灵活的和开源项目在微生物生态学定量图像分析
亚历克西斯·l·Pasulka
乔纳森·f·胡德
达纳·e·米歇尔1和- 1加州州立理工大学生物科学系,圣路易斯奥比斯波,CA,美国
- 2航空航天工程部门,加州州立理工大学,圣路易斯奥比斯波,CA,美国
显微数字化是一个重要的工具,获得丰富的海洋微生物包括病毒的可靠估计。然而,计算分析是需要获得一致和定量数据从数字显微镜图像。许多成像程序专有的和浪费。当前可用的免费成像程序通常是特定于平台的和/或缺乏灵活性分析显微镜图像从自然样本,如浮游环境,它可以包含的挑战,如碎片和高背景信号。这里我们描述两个基于matlab的开源软件图像分析程序,可以在计算机平台和提供工具来分析各种图像类型和细胞大小与一个用户友好的界面。微生物图像分析(MiA)计划旨在提供灵活性的选择、识别和量化的细胞大小不同和荧光强度在自然的微生物群落。病毒图像分析(通过)计划旨在提供一个有效的方法量化病毒丰度从数字化的图像以及列举中小强度的污渍。在这篇文章中,我们概述米娅和通过程序的功能和突出特定程序功能微生物图像通过几个案例研究。
介绍
直接测量微生物丰度和生物量至关重要的准确描述微生物的分布(如病毒、细菌、浮游植物和microzooplankton)在海洋生态系统和海洋生物地球化学循环(他们的贡献米罗斯拉维奇et al ., 2018;Khachikyan et al ., 2019)。显微数字化是海洋微生物学研究的基石(例如,爱好et al ., 1977;谢尔和谢尔,1983;Weinbauer和净重,1997;高尚而Fuhrman, 1998年),使得科学家们想象海洋微生物大范围的大小(例如,< 0.2µm - 200µm)。除了量化丰度、生物量和大小自然海洋微生物群落的结构(例如,2015;帕特尔et al ., 2007;Christaki et al ., 2011;泰勒et al ., 2012;Pasulka et al ., 2013),显微数字化被用来洞察特定分类群(通过荧光原位杂交-鱼;Pernthaler和阿曼,2004),增长率(Hamasaki et al ., 2004),microzooplankton放牧率(谢尔et al ., 1987)、营养模式(卡洛,1983),确定活性微生物群落的成员(通过衬底模拟探索;Hatzenpichler et al ., 2014;萨摩et al ., 2014)。自动定量成像设备(如成像FlowCytobot;Olson和Sosik, 2007年;Sosik奥尔森,2007)正在改善的时空分辨率海洋微生物群落的特征以及如何能导致一种改进(见全球浮游生物观测工作伦巴第et al ., 2019审查目前的技术)。然而,这些努力并不是为了取代精确、精细,高质量的本地取样期间进行海洋邮轮或定位观测采样项目的一部分。此外,超分辨率荧光显微镜方法正在改变我们的想象能力病毒和他们的相互作用(Castelletto Boretti, 2021),但传统的宽场荧光显微镜仍用于确定大量的病毒从环境和文化样本(例如,Turzynski et al ., 2021和来源)。因此,需要继续努力整合离散内微生物研究的可视化获得全面的了解海洋微生物群落结构及其对海洋生态系统的影响函数(塞巴斯蒂安和加索尔,2019)。
虽然微生物生态学家运用显微镜技术观察微生物群落几十年来,显微镜的进步,相机,和计算技术数字图像分析更为普遍和必要的工具(沃尔曼Stuurman,给人以2007;水域,2009;水域和惠特曼,2014年;等待et al ., 2020)。图像分析软件程序存在,但许多是专有的,可以成本高昂(例如,伊万里瓷器,ImagePro)。免费项目如ImageJ (imagej.nih.gov)和CellProfiler (木匠et al ., 2006;McQuin et al ., 2018文化和larger-cell应用程序)可以是有价值的,但许多缺乏所需的灵活性和自定义分析复杂环境样品和小颗粒像病毒。Daime等项目(达因et al ., 2006)更适用于环境样品,但是是特定于平台的(例如,Windows和Linnux)。此外,病毒粒子的量化仍然是一个挑战跨所有平台由于其小尺寸(例如,Shopov et al ., 2000;Barrero-Canosa Moraru, 2018)。一些基于matlab的开源程序已经开发跟踪病毒颗粒的运动(Jaqaman et al ., 2008;李et al ., 2016;王et al ., 2018),但一个易于使用的软件量化病毒粒子数量和荧光从培养和环境样品不存在。因此,作为工具,如phageFISH (阿勒斯et al ., 2013;Barrero-Canosa Moraru, 2018)和病毒BONCAT (Pasulka et al ., 2018)是应用于自然的社区,开源的图像分析工具仍然是需要的。
这里我们描述了两个基于matlab,开源项目分析微生物群落的显微数字化图像。通过MATLAB程序可以运行(在Mac或PC)或者可以下载可执行程序并运行通过免费MATLAB运行时环境。MATLAB的宽度函数用于分析电子显微镜图像,但是这些是用户不能没有编码MATLAB的应用知识。这里给出的两个项目将MATLAB的函数分析的用户在一个易于使用的方式不需要先验知识的代码。微生物图像分析(MiA)计划旨在提供灵活性的选择、识别和量化的细胞大小不同,荧光强度(自然或probe-conferred)在自然的微生物群落。此外,米娅有一个蜂窝基站id功能,使得用户能够定义和分类感兴趣的区域(roi)在图像的实时分析。病毒图像分析(通过)计划旨在提供一个有效的方法量化病毒丰度从数字化的图像以及列举主要的强度(例如,SYBR黄金)和二次染色(例如,双正交的非规范氨基酸标记[BONCAT]或鱼)。两个程序都允许用户以易于使用的格式导出数据,促进下游分析。下面我们概述米娅和通过程序的功能和突出特定程序功能通过几个案例研究。案例研究包括显微镜的图像:
1)自然浮游植物混合社区展示ROI的灵活性选择和细胞ID的功能特性,
2)一个混合文化的腰鞭毛虫食草动物Oxyrrhis滨和浮游植物杜氏盐藻tertiolecta为了说明基于人口的分离细胞的大小和光谱特性收集的程序,和
3)Emiliania huxleyi病毒(超高压)探索病毒丰度的量化(通过SYBR黄金染色)和荧光信号的检测氨基酸标记。
米娅和通过包
安装和需求
米娅和通过程序可以运行一个脚本在MATLAB软件MATLAB之外的或者是一个可执行的软件。脚本的源代码和可执行文件可以下载从公共GitHub库(有关详细信息,请参阅方法)。为了运行这个程序通过在MATLAB源代码,MATLAB R2020a必须安装。为了运行可执行程序,最新的MATLAB运行时环境必须安装。全面的在线文档程序也可以在GitHub的公共存储库。
包结构和模块的概述
总的来说,米娅和通过程序是由一系列面向对象的包和类(图1)。包命名根据他们的功能,包括“bfmatlab”、“常量”、“事件”、“图”和“接口”。外部包“bfmatlab Bio-Formats项目的一部分开发的开放显微镜环境(www.openmicroscopy.org(例如,)开放Zeiss-formatted图像。czi文件)用细微的修改,允许可见状态更新的米娅,并通过图形用户界面(gui)。“常量”包被设计用来保存任意地常数。目前,只有图形常数在包中,包括x - y -间距值,图位置数组和小到大字体大小。“事件”包创建任何定制事件的程序。在现阶段,只有一个极简主义者EventData包装子类对象需要传递动EventData值。“图”包包含所有通用项目相关图创建或图操作类,其中一个类创建一个完全空白的图,一个定制的问题对话框,一个定制的文件选择面板和一个自定义的状态更新面板。这些类被设计成模块化,可用于更有效地创建新的“图”或“接口”类。在“图”,有一个包里题为“功能”设计用来保存任何附加功能能够操纵或修改现有的图形。目前,唯一的文件在这个包里是一个外部的修改版本MATLAB FileExchange dragzoom程序”。m”,为用户提供各种能力在处理一个或多个轴对象。 In the Mac version of each program, this package also has a “MacFix” sub-package, specifically for the post-Catalina OS on Mac devices which interferes with MATLAB’s “uigetfile” ability to select separate file extension objects. Within this sub-package is a modified version of a MATLAB FileExchange “uigetfile_with_preview.m”, employing an older version of MATLAB file interface that does not have the same communication protocol problem.
图1程序结构的概述。主程序运行在父包接口。米娅,image_analysis主程序文件。(* = viral_analysis.m通过主程序文件)。在接口包中,有几个支持GUI类。这些类的项目有许多,但一些只在米娅发现程序在这个列表(斜体)。这个项目也有几个支持包(如常量、事件)以及各种支持类。
两个项目的“接口”包包含一系列的类。每个类是一个子集的接口(例如,一个完整的图接口或一个嵌入面板界面)设计与主界面“image_analysis工作。m”或“viral_analysis。米娅或通过m,分别。运行主界面打开完整的程序。在米娅,课程包括“分析。米”、“bckgrnd_sub_interface。米”、“通道。米”、“manual_threshold_interface。米”、“roi_stats。米”、“select_channel。米”、“roi_identification_interface.m”。通过内部类包括“分析。米”、“通道。米”、“manual_threshold_interface。米”、“select_channel.m”。 The “Interfaces” package varies the most between the MiA and ViA programs, and has minor differences between the PC and Mac versions. ViA has a sub-package “Functions” that holds functions necessary for the “Interfaces” to function. Currently, this sub-package contains a MATLAB FileExchange file by name of “findjob.m”, which extracts the underlying java object within a passed container or MATLAB GUI handle.
集体上述结构创建了一个简单的用户界面对米娅和通过。MiA用户界面显示面板的中间图像,统计在左边的面板中,和图像选择右边的面板(图2)。一系列的下拉菜单提供用户功能加载图片,选择和修改roi,保存数据,并调整显示设置。用户负载后图像和分配颜色通道、程序工具(表1)可以以任何顺序使用。如何使用这些工具的例子介绍了案例研究1和2所示。通过程序界面(图3)不同于米娅程序接口,因为病毒图像的处理需要更少的手动选择roi和发生在一个特定的顺序。界面的左边显示图像(或图像)和界面的右边显示一系列面板,用户按顺序和处理病毒图像(表2,图3)。图3显示最后处理病毒图像减去背景后,阈值,消除工件时使用单通道病毒图像(例如,DNA信号;图3一)或使用双通道病毒图像(例如,病毒BONCAT信号;图3 b)。更多的细节,下面的案例研究中提供的步骤3。
图2米娅接口的概述。左边的弹出式代表文件选项(绿色),ROI选择工具(蓝色)和显示选项(红色)。在右边,图像显示选项包括显示属性(嵌入),通道属性(黄色的弹出式)和图像属性(紫色注解)。左边的面板也有一个像素尺寸选择功能(黑色广场),允许用户设置一个roi, upper-pixel下限。中间的面板与单个细胞图像可视化概述了(例如,地区的利益;ROI)。输入目录和文件输出目录显示在图像和ROI(像素)的统计数据显示,左边的图像。如果添加一个转换因子,统计数据也将显示在微米(µm)。
表1和用例描述可用ROI MiA的工具。
图3通过界面的概述。左边显示一个图像加载如果只有一个通道(一)或双图像是否加载两个渠道(B)。右边的面板包含一系列按顺序使用,每个面板上的细节处理可以在表2。这里显示的面板,用户可以决定利益的最小和最大像素范围(黑色广场),然后显示处理后的病毒颗粒的统计数据的步骤。显示文件输入目录和输出目录下面insets的形象和面板显示下拉菜单包括文件菜单(绿色),显示菜单(红色),帮助菜单(蓝色)。
表2在通过描述图像处理所需的步骤。
图像分析和工作流实例
在本节中,我们选择了一系列数字化的图像来展示这些成像程序的功能包括1)灵活的选项,选择感兴趣的区域(ROI), 2) ROI识别工具,3)的一个例子从ROI提取定量数据,和4)几个例子的数据可以用来描述微生物群落结构(通过丰富或大小)或定量荧光信号(如荧光原位杂交信号)。每个案例研究材料包括图片和数据产生的图像上所有可用的公共GitHub库。
案例研究1 -自然浮游生物群落
灵活的选项的选择
米娅程序有多种ROI选择选项(表1),允许用户准确、有效地选择细胞通过一系列的图像类型。分析图像从复杂环境样品可以挑战由于不同程度的荧光信号在细胞和背景信号从碎片(图4一)。因此,这些类型的图像往往需要不同的分析策略比具有一致的细胞类型和暗背景的图像(例如,案例研究2)。该计划允许无缝切换不同细胞的选择最好的方法来满足每个区域的图像。用户还可以调整对比在任何期间通道实时分析(图4 b),它不以任何方式修改数据,但让用户能够加强信号的暗细胞的目的细胞的选择。
图4(一)示例图像的自然浮游生物群落与微弱硅藻细胞(白色箭头)和光明的腰鞭毛虫(黄色箭头)。(B)对比调整用于实时细胞选择的一个例子展示如何改变红色信号(嵌入)提高ROI的看到细胞能力选择(底部图像显示增强的信号)。(C)区域阈值的例子——选择区域(上)和概述了细胞内的地区(底部)。(D)用腰鞭毛虫概述了ROI识别窗口。
虽然米娅使阈值细胞在整个图像,不均匀背景可以使整幅图像的方法问题。因此,区域的阈值是特别有价值的环境图像(图4 c)。添加额外的灵活性,用户可以选择要使用的通道阈值算法定义roi。此外,该程序提供用户选择单个细胞的能力(例如,单ROI选择)或者进行徒手画。如果两个细胞很近,错误地选为一个细胞,分裂细胞的特性允许用户轻松地分离细胞(见案例研究2图5 b详情)。该项目还提供了大量的ROI删除选项。用户可以选择删除一个ROI,多个ROI区域内选择,或者所有的ROI。除在额外的ROI,像素尺寸选择功能,使得用户能够设置一个限制和消除小细胞(甚至工件图像)或设置一个上限和删除大细胞(图2)。背景减法特性,与几个不同的策略可供选择,可以用于更复杂的图像自然微生物群落。重要的是要注意,因为背景减法有潜力改变数据,原始的和减去背景数据提供数据导出。虽然用户一次只能想象三个频道在图像分析(如红、绿、蓝),如果存在额外的渠道,用户可以切换可视化在图像分析和ROI的渠道选择。此外,数据从所有渠道(不仅是那些可视化)可以导出一个图像分析会话结束时使用掩码文件(有关详细信息,请参阅“保存选项”)。
图5图像从一个文化的例子o .码头细胞(绿色)D tertiolecta(红细胞)(一)。可以用于分离细胞分裂细胞特性,概述了为一个单一的细胞(B)。数据导出的程序可用于可视化荧光或感兴趣的大小在每个地区收集的数据。在这个案例研究中我们用R可视化的分离细胞通过荧光信号D tertiolecta(红圈)有更高的红色荧光信号和o .码头(绿色圆圈)有更高的绿色荧光信号(C)。此外,我们有可视化的细胞图像的大小分布与较小的细胞代表的猎物D tertiolecta和更大的细胞代表腰鞭毛虫食草动物o .码头(D)。
ROI识别功能
而细胞荧光和/或细胞大小可以用来分离感兴趣的人群使用导出的数据图像分析(见案例研究2)后,特定类型的细胞混合,复杂的社区可以从这些类型的数据更具挑战性的识别信号。因此,当进行图像分析用户选择手动识别和分类细胞(图4 d)。用户可以输入不同的名称,他们想确定细胞(如腰鞭毛虫和硅藻)。功能使用户能够确定只有一个类型的细胞(如硅藻),或识别多种细胞类型。当项目开发获得自动分类分类和定量数据数字化的图像(例如,Hense et al ., 2008;Schulze et al ., 2013;科林et al ., 2017),这些项目需要大型参考训练集。这种规模的图像分析并不总是必需的,也不可行;因此,仍有需要手动图像分析为较小规模的研究。
保存选项
使用显微镜图像从一个自然环境可能是耗时的,并且需要多个迭代。因此,米娅程序允许用户保存“面具”文件(.mat),这是一个小的文件包含的信息感兴趣的面具或地区由用户确定。面具可以很容易地加载和修改在任何分析会话。这个项目还有一个面具文件自动保存功能,保存期间如果有电脑问题分析。图像分析完成时,用户可以导出数据从他们感兴趣的区域。对于每个ROI,数据包括数量ROI, ROI识别(如果指定),荧光强度(最小值,意思是,和max)每个颜色通道,ROI的面积,长度、宽度和周边像素)(所有的ROI,和x - y坐标的ROI图像。如果使用背景减法(ROI工具菜单中的一个可选的工具;图2),数据还包括减去背景荧光值,除了原始数据。资料汇总的表也会保存为文件中的第二个表。这个表包含数据可见的ROI统计小组的主要程序接口包括总细胞和最小/最大/说/ ROI区域中值像素。此外,如果一个像素包括微米转换因素是,这些统计数据也显示在微米。进行图像分析时,用户还可以保存图像的快照。维持当前快照对比调整,可以保存有或没有轮廓识别周围的细胞。
案例研究2 -文化的浮游植物(杜氏盐藻tertiolecta)和食草动物(Oxyrrhis滨)
灵活的选项的选择
图片收集到的浮游生物文化,通常有黑暗,甚至背景,提供了一个机会来演示一个简单的ROI选择过程(图5一个)。此外,荧光收集的数据从这些‘干净’数字图像提供了一个机会来演示如何独立的种群和收集信息从ROI图像分析后的数据。可以使用全局阈值阈值细胞在整个图像。使用该功能,细胞靠近另一个经常被选为一个ROI。在这些情况下,细胞分裂功能使用户能够快速、准确地分离单个细胞通过简单的画一条线沿着细胞边界(ROI图5 b)。
量化基于大小或人口的荧光信号
而手工ROI识别,证明在案例1中,可以是有价值的对于复杂的图像,按大小区分细胞类型或荧光信号可以使更高的吞吐量的ROI识别在处理图像时,黑暗的背景和透明细胞边界。用户可以轻松地使用导出的数据作为图像分析程序的一部分。案例研究2、浮游植物和食草动物的形象,我们可以独立的种群基于红绿色信号(图5 c),因为浮游植物细胞有叶绿素异养食草动物没有信号。然而,信号用于分离人口也可以来自一个人工通过鱼或BONCAT标签(例如,米歇尔et al ., 2021)。导出的数据还允许用户探索大小的微生物群落结构(图5 d)和量化的浓度不同的细胞(R示例代码可用案例研究在GitHub库)。
案例3 -病毒图像分析
量化大量的病毒颗粒
数字图像分析已被证明是更有效、准确而列举microscopy-based估计病毒颗粒从环境样品(Shopov et al ., 2000;陈et al ., 2001;Barrero-Canosa Moraru, 2018)。通过,由管道由Pasulka et al。(2018),明显不同于米娅因为ROI选择是旨在处理成像小颗粒的挑战。因此,图像处理的顺序(表2),但用户可以修改设置的每一个步骤。单通道图像(图3一)或双通道图像(图3 b可以加载和处理)。双通道图像(在下面更详细地讨论)时可能感兴趣的量化鱼或BONCAT信号在病毒颗粒。当装载图像,图像可以分配给“DNA”或“标签”信号(图3)。重要的是要注意,分配给“DNA”信号的图像被认为是真正的信号,就是将用于定义病毒颗粒。图像处理步骤中列出表2下面将更详细地讨论。
在数字图像中,背景增加了感兴趣的信号(水域和惠特曼,2014年)。因为病毒颗粒可以不同的荧光信号强度(尤其是成像自然病毒社区),必须测量和减去背景的像素强度值包含感兴趣的信号。因此,背景减法是图像处理的关键的第一步通过程序(使用表2,图6)。程序使用一个滚球减法的方法。简而言之,一个背景值确定每盘(默认盘大小= 10像素),以及每个盘的平均强度减去从盘的面积。因此,空间背景强度的变化很容易占在这种方法中,不影响整个图像检测病毒颗粒的能力。
图6背景减法之前例子形象的病毒(一)后,背景减法(B)后,阈值(C)。数据显示面板(D)显示病毒颗粒的大小和荧光比率。放大区域的“DNA”和“标签”图像(E)显示重心在病毒颗粒(如DNA图像)定义的。白色箭头表示病毒颗粒,没有标记信号。
然后使用阈值来识别图像中的病毒颗粒(表2,图6)。在这种类型的图像分割,图像被转换从一个灰度图像(图6 b)一个二进制图像(例如,黑色和白色;图6 c)。按照这种方式,使用阈值来选择roi(即。白色区域)而忽略其余的形象(即。、黑色区域)。这个程序提供了一个初始使用大津阈值水平的方法(首先,1979),但用户灵活地调整这个级别之间找到一个平衡图像工件和病毒颗粒。
在图像处理的最后一步,小和/或大型图像构件可以删除(图3)。通过选择一个最小值和最大值的像素大小,用户可以改变粒子的数量被认为是真实的。当这些值调整,数据显示在数据面板也会改变(表2,图3)。此时的图像处理,总的roi的应该反映病毒粒子丰富的形象。如果用户输入一微米(µm)像素转换(也可从这一步),然后统计数据大小(最小,最大,中位数,和意思)的粒子µm也提供。虽然用户可以记录这个信息从面板中,这些统计数据中导出数据导出“汇总表”。
之前出口数据,最终数据显示面板可能用于可视化病毒颗粒的粒度分布(表2,图6 d)。这张图片处理管道已经被用于可视化和量化病毒颗粒使用SYBR黄金从50 - 200纳米(Pasulka et al ., 2018)。虽然能够解决两个单个粒子从一个另一个设定的目标,由CCD相机的像素分辨率设置;因此,仔细考虑相机功能对下游病毒颗粒的分析至关重要。然而,重要的是要记住,荧光信号的大小不是病毒颗粒的实际尺寸(见图S5在Pasulka et al ., 2018)。最终数据显示荧光信号的强度还提供了信息在粒子(图6 d),但是这个数据可能更有用如果两个图像加载(详情见下文)。重要的是要注意,虽然板是用于第一次图像顺序处理,用户可以回到任何面板并根据需要调整设置。
检测病毒颗粒的荧光信号
方法如phageFISH (阿勒斯et al ., 2013)和viral-BONCAT (Pasulka et al ., 2018)提供量化的能力丰富的特殊类型的病毒和/或监视病毒感染动力学,分别。然而,数字图像分析仍然需要为了准确地量化了荧光信号。病毒的一般处理图片是相同的,如果一个或两个渠道。然而,当两个图像加载通道,用户可以输入不同的背景减法值,阈值水平,工件去除设置为每个图像。
一个额外的步骤,被激活当两个图像通道加载图像校准步骤(表2)。适当的显微镜对齐为获得最佳图像分析是至关重要的。虽然纳米过滤数据集之间的差异调整不构成问题较大的细胞(如:> 1µm),这些变化会对亚微米粒子问题如病毒,特别是当你有兴趣共存的荧光信号。因此,校准步骤是为了确保图像合理对齐。
工件去除面板将显示的粒子统计图像通道(图3 b),它可以用于确定有多少粒子标记。在处理两个图片频道,该频道标记DNA被认为是与“真实”的病毒颗粒图像。可视化标记病毒粒子如何匹配这些DNA病毒颗粒,可以使用显示重心特性(图2,图6 e)。这个红圈的地方周围所有DNA-image定义roi图像。最终数据显示面板也是一个有用的地方来可视化这些信息,现在的直方图显示的标记DNA荧光比率(图6 d)。在用户推荐出口数据和过程的信号标记病毒根据其他方法(例如,Pasulka et al ., 2018),荧光信号的比值可以提供的用户快速浏览一下级别的标签在治疗相比,如果一个标记控制(Pasulka et al ., 2018)。显示器显示原始荧光数据和背景减去荧光数据,这样用户可以快速可视化背景减法对信号的影响(图6 d)。因此,如果需要改变背景减法的步骤(或任何步骤),他们可以出现在图像处理。此外,可以保存为一个图像直方图的快速参考。
讨论
米娅和通过设计为开源显微镜图像分析程序(GNU通用公共许可证版本3),个人电脑和苹果电脑上工作,易于使用,并提供工具来分析各种图像类型和细胞大小。虽然米娅和通过基于matlab程序,用户不需要任何编程知识使用的程序。此外,可执行版本可供用户没有访问专有MATLAB软件。这样的开源成像程序旨在提供透明度和再现性数据收集从显微镜图像。此外,代码是开源的,这鼓励改进的灵活性以及社区项目的新方向。虽然海洋微生物学领域正朝着更加自动化的图像分析(Benfield et al . 2007;Schulze et al ., 2013;科林et al ., 2017),获得定量信息的能力与灵活ROI-selection显微镜图像选项,而不需要购买昂贵的软件和/或开发大训练集仍然是必要的。尽管这里给出的案例研究集中在海洋微生物群落,米娅和通过程序的功能是广泛适用于任何领域分析显微镜图像从培养的微生物生态学或环境样本。
的局限性和潜在的发展
同时重点发展的米娅的第一个迭代,通过手动图像从复杂环境样品分析,一些图像分析将受益于一个更常规和更快的过程。因此,未来的迭代程序可以运行一个批类似的图像分析在用户设置某些参数(如通道阈值,阈值水平,等等)。此外,米娅的当前迭代程序不包括一个分水岭算法分割对象。虽然这是一个未来的迭代可以包括与细胞集群分析图像,在当前迭代中,用户可以实现区域阈值和手动调整阈值水平分离邻近细胞。
程序内存影响程序的大小和速度的程序可以使用。米娅和通过临时记忆在成像会话。例如,加载新的图片在同一会话中保留了一些参数,如去年的目录图片选择和设置的顺序颜色通道灰度和CZI图像。然而,当前程序不维护任何设置程序实例之间。在未来的迭代计划,临时记忆可以作为基础开发更大的程序内存和允许用户在两次会话之间保存设置想要的。
目前所收集的数据的程序提供了一个易于使用的格式,使得用户的灵活性与下游的类型分析他们可以执行程序的选择(例如,excel, R, python)。但是,这个项目目前不能用于执行任何图像数据的统计数据。根据用户的需求,未来的迭代程序可以利用MATLAB的统计和机器学习工具。
方法
软件——上述开源软件在网上可用https://github.com/PECO-CP/MiA和https://github.com/PECO-CP/ViA。材料这三个案例研究以及详细的手册也可以在这个公共存储库。
样品制备和固定——自然浮游生物的形象,地表水样品(75毫升)收集在阿维拉海滩的加州理工大学的码头,CA (35.1698°N, 120.7408°W)和保存与碱性浓碘溶液(0.05%最终浓度)其次是多聚甲醛(PFA;最终浓度2%)和硫代硫酸钠(最终浓度0.003%)使用修改后的协议(谢尔和谢尔,1983)。保存样品固定在4°C过滤前24小时。样品是沾染了原黄素(0.33%最终浓度)和DAPI(0.05µg /毫升最终浓度)之前过滤。样本然后过滤到8.0µm黑色聚碳酸酯过滤器,安装到玻璃幻灯片VectaShield安装介质(向量实验室),冻结在-80°C到成像。文化的形象,Duniella tertiolecta是添加到文化的Oxyrrhis滨作为猎物,分钟后混合文化与戊二醛固定在4°C(最终浓度0.5%)24小时。10毫升的样品过滤到一个0.8µm黑色聚碳酸酯过滤器,安装到玻璃幻灯片DAPI VectaShield安装介质(向量实验室),冻结在-80°C到成像。在病毒图像准备Pasulka et al。(2018)。EhV207 (MOI 5)添加到文化大肠huxleyi在指数阶段(374年CCMP应变)。在宿主细胞溶解,示例0.45µm过滤器过滤,用戊二醛固定(最终浓度0.5%)15分钟在4°C, flash在液态氮冷冻,并存储在-80°C。样品被发现直接印刷到聚四氟乙烯玻璃幻灯片(电子显微镜科学、聚四氟乙烯打印幻灯片)和风干。15分钟的样本复染色SYBR黄金最终浓度(0.25%),0.02 -µm过滤水,清洗和风干前图像分析。
显微镜,样品进行了分析与蔡司Axio观察者Z1倒置荧光显微镜数字化使用20 x(自然浮游植物社会和文化形象)或100 x客观(病毒图像)使用禅宗显微镜软件。数字图像与6-megapixel CCD摄像机获得(506年蔡司Axiocam mono)。通道励磁和排放峰值波长在nm /带通365和445/50蓝色(DAPI-stained细胞),470/70和525/50绿色(荧光信号的原黄素和SYBR黄金以及戊二醛的自发荧光信号),440/40和675/50,红色(叶绿素自体荧光)。自然浮游植物群落的样例中,10 z平面图像获得每一个荧光通道。结果z-stack图像随后被结合使用一个扩展焦深(EDF)算法在禅宗软件获得焦点(禅宗蓝色2.3)来创建一个图像。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)中可以找到这篇文章/补充材料。
作者的贡献
美联社概念两个程序,写的初始代码用于通过参与项目测试和改进,和写的手稿。MW写的代码的早期迭代MiA,导致程序的改进。最主要的原因是JH MiA的代码和通过,发挥了积极作用程序开发和测试,参与手稿和手动写作。DM导致米娅和通过的测试,导致手稿和手工编写,参与案例研究的发展。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
加州理工大学的研究、学术和创造性活动补助计划&加州理工大学的比尔和琳达霜基金。
确认
我们承认加州理工的研究、学术和创造性活动补助计划支持图像的发展计划以及比尔和美琳达霜基金支持MDW和JFH夏季研究经验。我们还要感谢所有的学生使用和测试程序,包括一些圣罗莎溪基金会的支持。我们也愿意承认Polerecky et al。(2012)谁是开源nanoSIMS数据处理工具为这个基于matlab的图像处理程序提供了灵感。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
引用
阿勒斯E。,Moraru C., Duhaime M. B., Beneze E., Solonenko N., Barrero-Canosa J., et al. (2013). Single-cell and population level viral infection dynamics revealed by phageFISH, a method to visualize intracellular and free viruses.环绕。Microbiol。15日,2306 - 2318。doi: 10.1111 / 1462 - 2920.12100
Barrero-Canosa J。,Moraru C。(2018). “PhageFISH for monitoring phage infections at single cell level,” in噬菌体:方法和协议,第四卷,分子生物学方法卷,1898年。Ed Clokie m r,等。
苯菲尔米。,Grosjean P., Culverhouse P., Irigoien X., Sieracki M. E., Lopez-Urrutia A., et al (2007). RAPID: research on automated plankton identification.海洋学20岁,172 - 187。doi: 10.5670 / oceanog.2007.63
Caron d . a (1983)。枚举的异养和光养微型浮游生物技术,使用epi-fluorescence显微镜,比较与其他程序。达成。环绕。Microbiol。46岁,491 - 498。doi: 10.1128 / aem.46.2.491 - 498.1983
木匠a E。,琼斯·t·R。,Lamprecht M. R., Clarke C., Kang I. H., Friman O., et al. (2006). CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.基因组医学杂志。7日,17076895。doi: 10.1186 / gb - 2006 - 7 - 10 - r100中
Castelletto年代。,Boretti A. (2021). Viral particle imaging by super-resolution fluorescence microscopy.化学。理论物理。的影响。2、100013。doi: 10.1016 / j.chphi.2021.100013
陈F。,Lu J.-R., Binder B. J., Liu Y.-C., Hodson R. E. (2001). Application of digital image analysis and flow cytometry to enumerate marine viruses stained with SYBR gold.达成。环绕。Microbiol。67年,539 - 545。doi: 10.1128 / aem.67.2.539 - 545.2001
Christaki U。,Courties C., Massana R., Catala P., Lebaron P., Gasol J. M., et al. (2011). Optimized routine flow cytometric enumeration of heterotrophic flagellates using SYBR green I.Limnol。Oceanogr。方法9日,329 - 339。doi: 10.4319 / lom.2011.9.329
科林。,Coelho L. P., Sunagawa S., Bowler C., Karsenti E., Bork P., et al. (2017). Quantitative 3D-imaging for cell biology and ecology of environmental microbial eukaryotes.eLife6,e26066。doi: 10.7554 / eLife.26066.043
达因H。,Lücker S., Wagner M. (2006). Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.环绕。Microbiol。8,200 - 213。doi: 10.1111 / j.1462-2920.2005.00880.x
Hamasaki K。,Long R. A., Azam F. (2004). Individual cell growth rates of marine bacteria, measured by bromodeoxyuridine incorporation.Aquat。活细胞。生态。35岁,217年。doi: 10.3354 / ame035217
Hatzenpichler R。Scheller S。,Tavormina P. L., Babin B. M., Tirrell D. A., Orphan V. J. (2014).原位可视化环境微生物利用新合成的蛋白质氨基酸化学标签,然后单击。环绕。Microbiol。16,2568 - 2590。doi: 10.1111 / 1462 - 2920.12436
Hense b。,丐帮了P。,Jutting U., Scherb H., Rodenacker K. (2008). Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis.j .木板。Res。587 - 606年。doi: 10.1093 / plankt / fbn024
爱好j·E。,Daley R. J., Jasper S. (1977). Use of nuclepore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy.达成。环绕。Microbiol。33岁,1225 - 1228。doi: 10.1128 / aem.33.5.1225 - 1228.1977
Jaqaman K。,Loerke D., Mettlen M., Kuwata H., Grinstein S., Schmid S. L., et al. (2008). Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.Nat方法。5,695 - 702。doi: 10.1038 / nmeth.1237
Khachikyan。,Milucka J。,Littmann S., Ahmerkamp S., Meador T., Könneke M., et al. (2019). Direct cell mass measurements expand the role of small microorganisms in nature.达成。环绕。Microbiol。85年,e00493-e00419。doi: 10.1128 / AEM.00493-19
李·d·W。,Hsu H.-L., Bacon K. E., Daniel S. (2016). Image restoration and analysis of influenza virions binding to membrane receptors reveal adhesion-strengthening kinetics.《公共科学图书馆•综合》11日,e0163437。doi: 10.1371 / journal.pone.0163437
伦巴第F。,老板E。,Waite A. M., Vogt M., Uitz J., Stemmann L., et al. (2019). Globally consistent quantitative observations of planktonic ecosystems.前面。3月科学。6、196。doi: 10.3389 / fmars.2019.00196
McQuin C。,Goodman A., Chernyshev V., Kamentsky L., Cimini B. A., Karhohs K. W., et al. (2018). CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.公共科学图书馆杂志。16日,e2005970。doi: 10.1371 / journal.pbio.2005970
米歇尔·d·E。,Lomenick B。,周T.-F。,Sweredoski M. J., Pasulka A. L. (2021). Amino acid analog induces stress response in marine聚球藻属。达成。环绕。Microbiol。87年,e00200-e00221。doi: 10.1128 / AEM.00200-21
米罗斯拉维奇P。,伯灵顿。,Simmons S. E., Klein E., Appeltans W., Aburto-Oropeza O., et al. (2018). Essential ocean variables for global sustained observations biodiversity and ecosystem changes.水珠。改变医学杂志。24岁,2416 - 2433。doi: 10.1111 / gcb.14108
高贵的r . T。,Fuhrman J. A. (1998). Use of SYBR green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.Aquat。活细胞。生态。14日,113 - 118。doi: 10.3354 / ame014113
奥尔森r . J。,Sosik h . M。(2007). A submersible imaging-in-flow instrument to analyze nano- and microplankton: Imaging FlowCytobot.Limnol。Oceanogr。方法5,195 - 203。doi: 10.4319 / lom.2007.5.195
Pasulka a L。,Landry M. R., Taniguchi D. A. A., Taylor A. G., Church M. J. (2013). Temporal dynamics of phytoplankton and heterotrophic protists at station ALOHA.深海研究》第二93年,44-57。doi: 10.1016 / j.dsr2.2013.01.007
Pasulka a L。,Thamatrakoln K., Kopf S. H., Guan Y., Poulos B., Moradian A., et al. (2018). Interrogating marine virus-host interactions and elemental transfer with BONCAT and nanoSIMS-based methods.环绕。Microbiol。20岁,671 - 692。doi: 10.1111 / 1462 - 2920.13996
帕特尔。,高贵的r . T。,Steele J. A., Schwalbach M. S., Hewson I., Fuhrman J. A., et al. (2007). Virus and prokaryote enumeration from planktonic aquatic environments by epifluorescence microscopy with SYBR green I.Protoc Nat。2,269 - 276。doi: 10.1038 / nprot.2007.6
Pernthaler。,Amann R. (2004). Simultaneous fluorescence原位信使核糖核酸杂交和rRNA环境细菌。达成。环绕。Microbiol。70年,5426 - 5433。doi: 10.1128 / aem.70.9.5426 - 5433.2004
Polerecky L。,亚当·B。,Milucka J., Musat N., Vagner T., Kuypers M. M. M., et al. (2012). Look @ NanoSIMS – a tool for the analysis of nanoSIMS data in environmental microbiology.环绕。Microbiol。14日,1009 - 1023。doi: 10.1111 / j.1462-2920.2011.02681.x
萨摩t J。,Smriga S., Malfatti F., Sherwood B. P., Azam F. (2014). Broad distribution and high proportion of protein synthesis active marine bacteria revealed by click chemistry at the single cell level.前面。3月科学。1,48。doi: 10.3389 / fmars.2014.00048
Schulze K。,Tillich U. M., Dandekar T., Frohme M. (2013). PlanktoVision–an automated analysis system for the identification of phytoplankton.BMC Bioinf。14日,1。doi: 10.1186 / 1471-2105-14-115
塞巴斯蒂安·M。,Gasol J. M. (2019). Visualization is crucial for understanding microbial processes in the ocean.菲尔。反式。r . Soc B374年,20190083。doi: 10.1098 / rstb.2019.0083
谢尔B。,Sherr E. (1983). Enumeration of heterotrophic microprotozoa by epifluorescence microscopy.河口海岸大陆架科学。16日,1 - 7。0272 - 7714 . doi: 10.1016 / (83) 90089 - 6
谢尔b·F。,Sherr E. B., Fallon R. D. (1987). Use of monodispersed, fluorescently labeled bacteria to estimate原位原生动物bacterivory。达成。环绕。Microbiol。53岁,958 - 965。doi: 10.1128 / aem.53.5.958 - 965.1987
Shopov。,Williams S. C., Verity P. G. (2000). Improvements in image analysis and fluorescence microscopy to discriminate and enumerate bacteria and viruses in aquatic samples.Aquat。微生物。生态。22日,103 - 110。doi: 10.3354 / ame022103
Sosik h . M。,奥尔森r . J。(2007). Automated taxonomic classification of phytoplankton sampled with imaging-in-flow cytometry.Limnol。Oceanogr。方法5,204 - 216。doi: 10.4319 / lom.2007.5.204
泰勒·a·G。,Goericke R., Landry M. R., Selph K. E., Wick D. A., Roadman M. J. (2012). Sharp gradients in phytoplankton community structure across a frontal zone in the California current ecosystem.j .浮游生物Res。34岁,778 - 789。doi: 10.1093 / plankt / fbs036
泰勒·a·G。,Landry M. R., Selph K. E., Wokuluk J. J. (2015). Temporal and spatial patterns of microbial community biomass and composition in the southern California current ecosystem.深海研究》第二112年,117 - 128。doi: 10.1016 / j.dsr2.2014.02.006
Turzynski V。,我Monsees。,Moraru C。,Probst A. J. (2021). Imaging techniques for detecting prokaryotic viruses in environmental samples.病毒13日,2126年。doi: 10.3390 / v13112126
等待e . C。,Reiche M. A., Chew T.-L. (2020). Hypothesis-driving quantitative fluorescence microscopy – the importance of reverse-thinking in experimental design.j .细胞科学。133年,jcp250027。doi: 10.1242 / jcs.250027
王I.-H。,Burckhardt C. J., Yakimovich A., Greber U. F. (2018). Imaging, tracking and computational analysis of virus entry and egress with the cytoskeleton.病毒10日,166年。doi: 10.3390 / v10040166
水域j . C。,Wittmann T. (2014). Concepts in quantitative fluorescence microscopy.细胞生物的方法。123年,队。doi: 10.1016 / b978 - 0 - 12 - 420138 - 5.00001 x
Weinbauer m·G。,Suttle C. A. (1997). Comparison of epifluorescence and transmission electron microscopy for counting viruses in natural marine waters.Aquat。微生物。生态。13日,225 - 232。doi: 10.3354 / ame013225
关键词:微生物生态学、海洋微生物学、数字化、图像分析、显微镜
引用:Pasulka,罩摩根富林明,米歇尔·德·赖特博士(2023年)灵活和开源项目在微生物生态学定量图像分析。前面。3月科学。10:1052119。doi: 10.3389 / fmars.2023.1052119
收到:2022年9月23日;接受:2023年1月05;
发表:2023年1月19日。
编辑:
戈登·t·泰勒美国纽约州立大学石溪分校版权©2023 Pasulka,引擎盖,米歇尔和赖特。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
*通信:亚历克西斯l . Pasulkaapasulka@calpoly.edu