原始研究的文章

前面。3月科学。,01 February 2023
秒。海洋分子生物学和生态学
卷10 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fmars.2023.1082655

转录组和methylome动力学大黄鱼的鳃(Larimichthys稚鱼)在低盐度适应

剑杨 ^1、2,

Minhai刘¹,

婷婷周¹,

气李 ^{2 *}和

志华林 ^{1 *}

¹宁海海水养殖育种和种子产业研究所,浙江万里大学,中国宁波
²海水养殖的重点实验室,教育部,中国海洋大学,青岛,中国

DNA甲基化是一个重要的动态调节基因表达的表观遗传修饰生物面临非生物压力。然而,很少有研究全面检查DNA甲基化的作用在环境适应海洋鱼类。因此,本研究探讨了methylome动力学在大黄鱼和DNA甲基化调控机制(Larimichthys稚鱼在低盐度适应)。甲基化水平在鳃明显提高s组(5‰盐度)相比,大头(25‰盐度)。共有109个不同的甲基化基因和581个差异表达基因启动子目标被确定通过全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)和RNA-seq两腮的盐度组,分别。此外,23日hypo-methylated /上调差异甲基化(dmg)和28 hyper-methylated /下调基因dmg是通过综合分析,确定主要富集在信号转导、离子交换、能量代谢、细胞骨架系统和其他生物过程。总的来说,我们的研究结果表明,低盐度压力可以诱导自适应全基因组DNA甲基化变化,从而反过来影响基因的转录大黄鱼在低盐度适应。因此,我们的研究结果提供了新的见解海洋鱼类的监管机制,以应对快速的环境变化。

背景

表观遗传修饰可以调节基因的转录而不改变DNA序列,从而使生物体适应环境挑战(Busconi et al ., 2015;李et al ., 2018)。在这些表观遗传修饰中,DNA甲基化是目前最广为人知的表观遗传修饰,这是至关重要的正常生理活动的监管和环境适应理查兹et al ., 2010;Bossdorf, 2011张)。先前的研究已经表明,基因组DNA甲基化可以在动物和植物高度灵活的面对复杂多变的环境压力(Weyrich et al ., 2016;Artem et al ., 2017;黄et al ., 2021)。

环境盐度的变化可以直接影响分布、规模、增长、发展和海洋生物的繁殖(麦克唐纳et al ., 2010)。由于全球变暖,极端降水事件越来越频繁的世界(彼得et al ., 2019),增加地表径流。突然的气候变化会因此严重和突然改变近海水产养殖领域的盐度。大黄鱼(Larimichthys稚鱼)是最富有成效的培养海洋鱼类在中国,和沿海笼文化是实现最广泛的水产养殖模式为这个物种。最近,低盐度条件造成的极端降水导致近海水产养殖行业严重的经济损失。因此,阐明低盐度适应在大黄鱼的监管机制和选择新品种以更好的适应这些条件得到了越来越多的关注。先前的研究的盐度适应大黄鱼主要集中在渗透调节,能量代谢和免疫反应(曾庆红等人。,2017年;陆et al ., 2020;腾et al ., 2020)。然而,很少有研究评估的作用DNA甲基化在海洋生物面临着低盐度的压力。

亚硫酸氢全基因组测序(WGBS)和高通量测序技术研究提供了一个强有力的工具全基因组DNA甲基化动力学near-base-pair-level决议(Adusumalli et al ., 2015)。这里,我们进行一个综合分析WGBS和RNA-seq澄清之间的关联转录组和methylome动力学的鳃大黄鱼低盐度下压力。重要的是,我们的研究不仅试图探索DNA甲基化的潜在的表观遗传调控机制在海洋鱼类的适应环境,也为建立理论依据的选择新品种有更好的环境适应性水产养殖行业的损失降到最低。

材料和方法

动物实验和样品采集

收集实验鱼从水产养殖设施位于象山湾,浙江省,中国。在开始实验之前,120人被随机选择并允许在一辆坦克适应(3米直径)和25‰盐度海水30天。接下来,60体积的健康鱼(体重69.49±15.20 g,体长168.82±12.99毫米)被随机选择和转移到六个坦克(1米直径;每箱10个人有500 L 25‰的海水)适应7天的实验条件。在此期间,美联储鱼每天与商业混合饲料和水每天交换一次消除残余饲料和粪便。二级适应期之后,所有的鱼从每个坦克被随机分配到两个盐度治疗[5‰(s组)和25‰(大头)一式三份。在实验过程中,温度和做研讨会8.3°C和-8.9毫克L⁻¹,分别。鱼每天喂食一次与商业饲料和1/3的水交换。经过7天的曝光,5个人从每个坦克被随机选择和麻醉50 mg / L ms - 222,鳃组织被切割后,立即在液态氮被迅速冻结。样品被分成五个部分(每个部分技术得到了一式三份)进行基因表达,甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析,RNA-seq WGBS和大规模数组分析。

MSAP分析

从鳃组织基因组DNA是孤立使用TIANamp海洋动物DNA工具包(TIANGEN,北京)根据制造商的指示。DNA浓度和完整性检查使用NanoDrop 8000分光光度计和1.5%琼脂糖凝胶电泳,分别。

MSAP实验进行了描述熊et al。(1999)。吉尔DNA样本双消化(EcoRI + HpaII)或(EcoRI + MspI)。使用以下组件:每个反应进行基因组DNA, 400 ng;10×T4缓冲区,2μl;20μM EcoRI 0.4μl;HpaII(或MspI), 0.4μl;0.1% BSA, 0.2μl;无菌水被添加到最后一卷20μl。混合物在16°C孵化12 h。随后,结扎DNA pre-amplified在20μl反应体系如下:消化产品,2μl;10毫米核苷酸,0.4μL; 10× Buffer, 2 μL; 5 U/μL Taq polymerase, 0.2 μL; 10 μM pre-amplification E-A primer, 0.5 μL; 10 μM pre-amplification HM-T primer, 0.5 μL; sterile water, 14.6 μL. PCR was conducted under the following thermal profile: 94°C denaturation for 5 min; 26 cycles of 94°C for 30 s, 56°C for 1 min, and 72°C for 1 min; 72°C extension for 10 min. The pre-amplification products were 20-fold diluted with sterile water and used as the template for the selective amplification reactions. The selective amplification reactions system had the following components: 20-fold diluted pre-amplification product, 2 μL; 10 mM dNTPs, 0.4 μL; 10× Buffer, 2 μL; 5 U/μL Taq Polymerase, 0.2 μL; 10 μM E-primer, 0.5 μL; 10 μM M-primer, 0.5 μL; sterile water was added to reach a 20 μL volume. The reactions were conducted using the program described by李et al。(2017)。适配器和pre-amplification引物的序列进行了总结表1。选择性放大产品使用毛细管电泳分离和检测。GeneMarker软件(版本2.2)被用来分析和可视化吉尔MSAP数据。数据分析进行了描述李et al。(2017)。

表1

表1引物用于这项工作。

DNA甲基化和脱甲基基因的表达

与DNA甲基化相关基因的表达(dnmt1,dnmt3bb,tet1和tet2通过中存在)进行了分析。引物设计使用Primer3计划(表1)。执行中存在使用结核病绿色预混料交货Taq II工具包(豆类,大连,中国)。扩增程序被设置为显示制造商。的18岁核糖体rna基因被用作参考。

RNA-seq图书馆建设、测序和数据分析

鳃组织的总RNA提取6大黄鱼个人从集团和大头一式三份(即。每组),三个鱼。和完整性的总RNA浓度样本测量使用量子位^®RNA分析工具在一个量子位^®2.0荧光计和1.5%琼脂糖凝胶电泳,分别。之后,strand-specific RNA图书馆建成使用下超™RNA内库准备工具包(美国马内),和图书馆阅读获得纯化使用AMPure XP系统(美国贝克曼库尔特,CA)。在图书馆准备后,150个基点paired-end测序进行NovaSeq 6000音序器。使用DESeq2微分表达式分析(爱et al ., 2014),错误发现率(罗斯福)≤0.05,和|日志₂(褶皱变化)| > 1。去KEGG通路富集分析度进行使用的GOseq R包(ashburn et al ., 2000)和KOBAS软件(谢et al ., 2011),分别。

DNA甲基化图书馆建设、测序和数据分析

基因组DNA的提取六鳃组织集团和大头使用TIANamp海洋动物DNA工具包(TIANGEN,北京)。基因组DNA的浓度和完整性检查使用Nanodrop ND2000分光光度计(美国马热科学)和1%琼脂糖凝胶电泳,分别。基因组DNA样本分散使用Covaris 200 - 300 bp S220超声发生器(美国马Covaris)。之后,根据EZ DNA DNA样本bisulfite-treated Methylation-Gold工具包(美国Zymo研究,CA)指令。重亚硫酸盐处理后,un-methylated胞嘧啶尿嘧啶、甲基化胞嘧啶保持不变。亚硫酸氢修复和腺苷酸反应结束后,DNA片段受到PCR扩增构造序列库。量化后的图书馆和检查插入DNA片段使用一个量子位2.0荧光计和一个安捷伦2100生物分析仪,存在确定的最终浓度进行库(库浓度> 2 n M)。合格的DNA库使用Illumina公司HiSeq 2500测序仪被测序。

原始的读取是质量检查和过滤获得干净的读取。然后,参考基因组的测序读比较大黄鱼(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/972/)使用俾斯麦软件(版本0.12.5)(克鲁格和安德鲁斯,2011年)。重亚硫酸盐处理后,unmethylated胞嘧啶(C)转化为胸腺嘧啶(T)和甲基化C保持不变;因此,读取不能准确定位,并参考基因组中甲基化的网站不能被识别。然而,使用俾斯麦亚硫酸氢硅转换算法的软件,我们可以比较分析的映射结果重亚硫酸盐处理读,没有重亚硫酸盐处理读定甲基化C网站通过改变整个T C基地参考基因组为基础。接下来,甲基化网站和差异甲基化区域(dmr)确定使用MethylKit软件(0.99.2版)(Akalin et al ., 2012)相比,获得的结果与俾斯麦软件。为了分析不同的基因的甲基化状态的元素,我们进行了定性分析。分析过程是将基因元素分成20箱,然后比较每一本的甲基化水平反映每个基因的甲基化差异每个吉尔s组的样本和大头的元素。此外,甲基化和脱甲基dmr的元素和染色体进行统计分析,以反映不同的基因的甲基化动力学吉尔在低盐度下压力。dmr的分布特征,不同甲基化基因(dmg)被确定通过检测哪些基因与dmr重叠。去和KEGG分析识别dmg进行使用集群分析器的R包(Yu et al ., 2012)。确定了显著差异通过学生的t以及(p< 0.05)。

综合分析DNA甲基化和基因表达

评价DNA甲基化与基因表达之间的相关性的鳃大黄鱼报低盐度压力、皮尔森相关分析进行筛选和WGBS数据的转录组数据,并确定度之间的相互dmg在WGBS RNA-seq和DMR的目标基因。之后,去KEGG浓缩进行了的分析获得了dmg使用GOseq R包和KOBAS软件,分别。

验证WGBS和RNA-seq dmg重叠的

10度(arhgef37,gnb4,grtp1,LOC104929349,LOC104928056,LOC104918888,LOC104935555,pdhb,slc2a4,slc9a3dmg)和5 (gnb4,LOC104929349,LOC104928056,slc2a4,slc9a3)被选来验证的可靠性RNA-seq和WGBS数据,分别。度的验证和dmr(在离子通道大大丰富,能量代谢,细胞骨架,和其他关键基因通路)是使用中存在和大规模阵列进行甲基化分析。存在如上所述。大规模数组的程序,使用QIAamp DNA基因组DNA是孤立的迷你包(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)和亚硫酸氢修改的基因组DNA进行了使用亚硫酸氢EpiTect工具包(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)。定量的5 '启动子甲基化分析dmg进行使用Sequenom大规模阵列平台(Oebiotech、上海、中国)根据制造商的指示。甲基化引物用于数组中存在和质量分析进行了总结表1。

统计分析

s组基因表达差异和留存通过双向方差分析Bonferroni的紧随其后事后测试。s组之间的甲基化水平的差异和留存下来通过单向方差分析与邓肯的多个范围测试。一个p -值< 0.05被认为是具有统计学意义。

结果

甲基化状态的鳃大黄鱼低盐度下压力

阐明DNA甲基化状态的鳃大黄鱼在低盐度的压力下,我们第一次发现DNA transmethylase基因的表达(dnmt1和dnmt3bb)和demethyltransferase基因(tet1和tet2)。四个基因的表达水平在s组相比显著增加留存下来(图1一个)。此外,我们研究了甲基化状态在鳃组织中使用MSAP技术。hemi-methylation full-methylation,吉尔和总甲基化水平的基因组DNA的大头是26.92%,23.68%,和50.60%,而s组的水平分别为29.19%,27.41%,和56.60%,分别为(图1 b)。三甲基化指数均明显不同集团和留存下来。基因组DNA的分析CpG甲基化网站表示,33.36%的CpG网站保持不变,而32.83% CpG网站在s组脱甲基甲基化和33.81%相比,大头(图1 c)。

图1

图1甲基转移酶基因的表达和基因组DNA甲基化状态的鳃大黄鱼低盐度下压力。(一)相对DNA transmethylase基因的表达(dnmt1和dnmt3bb)和demethyltransferase基因(tet1和tet2);(B)甲基化水平的吉尔s组和留存;(C)基因组DNA CpG甲基化状态。*,代表不同的是重要的(p< 0.05);* * *,表示差异极其显著(p< 0.01)。

比较转录组分析在鳃组织低盐度下大黄鱼的压力

过滤低质量读取后,共有2.63亿个清洁读取生成,和至少88.75%清洁读取被唯一地映射到参考基因组(表2)。澄清低盐度的影响强调基因表达在鳃,主成分分析(PCA)是s组和留存下来的个体之间进行的。正如预期的那样,结果显示高相似基因表达的个体同一盐度下治疗,和s组和大头之间的显著差异(图2一个)。此外,比较分析FPKM(每千碱基片段的记录每百万映射读取)值表明,s组的基因表达水平明显低于个人留存下来的个人(p< 0.05)(图2 b)。此外,吉尔的基因表达水平在每个样本分析基于FPKM值的范围(图2 c),结果表明,基因表达在s组高而留存下来。整体而言,这些结果表明,低盐度压力显著影响鳃的基因表达模式。

表2

表2吉尔RNA-seq资料概述大黄鱼在低盐度下的压力。

图2

图2评估低盐度胁迫的基因表达。(一)主成分分析的基因表达水平在不同盐度治疗;(B)箱形图显示两个盐度治疗之间的基因表达水平的差异;(C)基于差异表达基因的分布数量FPKM价值两个盐度之间的治疗。* * *,表示差异极其显著(p< 0.01)。

确定吉尔低盐度胁迫的转录组动力学,共有581个差异表达基因(度)被确定基于∣日志₂(褶皱变化)∣> 1.5和核反应能量阈值< 0.05。识别度,330被抑制和281上调了s组相比,大头(图3一)。功能性浓缩度的分析表明,这些度显著富集在条款参与代谢过程,”“应激反应相关的生物调控,”其他途径(图3 b,表3)。KEGG路径分析表明,增长和衰减度明显丰富的“细胞粘附分子(摄像头),”“cytokine-cytokine受体的相互作用,”“细胞的过程,”和“紧密连接”基因通路,等等(图3 c,表4)。

图3

图3功能性浓缩度的分析。(一)火山情节展示不同盐度之间的度治疗;(B)KEGG通路富集分析增长和衰减度;(C)浓缩的增长和衰减度分析。

表3

表3总结鳃WGBS数据低盐度下大黄鱼的压力。

表4

表4去分析dmr目标dmg在鳃大黄鱼在低盐度下的压力。

验证度的转录组分析

总共有10度吉尔转录组选择表达式验证使用中存在。我们的结果证实的表达arhgef37,gnb4,LOC104929349,LOC104928056,LOC104918888明显减少,而表达的grtp1,LOC104935555,pdhb,slc2a4,slc9a3显著增加。这些研究结果与我们的RNA-seq结果一致,从而证实了转录组测序数据的可靠性图4)。

图4

图4中存在的验证度鳃的大黄鱼低盐度下压力。

DNA甲基化动力学的鳃大黄鱼低盐度下压力

揭示低盐度的影响压力的鳃组织大黄鱼,bisulfite-treated基因组DNA库构造使用样本的鳃组织三人每个s组和大头。质量控制后,4.9087亿年和4.7216亿年清洁读取得到的大头和s组,分别和至少67.04%的清洁读取被唯一地映射到参考基因组。因此,测序深度和密度被认为足以进行全基因组甲基化分析。此外,每个样本的亚硫酸氢转化率超过99%,从而确保可靠的结果的WGBS分析(表5)。的全基因组胞嘧啶甲基化水平三个序列上下文(CHG CG, CHH;其中“H”表示一个T或C)也计算。甲基化水平的平均CG、CHG CHH留存下来的75.72±0.76%,10.20±0.56%,和10.44±0.61%,分别而s组的水平是75.48±1.88%,10.03±0.07%和10.26±0.14%。

表5

表5KEGG dmr的分析目标dmg在鳃大黄鱼在低盐度下的压力。

识别基因组DNA甲基化动态s组和大头,我们接下来分析吉尔全基因组甲基化。我们的研究结果表明,外显子和内含子区域的甲基化水平高于发起人和下游地区。此外,集团展出不同基因组之间的甲基化水平高于留存下来的元素(图5 a, B),也观察到类似的CG-type甲基化模式染色体水平(图5 c)。此外,微分hyper-methylated区域甲基化分析表明,有少于hypo-methylated区域不同基因之间的区域(图5 d)。

图5

图5比较methylome分析鳃的大黄鱼低盐度下压力。(一)密度图的甲基化水平在不同地区的上游,基因的身体,前后区域。(B)密度图不同的功能基因的甲基化水平的元素。(C)圆环的情节CG-type s组之间的甲基化水平和留存下来,外圆代表集团,内圈代表了大头,和中间的圆圈是两组之间的差异甲基化水平;LG1 - 24表示大黄鱼染色体(NC_040011.1、NC_040012.1 NC_040013.1, NC_040014.1, NC_040015.1, NC_040016.1, NC_040017.1, NC_040018.1, NC_040019.1, NC_040020.1, NC_040021.1, NC_040022.1, NC_040023.1, NC_040024.1, NC_040025.1, NC_040026.1, NC_040027.1, NC_040028.1, NC_040029.1, NC_040030.1, NC_040031.1, NC_040032.1, NC_040033.1, NC_040034.1)(D)分布hypo-methylated hyper-methylated DMR s组之间的数字和大头在不同功能基因组的元素。

根据先前的研究,CG环境中占最大比例的全基因组DNA甲基化(道奇et al ., 2002;李斯特et al ., 2009;李斯特et al ., 2013),这与我们的研究结果是相一致的。因此,下游分析DNA甲基化和基因表达之间的关系进行了基于CG上下文甲基化。WGBS分析阐明共有16027 dmr和3858纯(差异甲基化促进剂)。去和KEGG分析总结了DMR目标基因的结果表6和表7,分别。功能分析表明,低盐度诱导DNA甲基化的变化主要是参与离子交换、能量物质运输、能量代谢、细胞骨架系统,神经系统,信号转导和其他生物过程在大黄鱼的鳃。

表6

表6去分析重叠dmr目标dmg在鳃大黄鱼在低盐度下的压力。

表7

表7KEGG浓缩的重叠dmr目标dmg在鳃大黄鱼在低盐度下的压力。

DNA甲基化和基因表达之间的相关性分析

的综合分析与WGBS RNA-seq表示,有422年和109年dmg dmr和纯数字标识,分别为(图6)。DMR的表达式/甲基化的相关性和DMP目标dmg的说明图6 b, C,分别。此外,表达水平的差异度和甲基化状态之间的整个dmr吉尔s组和留存下来图6 d。

图6

图6综合分析RNA-seq和WGBS吉尔的数据组织低盐度下大黄鱼的压力。(一)维恩图的重叠基因dmg和度的鳃组织集团之间的大黄鱼和留存;(B)维恩图的重叠度的基因表达和DMR目标dmg在鳃s组和留存;(C)维恩图的重叠度的基因表达和DMP目标dmg在鳃s组和留存;(D)热图显示模式之间的度表达式和甲基化的DMR目标dmg的鳃大黄鱼低盐度下压力。

功能分析表明,422年的目标dmg dmr明显丰富228年子类别的三个主要类别,包括128年的生物过程(BP)子类别,23细胞组件(CC)子类别,和77个分子功能(MF)的子类别p值< 0.01。前30名丰富的条件主要是参与渗透调节、能量代谢、基因转录、信号转导和总结表8。此外,前20名丰富KEGG路径是一致的与阐明通过去分析和总结表9。

表8

表8前30名在腮上低盐度下大黄鱼的压力。

表9

表9前20名KEGG通路在鳃大黄鱼在低盐度下的压力。

以前的研究报道,启动子甲基化与基因转录和表达有负相关(法律和雅各布森,2010)。因此,我们还分析了目标dmg的纯数字。去分析表明23 hypo-methylated dmg表达和上调主要富集在质膜(去:0005886),GTPase激活活动(:0005096),信号转导(去:0007165),和其他22个类别的p值< 0.01 (图7)。此外,这些dmg也浓缩在营里信号通路和其他6 KEGG通路(p值< 0.01)(图7 b)。此外,28 hyper-methylated和衰减dmg丰富细胞结(去:0030054),质膜(去:0005886),肌动蛋白细胞骨架组织(:0030036)和其他子类别(29日p值< 0.01)(图7 c),也丰富了轴突引导和21个其他KEGG通路(p值< 0.01)(图7 d)。这些51 dmg的功能分析(23 hypo-methylated + 28 hyper-methylated)表明,DNA甲基化可能发挥重要作用在离子交换的规定,能量代谢,自适应的改变细胞骨架和神经系统,和其他生物过程在低盐度适应鳃。

图7

图7去KEGG DMR的分析目标基因的鳃大黄鱼低盐度下压力。(一)浓缩的上调,hypo-methylated dmg;(B)KEGG通路浓缩的上调,hypo-methylated dmg;(C)浓缩的衰减,hyper-methylated dmg;(D)KEGG通路富集的衰减,hyper-methylated dmg。

这项工作选择10 dmg的综合分析来验证启动子甲基化状态与基因表达之间的相关性在鳃。结果表明,hyper-methylated状态的推动者arhgef37,gnb4,LOC104929349,LOC104928056,LOC104918888大大降低了这些基因的表达在吉尔在低盐度的压力。相比之下,hypo-methylation的推动者grtp1,LOC104935555,pdhb,slc2a4,slc9a3特别是这些基因的表达增加(图8)。

图8

图8基因组浏览器追踪显示之间的关系和基因表达启动子甲基化状态。

验证的dmg WGBS分析鳃组织

我们选择5 dmg (gnb4,LOC104929349,LOC104928056,slc2a4,slc9a3)验证的甲基化水平。每个DMG DMP地区之一是选择比较验证鳃组织的甲基化水平在集团和个人留存下来。所示图9,gnb4和LOC104928056表现出启动子区域甲基化水平较高的s组比大头;相反,LOC104929349,slc2a4,slc9a3s组表现出启动子区域甲基化水平较低。这些结果证实了甲基化状态在大规模阵列测试与WGBS数据是相一致的。

图9

图9验证dmg的鳃大黄鱼在低盐度下的压力。(A, C, E, G,我)五dmg WGBS和大规模阵列分析(gnb4,LOC104929349,LOC104928056,slc2a4,slc9a3)鳃s组和大头,分别;灰色的颜色代表了CG网站未被发现;(B、D、F、H、J)平均CG风格在启动子区域的甲基化水平五个dmg (gnb4,LOC104929349,LOC104928056,slc2a4,slc9a3),分别。

讨论

生物已经进化出复杂而灵活的监管机制,以适应环境变化。环境表观遗传学的研究报道,表观遗传修饰(如DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA)调节相关基因的表达,可能导致适应性表型突变在环境压力(Mirouze Paszkowski, 2011)。在这些修改中,DNA甲基化是一种最广泛记录的表观遗传修饰,这通常发生在真核基因组(鸟,2002;雅苒et al ., 2015)。一般来说,基因组DNA甲基化水平由DNA甲基化和脱甲基酶动态监管,从而使生物应对非生物压力(舒尔特,2014;Yoo et al ., 2017)。DNA甲基化的过程主要是由DNA甲基转移酶(DNMT)。在这些酶,dnmt1负责维护现有的DNA甲基化,而dnmt3bb中起关键作用的形成新的DNA甲基化(陈和李,2006年;摩尔et al ., 2013;崔和徐,2018)。相比之下,脱甲基作用过程主要由春节蛋白质家族,可氧化5-methylcystein (5 mc) 5-hydroxymethylcytosine (5 hmc), 5-formyl胞嘧啶(5-fC),最后5-carboxyl胞嘧啶(5 cac)。此外,tet1是至关重要的区别的甲基化和unmethylated DNA,和两个吗tet1和tet2可以氧化5 mc为5 hmc (Tahiliani et al ., 2009;Ito et al ., 2010)。在这项研究中,的表达dnmt1,dnmt3bb,tet1,tet2在腮低盐度胁迫下显著增加,表明这些条件适应性甲基化和脱甲基事件触发的鳃大黄鱼。MSAP检测表明,32.83%和33.81%的中央人民政府网站在吉尔明显甲基化和脱甲基低盐度胁迫下,分别。我们的基因表达和MSAP分析表明,低盐度压力诱导的自适应全基因组甲基化的变化。然而,MSAP可以只提供见解的甲基化状态CG上下文,因此这种方法不能全面、准确地反映整个基因组的甲基化状态。因此,我们进行了一次综合分析WGBS和RNA-seq全基因组DNA甲基化的动力学特征和潜在的表观遗传调控机制在鳃低盐度的压力。

进行一个比较转录组分析s组和留存下来的个体,我们的研究阐明581度鳃组织。浓缩表明这些丰富度,主要是与ATP合成相关基因通路耦合质子运输、脂肪酸代谢过程,碳水化合物代谢过程,三羧酸循环,信号转导,分生组织的结构组织和监管,表明低盐度应力诱导适应性改变能量代谢和分配、渗透调节、自适应结构变化,以及细胞或组织之间的信号转导。按照分析结果,KEEG富集分析表明FoxO信号通路富集度,谷胱甘肽代谢,细胞粘附分子(摄像头),cytokine-cytokine受体相互作用和其他能量代谢,和离子交换。此外,度也大大丰富necroptosis等几种途径,单纯疱疹感染,c型凝集素受体信号通路,toll样受体信号通路。其中,c型凝集素家族可以识别表面的微生物多糖结构,引起凝集,从而诱导吞噬,补体激活,和其他生物过程(van Vliet et al ., 2008;奥索里奥和里斯e苏萨,2011年)。toll样受体是守恒的模式识别受体,可以启动先天免疫反应和消灭病原体(卡瓦依和彰,2010)。浓缩的几种途径表明低盐度压力可能会削弱免疫系统,增加细菌的可能性,病毒和寄生虫感染。

研究DNA甲基化动力学和潜在的表观遗传机制在低盐度适应,这个工作比较WGBS分析s组和大头大黄鱼的个人。CG的甲基化率、CHG CHH鳃的大黄鱼是75.60±1.29%,10.35±0.41%,分别和10.12±0.37%。此外,我们的研究结果证实,CG上下文占DNA甲基化率最高,这与先前的研究一致(陈et al ., 2005;他et al ., 2011年)。鉴于CG环境甲基化分布率最高,展出我们的研究特别关注其分布特征和功能。我们的研究结果表明,CG环境基因甲基化主要分布在身体,cd地区,和内含子鳃的大黄鱼,这是与以往的研究一致(Cokus et al ., 2008;李斯特et al ., 2009)。此外,共有7025个甲基化和8042脱甲基CG网站中基因元素吉尔被确定在低盐度下压力。正如上面提到的,脱甲基CG网站数量的甲基化网站,与MSAP数据是相一致的。

先前的研究已经报道,DNA甲基化可以调节基因的转录和表达。例如,启动子DNA甲基化可以负调节基因的表达(Gal-Yam et al ., 2008;琼斯,2012)。然而,调节基因的DNA甲基化模式在其他地区仍不清楚(球et al ., 2009)。因此,我们的研究还集中在描述纯数字的功能。WGBS和RNA-seq的综合分析表明,有51 dmg (23 hypo-methylated /差异dmg, 28 hyper-methylated /衰减dmg)的表达式是负相关基因的启动子甲基化状态。去分析表明hypo-methylated /上调dmg和hyper-methylated /衰减dmg同时富集在六个方面:信号转导,等离子体膜,质膜的整体组成部分,GTPase激活活动,ATP绑定和钙离子结合。在这些丰富通路中,前三个扮演关键角色在信号转导和离子跨膜运输。GTPase激活参与细胞迁移,细胞增殖,膜泡运输和细胞骨架动力学(李et al ., 2012;金et al ., 2016),而钙离子结合扮演着关键的角色在细胞体积的维护和三磷酸鸟苷结合蛋白可以调节细胞钙浓度(Yuge et al ., 2003)。hypo-methylated普遍丰富去条款/上调dmg和hyper-methylated /衰减dmg表示,不同的甲基化和基因表达模式导致常见的关键过程,包括信号转导、离子运输、细胞迁移、和其他过程,需要进一步探索。此外,23 hypo-methylated和上调dmg也富含去参与渗透调节,细胞形状维护和信号转导。例如,dmg的老年病相关离子跨膜运输、膜,细胞外基质可能改善低盐度下的鳃的渗透调节能力的压力。此外,细胞粘附分子的上调(凸轮)是提高细胞形状的监管维护和信号转导(埃克斯勒et al ., 2008)。的PDZ域是一种常见的蛋白质相互作用域是至关重要的受体和离子的跨膜运输(金姆和盛,2004年)。Phosphatidylinositol-4 5-bisphosphate (PIP2)中起关键作用的调节肌动蛋白细胞骨架重组、离子转运蛋白活性和细胞凋亡(厕所et al ., 2015;智利和崔2018)。低盐度胁迫诱导相关dmg的表达和增强细胞之间的渗透调节能力和协作。Rab蛋白质可以调节细胞迁移和神经突触可塑性Stenmark 2009;Szodorai et al ., 2009),这是一致的与细胞骨架蛋白的上调绑定和细胞外的外来体。然而,28 hyper-methylated和衰减dmg尤其是丰富的细胞骨架系统和神经系统基因通路包括肌动蛋白细胞骨架组织、细胞迁移、细胞形状、监管lamellipodium,应力纤维肌动蛋白绑定和其他流程。浓缩数据显示7天的适应低盐度压力足以引起实质性的生理变化大黄鱼的鳃。ρ属于拉总科和扮演重要的角色在细胞迁移、粘附、增殖和凋亡(斯坦利et al ., 2014)。有关dmg的减少可能是由于鳃组织低盐度环境的适应,从而限制细胞迁移(如氯细胞)和受伤的细胞凋亡。蛋白质磷酸化是至关重要的离子交换,细胞形态维护和环境应力下细胞增殖(周等人,2018年;米勒et al ., 2019)。在这项研究中,我们推测,dmg的减少与蛋白质自身磷酸化和蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶活性还与鳃到低盐度的适应环境。符合去分析,KEGG通路分析这些dmg证实他们在轴突引导丰富,信号通路,aldosterone-regulated钠重吸收,HIF-1信号通路。此外,hyper-methylated和衰减dmg也富含免疫反应等相关途径趋化因子信号通路,t细胞受体信号通路和胆碱能突触。在这些中,趋化因子信号通路附近可以诱导细胞定向趋化性(Baggiolini 1998)。T细胞是重要的免疫细胞中扮演关键的角色直接消除靶细胞或协助其他免疫细胞,消除异常细胞和病原体(Robertsen 2006;Forlenza et al ., 2008)。因此,我们推测,低盐度压力削弱了免疫系统,使主人更容易受到病原体入侵。反过来,免疫相关基因表达激活来中和这些病原体。经过7天的适应环境、内部环境和体内平衡恢复,和几种dmg的表达逐渐减少。

此外,选择10 dmg基于去KEGG浓缩信息,并验证测试表明,这些基因的表达模式和甲基化状态与RNA-seq和WGBS结果一致。的启动子区域arhgef37,gnb4,LOC104929349(dlc1),LOC104928056(lipea),LOC104918888(aco2)明显hyper-methylated及其表达明显下调。在这其中,arhgef37鸟嘌呤核苷酸交换因子活性,可以通过调节影响细胞迁移和增殖活性的ρgtpase (Viplav et al ., 2019)。LOC104929349拥有GTP-Rho负监管活动,这是至关重要的细胞骨架成分和细胞迁移(卡瓦依et al ., 2010)。gnb4heterotrimer G蛋白的重要组成部分,它参与信号转导由G protein-coupled受体(王et al ., 2018),LOC104928056是脂肪组织分泌的一种中性脂肪酶催化水解甘油三酸酯(Kraemer,沈2006)。顺乌头酸酶2是一个关键酶,维持体内平衡的白色脂肪细胞代谢和调节脂肪酸合成(德维斯et al ., 2011)。五dmg的下调表明自适应细胞迁移、信号转导的力量,和脂质代谢降低鳃后7天适应时期。此外,启动子区域grtp1,LOC104935555,pdhb,slc2a4,slc9a3明显脱甲基和他们的表达明显上调。在这些基因中,grtp1拥有GTPase-activating活动和参与细胞内蛋白质运输(陆et al ., 2001)。LOC104935555具有碳酸酐酶4活动,起着至关重要的作用在细胞内的pH稳态维护(他和狡猾的,2014)。pdhb拥有lanine脱氢酶的活动,调节细胞迁移和增殖(唐et al ., 2016)。slc2a4是一个促进葡萄糖转运体,可以调节细胞内葡萄糖稳态维护(亚伯et al ., 2001)。slc9a3也被称为NH3,这是一个/钠氢交换器参与Na⁺/小时⁺跨膜运输维持细胞内的酸碱平衡,促进水和离子的吸收(Subramanya et al ., 2007)。这五个dmg的上调可以提高离子/葡萄糖跨膜运输能力来维持内部体内平衡和能源供应在鳃低盐度的压力。

结论

基于上述分析,自适应甲基化和脱甲基事件通常发生在吉尔在低盐度下压力。微分甲基化事件使大黄鱼适应低盐度压力通过提高渗透调节、能量代谢、细胞形状维护,信号转导和其他生物过程通过调节相关基因的转录和表达。总的来说,我们的研究结果提供了新的见解的分子机制海洋动物的反应和适应不同的环境压力。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,PRJNA798588https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,PRJNA87638。

道德声明

动物研究是审查和批准的保健和浙江万里大学实验动物的使用。

作者的贡献

司法院、ZL构思和设计研究。司法院和TZ导致数据管理。司法院和ML参加正式的分析和方法。司法院写的手稿。ZL和QL审查和编辑的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

的利益冲突

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引用

亚伯·e·D。,Peroni O., Kim J. K., Kim Y. B., Boss O., Hadro E., et al. (2001). Adipose-selective targeting of theGLUT4基因在肌肉和肝脏损害胰岛素行动。自然409 (6821),729 - 733。doi: 10.1038 / 35055575