., 2018gydF4y2Ba)。对老鼠原来DLL4 T细胞和成熟的承诺是必不可少的(gydF4y2BaHozumi et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科赫et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2BaMohtashami et al ., 2010gydF4y2Ba)和鼠标TCRαβ开发需要连续Notch信号(gydF4y2Ba施密特et al ., 2004gydF4y2Ba)。相比之下,人类TCRαβ发展依赖于减少切口激活(gydF4y2BaVan De机器人瓦力et al ., 2009gydF4y2Ba)。互补,Notch1信号强度等级在不同等级提出了配体,与JAG1最弱的活化剂,其次是JAG2, DLL1, DLL4最强的(gydF4y2BaVan De机器人瓦力et al ., 2011gydF4y2Ba)。此外,人类Notch1受体显示为DLL4 DLL1(内在选择性gydF4y2BaAndrawes et al ., 2013gydF4y2Ba)。gydF4y2BaReimann et al。(2012)gydF4y2Ba利用这种强烈激活潜能和培养UCB-derived CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞固定化DLL4-Fc(5μg毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)的后代显示增加CD7表达式后第七天与CD34表达减少。最近,gydF4y2Ba舒克拉et al . (2017)gydF4y2Ba可以设置一个阈值浓度> 7.5μg毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba板的固定DLL4 fc支持早期T细胞(DN3)采用无血清细胞从老鼠公司代7 d后文化。他们与人类CD34进一步证明gydF4y2Ba+gydF4y2Ba公司源自UCB只有DLL4和VCAM-1启用增加CD7的扩张gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD34gydF4y2Ba−gydF4y2Ba早期T细胞与DLL4相比单独或与纤连蛋白或retronectin DLL4。这个结果指出,旁边配体的结合配体的选择是决定引出协同效应T细胞和成熟的承诺。因为大多数切口ligand-presenting基质细胞在胸腺上皮自然因此non-motile,似乎动态变化在不同等级的空间可用性配体与T细胞的迁徙行为紧密相连,其中由微分整合蛋白的表达和整合素激活调制(gydF4y2BaMojcik et al ., 1995gydF4y2Ba;gydF4y2BaSavino et al ., 2004gydF4y2Ba)。ECM蛋白纤连蛋白介导公司通过α4β1细胞粘附和迁移,α5β1整合蛋白在胸腺细胞gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba已故的T细胞(CD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD69gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)(gydF4y2BaCrisa et al ., 1996gydF4y2Ba)。纤连蛋白主要表达在胸腺髓质(gydF4y2Ba所罗门et al ., 1997gydF4y2Ba),而所表达的细胞表面配体VCAM-1是皮质胸腺基质细胞,也受制于α4β1整合素和影响早期T细胞的粘附和迁移(gydF4y2BaProckop et al ., 2002gydF4y2Ba)。总的来说,我们的双官能水凝胶结合配体DLL1和胶粘剂RGD-sequence即其他整合蛋白,受α5β1 (gydF4y2Ba汉弗莱斯et al ., 2006gydF4y2Ba)。因此,CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞暴露在我们的双官能团的水凝胶受到影响合作的DLL1-induced Notch信号和RGD-induced信号转导。因此,我们人为地模仿胸腺Notch信号利基位于胸腺髓质,成熟的单+ T细胞被发现的地方。非典型T细胞分化我们证明了CD4阳性的比例升高gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞上观察到的90 nm DLL1-RGD-hydrogel支撑代表medullar-like条件。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba
在当前的研究中,我们测试了双官能PEG-based水凝胶含有细胞粘附支持主题RGD以及其潜在的人类等级配体DLL1有益的平台公司分化。黄金纳米粒子绑定DLL1 quasi-hexagonal方式提出了密度的~ 722分子DLL1μmgydF4y2Ba−2gydF4y2Ba在颗粒间的距离~ 40 nm ~ 141分子DLL1μmgydF4y2Ba−2gydF4y2Ba~ 90纳米的颗粒间的距离,分别。第一次我们应用的描述生物材料公司T细胞的分化。gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaT细胞分化极其有趣的生物医学应用程序,因为他们拥有一个强大的潜在减少副作用和并发症引起的造血干细胞移植。UCB公司培养了27天在不同的水凝胶以及参考样本,以评估其影响细胞的增殖和分化行为应用。生长在无血清培养系统定义的条件下,细胞的总数不断增加对所有测试表面的文化时期。旁边的增殖促进检测CD 4是唯一影响T细胞标记表达相关的数量在所有样本。基于这些发现,我们提出一个典型T谱系分化后27天的文化。固定RGD和DLL1 bifunctionalized水凝胶解决两个重要信号通路(整合蛋白和切口)T细胞分化,并结合影响产生的可溶性成分利用细胞因子定义T细胞分化培养基。尽管T血统的输出没有明显影响的定量差异nanopatterned DLL1表示,我们的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba系统诱导T细胞承诺至少在部分所示轻微提高CD4阳性T细胞比例和获得CD4的数量gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。因此,应用生物材料人工模仿medullar-like胸腺Notch信号环境。在此提出文化平台允许受配体密度的精确调整。然而,我们的数据清楚地表明,控制应用配体的空间布置是不足以有效地指导gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaT细胞分化。gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,T细胞的发展依赖于多个分子的协同作用,其表达胸腺中严格控制不仅在太空也。因此,我们的研究也强调了需要时空调节生物材料以达到bioinstructive平台gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaT细胞分化。换句话说,要加强配体表面分布的影响,该系统需要实现的动态变化中的交互,因为它发生在T细胞生理发展。那么它可能导致馈线人类T细胞分化游离系统的发展,为未来的临床应用是不可或缺的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba生成的T细胞。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
DK, AL-H分析结果,从所有的作者写的手稿与贡献。KJ进行了实验和分析结果。UG进行了扫描电镜测量。CL-T构思最初的想法,监督这项研究,分析结果,最后的稿件的校对。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
该项目由BMBF NanoMatFutur计划(FKZ 13 n12968)。BioInterfaces CL-T和AL-H承认资助的技术和亥姆霍兹协会的医学课程。这篇文章的出版由莱布尼兹汉诺威大学的开放基金。gydF4y2Ba
利益冲突声明gydF4y2Ba
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者感谢博士Toufik Naolou(装备,莱布尼兹汉诺威大学)的插图图显示nanopatterned水凝胶的生产。此外,我们感谢Anna-Lena温克勒协助执行的项目和Saskia克劳斯(装备),优秀的技术援助。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmats.2018.00081/full补充材料gydF4y2Ba
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关键词:gydF4y2Ba双官能挂钩、纳米水凝胶、细胞培养、造血干细胞,T细胞gydF4y2Ba
引用:gydF4y2BaKratzer D, Ludwig-Husemann,荣格K, Geckle U和Lee-Thedieck C(2019)纳米双官能团的水凝胶作为潜在指示造血干细胞分化的平台。gydF4y2Ba前面。板牙。gydF4y2Ba5:81。doi: 10.3389 / fmats.2018.00081gydF4y2Ba
收到:gydF4y2Ba2018年10月26日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2018年12月18日;gydF4y2Ba
发表:gydF4y2Ba2019年1月29日。gydF4y2Ba
编辑:gydF4y2Ba
Hsien-Yeh陈gydF4y2Ba国立台湾大学、台湾gydF4y2Ba审核:gydF4y2Ba
詹妮弗·帕特森gydF4y2BaKU鲁汶,比利时gydF4y2Ba艾哈迈德El-FiqigydF4y2Ba、Dankook大学、韩国gydF4y2Ba
Jianxun叮gydF4y2Ba长春应用化学研究所(CAS),中国gydF4y2Ba
版权gydF4y2Ba荣格,©2019 Kratzer Ludwig-Husemann Geckle Lee-Thedieck。这是一个开放分布式根据文章gydF4y2Ba知识共享归属许可(CC)gydF4y2Ba。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2Ba科妮莉亚Lee-Thedieck,gydF4y2Balee-thedieck@cell.uni-hannover.degydF4y2Ba