优化环境DNA分析使用注入深海鱼类生物多样性的监测
高雄吉田
学者Kawato
喜田岛藤原
永野百合子
真嗣Tsuchida
Akinori城市保持- 深海生物多样性研究小组、海洋生物多样性和环境评估研究中心,研究全球变化研究所,日本地球科学和技术部门的(JAMSTEC),横须贺,日本神奈川
深海生态系统存在困难的持续监控和测量深海生态系统的生物多样性,因为物流的限制,高昂的成本和有限的抽样的机会。环境DNA(埃德娜)metabarcoding分析提供了一个有用的方法估算水生生态系统的生物多样性,但很少被应用于深海鱼类的研究社区。在这项研究中,我们利用注入深海水连续监测深海鱼类通过埃德娜metabarcoding社区。为了发展一个最佳方法连续监测深海鱼类生物多样性通过埃德娜metabarcoding,我们确定适当数量的注入深海水过滤,过滤后的实际数量样本复制所需的生物多样性监测深海鱼类的社区。注入深海水样过滤在各种卷(5-53 L)在两个站点(Akazawa:注入深度800米,Yaizu:注入深度400米,静冈市,日本)深海抽水设施。根据评估的结果过滤时间,PCR扩增效率,发现鱼读取次数,过滤20 L Akazawa和过滤的水注入深海10 L Yaizu被证明是适合本研究的过滤量。鱼类生物多样性通过埃德娜metabarcoding分析显示Akazawa和Yaizu样本之间有着明显的差别。我们也评估的影响的过滤器复制数量的物种丰富度被埃德娜metabarcoding注入深海的水。在两个地点,10多个样本复制检测常见鱼类所必需的。我们的优化方法使用注入深海水和埃德娜metabarcoding可以应用于eDNA-based连续生物多样性监测深海的鱼更好地理解气候变化对深海生态系统的影响。
1。介绍
深海包括水深200米以下,是地球上最大的生态系统,具有独特的特点,支持生物多样性水平最高的国家之一在水生环境中而窝藏一个生态系统不同于其他海洋和陆地生态系统(Ramirez-Llodra et al ., 2010;科斯特洛和Chaudhary, 2017)。以其大容量、深海仍然知之甚少,有几个解决这个问题的困难:更深的海洋水域的访问和调查仍然是有限的(例如,成本高,物流困难,为采样)和有限的机会。因此,在深海生物多样性仍未完全阐明(Ramirez-Llodra et al ., 2010;韦伯et al ., 2010;莫拉et al ., 2011;科斯特洛和Chaudhary, 2017;藤原et al ., 2021)。因此,目前迫切需要评估深海生态系统的生物多样性包括生物多样性丧失通过连续监测气候变化和人为活动。
环境DNA(埃德娜)分析metabarcoding macroorganisms使用下一代测序已经用于监测生物多样性在水生生态系统(Taberlet et al ., 2012;米亚et al ., 2015;Valentini et al ., 2016;Vences et al ., 2016)。埃德娜metabarcoding同时和多个物种的高度敏感的检测,旨在了解物种的存在/缺失,分布的物种,生物量的估计,引进的物种和检测,检查各种水生环境中包括海洋(Thomsen et al ., 2012;山本et al ., 2016;Weltz et al ., 2017;凯利et al ., 2018;Ushio et al ., 2018;克努森et al ., 2019)。鱼是最多样化的脊椎动物,包括营养水平较高的大型食肉动物,他们是水生生态系统的关键部件之一功能通过食物网(Albouy et al ., 2019)。他们也敏感,气候变化和人类活动(例如,商业捕鱼)(盖洛et al ., 2020;黄et al ., 2021;Baag Mandal, 2022)。
不幸的是,深海的调查是不容易执行行为和昂贵,因此连续生物多样性监测的机会是有限的。作为解决这个问题的一种手段,我们专注于注入深海水作为艾德娜的来源。十多个深海抽水设施在日本商业和研究目的所在。注入深海水比深海更容易收集使用水取样设备(例如,供Niskin瓶)操作从一个研究容器中,并可在全年任何时候在陆地上。水注入深海的最重要的优势是,连续收集所需的大量深海的水是可能的。因此,我们利用它的起因埃德娜和连续监测生物多样性的深海鱼类在这项研究。
在深海中,埃德娜分析都集中在沉积物调查底栖生物群落(例如,瓜迪奥拉et al ., 2016;Sinniger et al ., 2016;Laroche et al ., 2021)。另一方面,一些水生社区的调查在深海进行(Fraija-Fernandez et al ., 2020;特工et al ., 2020;莫顿et al ., 2021)。最近,埃德娜和其他方法的组合(例如,成像数据)显示的更全面的方法监测深海生物多样性(藤原et al ., 2022;Stefanni et al ., 2022)。然而,据估计,在深海中,生物量低,埃德娜来源的数量低于沿海和表面海水(特工et al ., 2020)。此外,一些生物因素的深海鱼类(如慢代谢)(德拉赞Seibel, 2007)也会影响艾德娜释放到海水来源的数量。由于深海埃德娜低浓度水,需要大量过滤海水生物多样性监测检测大量的分类单元使用埃德娜metabarcoding分析(Bessey et al ., 2020;Stauffer et al ., 2021)。事实上,更多的物种可能会发现随着过滤卷(米亚et al ., 2016;Bessey et al ., 2020)。过滤体积鱼metabarcoding研究河流,小溪,礁变化从0.15 - 6 L (威尔科克斯et al ., 2016;Hinlo et al ., 2017;舒默et al ., 2019),尽管1 - 2 L的水经常被过滤了Bessey et al ., 2020)。最近的研究表明,超过20 L的水从每个网站的过滤需要检测物种,直到累积曲线方法渐近线(Cantera et al ., 2019;Koziol et al ., 2019)。然而,过滤水的体积越大,越大的PCR抑制物质一道埃德娜,这可能导致PCR抑制如前所述(我et al ., 2015;李尔et al ., 2017;哈珀et al ., 2019)。因此,我们也应该注意此类不良材料的出现。另一个重要的监控使用水注入深海鱼类生物多样性是metabarcoding分析样本复制的数量。海水鱼埃德娜可以零星分布,因此检测鱼使用埃德娜metabarcoding强烈影响其分布,之前报道(Bessey et al ., 2020)。足够数量的样品复制是有效评估生物多样性(Bessey et al ., 2020)。
连续监测深海鱼类生物多样性的使用水注入深海,季节性抽样和抽样后的水自然灾害(如地震、极端的洪水,和极端风暴),计划使用深海的水从两个抽水设施在日本中部的太平洋沿岸。一个在Akazawa(静冈县,注入深度:800米)面临外相模湾,另一个是在Yaizu(静冈县,注入深度:400米)面临骏河湾。在这项研究中,我们开发了一个使用注入深海艾德娜metabarcoding分析了解深海鱼类的生物多样性。评估的影响过滤提取出的水的体积埃德娜收益率,PCR扩增效率,和发现鱼类多样性metabarcoding分析,各种卷注入深海的水被过滤。此外,我们研究了影响检测的样本数量的复制深海鱼类。对于这些目的,我们收集了深海水Akazawa 9月14日至15日,2020年,2020年9月16 - 17,在Yaizu。
2。材料和方法
2.1。深海水采样和过滤
深海水样收集从两个深海抽水设施属于本公司,位于静冈县,Akazawa日本(34°50.331镑,139°08.192说,注入深度:800)9月14日至15日,2020年,和静冈县Yaizu,静冈市,日本(34°51.196镑,138°21.439说,注入深度:400)9月16 - 17,2020。这些设施是位于日本中部的太平洋沿岸,分别面对外相模湾和骏河湾。这些设施是我们实验室附近的自然灾害后,可以快速访问。此外,广泛调查海洋生物已经在这些领域也不断进行调查。环境数据,包括温度(°C),盐度(‰),电导率(女士/厘米),σT,叶绿素(Chl-aµg / L),浊度(工联会)评分和溶解氧(;mg / L)收集深海的水用高良健吾分析器测量传感器(JFE Advantech有限公司,西宫,日本)。立即注入深海水过滤收集现场使用Sterivex滤筒(0.45µm孔隙大小、PVDF膜,gamma-irradiated,无菌,SVHVL10RC,默克公司,达姆施塔特,德国)。深海的水在Yaizu过滤使用蠕动泵(Masterflex L / S Masterflex L / S多通道蠕动泵筒泵头和L / S 17 g油管,Masterflex,二,PA,美国),并在Akazawa直接过滤的过滤装置由压力由于高度差(补充图1)。在每个站点上,18 Sterivex过滤器在Akazawa和8 Yaizu同时用于过滤作为一个周期,和至少2.5或3周期每天进行。在这项研究中使用的所有过滤设备被消毒浸泡在1%或6%霍乱商业漂白剂溶液在使用前。过滤后的出口Sterivex筒封顶了消毒防护塞(b·布劳恩,Melsungen,德国),和大约2.0毫升RNAlater(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)立即被填充到筒通过进口防止退化埃德娜,和类似的入口被堵住。Sterivex墨盒在4°C冷藏运输回实验室,在实验室里被储存在-30°C到埃德娜提取。评估的影响过滤提取出的水的体积埃德娜收益率,PCR扩增效率,和发现鱼类多样性metabarcoding分析,三个或四个复制注入深海的水每卷(10年,20年,30、40、48岁,50岁和53 L Akazawa;和5、10、15、20、25、30 L Yaizu)是过滤除了48 L和53 L Akazawa,并在Yaizu 25 L和30 L。基于过滤,过滤量测定。此外,评估样本复制的数量之间的关系,发现鱼类多样性,我们准备从Akazawa 33复制的20-L过滤,并从Yaizu 27复制10 l过滤,共享一个过滤器与上面所示的等体积的实验的一部分。基于过滤时间,PCR产品的数量和总比鱼读、过滤卷(20-L过滤从Akazawa和10 l过滤从Yaizu)测定。 Details of deep-sea water samples and environmental data were summarized in表1和补充表S1。此外,20 L或10 L ultra-purified水(Milli-Q),填写一个一次性无菌塑料袋(Sekisui蹊有限公司,有限公司,大阪,日本)或塑料罐消毒6%霍乱商业漂白剂的解决方案,并使用Sterivex过滤滤芯由蠕动泵在每个集合网站和RNAlater也填入盒相同的方式作为消极的控制(过滤空白;神奇动物)在过滤和随后的实验。一个渗透Sterivex充满RNAlater也用作负控制(埃德娜洗脱空白;在每个集合地点EB)。
表1总结与过滤过滤样品体积,埃德娜恢复,读取的数据处理和分类任务。
2.2。DNA提取、图书馆准备,和下一代测序
埃德娜收集在滤膜Sterivex滤芯使用DNeasy提取血液和组织工具包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)如前所述(Kawato et al ., 2021)。在这种方法中,过滤器被从Sterivex滤芯后打开盒,并切成小块高效裂解埃德娜的来源(Kawato et al ., 2021)。埃德娜被筛选了200µl洗脱缓冲。埃德娜提取浓度被量子位dsDNA HS量化分析工具与量子位荧光计(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。评估中提取的纯度埃德娜,230海里(A230)的吸光度,260海里(A260),和280海里(A280)和比A260 / A230被JASCO v - 560紫外-可见分光光度计测量(JASCO、东京、日本)。
图书馆准备包括两步PCR metabarcoding艾德娜从水注入深海的鱼进行根据最近更新的方法(Kawato et al ., 2021),是基于之前报道的方法米亚et al ., 2015。在第一轮PCR,多重PCR针对线粒体12 s rRNA基因序列使用两套通用引物(MiFish-U-Forward, MiFish-E-Forward、MiFish-U-Reverse MiFish-E-Reverse;补充表S3)执行。这些引物集放大大约170 - bp的高变区线粒体碎片12 s rRNA基因和追加第二轮为下一代测序引物结合适配器两端的扩增子(总长度:ca。300个基点)(米亚et al ., 2015)。如前所述(进行PCR扩增Kawato et al ., 2021)使用铂SuperFi II DNA聚合酶(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和1 X SuperFi II缓冲区包含200µM每个核苷酸,每个引物0.6µM,至少40 ng埃德娜模板。八个技术复制每个埃德娜模板,按照先前的研究(米亚et al ., 2015)准备。PCR热循环条件如下;98°C 30年代首次变性,紧随其后的是38个周期98°C的变性10年代,退火60°C 10年代,30年代在72°C和扩展;最后一个扩展在72°C 5分钟。PCR扩增后,分析了扩增子的E-gel预制琼脂糖电泳系统使用一个E-gel SizeSelect II琼脂糖凝胶2%(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和一个安捷伦2100生物分析仪使用安捷伦高灵敏度DNA工具包(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。评价PCR扩增效率,PCR产物的数量由荧光强度(即表示。峰面积)的相应的产品使用安捷伦2100生物分析仪计算获得。
第一轮PCR后,第二轮PCR和下一代测序是由生物工程实验室。有限公司有限公司(日本Sagamihara)如前所述Kawato et al ., 2021)。第一轮PCR产物纯化了AMPure XP(美国贝克曼科特尔、沥青、钙)。第二轮PCR进行添加惟一索引序列和Illumina公司测序适配器(2 ndf, 2 ndr;补充表S3)使用前Taq(豆类生物、志贺、日本)。Adapter-attached PCR碎片纯化使用AMPure XP,然后这些paired-end序列库测序使用Illumina公司MiSeq(美国Illumina公司,圣地亚哥,CA) 2×300 bp的条件下。
评估潜在污染的外源DNA在实验过程包括水过滤,埃德娜提取、和PCR扩增,第一轮PCR扩增使用艾德娜从facebook和EB进行提取解决方案。这个过程中使用的所有设备和长椅前1%霍乱商业漂白剂清洗使用。管和移液技巧也是新的,用紫外线消毒器消毒灯泡。详细的操作程序用来避免污染风险进行根据前面描述的方法(米亚et al ., 2015;源氏et al ., 2021),是由员工熟悉这些程序。
2.3。生物信息学
扩增子原始序列数据被处理之前描述的方法(奥卡河et al ., 2021)使用USEARCH ver11.0.667 (埃德加,2010)。生paired-end读取被合并,低质量(Q得分< 2)和短读(< 100 bp)被过滤掉。合并读取分歧5 bp对齐的地区被丢弃。修剪后引物序列,劣质读取预计超过1%的错误率和短读(< 120个基点)被移除。重复序列生成的序列被发现和独特的序列没有单例,双张中的一张牌,tripletons被移除,以避免假阳性(埃德加,2016),得到。获得序列处理生成扩增子序列变异(asv)和嵌合序列被移除。
转让操作分类单位(辣子鸡)、基于先前描述的报告(奥卡河et al ., 2021),是由使用MiFish数据库版本。41岁。基于传统方法而不是动物区系的调查,我们进行了文献调查(如栖息地,栖息地的深度范围内,分布在Akazawa和Yaizu)产生的分类使用FishBase物种www.fishbase.org)(森林和保利,2022)和日本鱼类的阿特拉斯(Nakabo 2013)全面目录鱼类记录在日本海域。家庭层面上评估asv的分类任务,neighbor-joining (NJ)系统发育树包括asv建成使用MEGAX版本。10210527 (Kumar et al ., 2018与肌肉(后)埃德加,2004在MEGAX),这是一个内置的程序。asv和序列的身份超过98.5%(两个核苷酸差异允许)和一个进化枝组成相同的物种被分配到参考序列的物种名称,而那些序列80 - 98.5%的身份和一个进化枝组成同一物种被命名为“U98.5”加上相应的物种名称与最高的身份。asv和序列的身份低于80%的人从分类任务。单元中的每个OTU进化枝属于一个特定的物种属被分配的属名“sp紧随其后。”顺序编号(例如,Lepidotriglasp。1, sp。2)。每个OTU进化枝的一个特定的家庭而不是一个特定的属被任命为家庭“sp紧随其后。”顺序编号(例如,Synaphobranchidae sp. 1, sp. 2 or U98.5_Myctophidae sp. 1, U98.5_Myctophidae sp. 2). Hereafter, the terms, “OTU” and “species” are used interchangeably.
α多样性(ChaoI)使用素食v2.5.7辣子鸡分析(迪克森,2003)打包在R 4.1.2 (R核心团队,2021年)在RStudio版本2021.09.1 + 372 (RStudio团队,2020)。的非度量多维标度(nmd)基于存在/缺失数据的鱼类个体Akazawa样本和Yaizu进行使用与metaMDS Jaccard距离函数在素食包r .物种积累曲线存在/缺失数据的基础上分析了鱼类被埃德娜使用iNEXT版本。2.0.20打包在R 4.1.2 RStudio 2021.09.1 + 372版本。图形构造使用R包ggplot2版本。3.3.5 (韦翰,2016)。
2.4。统计分析
鱼读和过滤量之间的相关性研究通过计算皮尔逊积差相关系数的R 4.1.2 RStudio 2021.09.1 + 372版本。不同数量的辣子鸡、Akazawa之间Yaizu获得各种过滤卷是由使用Dunnett multcomp版本的测试。1.4 -17打包在R 4.1.2 RStudio 2021.09.1 + 372版本。我们还比较了不同数量的OTU从Akazawa 33复制的20-L过滤,和27复制10 l过滤Yaizu exactRankTests版本0.8中通过使用Mann-Whitney U测试-34年4.1 R。设置在RStudio 2021.09.1 + 372版本。一个区别p在所有测试< 0.05被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。比较过滤体积和埃德娜收益率注入深海水中提取
过滤水量之间的关系、过滤时间,产量恢复埃德娜,PCR扩增的效率进行评估使用过滤样品注入深海的水在不同数量。Akazawa抽样现场,我们开发了一个过滤装置,利用压力由于高度差(补充图1)。这个过滤设备有18个过滤器可以过滤的大体积泵深海的水没有电力供应。过滤时间所有过滤容量范围从约20到230分钟在Akazawa采集水样本,从大约15到260分钟Yaizu (图1)。浓度和纯度(A230 / A260)的比例提取埃德娜所示补充图2,3。埃德娜从所有过滤后的样品在两个抽样地点,不管深海过滤水的体积。过滤水卷有积极影响的数量恢复总DNA,埃德娜浓度较高的恢复大过滤体积较小的样品相比。DNA浓度估计通过测量A260吸光度值高于表示,用荧光试剂,以及它们之间的区别在Yaizu过滤体积的增加而增加(补充图3)。Yaizu样本,通过添加更多的模板DNA PCR产品没有检测到过滤水的大样本(补充图4)。是指出PCR产物的数量从10 l过滤获得样本之间的最高Yaizu只有最少的模板DNA样本解决方案增加了(补充图4、6)。Akazawa样本,PCR产品减少只有当模板DNA的解决方案是添加的最大数量(补充图5)。消极的控制包括ultra-purified水过滤过滤空格空格和埃德娜洗脱,没有可检测DNA浓度和PCR扩增获得并不认可。
图1收集的时间剖面过滤体积Akazawa Yaizu。圆圈表示实验值。线条和阴影乐队表明近似曲线和95%置信区间,分别。红色和青色代表信息从Akazawa Yaizu,分别。
3.2。测序的总结埃德娜metabarcoding源自深海海水中
总共90条鱼metabarcoding过滤各种filtration-volume样本系列的库(18库Akazawa和Yaizu)和过滤示例复制从固定filtration-volume系列(30库在Yaizu Akazawa和24库)被MiSeq测序(详细数据所示表1)。生读的数量(12395136读)为每个库范围从98448年到184547年的平均137724 (表1)。序列处理后,共有8450653个读取被分配为鱼序列范围从68381年到142242年平均每样93896 (表1)。之间的负相关性过滤卷和组装的百分比鱼读取两个采样点被发现(Akazawa:培生的r= -0.87,df = 16,P= 2.868 e-06;Yaizu:皮尔森的r= -0.65,df = 16,P= 0.035;表1;补充图7)。共有146个辣子鸡代表鱼包括92在物种水平,确定13属级别的确定,24个家庭级别的确定和17序列80 - 98.5%的身份被检测到两个抽样地点(补充表S2)。这些辣子鸡总共包括68条鱼科88属(补充图8两个采样点)和大多数发现辣子鸡benthopelagic, bathydemersal和深海区的物种(补充表S2,补充图9)。总共有43个和123个辣子鸡发现Akazawa Yaizu,分别为(补充图8)。辣子鸡,29个辣子鸡(检测总辣子鸡的67.4%)Akazawa和89年辣子鸡(检测总辣子鸡的72.4%)Yaizu是在良好的协议与已知的分布记录,即。,分别分发给外相模湾和骏河湾(补充表S2)(Nakabo 2013)。此外,27个辣子鸡的栖息地深度范围(检测总辣子鸡的62.8%)Akazawa和63年辣子鸡(检测总辣子鸡的51.2%)Yaizu对应的深度注入深海的每个摄入水(Yaizu Akazawa: 800;400米,补充表S2;图2)。表示不一致的物种栖息地深度范围的深度每个进水口9辣子鸡(检测总辣子鸡的20.9%)Akazawa和25个辣子鸡(检测总辣子鸡的20.3%)在Yaizu (补充表S2;图2),7个辣子鸡(检测总辣子鸡的16.3%)Akazawa 35辣子鸡(检测总辣子鸡的28.5%)Yaizu展出栖息地的深度范围从FishBase没有记录
图2鱼类的栖息地深度记录范围从埃德娜发现。最浅的和最深的记录深度检测鱼类的栖息地从FishBase (https://www.fishbase.se/home.html)是用圆的X和Y轴,分别。圈放置在红色框表示该物种可以分布在每个进水口的深度(Yaizu Akazawa: 800: 400)。(一)Akazawa,(B)Yaizu。圈子不同的颜色表示不同的生境类型由FishBase分类。圆圈的大小表示每个OTU总读的比率。前五名的名字物种最丰富的读取和物种进口深度以下,分别显示为黑色和蓝色字符。
3.3。从每个过滤检测鱼辣子鸡注入深海的水的体积
辣子鸡检测的数量在每个过滤体积样品低于估计的物种丰富度(ChaoI指数)和总发现辣子鸡(图3)。根据统计分析,辣子鸡的数量更大样本的检测过滤水没有明显高于小样本Akazawa过滤水的网站(图3一)。然而,显著增加数量的观察发现辣子鸡,15 - 20 - 25 l过滤样品Yaizu网站(图3 b)。辣子鸡的总数从各种大量的过滤水的样本是在Yaizu显著增加(图3)。也出现了类似的趋势之间的共享辣子鸡的数字复制的样品在Yaizu各种大量的过滤水。
图3鱼的辣子鸡确定不同filtration-volume样本(一)Akazawa,(B)Yaizu。圆形、三角形和正方形表示辣子鸡的数量,数量的辣子鸡,和alpha-diversity (ChaoI指数),分别。下面的数字圈显示所有复制辣子鸡之间共享的数量。有显著差异的数量之间的辣子鸡鉴于基于Dunnett相同字母的样品测试(p < 0.05)。
3.4。示例复制的数量之间的关系在两个网站和发现鱼类生物多样性
在这个实验中,每个过滤卷固定在复制(20 L Akazawa, 10 L Yaizu)基于评估的结果过滤时间,PCR扩增效率,发现鱼读取次数。辣子鸡检测到的数据复制不同采样地点(图4)。发现辣子鸡的数量范围从2到10 Akazawa(意味着= 6.36),从10在Yaizu 22(意味着= 15.36),在Yaizu显著高于Akazawa (Mann-Whitney U测试;p < 0.05)。之间的变化检测辣子鸡复制在Yaizu高于Akazawa。的总数量辣子鸡和chaoI指数从Yaizu采集的样本(总辣子鸡:98;chaoI指数:217.5)也高于Akazawa(总辣子鸡,35;chaoI指数(43.8)。共有118个辣子鸡代表鱼类包括76确认属和61家庭发现标识(补充图8 b)。这118的辣子鸡,辣子鸡Akazawa和Yaizu 15岁之间共享。鱼的组成有明显的不同类群之间的两个抽样地点(图5;nmd压力= 0.844778)。发生的频率在示例复制(鱼的发生比率OTU过滤中示例复制)显示,大约一半的数量从Yaizu辣子鸡,三分之一的辣子鸡Akazawa显示不到5%的发生比率(补充图10)。累积的辣子鸡Akazawa几乎聚集到40 50复制(图6)。此外,积累曲线的辣子鸡代表频率超过5%的人在15复制在Akazawa饱和。Akazawa相比,辣子鸡的累积曲线Yaizu使用所有OTU数据显示物种丰富度并不完全饱和甚至在50-replicate抽样(图6 b)。同样Akazawa,辣子鸡代表的频率超过5%,累积曲线也在15复制在Yaizu饱和。累积曲线的辣子鸡使用OTU数据频率在5%以上的复制表示,10多个样本复制在两个站点所需的检测,频繁发生的鱼类(图6)。
图4注入深海的鱼,辣子鸡获得水Akazawa和Yaizu采样。过滤体积Akazawa样本和Yaizu 20 L和10 L,分别。箱线图与圆圈表示辣子鸡的数量。上下值表明α多样性(ChaoI指数)和总数量的辣子鸡,分别。星号显示显著差异数量之间的辣子鸡Akazawa和基于Mann-Whitney Yaizu样品的测试(p < 0.05)。
图5非度量多维标度(nmd)鱼OTU发生从Akazawa和Yaizu。分析使用OTU阅读存在和Jaccard距离。红色和绿色圆圈显示过滤后的样品收集在Akazawa 9月14日和15日,2020年,分别。深绿色和蓝色的圆圈显示过滤后的样品收集在Yaizu 9月16日和17日,2020年,分别。凸壳集群根据收集的样本抽样的网站。nmd应力值为0.091377。
图6累积曲线的鱼辣子鸡发现从Akazawa埃德娜和Yaizu抽样工作。基于复制出现率在累积曲线(一)Akazawa和(B)Yaizu。线,虚线表示sample-size-based稀疏和外推抽样情节,分别。观察数字辣子鸡都用符号。阴影表明95%机密区间。红色方块:辣子鸡应用;蓝色三角形:辣子鸡超过5%发生;浅蓝色三角形:辣子鸡超过10%发生;白圈:辣子鸡超过20%发生;紫色的钻石:辣子鸡超过30%发生;绿色圆圈:辣子鸡有超过50%的发生。
4所示。讨论
在这项研究中,我们演示了鱼类多样性的成功应用监控使用艾德娜从注入深海的水和开发了一种新型过滤设备使用虹吸效应同时滤液18复制不需要昂贵的设备或权力。我们的研究结果表明,大量过滤(> 20-L)注入深海的水提出了一些技术上的困难和风险。此外,20 L注入深海的水的过滤Akazawa和过滤从Yaizu 10 L注入深海的水被证明是合适的过滤量监测深海鱼类生物多样性在目前的研究。同时,我们的数据表明,充分复制样品需要检测综合埃德娜很少发生鱼在水中注入深海(大约10或更多的复制覆盖主要社区,和更多的如果它包括小社区,根据网站)。此外,本研究建议最佳过滤水量和适当的样品复制取决于过滤系统和生物多样性的调查指出,因此,重要的是要考虑每个研究网站的优化方法和目的。
我们的结果显示无显著差异的数量检测辣子鸡Akazawa不同过滤大量的样本。PCR产物的数量不放大尽管埃德娜从一个更大的体积的水注入深海利用。此外,过滤体积之间的负相关和组装的总数鱼读取被发现。这些负面影响可能原因的增加过滤体积是PCR抑制材料的积累和非目标DNA的来源,如细菌粒子过滤器超过鱼埃德娜的积累来源当过滤器开始堵塞过滤的数量增加。过了大约30 - 45分钟的10 l过滤Yaizu和20-L Akazawa过滤,而更大的过滤需要过多的时间,花了一个多小时10 l和20-L过滤或更大。过滤体积大(超过20-L)注入深海的水提出了一些技术上的困难和风险,如污染风险的增加,埃德娜的退化,PCR抑制过滤材料在长时间的积累。因此,适当的过滤样品注入深海水量决定考虑这些困难和风险:从Akazawa注入深海的20-L过滤水和10 l过滤Yaizu被证明是合适的在目前的研究中,有以下原因:PCR产品的数量超过10 l过滤低Yaizu (补充图4、6),总比鱼读入超过20-L过滤减少Akazawa (补充图7)。
随着过滤体积,复制筛选样本的数量也是一个重要因素估算使用艾德娜metabarcoding分析生物多样性。埃德娜的来源在海水中展品零星分布,以及生物多样性的评估使用埃德娜是强烈影响的抽样工作(Bessey et al ., 2020;Stauffer et al ., 2021;安et al ., 2022)。发现物种的数量相对一致的复制、变异的8种之间复制Akazawa样本和12个物种之间复制Yaizu样本。这些变化略高于先前的研究在热带小溪和河流(Cantera et al ., 2019),但明显低于前一个深海研究(特工et al ., 2020)。发现物种的数量在Yaizu复制高于Akazawa,和总数Akazawa Yaizu 35和98年,分别。这些辣子鸡,25个辣子鸡(发现辣子鸡总数的71.4%)Akazawa和70年辣子鸡(发现辣子鸡总数的71.4%)Yaizu是在良好的协议与先前已知的分布记录。一项研究表明,埃德娜来自观察类群非常本地化(带来过度Di负载et al ., 2020),我们的研究结果表明,大约一半的辣子鸡Yaizu和三分之一的辣子鸡Akazawa只检测到从一个复制(大约不到5%发生比率复制;补充图10)。除了辣子鸡发生比率小于5%,累积曲线检测辣子鸡达到高原在大约10或更多的复制,而所有检测到的辣子鸡50 Yaizu不饱和甚至在复制。这些数据表明,埃德娜从低密度显示了零星的分布和鱼很少被注入。我们的结果与之前的一致建议,充分复制样品需要提高检测概率和鱼类生物多样性得到可靠的估计(Bessey et al ., 2020;Stauffer et al ., 2021)。
鱼埃德娜在开放海域被认为是探测到它被释放或更深的深度,但很少浅(运河et al ., 2021)。我们的研究结果表明,发现物种的栖息地深度范围对应于每个摄入注入深海的水的深度(Yaizu Akazawa: 800: 400,分别)。此外,大约70%的总发现辣子鸡两个抽样地点是在协议与以前的分布记录。剩余的辣子鸡,大约14%辣子鸡没有发现两个抽样地点分布记录从先前的报告和其他辣子鸡没有记录数据。因此,深海的水抽采样站点非常有用和用于估计深海鱼类的生物多样性。还需要进一步的影像学研究来直接观察到活鱼使用遥控车辆和/或自动饵相机增加艾德娜metabarcoding数据的可靠性。
最近的一项研究表明,预测温度和氧气的变化受气候变化预计将减少生物多样性在加州海湾的深海底栖鱼社区(盖洛et al ., 2020)。鱼类在海洋生态系统功能是关键生物通过食物网(Albouy et al ., 2019)。埃德娜是一个强大的工具来监控分析鱼类生物多样性与传统调查方法,如capture-based抽样(例如,山本et al ., 2017;安et al ., 2020;Bessey et al ., 2020;Sigsgaard et al ., 2020;奥卡河et al ., 2021)及其利用各种研究最近越来越流行。然而,深海实地调查使用研究船舶配备集水设备(例如,供Niskin瓶)很难进行,费时和昂贵的。最近,新的取样方法使用一种新型设备附加到拖网或滴灌水从拖网的使用更简单、更便宜的检测埃德娜一直在进行底拖网渔船(Russo et al ., 2021;Maiello et al ., 2022)。这些方法可能适用于商业渔船,可用于生物多样性的连续监测。同样,注入深海水作为艾德娜源提供的抽水设施也划算,上述船舶的需要,作为一个窗口到近岸深海环境,更受到人类活动和气候变化的影响,使其高效的方法监测深海鱼类生物多样性。了解气候变化对生物多样性的影响的鱼是一个很重要的问题预测未来的海洋生态系统。我们的优化方法可以提供准确的定性信息在深海鱼类生物多样性使用注入水和埃德娜metabarcoding分析深海水是有成本效益的和有用的方法连续监测生物多样性。
数据可用性声明
从MiSeq原始DNA序列数据存入央行(Bank of JAPAN)的DNA数据(DDBJ)测序读存档(半径标注;https://www.ddbj.nig.ac.jp/dra/index-e.html)加入DRA013780数量。在这项研究中提出的数据集可以在文章中找到补充材料。
道德声明
动物研究回顾和批准所有动物实验按照适当的指导方针进行的动物实验(日本科学理事会)。
作者的贡献
泰和可设计的研究。泰、可、YF, YN,圣,AY收集和过滤深海的水。可进行实验。泰,可带注释的辣子鸡。泰分析所有数据并写的手稿。所有作者批准了最终版本的手稿,同意负责所有方面的工作在确保相关问题的准确性或完整性的任何部分工作适当的调查和解决。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项研究是由日本地球科学和技术部门的。
确认
我们感谢Michiyasu野村(本公司)、Yusuke佐野和Hideo Kawai(静冈县全州深海抽水设备)的技术援助与样本收集;女士精工佐(JAMSTEC)与实验寻求帮助;雷切尔博士Atanacio (FishBase)提供一个FishBase数据集。我们也感谢Katsuhisa山田博士(本公司),孝宏天野之弥(静冈市地方政府办公室)先生,女士,Keiko Maeda(静冈县全州深海抽水设施)的物流支持,利用深海海水中。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmars.2022.965800/full补充材料
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关键词:埃德娜、生物多样性、深海的水,鱼监测方法,metabarcoding
引用:吉田T, Kawato M,藤原Y, Y长野,Tsuchida年代和城市环境DNA分析(2023)优化使用注入深海鱼类生物多样性的监测。前面。3月科学。9:965800。doi: 10.3389 / fmars.2022.965800
收到:2022年6月10日;接受:2022年12月29日;
发表:2023年1月17日。
编辑:
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*通信:高雄吉田,tyoshida@jamstec.go.jp